JPH0292298A - Hiv構成蛋白に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Hiv構成蛋白に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0292298A JPH0292298A JP63247215A JP24721588A JPH0292298A JP H0292298 A JPH0292298 A JP H0292298A JP 63247215 A JP63247215 A JP 63247215A JP 24721588 A JP24721588 A JP 24721588A JP H0292298 A JPH0292298 A JP H0292298A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はヒト免疫不全ウィルス(HIV)の分析等に使
用されるモノクローナル抗体であり、特に種々のエイズ
検査用キットにおける安全性に優れた陽性標準として使
用でき、かつHIVの基礎研究にも応用可能なモノクロ
ーナル抗体の樹立に関するものである。
用されるモノクローナル抗体であり、特に種々のエイズ
検査用キットにおける安全性に優れた陽性標準として使
用でき、かつHIVの基礎研究にも応用可能なモノクロ
ーナル抗体の樹立に関するものである。
後天性免疫不全症候群(AIDS、エイズ)は1981
年アメリカにおいて初めて報告された(Gottl i
ab、 M、S、 ら、N、Eng、J、Med、、
Mi、 1425(1981)参照〕、この疾患は、現
在ヒト免疫不全ウィルス(HIV)と呼ばれているレト
ロウィルスによって感染すると考えられている(Cof
fin、J、ら、S c i e n c e 、 ■
L697 (1986)参照〕。
年アメリカにおいて初めて報告された(Gottl i
ab、 M、S、 ら、N、Eng、J、Med、、
Mi、 1425(1981)参照〕、この疾患は、現
在ヒト免疫不全ウィルス(HIV)と呼ばれているレト
ロウィルスによって感染すると考えられている(Cof
fin、J、ら、S c i e n c e 、 ■
L697 (1986)参照〕。
従来、血清中のHIVに対する抗体を検出する確定検査
として、HIVを電気泳動にかけてgp120、gp4
1.p24.plB等の構成蛋白に分画し、これらをニ
トロセルロース膜に転写してストリップを作成し、この
ストリップをヒト血清と反応させて酵素免疫測定(EI
A)を行うウェスタンブロッティング法が用いられてい
る。この方法では予め抗HIV抗体の存在が既知である
エイズ患者血清を非動不活化して陽性標準として使用し
ている(Bio−Rad社 インストラクションマニュ
アル(1987)参照〕、シかしながら、エイズ患者血
清由来の抗体を利用する際、安定して多量に抗体を得る
ことは困難を要する。このため近年よりHIvそのもの
をマウスに免疫し、免疫後の牌細胞を摘出した後、適当
な骨髄腫(ミエローマ)all胞と融合させて融合細胞
(ハイプリドーマ)とし、この融合細胞を培養すること
によりHIVに特異的な結合反応を示すモノクローナル
抗体を大量に得る試みが数多くなされている0例えば、
Michael S、C,Fungら、Blotech
nology、5.940. (19B?)のように)
IIVの構成蛋白のひとつであるgp120対するモノ
クローナル抗体の報告やp24に対する抗体について報
告されている。ところで、米国特許第4.520.11
3号公報には、エイズ及びブリ・エイズ(Pro−AI
DS)患者の血清中に検出される抗体の持つ反応性また
は特異性が主にHIVのエンベロープ抗原を構成する蛋
白質gp41に対して向けられていることが指摘されて
いる。そこで、James J、GJangら、Pro
c、Natl、Acad、Sc!、LISA+JL1.
6159(1986)では、gp4tを構成する蛋白よ
りエイズ患者血清中の抗体に対して高免疫原性を有する
アミノ酸領域を検討し、その結果エンベロープ抗原の5
84−604番目のアミノ酸を構成する以下の21個の
配列をもつペプチドを特定化している。 Arg−11
e−Leu−Ala−Val−Glu−Arg−Tyr
−Leu−Lys−Asp−G l n−G 1 n−
Lue−Lue−G ly−11e−Trp−G Iy
−Cys−3er (Ala−アラニン、 Arg=ア
ルギニン。
として、HIVを電気泳動にかけてgp120、gp4
1.p24.plB等の構成蛋白に分画し、これらをニ
トロセルロース膜に転写してストリップを作成し、この
ストリップをヒト血清と反応させて酵素免疫測定(EI
A)を行うウェスタンブロッティング法が用いられてい
る。この方法では予め抗HIV抗体の存在が既知である
エイズ患者血清を非動不活化して陽性標準として使用し
ている(Bio−Rad社 インストラクションマニュ
アル(1987)参照〕、シかしながら、エイズ患者血
清由来の抗体を利用する際、安定して多量に抗体を得る
ことは困難を要する。このため近年よりHIvそのもの
をマウスに免疫し、免疫後の牌細胞を摘出した後、適当
な骨髄腫(ミエローマ)all胞と融合させて融合細胞
(ハイプリドーマ)とし、この融合細胞を培養すること
によりHIVに特異的な結合反応を示すモノクローナル
抗体を大量に得る試みが数多くなされている0例えば、
Michael S、C,Fungら、Blotech
nology、5.940. (19B?)のように)
IIVの構成蛋白のひとつであるgp120対するモノ
クローナル抗体の報告やp24に対する抗体について報
告されている。ところで、米国特許第4.520.11
3号公報には、エイズ及びブリ・エイズ(Pro−AI
DS)患者の血清中に検出される抗体の持つ反応性また
は特異性が主にHIVのエンベロープ抗原を構成する蛋
白質gp41に対して向けられていることが指摘されて
いる。そこで、James J、GJangら、Pro
c、Natl、Acad、Sc!、LISA+JL1.
6159(1986)では、gp4tを構成する蛋白よ
りエイズ患者血清中の抗体に対して高免疫原性を有する
アミノ酸領域を検討し、その結果エンベロープ抗原の5
84−604番目のアミノ酸を構成する以下の21個の
配列をもつペプチドを特定化している。 Arg−11
e−Leu−Ala−Val−Glu−Arg−Tyr
−Leu−Lys−Asp−G l n−G 1 n−
Lue−Lue−G ly−11e−Trp−G Iy
−Cys−3er (Ala−アラニン、 Arg=ア
ルギニン。
Aap*アスパラギン酸、 Cys−システィン、 G
1n==グルタミン、 Glu−グルタミ°ン酸、 G
ly・グリシン。
1n==グルタミン、 Glu−グルタミ°ン酸、 G
ly・グリシン。
11e−イソロイシン、 Leu+−ロイシン、 Ly
s=リジン。
s=リジン。
Ser・セリン、 Trp・トリプトファン1↑yr=
チロシン、 Val−バリン) 又、この報告の中で、James J、G、Wangら
はかかる配列をもつ合成ペプチドを用いて直接反応容器
等に面相化することにより、血清中の抗H!■抗体を特
異的かつ感度良く検出している。
チロシン、 Val−バリン) 又、この報告の中で、James J、G、Wangら
はかかる配列をもつ合成ペプチドを用いて直接反応容器
等に面相化することにより、血清中の抗H!■抗体を特
異的かつ感度良く検出している。
′従来のHIV検出演出法いてEIA、ウェスが多く、
非動不活化してはいるが、検査者等にとっでは尚も感染
の危険が残る。その上、患者血清の絶対量も不足しがち
である。又、HIVそのものを免疫原として作成したマ
ウスモノクローナル抗体には現在gp120やp24に
対するものが種々報告されているが、ウィルス膜中に埋
没した形態で存在するg941に対して特異性を有する
抗体は得られていない、このため、gp4tがHIVの
感染及び9因発現の探究に多大な重要性を有しているに
も拘らず、HI V構成蛋白の中で最も分析および研究
が遅れている。
非動不活化してはいるが、検査者等にとっでは尚も感染
の危険が残る。その上、患者血清の絶対量も不足しがち
である。又、HIVそのものを免疫原として作成したマ
ウスモノクローナル抗体には現在gp120やp24に
対するものが種々報告されているが、ウィルス膜中に埋
没した形態で存在するg941に対して特異性を有する
抗体は得られていない、このため、gp4tがHIVの
感染及び9因発現の探究に多大な重要性を有しているに
も拘らず、HI V構成蛋白の中で最も分析および研究
が遅れている。
以上の問題点に着目して、HIV蛋白gp41に特異的
なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段および作用〕本発明では、
感染の恐れのある天然のHIVは一切用いず、HIMの
膜蛋白gp41由来のアミノ酸配列の一部に一部する合
成ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製す
る。
感染の恐れのある天然のHIVは一切用いず、HIMの
膜蛋白gp41由来のアミノ酸配列の一部に一部する合
成ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製す
る。
その際、合成ペプチドをヒト以外の動物1例えばマウス
のような哺乳類に投与して免疫し、その後該動物よりリ
ンパ球細胞として牌細胞を取り出し、無限増殖能をもつ
骨髄腫(ミエローマ)細胞と細胞融合させる。ここで融
合に用いる手段にはポリエチレングリコール(PEG)
のような融合促進剤を使用する方法(にoheler
G。
のような哺乳類に投与して免疫し、その後該動物よりリ
ンパ球細胞として牌細胞を取り出し、無限増殖能をもつ
骨髄腫(ミエローマ)細胞と細胞融合させる。ここで融
合に用いる手段にはポリエチレングリコール(PEG)
のような融合促進剤を使用する方法(にoheler
G。
and Milstein C,、Nature、」旦
、495+ (1975)’参照)や、電気パルスを利
用した融合方法(tl。
、495+ (1975)’参照)や、電気パルスを利
用した融合方法(tl。
Zimmermann and J、Vienken、
J、Menb?ane Biol。
J、Menb?ane Biol。
■、 165. (1982)参照)等がある。
本発明のモノクローナル抗体は天然のウィルス蛋白を免
疫原とする場合と異なり、ウィルス本体とは反応せず、
HIVの膜蛋白gp41由来のアミノ酸の一部に反応し
てgp41と結合する。
疫原とする場合と異なり、ウィルス本体とは反応せず、
HIVの膜蛋白gp41由来のアミノ酸の一部に反応し
てgp41と結合する。
(実施例〕
本発明を実施例に基いて説明する。
まず、免疫原には以下のアミノ酸配列よりなる合成ペプ
チドを用いた。Arg−11e−Leu−AlaVal
−Glu−Arg−Tyr−Leu−Lys−Asp−
Gin−Gin−LeuLeu−Gly−11e−Tr
p−Gly−Cys−Ser(A1a=アラニン。
チドを用いた。Arg−11e−Leu−AlaVal
−Glu−Arg−Tyr−Leu−Lys−Asp−
Gin−Gin−LeuLeu−Gly−11e−Tr
p−Gly−Cys−Ser(A1a=アラニン。
Arg−アルギニン、^sp=アスパラギン酸、 Cy
s=システィン、 Gln−グルタミン、 Glu−グ
ルタミン酸。
s=システィン、 Gln−グルタミン、 Glu−グ
ルタミン酸。
cry−グリシン、 11e=イソロイシン+ Leu
=ロイシン、 Lys・リジン、 5er−セリン
*TrpcFリプトファン、 Tyr−チロシン、 V
al・バリン)(1)肺細胞の調整 まず、上記合成ペプチド100μgを特定のキャリアを
媒体として動物に投与した。即ち、ポリビニルピロリド
ン(P V P ) 100μ2と混合溶解させ、こ
れを6週令の雌BALB/Cマウス(チャールズリバー
■より入手)の腹腔内に注射して免疫した# 1か月後
、同様の腹腔内注射を行って追加免疫をして、更に1か
月後に背皮下9尾静脈、眼等に分散して同様の注射を行
ない、その4日後にBALB/Cマウスより肺臓を摘出
して以下の調製を行った。まず、摘出した肺臓をD −
M E M (Dulbecco’s旧11malE
ssentlal Medium)培養液中で数回振っ
て余分な脂肪塊等を洗い落とした0次に、D−MEM培
養液10−を入れたベトリ皿に肺臓を移し、大きく4つ
程度に切断した後、ピンセットによりリンパ球を押し出
した。リンパ球を含んだD−MEM培養液をステンレス
メツシュを通して組織塊を濾過して取り除くことにより
リンパ球浮遊液を調製した。
=ロイシン、 Lys・リジン、 5er−セリン
*TrpcFリプトファン、 Tyr−チロシン、 V
al・バリン)(1)肺細胞の調整 まず、上記合成ペプチド100μgを特定のキャリアを
媒体として動物に投与した。即ち、ポリビニルピロリド
ン(P V P ) 100μ2と混合溶解させ、こ
れを6週令の雌BALB/Cマウス(チャールズリバー
■より入手)の腹腔内に注射して免疫した# 1か月後
、同様の腹腔内注射を行って追加免疫をして、更に1か
月後に背皮下9尾静脈、眼等に分散して同様の注射を行
ない、その4日後にBALB/Cマウスより肺臓を摘出
して以下の調製を行った。まず、摘出した肺臓をD −
M E M (Dulbecco’s旧11malE
ssentlal Medium)培養液中で数回振っ
て余分な脂肪塊等を洗い落とした0次に、D−MEM培
養液10−を入れたベトリ皿に肺臓を移し、大きく4つ
程度に切断した後、ピンセットによりリンパ球を押し出
した。リンパ球を含んだD−MEM培養液をステンレス
メツシュを通して組織塊を濾過して取り除くことにより
リンパ球浮遊液を調製した。
(2)融合細胞およびPEG溶液の調製融合に用いるミ
エローマはマウス骨髄腫細胞P3x63−AJI 8.
653 (環ATCC番号 CRL−1580)を使用
した。大型培養@(150d) ニ成育シタミエローマ
5X10?個を遠心管に移して1200r、p、m、で
5分間遠心して細胞を集め、これを血清を含まないD−
MEM培養培養液1巾浮遊させた後、肺細胞2X10”
個を含む上記リンパ球浮遊液を混合して再度120Or
po+で5分間遠心して融合に備えた。
エローマはマウス骨髄腫細胞P3x63−AJI 8.
653 (環ATCC番号 CRL−1580)を使用
した。大型培養@(150d) ニ成育シタミエローマ
5X10?個を遠心管に移して1200r、p、m、で
5分間遠心して細胞を集め、これを血清を含まないD−
MEM培養培養液1巾浮遊させた後、肺細胞2X10”
個を含む上記リンパ球浮遊液を混合して再度120Or
po+で5分間遠心して融合に備えた。
次に、融合に用いるポリエチグレングリコール(PEG
)溶液は次のように調製した。PEG(メルク5972
7) 1 gをガラス試験管に取り、これにアルミ栓を
してオートクレーブにかけた後60℃まで冷まし、更に
45℃に加温したD−MEM培養液を11d加え、攪拌
して45゛cの温浴中で保存した。
)溶液は次のように調製した。PEG(メルク5972
7) 1 gをガラス試験管に取り、これにアルミ栓を
してオートクレーブにかけた後60℃まで冷まし、更に
45℃に加温したD−MEM培養液を11d加え、攪拌
して45゛cの温浴中で保存した。
(3)融合作業
遠心した融合細胞の上清を出来るだけ取り除き、上記P
EG1液lIdを1分間でピペットにより滴下した.こ
の間、遠心管は激しく振とうして細胞沈渣を充分はぐし
た0次に遠心管を振り続けて1分間の攪拌を行ない融合
を促進させた0次の1分間でD−MEM培養液IIdl
を滴下した後ピペットを交換して更に1d滴下した。
EG1液lIdを1分間でピペットにより滴下した.こ
の間、遠心管は激しく振とうして細胞沈渣を充分はぐし
た0次に遠心管を振り続けて1分間の攪拌を行ない融合
を促進させた0次の1分間でD−MEM培養液IIdl
を滴下した後ピペットを交換して更に1d滴下した。
このようにPEGを徐々に薄めた後更にD−MEM溶液
8II!lを2分間で滴下することにより一気にPEG
を希釈して融合作業を終えた。
8II!lを2分間で滴下することにより一気にPEG
を希釈して融合作業を終えた。
(4)ハイプリドーマの培養
融合を終了した遠心管中の細胞浮遊液は1200rpm
で5分間遠心した後、上清を廃棄して、ハイブリドーマ
増殖用HAT培地(70%DーMEMm液.20%牛脂
児血清, 10%NCTC培地の混合液にヒボキサンチ
ン13.61Mg/戚.チミジン3.88μg/ym.
アミノプリテン0.176μg/dを含む)30dに浮
遊させ、これを100μ2ずつ96マイクロプレ一ト3
枚の各ウェルに分注して5%CG! 37℃のインキュ
ベーター中で培養した.培養4日目にHAT培地を10
0μ2ずつ各ウェルに添加し、更に培養7日目および1
00日目各ウェル100μiずつ新鮮なHAT培地に交
換する.培l115日目頃に各ウェルに育成して来たハ
イプリドーマがコロニーを形成した時点でスクリーニン
グにより免疫原である合成ペプチドに対する特異性を調
べた。
で5分間遠心した後、上清を廃棄して、ハイブリドーマ
増殖用HAT培地(70%DーMEMm液.20%牛脂
児血清, 10%NCTC培地の混合液にヒボキサンチ
ン13.61Mg/戚.チミジン3.88μg/ym.
アミノプリテン0.176μg/dを含む)30dに浮
遊させ、これを100μ2ずつ96マイクロプレ一ト3
枚の各ウェルに分注して5%CG! 37℃のインキュ
ベーター中で培養した.培養4日目にHAT培地を10
0μ2ずつ各ウェルに添加し、更に培養7日目および1
00日目各ウェル100μiずつ新鮮なHAT培地に交
換する.培l115日目頃に各ウェルに育成して来たハ
イプリドーマがコロニーを形成した時点でスクリーニン
グにより免疫原である合成ペプチドに対する特異性を調
べた。
(5)スリーニング
ELISA用96ウエル平底プレート(Nunc :4
−68667 )を用意し各ウェルに合成ペプチドをI
IIgずつ分注し37℃で1時間静置して固相化した.
各ウェルを0.OIMIJン酸緩衝液(PBS)で3回
洗浄し、更に3%のBSAを含んだO.GIMPBSを
それぞれ100μlずつ加えて再び37“Cで1時間静
置し、次いで0.05%Tween20を含む0、01
M P B S 、PH7.5で3回洗浄した.このよ
うに所定量の合成ペプチドを固相化したブレートノ各つ
ェルに培養中のプレートの各ウェルより100uj!の
培養上清をそれぞれ移し室温で1時間静置した0次に、
Twean20− P B S液で4回洗Sおよび5%
のTween20を含んだ0.OIM P B S 。
−68667 )を用意し各ウェルに合成ペプチドをI
IIgずつ分注し37℃で1時間静置して固相化した.
各ウェルを0.OIMIJン酸緩衝液(PBS)で3回
洗浄し、更に3%のBSAを含んだO.GIMPBSを
それぞれ100μlずつ加えて再び37“Cで1時間静
置し、次いで0.05%Tween20を含む0、01
M P B S 、PH7.5で3回洗浄した.このよ
うに所定量の合成ペプチドを固相化したブレートノ各つ
ェルに培養中のプレートの各ウェルより100uj!の
培養上清をそれぞれ移し室温で1時間静置した0次に、
Twean20− P B S液で4回洗Sおよび5%
のTween20を含んだ0.OIM P B S 。
P117.2により1000倍に希釈してこれを100
plずつ各ウェルに分注した。室温で1時間静置した後
、Theen20− P B S液で4回洗浄し、次い
でオルソフエニルジアミン(OPD)1.5μl/dを
0.1Mクエン酸緩衝液、PH5,5に溶かし、30%
の過酸化水素1μm7d4を加えたものを100μlず
つ各ウェルに分注した。室温の暗所にて静置して15〜
30分間反応させ、2N硫酸50μ!を各ウェルに添加
して呈色反応を停止し、それぞれの吸光度をマイクロプ
レートリーダー(Btotec社、 EL−310)を
用いて490 mで測定した。このような間接ELIS
A法により合成ペプチドに反応する抗体の存在が確認さ
れたウェルについて、測定値の高い順にハイブリドーマ
を取り出し24ウエル培養用プレートに移して上述と同
様の培養を行った。
plずつ各ウェルに分注した。室温で1時間静置した後
、Theen20− P B S液で4回洗浄し、次い
でオルソフエニルジアミン(OPD)1.5μl/dを
0.1Mクエン酸緩衝液、PH5,5に溶かし、30%
の過酸化水素1μm7d4を加えたものを100μlず
つ各ウェルに分注した。室温の暗所にて静置して15〜
30分間反応させ、2N硫酸50μ!を各ウェルに添加
して呈色反応を停止し、それぞれの吸光度をマイクロプ
レートリーダー(Btotec社、 EL−310)を
用いて490 mで測定した。このような間接ELIS
A法により合成ペプチドに反応する抗体の存在が確認さ
れたウェルについて、測定値の高い順にハイブリドーマ
を取り出し24ウエル培養用プレートに移して上述と同
様の培養を行った。
(6)クローニング
このように選別された陽性のハイブリドーマは通常の軟
寒天2重層法を用いて24ウエルプレート中で単個細胞
を2週間増殖させ、成育したクローンを取り出すことに
より純化した。更に、上記と同様のスクリーニングを適
宜繰り返すことにより抗原ペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマを樹立した。
寒天2重層法を用いて24ウエルプレート中で単個細胞
を2週間増殖させ、成育したクローンを取り出すことに
より純化した。更に、上記と同様のスクリーニングを適
宜繰り返すことにより抗原ペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマを樹立した。
第1表は樹立したハイブリドーマの法名およびオフタロ
ニー法により決定された各イムノグロブリンクラスであ
る。
ニー法により決定された各イムノグロブリンクラスであ
る。
第1表
(7)モノクローナル抗体の産生及び精製免疫に用いた
マウスと同系であるマウスの腹腔内に樹立したハイブリ
ドーマを107細胞ずつ投与した。投与したハイブリド
ーマは15〜20日間程で腹水腫瘍を形成し、腹腔中か
ら抗体活性の高い抗体を含む腹水が大量に得られた。
マウスと同系であるマウスの腹腔内に樹立したハイブリ
ドーマを107細胞ずつ投与した。投与したハイブリド
ーマは15〜20日間程で腹水腫瘍を形成し、腹腔中か
ら抗体活性の高い抗体を含む腹水が大量に得られた。
次に、採取した腹水は陽イオン交換クロマトグラフィー
にかけて抗体成分を分取した。
にかけて抗体成分を分取した。
第1図は第1表で示したハイブリドーマのうち226を
精製した際に溶出されて得られた各吸着画分を280論
の波長による吸光度で分析したときのフラクションパタ
ーンである。横軸に腹水を添加してからの時間、縦軸に
吸光度を示した。又、図には各吸着画分に対応するピー
クにそれぞれ番号1〜6を付けた。
精製した際に溶出されて得られた各吸着画分を280論
の波長による吸光度で分析したときのフラクションパタ
ーンである。横軸に腹水を添加してからの時間、縦軸に
吸光度を示した。又、図には各吸着画分に対応するピー
クにそれぞれ番号1〜6を付けた。
第2図は第1図に示したフラクションパターンの各ピー
ク部分1〜6を各々5O3−PAGEポリアクリルアミ
ド電気泳動法にて分析した結果であり、左側の2列は分
子tm準物質とカラム添加前のハイブリドーマの原液に
よる結果である。第2図を比較検討することによりピー
ク3に抗体が含まれていることが判明した。
ク部分1〜6を各々5O3−PAGEポリアクリルアミ
ド電気泳動法にて分析した結果であり、左側の2列は分
子tm準物質とカラム添加前のハイブリドーマの原液に
よる結果である。第2図を比較検討することによりピー
ク3に抗体が含まれていることが判明した。
(8)モノクローナル抗体の性状
第3図は第1表に示した各ハイブリドーマの培養上清に
よる合成ペプチドとの反応を各希釈系列の培養上清につ
いて得た濃度反応曲線である。ハイブリドーマがlXl
0’個/d以上に生育した培養液より、D−MEMに5
%FBSを加えた希釈液を用いて3倍毎の希釈系列を作
成し、それぞれtoopxずつスクリーニング時と同様
のELISAプレートに移して反応させた。
よる合成ペプチドとの反応を各希釈系列の培養上清につ
いて得た濃度反応曲線である。ハイブリドーマがlXl
0’個/d以上に生育した培養液より、D−MEMに5
%FBSを加えた希釈液を用いて3倍毎の希釈系列を作
成し、それぞれtoopxずつスクリーニング時と同様
のELISAプレートに移して反応させた。
第3図の各グラフの横軸には段階的な希釈系列を示し、
縦軸には各希釈系列における反応液の吸光度(波長49
0nm )を示した。図中記号・は合成ペプチドを固相
したELISAプレートを使用したときの結果を表し、
記号Oはコントロールとして合成ペプチドを添加する工
程のみを省いて作成した同様のELISAプレートを使
用したときの結果を表す、各同右上の表示はハイブリド
ーマの法名である0合成ペプチドを固定したプレートで
はどの反応曲線も合成ペプチドに対して特異性を示して
いるが、2E6.3Ell、 4 Hllの3つのイ
ムノグロブリンIgG株はウェル表面にブロックされて
いるBSAには反応せず非特異吸着は見られないのに対
し、他の1gM株はBSAにも弱い吸着を示した。
縦軸には各希釈系列における反応液の吸光度(波長49
0nm )を示した。図中記号・は合成ペプチドを固相
したELISAプレートを使用したときの結果を表し、
記号Oはコントロールとして合成ペプチドを添加する工
程のみを省いて作成した同様のELISAプレートを使
用したときの結果を表す、各同右上の表示はハイブリド
ーマの法名である0合成ペプチドを固定したプレートで
はどの反応曲線も合成ペプチドに対して特異性を示して
いるが、2E6.3Ell、 4 Hllの3つのイ
ムノグロブリンIgG株はウェル表面にブロックされて
いるBSAには反応せず非特異吸着は見られないのに対
し、他の1gM株はBSAにも弱い吸着を示した。
第4図は合成ペプチドを変量とした場合の上記ELIS
Aの結果である。即ち、合成ペプチドLOug/dから
2倍ずつの希釈系列を作成してそれぞれの100μlを
用いてプレートに固相することにより各ウェルにおける
固相量は段階的に1 、0.5.0.25.0.125
.0.0625.0.03125゜0.0156a 1
/ウェルとした。このような固相化ウェルに各種ハイ
ブリドーマ上清を100μ!ずつ反応させ、波長490
nmによる吸光度を調べた。
Aの結果である。即ち、合成ペプチドLOug/dから
2倍ずつの希釈系列を作成してそれぞれの100μlを
用いてプレートに固相することにより各ウェルにおける
固相量は段階的に1 、0.5.0.25.0.125
.0.0625.0.03125゜0.0156a 1
/ウェルとした。このような固相化ウェルに各種ハイ
ブリドーマ上清を100μ!ずつ反応させ、波長490
nmによる吸光度を調べた。
図の横軸は合成ペプチドの固相量、縦軸は吸光度である
0図の縦軸の記号**ネに示すレベルは検出限界であり
、それ以上の値は検出できないことを示す、第4図に表
した結果から、測定した7株のバイプリドーマ上清の全
てが固相した合成ペプチドに対し定量的に反応したが、
特に3E11.2B6,4H11の1.0株では感度の
高い定量性を示した。
0図の縦軸の記号**ネに示すレベルは検出限界であり
、それ以上の値は検出できないことを示す、第4図に表
した結果から、測定した7株のバイプリドーマ上清の全
てが固相した合成ペプチドに対し定量的に反応したが、
特に3E11.2B6,4H11の1.0株では感度の
高い定量性を示した。
第5図はHIVの各種蛋白に対する特異性を調べるため
の公知のウェスタンブロッティング法による結果である
。ウェスタンブロッティングにはr Imwunobl
ot As5ay J (Bio−rad社、カタログ
番号197−1001 )をキットとして用い各サンプ
ルと対応させることによりバンドパターンを調べた。尚
、キットは各HIV構成蛋白を分子量順の分画に電気泳
動した像をニトロセルロース上に転写したストリップよ
り成る。又、マウス由来の本発明の抗体に対する2次抗
体にはヤギ抗マウスIgG&Mを適用し、その他試薬及
び使用方法はキットの内容に従った0図のサンプルは左
から順に2E6,3E11,4H11の各IgG株のハ
イプリドーマ培養上清及び腹水であり、1gM株からは
例として3F5による腹水を用いた。更に、右の3つの
サンプルは、陽性標準としてのエイズ患者血清より反応
性の低いサンプルと高いサンプルの2検体及び陰性標準
としての新鮮な培養液(90%D−MEM及び10%F
BSの混合溶液)を示す、縦軸の数字は分子量である。
の公知のウェスタンブロッティング法による結果である
。ウェスタンブロッティングにはr Imwunobl
ot As5ay J (Bio−rad社、カタログ
番号197−1001 )をキットとして用い各サンプ
ルと対応させることによりバンドパターンを調べた。尚
、キットは各HIV構成蛋白を分子量順の分画に電気泳
動した像をニトロセルロース上に転写したストリップよ
り成る。又、マウス由来の本発明の抗体に対する2次抗
体にはヤギ抗マウスIgG&Mを適用し、その他試薬及
び使用方法はキットの内容に従った0図のサンプルは左
から順に2E6,3E11,4H11の各IgG株のハ
イプリドーマ培養上清及び腹水であり、1gM株からは
例として3F5による腹水を用いた。更に、右の3つの
サンプルは、陽性標準としてのエイズ患者血清より反応
性の低いサンプルと高いサンプルの2検体及び陰性標準
としての新鮮な培養液(90%D−MEM及び10%F
BSの混合溶液)を示す、縦軸の数字は分子量である。
第5図かられかるように、2E6は培養上清、腹水共に
分子量41−43,000の分画(gp41 )に結合
しており、3E11は腹水のみ弱く結合し、4H11は
結合反応が検出されなかった。一方、1gM株の3F5
は全長に亘り非特異な吸着がみられgp41への特異性
はなかった。このように同じIgG株においても、22
6の抗体のみがgp41に強く結合していることがわか
る。
分子量41−43,000の分画(gp41 )に結合
しており、3E11は腹水のみ弱く結合し、4H11は
結合反応が検出されなかった。一方、1gM株の3F5
は全長に亘り非特異な吸着がみられgp41への特異性
はなかった。このように同じIgG株においても、22
6の抗体のみがgp41に強く結合していることがわか
る。
第6図は前記2E6の抗体が反応する合成ペプチドにお
ける認識部位及びエイズ患者血清中の抗体によるt!I
I! 識部位を反応阻害性により調べた結果である。患
者血清および正常人血清に対してヤギ血清20%を加え
たP B S 、PH7,2を用いて3倍ずつの希釈系
列を作った0次に、上述したELISAプレートと同様
にlウェル当たりLagずつの合成ペプチドを固相化し
たマイクロプレートの各2列に前記稀釈系列の患者およ
び正常人の血清をそれぞれ2ウエル毎に100pe/ウ
エル分注した。1時間の反応後、液を廃棄し、0.OI
M P B Sで3回洗浄した2次に、2E6のハイブ
リドーマ培養上清を100d/ウエルずつ均等に加えて
1時間反応させた。ここにおいて各1枚のプレートには
患者血清または正常人血清の稀釈列について2列ずつの
同一の処理がなされた状態にある0次に上記と同様の洗
浄を3回行った後、患者および正常人血清における前記
2列の同一処理した稀釈系列のウェルに対して、一方の
列には2B6抗体と反応するヤギ抗マウスIgGを、も
う一方の列には患者血清中の抗HIV抗体と反応するヤ
ギ抗ヒ)IgGをそれぞれペルオキシダーゼ標識の2次
抗体として加え、室温で1時間反応させた。反応後、上
述のELISAと同様にして各ウェルを洗浄し、基質反
応をさせて490n−の吸長での吸光度を示した。第6
図のグラフの横軸は患者または正常人血清の稀釈系列、
縦軸は吸光度を表す。
ける認識部位及びエイズ患者血清中の抗体によるt!I
I! 識部位を反応阻害性により調べた結果である。患
者血清および正常人血清に対してヤギ血清20%を加え
たP B S 、PH7,2を用いて3倍ずつの希釈系
列を作った0次に、上述したELISAプレートと同様
にlウェル当たりLagずつの合成ペプチドを固相化し
たマイクロプレートの各2列に前記稀釈系列の患者およ
び正常人の血清をそれぞれ2ウエル毎に100pe/ウ
エル分注した。1時間の反応後、液を廃棄し、0.OI
M P B Sで3回洗浄した2次に、2E6のハイブ
リドーマ培養上清を100d/ウエルずつ均等に加えて
1時間反応させた。ここにおいて各1枚のプレートには
患者血清または正常人血清の稀釈列について2列ずつの
同一の処理がなされた状態にある0次に上記と同様の洗
浄を3回行った後、患者および正常人血清における前記
2列の同一処理した稀釈系列のウェルに対して、一方の
列には2B6抗体と反応するヤギ抗マウスIgGを、も
う一方の列には患者血清中の抗HIV抗体と反応するヤ
ギ抗ヒ)IgGをそれぞれペルオキシダーゼ標識の2次
抗体として加え、室温で1時間反応させた。反応後、上
述のELISAと同様にして各ウェルを洗浄し、基質反
応をさせて490n−の吸長での吸光度を示した。第6
図のグラフの横軸は患者または正常人血清の稀釈系列、
縦軸は吸光度を表す。
図中記号・は上記ELISAプレートに対し患者血清を
反応させた後に2E6と反応させた結果であり、記号O
は上記ELISAプレートに対し正常人血清を反応させ
た後に286と反応させた結果である。又、図の実線は
2次抗体としてヤギ抗マウスIgGを加えたウェルによ
る結果を示し、点線は2次抗体としてヤギ抗ヒfigG
を加えたウェルによる結果を示している。第6図より合
成ペプチドの反応部位を患者血清中の抗HIV抗体でブ
ロッキングした場合と反応部位をブロッキングしない正
常血清の場合とでは2E6はいずれも合成ペプチドに結
合していることが分かった。このことは、患者血清中の
抗HIV抗体と2E6の抗体とがそれぞれ異なる反応部
位を介して合成ペプチドに結合することを示している。
反応させた後に2E6と反応させた結果であり、記号O
は上記ELISAプレートに対し正常人血清を反応させ
た後に286と反応させた結果である。又、図の実線は
2次抗体としてヤギ抗マウスIgGを加えたウェルによ
る結果を示し、点線は2次抗体としてヤギ抗ヒfigG
を加えたウェルによる結果を示している。第6図より合
成ペプチドの反応部位を患者血清中の抗HIV抗体でブ
ロッキングした場合と反応部位をブロッキングしない正
常血清の場合とでは2E6はいずれも合成ペプチドに結
合していることが分かった。このことは、患者血清中の
抗HIV抗体と2E6の抗体とがそれぞれ異なる反応部
位を介して合成ペプチドに結合することを示している。
換言すれば本実施例のモノクローナル抗体は抗HIV抗
体と合成ペプチドとの反応を妨げない。
体と合成ペプチドとの反応を妨げない。
第2表は本実施例のモノクローナル抗体群と不活化され
たHIVとの反応性を確認した結果である0反応には市
販のヒト血清スクリーニング用のELISAキット(パ
スツール社、製造番号7D224)を用いた。このキッ
トはエイズウィルスをそのまま固相化したウェルと固相
化しないウェルの2種類よりなる96ウエルマイクロプ
レートである。まず、本実施例の各モノクローナル抗体
群および反応性の異なるエイズ患者血清並びにコントロ
ールとしてのD−MEM培養液(10%血清を含む)を
それぞれ前記2種類のウェルに加えて反応させた0次に
、2次抗体以降の試薬としてはヒト血清用の本キットの
ものは用いず、第7図以前のELISAと同様のマウス
用試薬を用いて判定を行った0図から明らかなように、
患者血清はいずれもウィルス陽性ウェルに反応し陰性ウ
ェルには反応せずウィルス特異性を示したのに対し、本
実施例のマウスモノクローナル抗体は特に2E6゜3
Ell、 4 HllのIgG株でそれぞれ前記2種
類のウェルに対して陰性を示した。これはこれらIgG
株のモノクローナル抗体がHrVそのものには結合しな
いことを意味する。一方、その他IgM株は前記2種類
のウェルにおいて反応してしまい、HIMに対する特異
性はみられなかった。
たHIVとの反応性を確認した結果である0反応には市
販のヒト血清スクリーニング用のELISAキット(パ
スツール社、製造番号7D224)を用いた。このキッ
トはエイズウィルスをそのまま固相化したウェルと固相
化しないウェルの2種類よりなる96ウエルマイクロプ
レートである。まず、本実施例の各モノクローナル抗体
群および反応性の異なるエイズ患者血清並びにコントロ
ールとしてのD−MEM培養液(10%血清を含む)を
それぞれ前記2種類のウェルに加えて反応させた0次に
、2次抗体以降の試薬としてはヒト血清用の本キットの
ものは用いず、第7図以前のELISAと同様のマウス
用試薬を用いて判定を行った0図から明らかなように、
患者血清はいずれもウィルス陽性ウェルに反応し陰性ウ
ェルには反応せずウィルス特異性を示したのに対し、本
実施例のマウスモノクローナル抗体は特に2E6゜3
Ell、 4 HllのIgG株でそれぞれ前記2種
類のウェルに対して陰性を示した。これはこれらIgG
株のモノクローナル抗体がHrVそのものには結合しな
いことを意味する。一方、その他IgM株は前記2種類
のウェルにおいて反応してしまい、HIMに対する特異
性はみられなかった。
第2表
以上に示したような特異を持つことにより、本実施例の
モノクローナル抗体はHIV構成蛋白であるgp41を
特異的に認識する陽性標準用の抗体としてウェスタンブ
ロッティングやEIA等に利用できる。また、本モノク
ローナル抗体はマウスハイブリドーマ由来であることか
ら、現在検査室で懸念されているような患者血清の使用
によるバイオハザードの心配もな(、しかも大量生産も
容易なため慢性状態にある標準サンプルの不足を解消す
ることができる。
モノクローナル抗体はHIV構成蛋白であるgp41を
特異的に認識する陽性標準用の抗体としてウェスタンブ
ロッティングやEIA等に利用できる。また、本モノク
ローナル抗体はマウスハイブリドーマ由来であることか
ら、現在検査室で懸念されているような患者血清の使用
によるバイオハザードの心配もな(、しかも大量生産も
容易なため慢性状態にある標準サンプルの不足を解消す
ることができる。
第7図は本実施例のモノクローナル抗体を利用した免疫
反応の模式図である。図に示すように本実施例のモノク
ローナル抗体は免疫原の合成ペプチドを抗HIV抗体に
対するのとは異なる反応部位で結合して複合体を形成す
るので、この複合体におけるモノクローナル抗体を反応
容器等に固相化すれば、合成ペプチドにおける抗HIV
抗体との反応部位は隠されることがない、即ち、合成ペ
プチドを直接固相した場合、ペプチドは抗HIV抗体と
の反応部位も含めて全(不均一に付着されるのに比べて
、本性ではペプチドが均一に固定される。従って、本実
施例のモノクローナル抗体によれば公知の凝集試験やE
IAに応用することにより、効率良く安定した抗HIV
抗体の検出を行うことができる。
反応の模式図である。図に示すように本実施例のモノク
ローナル抗体は免疫原の合成ペプチドを抗HIV抗体に
対するのとは異なる反応部位で結合して複合体を形成す
るので、この複合体におけるモノクローナル抗体を反応
容器等に固相化すれば、合成ペプチドにおける抗HIV
抗体との反応部位は隠されることがない、即ち、合成ペ
プチドを直接固相した場合、ペプチドは抗HIV抗体と
の反応部位も含めて全(不均一に付着されるのに比べて
、本性ではペプチドが均一に固定される。従って、本実
施例のモノクローナル抗体によれば公知の凝集試験やE
IAに応用することにより、効率良く安定した抗HIV
抗体の検出を行うことができる。
尚、本発明は上述した実施例に限られることなく、適宜
変更が可能である0例えば免疫原には上述した21個の
アミノ酸配列をもつ合成ペプチドに他のアミノ酸配列を
もつペプチドを追加したものを用いても良い。又、本実
施例では免疫原を投与する際にPVPのような特定のキ
ャリアを媒体として用いたが、適当なアジュバント(例
えばフロイントの完全アジュバント)とともに免疫して
もよい、又、融合にはマウス骨髄腫細胞P3 X 63
− Ag8.653を用いたが、他の種々の公知なミエ
ローマ細胞を使用してもよい。
変更が可能である0例えば免疫原には上述した21個の
アミノ酸配列をもつ合成ペプチドに他のアミノ酸配列を
もつペプチドを追加したものを用いても良い。又、本実
施例では免疫原を投与する際にPVPのような特定のキ
ャリアを媒体として用いたが、適当なアジュバント(例
えばフロイントの完全アジュバント)とともに免疫して
もよい、又、融合にはマウス骨髄腫細胞P3 X 63
− Ag8.653を用いたが、他の種々の公知なミエ
ローマ細胞を使用してもよい。
又、クローニングの手段には軟寒天2重層法の他に公知
の限界希釈法等が使用できる。
の限界希釈法等が使用できる。
〔本発明の効果]
本発明のモノクローナル抗体によれば、H[vl成蛋白
であるgp41に反応するので、ウェスタンブロッティ
ングまたはEIA等の陽性基準として使用でき、かつハ
イブリドーマ由来であるため検査中のバイオハザードの
心配がない。
であるgp41に反応するので、ウェスタンブロッティ
ングまたはEIA等の陽性基準として使用でき、かつハ
イブリドーマ由来であるため検査中のバイオハザードの
心配がない。
又、HIVそのものには反応しないため、ウィルスの破
壊状況、 gp41の露出状況等を検出して分析するた
めに有効に使用することができる。
壊状況、 gp41の露出状況等を検出して分析するた
めに有効に使用することができる。
第1図は第1表で示したハイブリドーマのうちE6と命
名されたハイブリドーマをDEAEカラムクロマトグラ
フィーで分画して得られたフラクションパターンを示す
グラフ、 第2図は第1図で得られたフラクションパターンの各ピ
ーク部分の5DS−PAGEポリアクリルアミドゲル電
気床動像の写真、 第3図は各種ハイブリドーマの培養上清の各希釈系列に
よる合成ペプチドとのELISA反応の結果を示すグラ
フ、 第4図は各希釈系列の合成ペプチドに対する各バイブリ
ドーマの培養上清のELISA反応の結果を示すグラフ
、 第5図は各種ハイブリドーマの培養上清と腹水、及びエ
イズ患者血清によるウェスタンブロッティングの結果を
示す写真、 第6図は合成ペプチドとエイズ患者血清との反応に対す
るハリブリドーマ2E6が産生じた抗体の反応阻害性を
示すグラフ、 第7図は本実施例のモノクローナル抗体を介して合成ペ
プチドを固相化した抗HIV抗体検出法における抗HI
V抗体の結合状態を示す模式図である。
名されたハイブリドーマをDEAEカラムクロマトグラ
フィーで分画して得られたフラクションパターンを示す
グラフ、 第2図は第1図で得られたフラクションパターンの各ピ
ーク部分の5DS−PAGEポリアクリルアミドゲル電
気床動像の写真、 第3図は各種ハイブリドーマの培養上清の各希釈系列に
よる合成ペプチドとのELISA反応の結果を示すグラ
フ、 第4図は各希釈系列の合成ペプチドに対する各バイブリ
ドーマの培養上清のELISA反応の結果を示すグラフ
、 第5図は各種ハイブリドーマの培養上清と腹水、及びエ
イズ患者血清によるウェスタンブロッティングの結果を
示す写真、 第6図は合成ペプチドとエイズ患者血清との反応に対す
るハリブリドーマ2E6が産生じた抗体の反応阻害性を
示すグラフ、 第7図は本実施例のモノクローナル抗体を介して合成ペ
プチドを固相化した抗HIV抗体検出法における抗HI
V抗体の結合状態を示す模式図である。
Claims (1)
- 1、ヒト免疫不全ウィルスHIVの膜蛋白gp41由来
のアミノ酸配列の一部に一致する合成ペプチドをヒト以
外の動物に免疫し免疫後の該動物の脾細胞と骨髄腫細胞
との融合細胞から産生されるモノクローナル抗体であっ
て、HIV本体には反応せず、膜蛋白gp41と反応す
ることを特徴とするHIV構成蛋白に対するモノクロー
ナル抗体。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63247215A JPH0292298A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | Hiv構成蛋白に対するモノクローナル抗体 |
GB8921589A GB2223226B (en) | 1988-09-30 | 1989-09-25 | A monoclonal antibody against synthetic peptide |
DE19893932461 DE3932461A1 (de) | 1988-09-30 | 1989-09-28 | Monoklonaler antikoerper gegen ein synthetisches peptid und verfahren zu dessen herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63247215A JPH0292298A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | Hiv構成蛋白に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0292298A true JPH0292298A (ja) | 1990-04-03 |
Family
ID=17160160
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63247215A Pending JPH0292298A (ja) | 1988-09-30 | 1988-09-30 | Hiv構成蛋白に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0292298A (ja) |
DE (1) | DE3932461A1 (ja) |
GB (1) | GB2223226B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19622088A1 (de) * | 1996-05-31 | 1997-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Anti-HIV-Antikörper als Kontrollproben |
CN1339319A (zh) * | 2000-08-18 | 2002-03-13 | 清华大学 | 一种治疗艾滋病的药物及其制备方法 |
JP2019509046A (ja) | 2015-12-05 | 2019-04-04 | サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ヴォドアCentre Hospitalier Universitaire Vaudois | Hiv結合剤 |
WO2020012435A1 (en) | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Lausanne University Hospital | Hiv binding agents |
JP2022541900A (ja) | 2019-07-15 | 2022-09-28 | ローザンヌ ユニヴァーシティ ホスピタル | Hiv結合剤 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
JP2702911B2 (ja) * | 1985-09-11 | 1998-01-26 | ユナイテツド・バイオメデイカル・インコ−ポレ−テツド | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 |
IE63109B1 (en) * | 1986-06-23 | 1995-03-22 | Genetic Systems Corp | Human monoclonal antibody to lymphadenopathy-associated virus |
WO1988005824A1 (en) * | 1987-02-02 | 1988-08-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Selection of monoclonal antibodies to viral glycoproteins |
NO881151L (no) * | 1987-03-27 | 1988-09-28 | Syntello Ab | Syntetisk hiv-1-antigen. |
GB8714802D0 (en) * | 1987-06-24 | 1987-07-29 | Proteus Biotech Ltd | Synthetic polypeptides |
AU608413B2 (en) * | 1988-03-30 | 1991-03-28 | Abbott Laboratories | Mouse monoclonal antibody (5-21-3) to human immunodeficiency virus gp41 protein |
-
1988
- 1988-09-30 JP JP63247215A patent/JPH0292298A/ja active Pending
-
1989
- 1989-09-25 GB GB8921589A patent/GB2223226B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 DE DE19893932461 patent/DE3932461A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8921589D0 (en) | 1989-11-08 |
GB2223226B (en) | 1992-10-28 |
GB2223226A (en) | 1990-04-04 |
DE3932461A1 (de) | 1990-04-05 |
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