JPH0292298A - Ｈｉｖ構成蛋白に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の分析等に使
用されるモノクローナル抗体であり、特に種々のエイズ
検査用キットにおける安全性に優れた陽性標準として使
用でき、かつＨＩＶの基礎研究にも応用可能なモノクロ
ーナル抗体の樹立に関するものである。

〔従来の技術〕

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）は１９８１
年アメリカにおいて初めて報告された（Ｇｏｔｔｌ　ｉ
ａｂ、　Ｍ、Ｓ、　　ら、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、
Ｍｉ、　１４２５（１９８１）参照〕、この疾患は、現
在ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）と呼ばれているレト
ロウィルスによって感染すると考えられている（Ｃｏｆ
ｆｉｎ、Ｊ、ら、Ｓ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ　、　■
Ｌ６９７　（１９８６）参照〕。

従来、血清中のＨＩＶに対する抗体を検出する確定検査
として、ＨＩＶを電気泳動にかけてｇｐ１２０、ｇｐ４
１．ｐ２４．ｐｌＢ等の構成蛋白に分画し、これらをニ
トロセルロース膜に転写してストリップを作成し、この
ストリップをヒト血清と反応させて酵素免疫測定（ＥＩ
Ａ）を行うウェスタンブロッティング法が用いられてい
る。この方法では予め抗ＨＩＶ抗体の存在が既知である
エイズ患者血清を非動不活化して陽性標準として使用し
ている（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社　インストラクションマニュ
アル（１９８７）参照〕、シかしながら、エイズ患者血
清由来の抗体を利用する際、安定して多量に抗体を得る
ことは困難を要する。このため近年よりＨＩｖそのもの
をマウスに免疫し、免疫後の牌細胞を摘出した後、適当
な骨髄腫（ミエローマ）ａｌｌ胞と融合させて融合細胞
（ハイプリドーマ）とし、この融合細胞を培養すること
によりＨＩＶに特異的な結合反応を示すモノクローナル
抗体を大量に得る試みが数多くなされている０例えば、
Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｓ、Ｃ，Ｆｕｎｇら、Ｂｌｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、５．９４０．　（１９Ｂ？）のように）
ＩＩＶの構成蛋白のひとつであるｇｐ１２０対するモノ
クローナル抗体の報告やｐ２４に対する抗体について報
告されている。ところで、米国特許第４．５２０．１１
３号公報には、エイズ及びブリ・エイズ（Ｐｒｏ−ＡＩ
ＤＳ）患者の血清中に検出される抗体の持つ反応性また
は特異性が主にＨＩＶのエンベロープ抗原を構成する蛋
白質ｇｐ４１に対して向けられていることが指摘されて
いる。そこで、Ｊａｍｅｓ　Ｊ、ＧＪａｎｇら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ！、ＬＩＳＡ＋ＪＬ１．
６１５９（１９８６）では、ｇｐ４ｔを構成する蛋白よ
りエイズ患者血清中の抗体に対して高免疫原性を有する
アミノ酸領域を検討し、その結果エンベロープ抗原の５
８４−６０４番目のアミノ酸を構成する以下の２１個の
配列をもつペプチドを特定化している。　Ａｒｇ−１１
ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−
Ｌｕｅ−Ｌｕｅ−Ｇ　ｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉｙ
−Ｃｙｓ−３ｅｒ　（Ａｌａ−アラニン、　Ａｒｇ＝ア
ルギニン。

Ａａｐ＊アスパラギン酸、　Ｃｙｓ−システィン、　Ｇ
１ｎ＝＝グルタミン、　Ｇｌｕ−グルタミ°ン酸、　Ｇ
ｌｙ・グリシン。

１１ｅ−イソロイシン、　Ｌｅｕ＋−ロイシン、　Ｌｙ
ｓ＝リジン。

Ｓｅｒ・セリン、　Ｔｒｐ・トリプトファン１↑ｙｒ＝
チロシン、　Ｖａｌ−バリン） 又、この報告の中で、Ｊａｍｅｓ　Ｊ、Ｇ、Ｗａｎｇら
はかかる配列をもつ合成ペプチドを用いて直接反応容器
等に面相化することにより、血清中の抗Ｈ！■抗体を特
異的かつ感度良く検出している。

〔発明が解決しようとする課題〕

′従来のＨＩＶ検出演出法いてＥＩＡ、ウェスが多く、
非動不活化してはいるが、検査者等にとっでは尚も感染
の危険が残る。その上、患者血清の絶対量も不足しがち
である。又、ＨＩＶそのものを免疫原として作成したマ
ウスモノクローナル抗体には現在ｇｐ１２０やｐ２４に
対するものが種々報告されているが、ウィルス膜中に埋
没した形態で存在するｇ９４１に対して特異性を有する
抗体は得られていない、このため、ｇｐ４ｔがＨＩＶの
感染及び９因発現の探究に多大な重要性を有しているに
も拘らず、ＨＩ　Ｖ構成蛋白の中で最も分析および研究
が遅れている。

以上の問題点に着目して、ＨＩＶ蛋白ｇｐ４１に特異的
なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段および作用〕本発明では、
感染の恐れのある天然のＨＩＶは一切用いず、ＨＩＭの
膜蛋白ｇｐ４１由来のアミノ酸配列の一部に一部する合
成ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製す
る。

その際、合成ペプチドをヒト以外の動物１例えばマウス
のような哺乳類に投与して免疫し、その後該動物よりリ
ンパ球細胞として牌細胞を取り出し、無限増殖能をもつ
骨髄腫（ミエローマ）細胞と細胞融合させる。ここで融
合に用いる手段にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
のような融合促進剤を使用する方法（にｏｈｅｌｅｒ　
Ｇ。

ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、」旦
、４９５＋　（１９７５）’参照）や、電気パルスを利
用した融合方法（ｔｌ。

Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｖｉｅｎｋｅｎ、
　Ｊ、Ｍｅｎｂ？ａｎｅ　Ｂｉｏｌ。

■、　１６５．　（１９８２）参照）等がある。

本発明のモノクローナル抗体は天然のウィルス蛋白を免
疫原とする場合と異なり、ウィルス本体とは反応せず、
ＨＩＶの膜蛋白ｇｐ４１由来のアミノ酸の一部に反応し
てｇｐ４１と結合する。

（実施例〕 本発明を実施例に基いて説明する。

まず、免疫原には以下のアミノ酸配列よりなる合成ペプ
チドを用いた。Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−ＡｌａＶａｌ
−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（Ａ１ａ＝アラニン。

Ａｒｇ−アルギニン、＾ｓｐ＝アスパラギン酸、　Ｃｙ
ｓ＝システィン、　Ｇｌｎ−グルタミン、　Ｇｌｕ−グ
ルタミン酸。

ｃｒｙ−グリシン、　１１ｅ＝イソロイシン＋　Ｌｅｕ
＝ロイシン、　　Ｌｙｓ・リジン、　　５ｅｒ−セリン
＊ＴｒｐｃＦリプトファン、　Ｔｙｒ−チロシン、　Ｖ
ａｌ・バリン）（１）肺細胞の調整 まず、上記合成ペプチド１００μｇを特定のキャリアを
媒体として動物に投与した。即ち、ポリビニルピロリド
ン（Ｐ　Ｖ　Ｐ　）　　１００μ２と混合溶解させ、こ
れを６週令の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（チャールズリバー
■より入手）の腹腔内に注射して免疫した＃　１か月後
、同様の腹腔内注射を行って追加免疫をして、更に１か
月後に背皮下９尾静脈、眼等に分散して同様の注射を行
ない、その４日後にＢＡＬＢ／Ｃマウスより肺臓を摘出
して以下の調製を行った。まず、摘出した肺臓をＤ　−
Ｍ　Ｅ　Ｍ　　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ旧１１ｍａｌＥ
ｓｓｅｎｔｌａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）培養液中で数回振っ
て余分な脂肪塊等を洗い落とした０次に、Ｄ−ＭＥＭ培
養液１０−を入れたベトリ皿に肺臓を移し、大きく４つ
程度に切断した後、ピンセットによりリンパ球を押し出
した。リンパ球を含んだＤ−ＭＥＭ培養液をステンレス
メツシュを通して組織塊を濾過して取り除くことにより
リンパ球浮遊液を調製した。

（２）融合細胞およびＰＥＧ溶液の調製融合に用いるミ
エローマはマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｘ６３−ＡＪＩ　８．
６５３　（環ＡＴＣＣ番号　ＣＲＬ−１５８０）を使用
した。大型培養＠（１５０ｄ）　ニ成育シタミエローマ
５Ｘ１０？個を遠心管に移して１２００ｒ、ｐ、ｍ、で
５分間遠心して細胞を集め、これを血清を含まないＤ−
ＭＥＭ培養培養液１巾浮遊させた後、肺細胞２Ｘ１０”
個を含む上記リンパ球浮遊液を混合して再度１２０Ｏｒ
ｐｏ＋で５分間遠心して融合に備えた。

次に、融合に用いるポリエチグレングリコール（ＰＥＧ
）溶液は次のように調製した。ＰＥＧ（メルク５９７２
７）　１　ｇをガラス試験管に取り、これにアルミ栓を
してオートクレーブにかけた後６０℃まで冷まし、更に
４５℃に加温したＤ−ＭＥＭ培養液を１１ｄ加え、攪拌
して４５゛ｃの温浴中で保存した。

（３）融合作業 遠心した融合細胞の上清を出来るだけ取り除き、上記Ｐ
ＥＧ１液ｌＩｄを１分間でピペットにより滴下した．こ
の間、遠心管は激しく振とうして細胞沈渣を充分はぐし
た０次に遠心管を振り続けて１分間の攪拌を行ない融合
を促進させた０次の１分間でＤ−ＭＥＭ培養液ＩＩｄｌ
を滴下した後ピペットを交換して更に１ｄ滴下した。

このようにＰＥＧを徐々に薄めた後更にＤ−ＭＥＭ溶液
８ＩＩ！ｌを２分間で滴下することにより一気にＰＥＧ
を希釈して融合作業を終えた。

（４）ハイプリドーマの培養 融合を終了した遠心管中の細胞浮遊液は１２００ｒｐｍ
で５分間遠心した後、上清を廃棄して、ハイブリドーマ
増殖用ＨＡＴ培地（７０％ＤーＭＥＭｍ液．２０％牛脂
児血清，　１０％ＮＣＴＣ培地の混合液にヒボキサンチ
ン１３．６１Ｍｇ／戚．チミジン３．８８μｇ／ｙｍ．
アミノプリテン０．１７６μｇ／ｄを含む）３０ｄに浮
遊させ、これを１００μ２ずつ９６マイクロプレ一ト３
枚の各ウェルに分注して５％ＣＧ！　３７℃のインキュ
ベーター中で培養した．培養４日目にＨＡＴ培地を１０
０μ２ずつ各ウェルに添加し、更に培養７日目および１
００日目各ウェル１００μｉずつ新鮮なＨＡＴ培地に交
換する．培ｌ１１５日目頃に各ウェルに育成して来たハ
イプリドーマがコロニーを形成した時点でスクリーニン
グにより免疫原である合成ペプチドに対する特異性を調
べた。

（５）スリーニング ＥＬＩＳＡ用９６ウエル平底プレート（Ｎｕｎｃ　：４
−６８６６７　）を用意し各ウェルに合成ペプチドをＩ
ＩＩｇずつ分注し３７℃で１時間静置して固相化した．
各ウェルを０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回
洗浄し、更に３％のＢＳＡを含んだＯ．ＧＩＭＰＢＳを
それぞれ１００μｌずつ加えて再び３７“Ｃで１時間静
置し、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０、０１
Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　、ＰＨ７．５で３回洗浄した．このよ
うに所定量の合成ペプチドを固相化したブレートノ各つ
ェルに培養中のプレートの各ウェルより１００ｕｊ！の
培養上清をそれぞれ移し室温で１時間静置した０次に、
Ｔｗｅａｎ２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓ液で４回洗Ｓおよび５％
のＴｗｅｅｎ２０を含んだ０．ＯＩＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　。

Ｐ１１７．２により１０００倍に希釈してこれを１００
ｐｌずつ各ウェルに分注した。室温で１時間静置した後
、Ｔｈｅｅｎ２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓ液で４回洗浄し、次い
でオルソフエニルジアミン（ＯＰＤ）１．５μｌ／ｄを
０．１Ｍクエン酸緩衝液、ＰＨ５，５に溶かし、３０％
の過酸化水素１μｍ７ｄ４を加えたものを１００μｌず
つ各ウェルに分注した。室温の暗所にて静置して１５〜
３０分間反応させ、２Ｎ硫酸５０μ！を各ウェルに添加
して呈色反応を停止し、それぞれの吸光度をマイクロプ
レートリーダー（Ｂｔｏｔｅｃ社、　ＥＬ−３１０）を
用いて４９０　ｍで測定した。このような間接ＥＬＩＳ
Ａ法により合成ペプチドに反応する抗体の存在が確認さ
れたウェルについて、測定値の高い順にハイブリドーマ
を取り出し２４ウエル培養用プレートに移して上述と同
様の培養を行った。

（６）クローニング このように選別された陽性のハイブリドーマは通常の軟
寒天２重層法を用いて２４ウエルプレート中で単個細胞
を２週間増殖させ、成育したクローンを取り出すことに
より純化した。更に、上記と同様のスクリーニングを適
宜繰り返すことにより抗原ペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマを樹立した。

第１表は樹立したハイブリドーマの法名およびオフタロ
ニー法により決定された各イムノグロブリンクラスであ
る。

第１表 （７）モノクローナル抗体の産生及び精製免疫に用いた
マウスと同系であるマウスの腹腔内に樹立したハイブリ
ドーマを１０７細胞ずつ投与した。投与したハイブリド
ーマは１５〜２０日間程で腹水腫瘍を形成し、腹腔中か
ら抗体活性の高い抗体を含む腹水が大量に得られた。

次に、採取した腹水は陽イオン交換クロマトグラフィー
にかけて抗体成分を分取した。

第１図は第１表で示したハイブリドーマのうち２２６を
精製した際に溶出されて得られた各吸着画分を２８０論
の波長による吸光度で分析したときのフラクションパタ
ーンである。横軸に腹水を添加してからの時間、縦軸に
吸光度を示した。又、図には各吸着画分に対応するピー
クにそれぞれ番号１〜６を付けた。

第２図は第１図に示したフラクションパターンの各ピー
ク部分１〜６を各々５Ｏ３−ＰＡＧＥポリアクリルアミ
ド電気泳動法にて分析した結果であり、左側の２列は分
子ｔｍ準物質とカラム添加前のハイブリドーマの原液に
よる結果である。第２図を比較検討することによりピー
ク３に抗体が含まれていることが判明した。

（８）モノクローナル抗体の性状 第３図は第１表に示した各ハイブリドーマの培養上清に
よる合成ペプチドとの反応を各希釈系列の培養上清につ
いて得た濃度反応曲線である。ハイブリドーマがｌＸｌ
０’個／ｄ以上に生育した培養液より、Ｄ−ＭＥＭに５
％ＦＢＳを加えた希釈液を用いて３倍毎の希釈系列を作
成し、それぞれｔｏｏｐｘずつスクリーニング時と同様
のＥＬＩＳＡプレートに移して反応させた。

第３図の各グラフの横軸には段階的な希釈系列を示し、
縦軸には各希釈系列における反応液の吸光度（波長４９
０ｎｍ　）を示した。図中記号・は合成ペプチドを固相
したＥＬＩＳＡプレートを使用したときの結果を表し、
記号Ｏはコントロールとして合成ペプチドを添加する工
程のみを省いて作成した同様のＥＬＩＳＡプレートを使
用したときの結果を表す、各同右上の表示はハイブリド
ーマの法名である０合成ペプチドを固定したプレートで
はどの反応曲線も合成ペプチドに対して特異性を示して
いるが、２Ｅ６．３Ｅｌｌ、　　４　Ｈｌｌの３つのイ
ムノグロブリンＩｇＧ株はウェル表面にブロックされて
いるＢＳＡには反応せず非特異吸着は見られないのに対
し、他の１ｇＭ株はＢＳＡにも弱い吸着を示した。

第４図は合成ペプチドを変量とした場合の上記ＥＬＩＳ
Ａの結果である。即ち、合成ペプチドＬＯｕｇ／ｄから
２倍ずつの希釈系列を作成してそれぞれの１００μｌを
用いてプレートに固相することにより各ウェルにおける
固相量は段階的に１　、０．５．０．２５．０．１２５
．０．０６２５．０．０３１２５゜０．０１５６ａ　１
　／ウェルとした。このような固相化ウェルに各種ハイ
ブリドーマ上清を１００μ！ずつ反応させ、波長４９０
ｎｍによる吸光度を調べた。

図の横軸は合成ペプチドの固相量、縦軸は吸光度である
０図の縦軸の記号＊＊ネに示すレベルは検出限界であり
、それ以上の値は検出できないことを示す、第４図に表
した結果から、測定した７株のバイプリドーマ上清の全
てが固相した合成ペプチドに対し定量的に反応したが、
特に３Ｅ１１．２Ｂ６，４Ｈ１１の１．０株では感度の
高い定量性を示した。

第５図はＨＩＶの各種蛋白に対する特異性を調べるため
の公知のウェスタンブロッティング法による結果である
。ウェスタンブロッティングにはｒ　Ｉｍｗｕｎｏｂｌ
ｏｔ　Ａｓ５ａｙ　Ｊ　（Ｂｉｏ−ｒａｄ社、カタログ
番号１９７−１００１　）をキットとして用い各サンプ
ルと対応させることによりバンドパターンを調べた。尚
、キットは各ＨＩＶ構成蛋白を分子量順の分画に電気泳
動した像をニトロセルロース上に転写したストリップよ
り成る。又、マウス由来の本発明の抗体に対する２次抗
体にはヤギ抗マウスＩｇＧ＆Ｍを適用し、その他試薬及
び使用方法はキットの内容に従った０図のサンプルは左
から順に２Ｅ６，３Ｅ１１，４Ｈ１１の各ＩｇＧ株のハ
イプリドーマ培養上清及び腹水であり、１ｇＭ株からは
例として３Ｆ５による腹水を用いた。更に、右の３つの
サンプルは、陽性標準としてのエイズ患者血清より反応
性の低いサンプルと高いサンプルの２検体及び陰性標準
としての新鮮な培養液（９０％Ｄ−ＭＥＭ及び１０％Ｆ
ＢＳの混合溶液）を示す、縦軸の数字は分子量である。

第５図かられかるように、２Ｅ６は培養上清、腹水共に
分子量４１−４３，０００の分画（ｇｐ４１　）に結合
しており、３Ｅ１１は腹水のみ弱く結合し、４Ｈ１１は
結合反応が検出されなかった。一方、１ｇＭ株の３Ｆ５
は全長に亘り非特異な吸着がみられｇｐ４１への特異性
はなかった。このように同じＩｇＧ株においても、２２
６の抗体のみがｇｐ４１に強く結合していることがわか
る。

第６図は前記２Ｅ６の抗体が反応する合成ペプチドにお
ける認識部位及びエイズ患者血清中の抗体によるｔ！Ｉ
Ｉ！　識部位を反応阻害性により調べた結果である。患
者血清および正常人血清に対してヤギ血清２０％を加え
たＰ　Ｂ　Ｓ　、ＰＨ７，２を用いて３倍ずつの希釈系
列を作った０次に、上述したＥＬＩＳＡプレートと同様
にｌウェル当たりＬａｇずつの合成ペプチドを固相化し
たマイクロプレートの各２列に前記稀釈系列の患者およ
び正常人の血清をそれぞれ２ウエル毎に１００ｐｅ／ウ
エル分注した。１時間の反応後、液を廃棄し、０．ＯＩ
Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄した２次に、２Ｅ６のハイブ
リドーマ培養上清を１００ｄ／ウエルずつ均等に加えて
１時間反応させた。ここにおいて各１枚のプレートには
患者血清または正常人血清の稀釈列について２列ずつの
同一の処理がなされた状態にある０次に上記と同様の洗
浄を３回行った後、患者および正常人血清における前記
２列の同一処理した稀釈系列のウェルに対して、一方の
列には２Ｂ６抗体と反応するヤギ抗マウスＩｇＧを、も
う一方の列には患者血清中の抗ＨＩＶ抗体と反応するヤ
ギ抗ヒ）ＩｇＧをそれぞれペルオキシダーゼ標識の２次
抗体として加え、室温で１時間反応させた。反応後、上
述のＥＬＩＳＡと同様にして各ウェルを洗浄し、基質反
応をさせて４９０ｎ−の吸長での吸光度を示した。第６
図のグラフの横軸は患者または正常人血清の稀釈系列、
縦軸は吸光度を表す。

図中記号・は上記ＥＬＩＳＡプレートに対し患者血清を
反応させた後に２Ｅ６と反応させた結果であり、記号Ｏ
は上記ＥＬＩＳＡプレートに対し正常人血清を反応させ
た後に２８６と反応させた結果である。又、図の実線は
２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧを加えたウェルによ
る結果を示し、点線は２次抗体としてヤギ抗ヒｆｉｇＧ
を加えたウェルによる結果を示している。第６図より合
成ペプチドの反応部位を患者血清中の抗ＨＩＶ抗体でブ
ロッキングした場合と反応部位をブロッキングしない正
常血清の場合とでは２Ｅ６はいずれも合成ペプチドに結
合していることが分かった。このことは、患者血清中の
抗ＨＩＶ抗体と２Ｅ６の抗体とがそれぞれ異なる反応部
位を介して合成ペプチドに結合することを示している。

換言すれば本実施例のモノクローナル抗体は抗ＨＩＶ抗
体と合成ペプチドとの反応を妨げない。

第２表は本実施例のモノクローナル抗体群と不活化され
たＨＩＶとの反応性を確認した結果である０反応には市
販のヒト血清スクリーニング用のＥＬＩＳＡキット（パ
スツール社、製造番号７Ｄ２２４）を用いた。このキッ
トはエイズウィルスをそのまま固相化したウェルと固相
化しないウェルの２種類よりなる９６ウエルマイクロプ
レートである。まず、本実施例の各モノクローナル抗体
群および反応性の異なるエイズ患者血清並びにコントロ
ールとしてのＤ−ＭＥＭ培養液（１０％血清を含む）を
それぞれ前記２種類のウェルに加えて反応させた０次に
、２次抗体以降の試薬としてはヒト血清用の本キットの
ものは用いず、第７図以前のＥＬＩＳＡと同様のマウス
用試薬を用いて判定を行った０図から明らかなように、
患者血清はいずれもウィルス陽性ウェルに反応し陰性ウ
ェルには反応せずウィルス特異性を示したのに対し、本
実施例のマウスモノクローナル抗体は特に２Ｅ６゜３　
Ｅｌｌ、　　４　ＨｌｌのＩｇＧ株でそれぞれ前記２種
類のウェルに対して陰性を示した。これはこれらＩｇＧ
株のモノクローナル抗体がＨｒＶそのものには結合しな
いことを意味する。一方、その他ＩｇＭ株は前記２種類
のウェルにおいて反応してしまい、ＨＩＭに対する特異
性はみられなかった。

第２表 以上に示したような特異を持つことにより、本実施例の
モノクローナル抗体はＨＩＶ構成蛋白であるｇｐ４１を
特異的に認識する陽性標準用の抗体としてウェスタンブ
ロッティングやＥＩＡ等に利用できる。また、本モノク
ローナル抗体はマウスハイブリドーマ由来であることか
ら、現在検査室で懸念されているような患者血清の使用
によるバイオハザードの心配もな（、しかも大量生産も
容易なため慢性状態にある標準サンプルの不足を解消す
ることができる。

第７図は本実施例のモノクローナル抗体を利用した免疫
反応の模式図である。図に示すように本実施例のモノク
ローナル抗体は免疫原の合成ペプチドを抗ＨＩＶ抗体に
対するのとは異なる反応部位で結合して複合体を形成す
るので、この複合体におけるモノクローナル抗体を反応
容器等に固相化すれば、合成ペプチドにおける抗ＨＩＶ
抗体との反応部位は隠されることがない、即ち、合成ペ
プチドを直接固相した場合、ペプチドは抗ＨＩＶ抗体と
の反応部位も含めて全（不均一に付着されるのに比べて
、本性ではペプチドが均一に固定される。従って、本実
施例のモノクローナル抗体によれば公知の凝集試験やＥ
ＩＡに応用することにより、効率良く安定した抗ＨＩＶ
抗体の検出を行うことができる。

尚、本発明は上述した実施例に限られることなく、適宜
変更が可能である０例えば免疫原には上述した２１個の
アミノ酸配列をもつ合成ペプチドに他のアミノ酸配列を
もつペプチドを追加したものを用いても良い。又、本実
施例では免疫原を投与する際にＰＶＰのような特定のキ
ャリアを媒体として用いたが、適当なアジュバント（例
えばフロイントの完全アジュバント）とともに免疫して
もよい、又、融合にはマウス骨髄腫細胞Ｐ３　Ｘ　６３
−　Ａｇ８．６５３を用いたが、他の種々の公知なミエ
ローマ細胞を使用してもよい。

又、クローニングの手段には軟寒天２重層法の他に公知
の限界希釈法等が使用できる。

〔本発明の効果］ 本発明のモノクローナル抗体によれば、Ｈ［ｖｌ成蛋白
であるｇｐ４１に反応するので、ウェスタンブロッティ
ングまたはＥＩＡ等の陽性基準として使用でき、かつハ
イブリドーマ由来であるため検査中のバイオハザードの
心配がない。

又、ＨＩＶそのものには反応しないため、ウィルスの破
壊状況、　ｇｐ４１の露出状況等を検出して分析するた
めに有効に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は第１表で示したハイブリドーマのうちＥ６と命
名されたハイブリドーマをＤＥＡＥカラムクロマトグラ
フィーで分画して得られたフラクションパターンを示す
グラフ、 第２図は第１図で得られたフラクションパターンの各ピ
ーク部分の５ＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電
気床動像の写真、 第３図は各種ハイブリドーマの培養上清の各希釈系列に
よる合成ペプチドとのＥＬＩＳＡ反応の結果を示すグラ
フ、 第４図は各希釈系列の合成ペプチドに対する各バイブリ
ドーマの培養上清のＥＬＩＳＡ反応の結果を示すグラフ
、 第５図は各種ハイブリドーマの培養上清と腹水、及びエ
イズ患者血清によるウェスタンブロッティングの結果を
示す写真、 第６図は合成ペプチドとエイズ患者血清との反応に対す
るハリブリドーマ２Ｅ６が産生じた抗体の反応阻害性を
示すグラフ、 第７図は本実施例のモノクローナル抗体を介して合成ペ
プチドを固相化した抗ＨＩＶ抗体検出法における抗ＨＩ
Ｖ抗体の結合状態を示す模式図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ヒト免疫不全ウィルスＨＩＶの膜蛋白ｇｐ４１由来
   のアミノ酸配列の一部に一致する合成ペプチドをヒト以
   外の動物に免疫し免疫後の該動物の脾細胞と骨髄腫細胞
   との融合細胞から産生されるモノクローナル抗体であっ
   て、ＨＩＶ本体には反応せず、膜蛋白ｇｐ４１と反応す
   ることを特徴とするＨＩＶ構成蛋白に対するモノクロー
   ナル抗体。