JPH0751062B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH0751062B2 JPH0751062B2 JP4051949A JP5194992A JPH0751062B2 JP H0751062 B2 JPH0751062 B2 JP H0751062B2 JP 4051949 A JP4051949 A JP 4051949A JP 5194992 A JP5194992 A JP 5194992A JP H0751062 B2 JPH0751062 B2 JP H0751062B2
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- human
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- hybridoma
- oncofetal
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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Description
【0001】本発明は、ヒト胎盤由来のヒト腫瘍胎児性
フェリチン抗原のエピトープと結合するが成人の脾又は
肝のフェリチン抗原のエピトープとは結合しないモノク
ローナル抗体に係る。
フェリチン抗原のエピトープと結合するが成人の脾又は
肝のフェリチン抗原のエピトープとは結合しないモノク
ローナル抗体に係る。
【0002】本発明は更に、ヒト乳癌及び/又はホジキ
ン氏病を発見するために、ヒト腫瘍胎児性フェリチンが
存在しそうな体組織及び/又はリンパ球を患者から取出
して選択的に定量するアッセイに係る。
ン氏病を発見するために、ヒト腫瘍胎児性フェリチンが
存在しそうな体組織及び/又はリンパ球を患者から取出
して選択的に定量するアッセイに係る。
【0003】本発明の特定具体例によれば、ヒト腫瘍胎
児性フェリチンの有無が細胞障害アッセイによって判定
される。
児性フェリチンの有無が細胞障害アッセイによって判定
される。
【0004】本発明の別の特定具体例によれば、ヒト腫
瘍胎児性フェリチンの有無がラジオイムノアッセイによ
って判定される。
瘍胎児性フェリチンの有無がラジオイムノアッセイによ
って判定される。
【0005】本発明のアッセイは、特定のモノクローナ
ル抗体の使用に基く。該抗体は、腫瘍胎児性フェリチン
の有無を判定するのに適したアッセイであればいかなる
タイプのアッセイにも使用することが可能であり、フェ
リチンの存在は第1期もしくは第2期の乳癌又はホジキ
ン氏病の指標とされる。
ル抗体の使用に基く。該抗体は、腫瘍胎児性フェリチン
の有無を判定するのに適したアッセイであればいかなる
タイプのアッセイにも使用することが可能であり、フェ
リチンの存在は第1期もしくは第2期の乳癌又はホジキ
ン氏病の指標とされる。
【0006】本発明の好ましい具体例によれば、患者の
血流中のリンパ球の表面上の腫瘍胎児性フェリチンの存
在が判定され、フェリチンの存在が乳癌又はホジキン氏
病の指標とされる。
血流中のリンパ球の表面上の腫瘍胎児性フェリチンの存
在が判定され、フェリチンの存在が乳癌又はホジキン氏
病の指標とされる。
【0007】フェリチンは、主として組織に貯蔵された
鉄タンパク質であり、血漿中で少量(65−150ng/ml)が
検出され得る。正常組織のフェリチンを等電点電気泳動
で分析すると、かなりの異質性が見られる。MarcusとZi
mberg (Arch. Biochem. Biophysic. 162, 493, 1974)
は乳腫瘍組織から単離されたフェリチンが成人肝フェリ
チンには見られない酸性イソフェリチンを含有すること
を発表し、DrysdaleとSinger(Cancer Res. 44, 3352,
1974)はHela腫瘍細胞と胎盤細胞とに酸性イソフェリチ
ンが存在することを発表した。彼らは、このようなイソ
フェリチンを“腫瘍胎児性”イソフェリチンと指称し得
ると考えた。
鉄タンパク質であり、血漿中で少量(65−150ng/ml)が
検出され得る。正常組織のフェリチンを等電点電気泳動
で分析すると、かなりの異質性が見られる。MarcusとZi
mberg (Arch. Biochem. Biophysic. 162, 493, 1974)
は乳腫瘍組織から単離されたフェリチンが成人肝フェリ
チンには見られない酸性イソフェリチンを含有すること
を発表し、DrysdaleとSinger(Cancer Res. 44, 3352,
1974)はHela腫瘍細胞と胎盤細胞とに酸性イソフェリチ
ンが存在することを発表した。彼らは、このようなイソ
フェリチンを“腫瘍胎児性”イソフェリチンと指称し得
ると考えた。
【0008】MarcusとZimberg(Clin. Res. 23, A447, 1
975)及びJacobsら(Br. J. Cancer 34, 286, 1976) は、
乳癌患者では血清中のフェリチン濃度が増すことを報告
し、フェリチンの定量が乳癌発見の指標となり得ると考
えた。しかしながら、異種の抗フェリチン血清は、成人
フェリチンの抗原決定基及び腫瘍胎児性フェリチンの抗
原決定基の双方と交叉反応するので、これらの2種のイ
ソフェリチンを判別することができない。従って、フェ
リチンレベルが正常範囲より高い(>200ng/ml)患者の
場合にのみ有意な結果が得られる。最近の研究では、Mo
roz ら(CancerImmunol. and Immunotherapy 3, 101, 1
977)は、乳癌患者において表面にフェリチンを有する
リンパ球のサブ集団を同定した。このフェリチンは腫瘍
胎児性フェリチンであり、これらのフェリチンが陽性の
リンパ球は乳癌の初期(第1期〜第2期)に現れる。こ
のようなリンパ球は、良性の乳疾患患者又は健康人では
検出されない(Gillerら,Surgery Gyn. Obst. 149, 65
5, 1979 )。
975)及びJacobsら(Br. J. Cancer 34, 286, 1976) は、
乳癌患者では血清中のフェリチン濃度が増すことを報告
し、フェリチンの定量が乳癌発見の指標となり得ると考
えた。しかしながら、異種の抗フェリチン血清は、成人
フェリチンの抗原決定基及び腫瘍胎児性フェリチンの抗
原決定基の双方と交叉反応するので、これらの2種のイ
ソフェリチンを判別することができない。従って、フェ
リチンレベルが正常範囲より高い(>200ng/ml)患者の
場合にのみ有意な結果が得られる。最近の研究では、Mo
roz ら(CancerImmunol. and Immunotherapy 3, 101, 1
977)は、乳癌患者において表面にフェリチンを有する
リンパ球のサブ集団を同定した。このフェリチンは腫瘍
胎児性フェリチンであり、これらのフェリチンが陽性の
リンパ球は乳癌の初期(第1期〜第2期)に現れる。こ
のようなリンパ球は、良性の乳疾患患者又は健康人では
検出されない(Gillerら,Surgery Gyn. Obst. 149, 65
5, 1979 )。
【0009】リンパ球に付着したフェリチン又は組織液
中に存在するフェリチンの同定に基いて、乳癌が早期に
発見される。
中に存在するフェリチンの同定に基いて、乳癌が早期に
発見される。
【0010】近年、マウスミエローマ細胞と超免疫マウ
ス脾細胞との融合方法が開発された(Kohler及びMilste
in, Nature, 256:495:1975)。形成されたハイブリドー
マは、1個の抗原決定基にのみ反応する1個の抗体を産
生し得る。このようなハイブリドーマをクローニングす
ると、1個のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマのクローンが得られる。
ス脾細胞との融合方法が開発された(Kohler及びMilste
in, Nature, 256:495:1975)。形成されたハイブリドー
マは、1個の抗原決定基にのみ反応する1個の抗体を産
生し得る。このようなハイブリドーマをクローニングす
ると、1個のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマのクローンが得られる。
【0011】本発明は、腫瘍胎児性フェリチンのみが有
しており成人フェリチンが有していない1個の抗原決定
基に反応するモノクローナル抗体の産生に関する。本発
明のモノクローナル抗体を用いた成人の(血漿又はリン
パ球での)イソフェリチンの同定は、悪性疾患を発見す
るためのより特異的でより感受性の高い手段となり得
る。その結果、血清中の成人フェリチンが増加する良性
疾患が悪性疾患と診断されるエラーが少なくなる。
しており成人フェリチンが有していない1個の抗原決定
基に反応するモノクローナル抗体の産生に関する。本発
明のモノクローナル抗体を用いた成人の(血漿又はリン
パ球での)イソフェリチンの同定は、悪性疾患を発見す
るためのより特異的でより感受性の高い手段となり得
る。その結果、血清中の成人フェリチンが増加する良性
疾患が悪性疾患と診断されるエラーが少なくなる。
【0012】本発明は、夫々がヒト胎盤フェリチンの別
個の抗原決定基に特異的な2種のマウスモノクローナル
抗体の製造に係る。
個の抗原決定基に特異的な2種のマウスモノクローナル
抗体の製造に係る。
【0013】1)ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原のエピ
トープと結合するCM−OF−H9(フランスのCollec
tion Nationale de Cultures de Microorganises of th
e Institut PasteurにI−256 として寄託)。
トープと結合するCM−OF−H9(フランスのCollec
tion Nationale de Cultures de Microorganises of th
e Institut PasteurにI−256 として寄託)。
【0014】2)ヒト腫瘍胎児性フェリチン及び成人脾
フェリチンに対する相互決定基に反応するCM−OF−
3。
フェリチンに対する相互決定基に反応するCM−OF−
3。
【0015】本発明は更に、乳癌を早期発見するための
感受性アッセイに係る。このアッセイは更に、ホジキン
氏病をも発見し得る。乳癌の早期発見又はホジキン氏病
の発見のために、血清中及び他の体液中に存在するか又
はリンパ球に付着した“腫瘍胎児性”フェリチンの同定
に基くテストが行なわれる。
感受性アッセイに係る。このアッセイは更に、ホジキン
氏病をも発見し得る。乳癌の早期発見又はホジキン氏病
の発見のために、血清中及び他の体液中に存在するか又
はリンパ球に付着した“腫瘍胎児性”フェリチンの同定
に基くテストが行なわれる。
【0016】モノクローナル抗体CM−OF−H9は腫
瘍胎児性フェリチンにのみ特異性を有しているため、癌
による血清フェリチンの増加と正常フェリチン又は良性
疾患(例えば地中海貧血)によるフェリチンの増加とを
判別し得る。CM−OF−3は、正常フェリチン及び良
性疾患によるフェリチンの増加を検出し得る。両方の抗
体を用いたテストによって悪性疾患と悪性でない疾患と
を判別し得る。
瘍胎児性フェリチンにのみ特異性を有しているため、癌
による血清フェリチンの増加と正常フェリチン又は良性
疾患(例えば地中海貧血)によるフェリチンの増加とを
判別し得る。CM−OF−3は、正常フェリチン及び良
性疾患によるフェリチンの増加を検出し得る。両方の抗
体を用いたテストによって悪性疾患と悪性でない疾患と
を判別し得る。
【0017】
【実施例】腫瘍胎児性フェリチンの調製 Beawish らの方法(J. Clin. Path. 24, 581, 1971)を
修正してヒト胎盤からフェリチンを取出した。胎盤組織
(500gr) を切片し、全容2000mlになるまで水を添加し
た。組織懸濁液を均質化し、75℃で20分間加熱した。冷
却し10,000rpm で15分間遠心分離して得た上清を酢酸で
処理してpH 4.6にした。10,000rpm で15分間遠心分離し
て沈殿タンパク質を除去し、透明な上清を希NaOHで
中性pHに調整した。透明な褐色上清を 100,000gで240
分間超遠心し、懸濁フェリチンを管底部に小粒として収
集した。沈殿物を 0.9%食塩水溶液に再溶解し、更にSe
phadex G 200カラムに通して精製した。
修正してヒト胎盤からフェリチンを取出した。胎盤組織
(500gr) を切片し、全容2000mlになるまで水を添加し
た。組織懸濁液を均質化し、75℃で20分間加熱した。冷
却し10,000rpm で15分間遠心分離して得た上清を酢酸で
処理してpH 4.6にした。10,000rpm で15分間遠心分離し
て沈殿タンパク質を除去し、透明な上清を希NaOHで
中性pHに調整した。透明な褐色上清を 100,000gで240
分間超遠心し、懸濁フェリチンを管底部に小粒として収
集した。沈殿物を 0.9%食塩水溶液に再溶解し、更にSe
phadex G 200カラムに通して精製した。
【0018】このカラムより得たフェリチン画分を、pH
7.5 、濃度勾配0.02〜0.5 Mのトリス−HClバッファ
を用いDEAEセルロースアニオン交換樹脂に通した。
3個のタンパクピークが生じた。最も酸性のピークpI
=4.8(No. III)を収集して分析した。等電点電気泳動
と、抗フェリチン血清及び抗ヒト全血清に対する免疫電
気泳動とによって純度を測定した。得られたフェリチン
を下記の如くマウスに免疫接種した。
7.5 、濃度勾配0.02〜0.5 Mのトリス−HClバッファ
を用いDEAEセルロースアニオン交換樹脂に通した。
3個のタンパクピークが生じた。最も酸性のピークpI
=4.8(No. III)を収集して分析した。等電点電気泳動
と、抗フェリチン血清及び抗ヒト全血清に対する免疫電
気泳動とによって純度を測定した。得られたフェリチン
を下記の如くマウスに免疫接種した。
【0019】ハイブリドーマの調製 ミエローマ細胞: 細胞融合用のミエローマ細胞PB/NS1/1−Ag4
−1を20%胎児性仔牛血清(FCS)を含むRPMI−
1640中で増殖させた。
−1を20%胎児性仔牛血清(FCS)を含むRPMI−
1640中で増殖させた。
【0020】マウス: Balb/cメス(テスト開始時に4−6週令)。
【0021】免疫プロトコル: 完全フロイントアジュバント中の酸性フェリチン50μg
を週1回の割合で3回接種し最後にフェリチン10μg を
注射して3日後に細胞融合を行なった。少くとも1カ月
経過後に超免疫マウスに最終的なブースターを行なっ
た。
を週1回の割合で3回接種し最後にフェリチン10μg を
注射して3日後に細胞融合を行なった。少くとも1カ月
経過後に超免疫マウスに最終的なブースターを行なっ
た。
【0022】細胞調製 脾細胞:a.マウスの脾をRPMI−Oに取出した。
【0023】b.ペトリ皿でRPMI−Oで2回洗っ
た。
た。
【0024】c.18ゲージの針を用いRPMI−O中で
切開した。
切開した。
【0025】d.細胞懸濁液を試験管に移し、多量の組
織を沈殿させた。
織を沈殿させた。
【0026】e.セル懸濁液を新しい管に移し、800rpm
(160xg)で5分間回転させた。
(160xg)で5分間回転させた。
【0027】赤血球をpH7.5 の0.83%NH4 Clで溶解
させた。
させた。
【0028】f.細胞をRPMI−Oで3回洗浄し、R
PMI−Oに再び懸濁させた。
PMI−Oに再び懸濁させた。
【0029】g.トリパンブルーで細胞をカウントし
た。
た。
【0030】ミエローマ細胞: a.培養フラスコから細胞を50mlのFalcon/Corning 管
にピペットで静かに移した。
にピペットで静かに移した。
【0031】b.900rpm(200g) で5分間回転させた。
【0032】c.RPMI−Oで1回洗浄し、RPMI
−Oに再び懸濁させトリパンブルーでカウントした。
−Oに再び懸濁させトリパンブルーでカウントした。
【0033】脾細胞−ミエローマ細胞の融合: a.50ml円錐形ファルコン/コーニング使い捨て遠心管
で脾細胞とミエローマ細胞とを10:1で融合した。
で脾細胞とミエローマ細胞とを10:1で融合した。
【0034】b.900rpm(200xg) で5分間回転し細胞を
ペレット化した。
ペレット化した。
【0035】c.培地をできるだけ完全に吸引した。
【0036】d.以後の溶液及び培地は全て室温で使用
された。
された。
【0037】細胞ペレットを入れた管を37℃の浴に浸漬
し、穏やかに撹拌しながら0.2ml の33%PEG1500を1
分間で添加し、200 gで5分間遠心した。細胞を再び懸
濁させ、1分間穏やかに撹拌し、次に穏やかに撹拌しな
がら5mlのRPMI−Oを添加し、20%胎児性仔牛血清
(FCS)を含む5mlのRPMI−Oを添加した。この
ときに、ハイブリッド混合物は僅かに再懸濁し多数の小
擬集塊を含む細胞懸濁液の状態であった。
し、穏やかに撹拌しながら0.2ml の33%PEG1500を1
分間で添加し、200 gで5分間遠心した。細胞を再び懸
濁させ、1分間穏やかに撹拌し、次に穏やかに撹拌しな
がら5mlのRPMI−Oを添加し、20%胎児性仔牛血清
(FCS)を含む5mlのRPMI−Oを添加した。この
ときに、ハイブリッド混合物は僅かに再懸濁し多数の小
擬集塊を含む細胞懸濁液の状態であった。
【0038】e.混合物を 200gで5分間回転してペレ
ット化した。
ット化した。
【0039】f.濃度3×106 /ccのRPMI−HY−
HATD(37℃)に細胞を入れ細胞ペレットに培地をか
けながら再び懸濁させた。
HATD(37℃)に細胞を入れ細胞ペレットに培地をか
けながら再び懸濁させた。
【0040】g.5mlのピペットから細胞懸濁液を2滴
添加するか又は(約65マイクロリットルの)カットオフ
チップを用いたマルチピペッタによって、96個のウェル
プレートの平底に100-120 RPMI−HY−HATD
(約2×105 細胞)を含むハイブリッドを塗抹した。
添加するか又は(約65マイクロリットルの)カットオフ
チップを用いたマルチピペッタによって、96個のウェル
プレートの平底に100-120 RPMI−HY−HATD
(約2×105 細胞)を含むハイブリッドを塗抹した。
【0041】h.1×106 /mlでNS−1細胞+RPM
I−HY−HATDを含む対照ウェルを用意した。
I−HY−HATDを含む対照ウェルを用意した。
【0042】i.プレートを7日間培養した。
【0043】j.8日目及び以後週に2回の割合で培地
を慎重に吸引して除去し、80−100 マイクロリットルの
RPMI−HY−HT培地を補給した。
を慎重に吸引して除去し、80−100 マイクロリットルの
RPMI−HY−HT培地を補給した。
【0044】k.細胞融合(hybridization) の3及び4
週後に陽性のウェルをスクリーニングした。
週後に陽性のウェルをスクリーニングした。
【0045】培地及び溶液: 1.RPMI−O(FCSを含まない) 2.RPMI 1640−HY 500ML の無菌蒸留水 55mlの10倍RPMI−1640 6mlの1.0 Nの水酸化ナトリウム 14mlの7.5 %重炭酸ナトリウム 6mlのPen/Strep +DMEM 10mlのグルタミン+DMEM 86.5mlのFCS+DMEM 3.RPMI−HY−HATD:0日目→7日目培地10ml当り 95mlのRPMI−1640+20%FCS 1.0ml のピルビン酸塩(100倍) 2.0ml の50倍HAT 2.0ml の50倍デオキシシチジン 4.RPMI−HY−HT:8日目→14日目培地100ml 当り 97mlのRPMI−1640+20%FCS 2.0ml の50倍HT 1.0ml のピルビン酸塩(100倍) 15日目以後のハイブリッドに対しては、RPMI−1640
+20%FCSとピルビン酸塩とを使用するか、又はRP
MI−HY−HT中に維持する。
+20%FCSとピルビン酸塩とを使用するか、又はRP
MI−HY−HT中に維持する。
【0046】5.PEG33及び25重量/容量% 無臭白色でなければならない。100ml オートクレーブに
対し適量(重量グラム)をガラスびんに入れ15 lbsにし
て10〜15分間維持する。びんが手で持てる程度(約50
℃)に冷えてから、RPMI1640−0を添加して100ml
にし、振って混合し、RTで貯蔵する。
対し適量(重量グラム)をガラスびんに入れ15 lbsにし
て10〜15分間維持する。びんが手で持てる程度(約50
℃)に冷えてから、RPMI1640−0を添加して100ml
にし、振って混合し、RTで貯蔵する。
【0047】6.HATD−試薬の最終濃度 H=ヒポキサンチン 10-4M A=アミノプテリン 10-6M T=チミジン 2×10-5M D=デオキシシチジン 2×10-6MHT原液の100 倍溶液−100cc チミジン(分子量242.33) 0.04846g ヒポキサンチン(分子量 136.1)0.1361g 100ml まで dd H2 Oを添加し60−70℃に加熱して溶解
する。 dd H2 Oを添加して最終量を再調整する。50倍
に希釈しフィルタ(0.2μ) 殺菌する。2mlアリコートを
作成し−20℃で貯蔵する。
する。 dd H2 Oを添加して最終量を再調整する。50倍
に希釈しフィルタ(0.2μ) 殺菌する。2mlアリコートを
作成し−20℃で貯蔵する。
【0048】A原液の1000倍溶液−100cc アミノプテリン(分子量 440.4)0.44g dd H2 Oを添加して50mlにし、アミノプテリンが溶解
するまで 0.1NのNaOHを滴下する。
するまで 0.1NのNaOHを滴下する。
【0049】dd H2 Oを添加して最終量を100ml にす
る。調製量100ml をフィルタ(0.2μ) 殺菌し、−20℃で
貯蔵する。
る。調製量100ml をフィルタ(0.2μ) 殺菌し、−20℃で
貯蔵する。
【0050】D原液の100 倍溶液−100cc デオキシシチジン(分子量 227.2) 0.00454g dd H2 Oに溶解し、100cc に調製し原液の50倍に希釈
し、フィルタ(0.2μ)殺菌する。−20℃で貯蔵する。
し、フィルタ(0.2μ)殺菌する。−20℃で貯蔵する。
【0051】HATの50倍液−200ml 100 倍HT100ml と1000倍A10ml+ dd H2 O90mlとを
合せて50倍HATを調製し、フィルタ(0.2μ) 殺菌し、
2mlアリコートを作成し−20℃で冷凍する。
合せて50倍HATを調製し、フィルタ(0.2μ) 殺菌し、
2mlアリコートを作成し−20℃で冷凍する。
【0052】血球凝集反応テストによってモノクローナ
ル抗体の特異性のスクリーニングと定量とを実施した。
ル抗体の特異性のスクリーニングと定量とを実施した。
【0053】腫瘍胎児性フェリチン及び成人脾フェリチ
ンをCrCl2 よってOx赤血球細胞(OxRBC)に
結合した。
ンをCrCl2 よってOx赤血球細胞(OxRBC)に
結合した。
【0054】(1:10から初めて)ハイブリードーマ培
地の希釈度を増していき、該培地の上清50μlを10μl
の成人又は胎児性フェリチンOxRBCと混合し、血球
凝集反応を定量した。
地の希釈度を増していき、該培地の上清50μlを10μl
の成人又は胎児性フェリチンOxRBCと混合し、血球
凝集反応を定量した。
【0055】少くとも1:1000の血液凝集素価を与える
クローンの上清を選択した。
クローンの上清を選択した。
【0056】選択クローンをCM−OF−3と指称す
る。
る。
【0057】クローンCM−OF−3は腫瘍胎児性フェ
リチンに特異的であり成人フェリチン及び腫瘍胎児性フ
ェリチンの双方と交叉反応する。
リチンに特異的であり成人フェリチン及び腫瘍胎児性フ
ェリチンの双方と交叉反応する。
【0058】得られたモノクローナル抗体CM−OF−
3を使用し、腫瘍胎児性フェリチンと成人フェリチンと
の交叉反応決定基をブロックして、胎児性決定基のみに
反応する別のモノクローナル抗体CM−OF−H9を生
成した。
3を使用し、腫瘍胎児性フェリチンと成人フェリチンと
の交叉反応決定基をブロックして、胎児性決定基のみに
反応する別のモノクローナル抗体CM−OF−H9を生
成した。
【0059】下記の免疫接種方法を使用した。
【0060】A.免疫接種及び融合プロトコル: ヒト胎盤から単離した腫瘍胎児性フェリチン即ちPI
4.8のタンパク質を下記の割合でモノクローナル抗体C
M−OF−3と反応させた。腫瘍胎児性フェリチン(P
BS中90μg )を抗フェリチンモノクローナル抗体CM
−OF−3(10 mgr/ml)を含むBALB/cマウスの
腹水液と混合した。
4.8のタンパク質を下記の割合でモノクローナル抗体C
M−OF−3と反応させた。腫瘍胎児性フェリチン(P
BS中90μg )を抗フェリチンモノクローナル抗体CM
−OF−3(10 mgr/ml)を含むBALB/cマウスの
腹水液と混合した。
【0061】混合物を37℃で30分間インキュベートし、
次いで4℃で1晩インキュベートした。混合物を10000
g遠心し、形成された沈殿物を廃棄し、上清を用いて免
疫接種を実施した。前記上清を完全フロイントアジュバ
ントと混合し、週1回の皮内注射を3回実施して各BA
LB/cマウスに免疫を与えた。ブースターとして、前
記の1/5の用量を腹腔内に注射した。
次いで4℃で1晩インキュベートした。混合物を10000
g遠心し、形成された沈殿物を廃棄し、上清を用いて免
疫接種を実施した。前記上清を完全フロイントアジュバ
ントと混合し、週1回の皮内注射を3回実施して各BA
LB/cマウスに免疫を与えた。ブースターとして、前
記の1/5の用量を腹腔内に注射した。
【0062】ブースターから3日後、マウスの脾を無菌
的に取出して、前記のハイブリダイゼーション方法に従
い108 個の脾細胞を107 個のP3−NSI/1−Ag4
ミエローマ細胞と共にインキュベートして融合を生起
し、以後も前記方法に準じて処理して陽性のクローンを
同定した。得られたクローンをCM−OF−H9と指称
する。
的に取出して、前記のハイブリダイゼーション方法に従
い108 個の脾細胞を107 個のP3−NSI/1−Ag4
ミエローマ細胞と共にインキュベートして融合を生起
し、以後も前記方法に準じて処理して陽性のクローンを
同定した。得られたクローンをCM−OF−H9と指称
する。
【0063】B.得られたモノクローナル抗体の定性 モノクローナル抗体CM−OF−H9は下記の特性を有
する。
する。
【0064】IgG1 クラスに属する。フェリチンと共
に沈殿物を形成しない。ラビット補体と結合する。得ら
れた腹水液中の抗体含量は約7mg/mlであった。1mlの
腹水液は約2mgの腫瘍胎児性フェリチンと結合するが、
成人の脾又は肝のフェリチンとは結合しない。
に沈殿物を形成しない。ラビット補体と結合する。得ら
れた腹水液中の抗体含量は約7mg/mlであった。1mlの
腹水液は約2mgの腫瘍胎児性フェリチンと結合するが、
成人の脾又は肝のフェリチンとは結合しない。
【0065】血清学的テスト方法の原理 リンパ球付着フェリチン(LBF)の定量: リンパ球付着フェリチン(lynphocyte bound ferritin
)は、ヒト患者の乳癌の存在の指標となる。
)は、ヒト患者の乳癌の存在の指標となる。
【0066】フェリチンは下記の如く定量される。
【0067】a.リンパ球を未梢血から単離する。
【0068】b.ヒト胎盤由来のフェリチンに特異的な
モノクローナル抗体を使用し、慣用のアッセイによって
リンパ球付着フェリチンを定量する。
モノクローナル抗体を使用し、慣用のアッセイによって
リンパ球付着フェリチンを定量する。
【0069】テストを下記の如く実施するのが好まし
い。
い。
【0070】a.Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心法によっ
て未梢血からリンパ球を単離する。
て未梢血からリンパ球を単離する。
【0071】b.慣用のアッセイ、例えば細胞障害テス
ト又はラジオイムノアッセイによってLBFの有無を検
査する。
ト又はラジオイムノアッセイによってLBFの有無を検
査する。
【0072】血清又は他の体液を用いて前記の如きアッ
セイを実施することも可能である。
セイを実施することも可能である。
【0073】乳癌及びホジキン氏病の早期発見用テスト 細胞の収集と調製: 1.ヘパリンを入れた15mlの採血管。
【0074】2.25mlの円錐形遠心管。
【0075】3.パスツールピペット及びバルブ。
【0076】4.pH 7.2のPBS(燐酸ナトリウム緩
衝食塩水)。
衝食塩水)。
【0077】5.Ficoll-Hypaque濃溶液1.077 gm/ml。
【0078】細胞の収集方法: 1.ヘパリンを入れた採血管に血液15mlを採取しpH
7.2のPBSで1:2に希釈する。
7.2のPBSで1:2に希釈する。
【0079】2.細胞懸濁液の下層に10mlのFicoll-Hyp
aque濃溶液を入れる。
aque濃溶液を入れる。
【0080】3.室温で300gで30分間遠心する。
【0081】4.Ficoll-Hypaque:培地の界面からパス
ツールピペットで単核細胞を収集し、新しい15mlの管に
移す。
ツールピペットで単核細胞を収集し、新しい15mlの管に
移す。
【0082】5.15mlのウォッシュ培地に懸濁させてセ
ルの洗浄を3回繰返し、4℃で300gの遠心を10分間行な
う。
ルの洗浄を3回繰返し、4℃で300gの遠心を10分間行な
う。
【0083】6.ウォッシュ培地に再び懸濁させて細胞
数をカウントする。
数をカウントする。
【0084】ラジオイムノアッセイ(RIA) 付加的所要材料 1.100 ×15mmのMinisorp試験管 2.RPMI 1640 3.ナトリウムアジド 0.025%含有のpH7.2 のPBS
中のウシ血清アルブミン(BSA)5% 4.正常ラビット血清(NRS) 5.CM−OF−H9モノクローナル抗体 6.白色腹水液 7. 125Iの抗マウスIgGラジオイムノアッセイ−1 Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心によって未梢血単核細胞を
単離する。
中のウシ血清アルブミン(BSA)5% 4.正常ラビット血清(NRS) 5.CM−OF−H9モノクローナル抗体 6.白色腹水液 7. 125Iの抗マウスIgGラジオイムノアッセイ−1 Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心によって未梢血単核細胞を
単離する。
【0085】3組のテストを実施する。
【0086】1.6個の試験管の夫々に2×106 〜3×
106 個の細胞を分け入れ、 300gで10分間遠心して細胞
をペレット化する。
106 個の細胞を分け入れ、 300gで10分間遠心して細胞
をペレット化する。
【0087】2.PBSで1:10に希釈したNRS20μ
l を添加し、4℃で60分間インキュベートする。
l を添加し、4℃で60分間インキュベートする。
【0088】3.3個の試験管の夫々に(5%BSAで
10-5に希釈した)腹水液30μl を添加する。
10-5に希釈した)腹水液30μl を添加する。
【0089】A=腫瘍胎児性フェリチンと反応しない非
特異的 モノクローナル抗体IgG1を含む対照腹水液 B=CM−OF−H9モノクローナル抗体 十分に混合して室温で2時間インキュベートする。
特異的 モノクローナル抗体IgG1を含む対照腹水液 B=CM−OF−H9モノクローナル抗体 十分に混合して室温で2時間インキュベートする。
【0090】4.10mlのRPMI−1640と共に4℃で30
0gの遠心を10分間行なって細胞を2回洗浄する。
0gの遠心を10分間行なって細胞を2回洗浄する。
【0091】5.0.1 μCiの125 Iラビット抗マウスI
gG( 125I−ラビットIgG 1μCi/μg )を添加
し、4℃で60分間インキュベートし、冷たいRPMI−
1640で4と同様に2回洗浄し、放射能をカウントする。
gG( 125I−ラビットIgG 1μCi/μg )を添加
し、4℃で60分間インキュベートし、冷たいRPMI−
1640で4と同様に2回洗浄し、放射能をカウントする。
【0092】(AのcpmA)−(BのcpmB)<50
0 のとき、陽性(+)と判定する。
0 のとき、陽性(+)と判定する。
【0093】ラジオイムノアッセイ−2 RIA−1の段階1の処理後に下記の方法でテストす
る。Utsumi及びKarush(Biochem. 1965, 4,1766)の方
法に従ってCM−OF−H9をペプシン消化してCM−
OF−H9のF′(ab)2 を得、同様に非特異的Ig
G1 (RIA−1の対照)のF(ab)2 を得る。これ
らのF(ab)2 断片を下記の如く使用する。
る。Utsumi及びKarush(Biochem. 1965, 4,1766)の方
法に従ってCM−OF−H9をペプシン消化してCM−
OF−H9のF′(ab)2 を得、同様に非特異的Ig
G1 (RIA−1の対照)のF(ab)2 を得る。これ
らのF(ab)2 断片を下記の如く使用する。
【0094】試験管A=0.025 %のナトリウムアジドを
含むpH7.2 のPBS中の5%BSA中の対照F(ab)
2 試験管B=0.025 %のナトリウムアジドを含むpH7.2 の
PBS中の5%BSA中のCM−OF−H9のF(a
b)2 室温で60分間インキュベートし、pH 7.2のPBS中の
1%BSA2mlで1回洗浄する。
含むpH7.2 のPBS中の5%BSA中の対照F(ab)
2 試験管B=0.025 %のナトリウムアジドを含むpH7.2 の
PBS中の5%BSA中のCM−OF−H9のF(a
b)2 室温で60分間インキュベートし、pH 7.2のPBS中の
1%BSA2mlで1回洗浄する。
【0095】試験管A,Bに125 I−標識腫瘍胎児性フ
ェリチン又は125 I−ポリクロナル抗腫瘍胎児性フェリ
チンと腫瘍胎児性フェリチンとの複合体を添加する(約
105cpm を与える)。抗原/抗体のモル比1:1又は
1:2までの複合体を調製し、室温で1時間夫々プレイ
ンキュベートする。標識腫瘍胎児性フェリチンを細胞と
共に室温で1時間インキュベートし、pH7.2 のPBS
中の1%BSAで2回洗浄し、未結合の標識腫瘍胎児性
フェリチンを取出してカウントする。
ェリチン又は125 I−ポリクロナル抗腫瘍胎児性フェリ
チンと腫瘍胎児性フェリチンとの複合体を添加する(約
105cpm を与える)。抗原/抗体のモル比1:1又は
1:2までの複合体を調製し、室温で1時間夫々プレイ
ンキュベートする。標識腫瘍胎児性フェリチンを細胞と
共に室温で1時間インキュベートし、pH7.2 のPBS
中の1%BSAで2回洗浄し、未結合の標識腫瘍胎児性
フェリチンを取出してカウントする。
【0096】Bのカウント数がAより多いと陽性(+)
と判定する。
と判定する。
【0097】細胞障害アッセイ 2組のテストを実施する。
【0098】1.濃度5×106 細胞/mlでPBLをRP
MI−1640に懸濁させる。
MI−1640に懸濁させる。
【0099】2.12×75mmの試験管4本にPBLを150
μl ずつ入れ、(希釈度10-4の)腹水液(30μl )を添
加する。
μl ずつ入れ、(希釈度10-4の)腹水液(30μl )を添
加する。
【0100】A=対照腹水液 B=CM−OF−H9 Aを入れた試験管2本とBを入れた試験管2本とを4℃
で45分間インキュベートする。
で45分間インキュベートする。
【0101】3.ラビット補体を添加し(PBSで1:
5に希釈して100 μl )、穏やかに攪拌しながら37℃で
60分間インキュベートする。
5に希釈して100 μl )、穏やかに攪拌しながら37℃で
60分間インキュベートする。
【0102】4.トリパンブルーで生細胞をカウントす
る。
る。
【0103】陽性テスト:
【0104】
【数1】
【0105】上記したアッセイ方法に従って、正常人ま
たは患者由来のフェリチンについてテストした結果は次
表の通りである。
たは患者由来のフェリチンについてテストした結果は次
表の通りである。
【0106】モノクローナル抗体の反応性 CM-OF-H9 CM-OF-3 1.地中海貧血の成人脾 − + 2.正常血清 − + 3.乳癌(PBL)* + + 4.乳癌(血清) + + 5.ホジキン氏患者(脾) + + 6.良性乳疾患(PBL)* − − 7.良性乳疾患(血清) − + * PBL:未梢血リンパ球 2種の抗体によって、乳癌とホジキン氏病とを迅速且つ
適切に発見し、更に、これらの病気と、やはりフェリチ
ンの増加を生じる地中海貧血とを判別することが可能で
ある。
適切に発見し、更に、これらの病気と、やはりフェリチ
ンの増加を生じる地中海貧血とを判別することが可能で
ある。
【0107】細胞障害アッセイ用キット 1.モノクローナル抗体CM−OF−H9 2.腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロー
ナル抗体 3.ラビット補体 4.標準溶液中の従来のアジュバントRIAアッセイ用キット 1.CM−OF−H9のF(ab)2 2.腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロナ
ルのF(ab)2 3. 125I−標識腫瘍胎児性フェリチンRIA−1アッセイ用キット 1.モノクローナル抗体CM−OF−H9 2.腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロー
ナル抗体 3. 125I−抗マウスIgG1 4.アジュバント及び標準溶液
ナル抗体 3.ラビット補体 4.標準溶液中の従来のアジュバントRIAアッセイ用キット 1.CM−OF−H9のF(ab)2 2.腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロナ
ルのF(ab)2 3. 125I−標識腫瘍胎児性フェリチンRIA−1アッセイ用キット 1.モノクローナル抗体CM−OF−H9 2.腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロー
ナル抗体 3. 125I−抗マウスIgG1 4.アジュバント及び標準溶液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/395 J T C07K 16/18 8318−4H C12N 15/02 C12P 21/08 9161−4B G01N 33/577 B (C12P 21/08 C12R 1:91)
Claims (6)
- 【請求項1】 ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合す
るがヒトの脾フェリチン抗原又はヒトの肝フェリチン抗
原とは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマであって、 (a) ヒト患者の胎盤由来の腫瘍胎児性フェリチンをヒ
ト腫瘍胎児性フェリチン及びヒト成人脾フェリチンの抗
原上の共通の結合サイトと反応するモノクローナル抗体
と反応させて、前記結合サイトを前記モノクローナル抗
体との反応によりブロックしたフェリチンを形成し、 (b) ヒトを除く動物に、工程(a) の反応生成物である
フェリチンを免疫接種し、 (c) 前記した動物の感作リンパ球をミエローマ細胞と
融合し、 (d) ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原のエピトープと結
合するがヒトの脾フェリチン抗原のエピトープ又はヒト
の肝フェリチン抗原のエピトープとは結合しないモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択
することからなる方法により製造されることを特徴とす
るハイブリドーマ。 - 【請求項2】 前記免疫接種が、完全フロイントアジュ
バント中の腫瘍胎児性フェリチンを用いる免疫接種の連
続による請求項1に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項3】 リンパ球とミエローマ細胞を20:1 〜
1:1 の割合で用いる請求項1に記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項4】 前記割合が約10:1 である請求項3に記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項5】 免疫接種される動物がマウスである請求
項1に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項6】 マウスがBalb/c メスマウスである請求
項5に記載のハイブリドーマ。
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IL62879A IL62879A (en) | 1981-05-15 | 1981-05-15 | Monoclonal antibodies,clones producing them,preparation of such antibodies and clones and cytotoxic and immunoassay using such antibodies |
IL62879 | 1981-05-15 |
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