JPH0751062B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents

モノクローナル抗体

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JPH0751062B2
JPH0751062B2 JP4051949A JP5194992A JPH0751062B2 JP H0751062 B2 JPH0751062 B2 JP H0751062B2 JP 4051949 A JP4051949 A JP 4051949A JP 5194992 A JP5194992 A JP 5194992A JP H0751062 B2 JPH0751062 B2 JP H0751062B2
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hybridoma
oncofetal
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ヒト胎盤由来のヒト腫瘍胎児性
フェリチン抗原のエピトープと結合するが成人の脾又は
肝のフェリチン抗原のエピトープとは結合しないモノク
ローナル抗体に係る。
【０００２】本発明は更に、ヒト乳癌及び／又はホジキ
ン氏病を発見するために、ヒト腫瘍胎児性フェリチンが
存在しそうな体組織及び／又はリンパ球を患者から取出
して選択的に定量するアッセイに係る。
【０００３】本発明の特定具体例によれば、ヒト腫瘍胎
児性フェリチンの有無が細胞障害アッセイによって判定
される。
【０００４】本発明の別の特定具体例によれば、ヒト腫
瘍胎児性フェリチンの有無がラジオイムノアッセイによ
って判定される。
【０００５】本発明のアッセイは、特定のモノクローナ
ル抗体の使用に基く。該抗体は、腫瘍胎児性フェリチン
の有無を判定するのに適したアッセイであればいかなる
タイプのアッセイにも使用することが可能であり、フェ
リチンの存在は第１期もしくは第２期の乳癌又はホジキ
ン氏病の指標とされる。
【０００６】本発明の好ましい具体例によれば、患者の
血流中のリンパ球の表面上の腫瘍胎児性フェリチンの存
在が判定され、フェリチンの存在が乳癌又はホジキン氏
病の指標とされる。
【０００７】フェリチンは、主として組織に貯蔵された
鉄タンパク質であり、血漿中で少量（65−150ng/ml）が
検出され得る。正常組織のフェリチンを等電点電気泳動
で分析すると、かなりの異質性が見られる。MarcusとZi
mberg （Arch. Biochem. Biophysic. 162, 493, 1974）
は乳腫瘍組織から単離されたフェリチンが成人肝フェリ
チンには見られない酸性イソフェリチンを含有すること
を発表し、DrysdaleとSinger（Cancer Res. 44, 3352,
1974）はHela腫瘍細胞と胎盤細胞とに酸性イソフェリチ
ンが存在することを発表した。彼らは、このようなイソ
フェリチンを“腫瘍胎児性”イソフェリチンと指称し得
ると考えた。
【０００８】MarcusとZimberg(Clin. Res. 23, A447, 1
975)及びJacobsら(Br. J. Cancer 34, 286, 1976) は、
乳癌患者では血清中のフェリチン濃度が増すことを報告
し、フェリチンの定量が乳癌発見の指標となり得ると考
えた。しかしながら、異種の抗フェリチン血清は、成人
フェリチンの抗原決定基及び腫瘍胎児性フェリチンの抗
原決定基の双方と交叉反応するので、これらの２種のイ
ソフェリチンを判別することができない。従って、フェ
リチンレベルが正常範囲より高い（＞200ng/ml）患者の
場合にのみ有意な結果が得られる。最近の研究では、Mo
roz ら（CancerImmunol. and Immunotherapy 3, 101, 1
977）は、乳癌患者において表面にフェリチンを有する
リンパ球のサブ集団を同定した。このフェリチンは腫瘍
胎児性フェリチンであり、これらのフェリチンが陽性の
リンパ球は乳癌の初期（第１期〜第２期）に現れる。こ
のようなリンパ球は、良性の乳疾患患者又は健康人では
検出されない（Gillerら，Surgery Gyn. Obst. 149, 65
5, 1979 ）。
【０００９】リンパ球に付着したフェリチン又は組織液
中に存在するフェリチンの同定に基いて、乳癌が早期に
発見される。
【００１０】近年、マウスミエローマ細胞と超免疫マウ
ス脾細胞との融合方法が開発された（Kohler及びMilste
in, Nature, 256:495:1975）。形成されたハイブリドー
マは、１個の抗原決定基にのみ反応する１個の抗体を産
生し得る。このようなハイブリドーマをクローニングす
ると、１個のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマのクローンが得られる。
【００１１】本発明は、腫瘍胎児性フェリチンのみが有
しており成人フェリチンが有していない１個の抗原決定
基に反応するモノクローナル抗体の産生に関する。本発
明のモノクローナル抗体を用いた成人の（血漿又はリン
パ球での）イソフェリチンの同定は、悪性疾患を発見す
るためのより特異的でより感受性の高い手段となり得
る。その結果、血清中の成人フェリチンが増加する良性
疾患が悪性疾患と診断されるエラーが少なくなる。
【００１２】本発明は、夫々がヒト胎盤フェリチンの別
個の抗原決定基に特異的な２種のマウスモノクローナル
抗体の製造に係る。
【００１３】１）ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原のエピ
トープと結合するＣＭ−ＯＦ−Ｈ９（フランスのCollec
tion Nationale de Cultures de Microorganises of th
e Institut PasteurにＩ−256 として寄託）。
【００１４】２）ヒト腫瘍胎児性フェリチン及び成人脾
フェリチンに対する相互決定基に反応するＣＭ−ＯＦ−
３。
【００１５】本発明は更に、乳癌を早期発見するための
感受性アッセイに係る。このアッセイは更に、ホジキン
氏病をも発見し得る。乳癌の早期発見又はホジキン氏病
の発見のために、血清中及び他の体液中に存在するか又
はリンパ球に付着した“腫瘍胎児性”フェリチンの同定
に基くテストが行なわれる。
【００１６】モノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９は腫
瘍胎児性フェリチンにのみ特異性を有しているため、癌
による血清フェリチンの増加と正常フェリチン又は良性
疾患（例えば地中海貧血）によるフェリチンの増加とを
判別し得る。ＣＭ−ＯＦ−３は、正常フェリチン及び良
性疾患によるフェリチンの増加を検出し得る。両方の抗
体を用いたテストによって悪性疾患と悪性でない疾患と
を判別し得る。
【００１７】
【実施例】腫瘍胎児性フェリチンの調製 Beawish らの方法（J. Clin. Path. 24, 581, 1971）を
修正してヒト胎盤からフェリチンを取出した。胎盤組織
(500gr) を切片し、全容2000mlになるまで水を添加し
た。組織懸濁液を均質化し、75℃で20分間加熱した。冷
却し10,000rpm で15分間遠心分離して得た上清を酢酸で
処理してpH 4.6にした。10,000rpm で15分間遠心分離し
て沈殿タンパク質を除去し、透明な上清を希ＮａＯＨで
中性pHに調整した。透明な褐色上清を 100,000ｇで240
分間超遠心し、懸濁フェリチンを管底部に小粒として収
集した。沈殿物を 0.9％食塩水溶液に再溶解し、更にSe
phadex G 200カラムに通して精製した。
【００１８】このカラムより得たフェリチン画分を、pH
7.5 、濃度勾配0.02〜0.5 Ｍのトリス−ＨＣｌバッファ
を用いＤＥＡＥセルロースアニオン交換樹脂に通した。
３個のタンパクピークが生じた。最も酸性のピークｐＩ
＝4.8(No. III)を収集して分析した。等電点電気泳動
と、抗フェリチン血清及び抗ヒト全血清に対する免疫電
気泳動とによって純度を測定した。得られたフェリチン
を下記の如くマウスに免疫接種した。
【００１９】ハイブリドーマの調製 ミエローマ細胞： 細胞融合用のミエローマ細胞ＰＢ／ＮＳ１／１−Ａｇ４
−１を20％胎児性仔牛血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−
1640中で増殖させた。
【００２０】マウス： Balb/cメス（テスト開始時に４−６週令）。
【００２１】免疫プロトコル： 完全フロイントアジュバント中の酸性フェリチン50μg
を週１回の割合で３回接種し最後にフェリチン10μg を
注射して３日後に細胞融合を行なった。少くとも１カ月
経過後に超免疫マウスに最終的なブースターを行なっ
た。
【００２２】細胞調製 脾細胞：ａ．マウスの脾をＲＰＭＩ−Ｏに取出した。
【００２３】ｂ．ペトリ皿でＲＰＭＩ−Ｏで２回洗っ
た。
【００２４】ｃ．18ゲージの針を用いＲＰＭＩ−Ｏ中で
切開した。
【００２５】ｄ．細胞懸濁液を試験管に移し、多量の組
織を沈殿させた。
【００２６】ｅ．セル懸濁液を新しい管に移し、800rpm
(160xg）で５分間回転させた。
【００２７】赤血球をpH7.5 の0.83％ＮＨ4 Ｃｌで溶解
させた。
【００２８】ｆ．細胞をＲＰＭＩ−Ｏで３回洗浄し、Ｒ
ＰＭＩ−Ｏに再び懸濁させた。
【００２９】ｇ．トリパンブルーで細胞をカウントし
た。
【００３０】ミエローマ細胞： ａ．培養フラスコから細胞を50mlのFalcon／Corning 管
にピペットで静かに移した。
【００３１】ｂ．900rpm(200ｇ) で５分間回転させた。
【００３２】ｃ．ＲＰＭＩ−Ｏで１回洗浄し、ＲＰＭＩ
−Ｏに再び懸濁させトリパンブルーでカウントした。
【００３３】脾細胞−ミエローマ細胞の融合： ａ．50ml円錐形ファルコン／コーニング使い捨て遠心管
で脾細胞とミエローマ細胞とを10：１で融合した。
【００３４】ｂ．900rpm(200xg) で５分間回転し細胞を
ペレット化した。
【００３５】ｃ．培地をできるだけ完全に吸引した。
【００３６】ｄ．以後の溶液及び培地は全て室温で使用
された。
【００３７】細胞ペレットを入れた管を37℃の浴に浸漬
し、穏やかに撹拌しながら0.2ml の33％ＰＥＧ1500を１
分間で添加し、200 ｇで５分間遠心した。細胞を再び懸
濁させ、１分間穏やかに撹拌し、次に穏やかに撹拌しな
がら５mlのＲＰＭＩ−Ｏを添加し、20％胎児性仔牛血清
（ＦＣＳ）を含む５mlのＲＰＭＩ−Ｏを添加した。この
ときに、ハイブリッド混合物は僅かに再懸濁し多数の小
擬集塊を含む細胞懸濁液の状態であった。
【００３８】ｅ．混合物を 200ｇで５分間回転してペレ
ット化した。
【００３９】ｆ．濃度３×106 ／ccのＲＰＭＩ−ＨＹ−
ＨＡＴＤ（37℃）に細胞を入れ細胞ペレットに培地をか
けながら再び懸濁させた。
【００４０】ｇ．５mlのピペットから細胞懸濁液を２滴
添加するか又は（約65マイクロリットルの）カットオフ
チップを用いたマルチピペッタによって、96個のウェル
プレートの平底に100-120 ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＡＴＤ
（約２×105 細胞）を含むハイブリッドを塗抹した。
【００４１】ｈ．１×106 ／mlでＮＳ−１細胞＋ＲＰＭ
Ｉ−ＨＹ−ＨＡＴＤを含む対照ウェルを用意した。
【００４２】ｉ．プレートを７日間培養した。
【００４３】ｊ．８日目及び以後週に２回の割合で培地
を慎重に吸引して除去し、80−100 マイクロリットルの
ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＴ培地を補給した。
【００４４】ｋ．細胞融合(hybridization) の３及び４
週後に陽性のウェルをスクリーニングした。
【００４５】培地及び溶液： １．ＲＰＭＩ−Ｏ（ＦＣＳを含まない） ２．ＲＰＭＩ 1640−ＨＹ 500ML の無菌蒸留水 55mlの１０倍ＲＰＭＩ−1640 ６mlの1.0 Ｎの水酸化ナトリウム 14mlの7.5 ％重炭酸ナトリウム ６mlのPen/Strep ＋ＤＭＥＭ 10mlのグルタミン＋ＤＭＥＭ 86.5mlのＦＣＳ＋ＤＭＥＭ ３．ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＡＴＤ：０日目→７日目培地10ml当り 95mlのＲＰＭＩ−1640＋20％ＦＣＳ 1.0ml のピルビン酸塩(100倍) 2.0ml の５０倍ＨＡＴ 2.0ml の50倍デオキシシチジン ４．ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＴ：８日目→14日目培地100ml 当り 97mlのＲＰＭＩ−1640＋20％ＦＣＳ 2.0ml の50倍ＨＴ 1.0ml のピルビン酸塩(100倍) 15日目以後のハイブリッドに対しては、ＲＰＭＩ−1640
＋20％ＦＣＳとピルビン酸塩とを使用するか、又はＲＰ
ＭＩ−ＨＹ−ＨＴ中に維持する。
【００４６】５．ＰＥＧ33及び25重量／容量％ 無臭白色でなければならない。100ml オートクレーブに
対し適量（重量グラム）をガラスびんに入れ15 lbsにし
て10〜15分間維持する。びんが手で持てる程度（約50
℃）に冷えてから、ＲＰＭＩ1640−０を添加して100ml
にし、振って混合し、ＲＴで貯蔵する。
【００４７】６．ＨＡＴＤ−試薬の最終濃度 Ｈ＝ヒポキサンチン 10-4Ｍ Ａ＝アミノプテリン 10-6Ｍ Ｔ＝チミジン ２×10-5Ｍ Ｄ＝デオキシシチジン ２×10-6ＭＨＴ原液の100 倍溶液−100cc チミジン（分子量242.33） 0.04846ｇ ヒポキサンチン（分子量 136.1）0.1361ｇ 100ml まで dd Ｈ2 Ｏを添加し60−70℃に加熱して溶解
する。 dd Ｈ2 Ｏを添加して最終量を再調整する。50倍
に希釈しフィルタ(0.2μ) 殺菌する。２mlアリコートを
作成し−20℃で貯蔵する。
【００４８】Ａ原液の1000倍溶液−100cc アミノプテリン（分子量 440.4）0.44ｇ dd Ｈ2 Ｏを添加して50mlにし、アミノプテリンが溶解
するまで 0.1ＮのＮａＯＨを滴下する。
【００４９】dd Ｈ2 Ｏを添加して最終量を100ml にす
る。調製量100ml をフィルタ(0.2μ) 殺菌し、−20℃で
貯蔵する。
【００５０】Ｄ原液の100 倍溶液−100cc デオキシシチジン（分子量 227.2） 0.00454ｇ dd Ｈ2 Ｏに溶解し、100cc に調製し原液の50倍に希釈
し、フィルタ(0.2μ)殺菌する。−20℃で貯蔵する。
【００５１】ＨＡＴの50倍液−200ml 100 倍ＨＴ100ml と1000倍Ａ10ml＋ dd Ｈ2 Ｏ90mlとを
合せて50倍ＨＡＴを調製し、フィルタ(0.2μ) 殺菌し、
２mlアリコートを作成し−20℃で冷凍する。
【００５２】血球凝集反応テストによってモノクローナ
ル抗体の特異性のスクリーニングと定量とを実施した。
【００５３】腫瘍胎児性フェリチン及び成人脾フェリチ
ンをＣｒＣｌ2 よってＯｘ赤血球細胞（ＯｘＲＢＣ）に
結合した。
【００５４】（１：10から初めて）ハイブリードーマ培
地の希釈度を増していき、該培地の上清50μｌを10μｌ
の成人又は胎児性フェリチンＯｘＲＢＣと混合し、血球
凝集反応を定量した。
【００５５】少くとも１：1000の血液凝集素価を与える
クローンの上清を選択した。
【００５６】選択クローンをＣＭ−ＯＦ−３と指称す
る。
【００５７】クローンＣＭ−ＯＦ−３は腫瘍胎児性フェ
リチンに特異的であり成人フェリチン及び腫瘍胎児性フ
ェリチンの双方と交叉反応する。
【００５８】得られたモノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−
３を使用し、腫瘍胎児性フェリチンと成人フェリチンと
の交叉反応決定基をブロックして、胎児性決定基のみに
反応する別のモノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９を生
成した。
【００５９】下記の免疫接種方法を使用した。
【００６０】Ａ．免疫接種及び融合プロトコル： ヒト胎盤から単離した腫瘍胎児性フェリチン即ちＰＩ
4.8のタンパク質を下記の割合でモノクローナル抗体Ｃ
Ｍ−ＯＦ−３と反応させた。腫瘍胎児性フェリチン（Ｐ
ＢＳ中90μg ）を抗フェリチンモノクローナル抗体ＣＭ
−ＯＦ−３（10 mgr／ml）を含むＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹水液と混合した。
【００６１】混合物を37℃で30分間インキュベートし、
次いで４℃で１晩インキュベートした。混合物を10000
ｇ遠心し、形成された沈殿物を廃棄し、上清を用いて免
疫接種を実施した。前記上清を完全フロイントアジュバ
ントと混合し、週１回の皮内注射を３回実施して各ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに免疫を与えた。ブースターとして、前
記の１／５の用量を腹腔内に注射した。
【００６２】ブースターから３日後、マウスの脾を無菌
的に取出して、前記のハイブリダイゼーション方法に従
い108 個の脾細胞を107 個のＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４
ミエローマ細胞と共にインキュベートして融合を生起
し、以後も前記方法に準じて処理して陽性のクローンを
同定した。得られたクローンをＣＭ−ＯＦ−Ｈ９と指称
する。
【００６３】Ｂ．得られたモノクローナル抗体の定性 モノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９は下記の特性を有
する。
【００６４】ＩｇＧ1 クラスに属する。フェリチンと共
に沈殿物を形成しない。ラビット補体と結合する。得ら
れた腹水液中の抗体含量は約７mg／mlであった。１mlの
腹水液は約２mgの腫瘍胎児性フェリチンと結合するが、
成人の脾又は肝のフェリチンとは結合しない。
【００６５】血清学的テスト方法の原理 リンパ球付着フェリチン（ＬＢＦ）の定量： リンパ球付着フェリチン（lynphocyte bound ferritin
）は、ヒト患者の乳癌の存在の指標となる。
【００６６】フェリチンは下記の如く定量される。
【００６７】ａ．リンパ球を未梢血から単離する。
【００６８】ｂ．ヒト胎盤由来のフェリチンに特異的な
モノクローナル抗体を使用し、慣用のアッセイによって
リンパ球付着フェリチンを定量する。
【００６９】テストを下記の如く実施するのが好まし
い。
【００７０】ａ．Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心法によっ
て未梢血からリンパ球を単離する。
【００７１】ｂ．慣用のアッセイ、例えば細胞障害テス
ト又はラジオイムノアッセイによってＬＢＦの有無を検
査する。
【００７２】血清又は他の体液を用いて前記の如きアッ
セイを実施することも可能である。
【００７３】乳癌及びホジキン氏病の早期発見用テスト 細胞の収集と調製： １．ヘパリンを入れた15mlの採血管。
【００７４】２．25mlの円錐形遠心管。
【００７５】３．パスツールピペット及びバルブ。
【００７６】４．ｐＨ 7.2のＰＢＳ（燐酸ナトリウム緩
衝食塩水）。
【００７７】５．Ficoll-Hypaque濃溶液1.077 gm／ml。
【００７８】細胞の収集方法： １．ヘパリンを入れた採血管に血液15mlを採取しｐＨ
7.2のＰＢＳで１：２に希釈する。
【００７９】２．細胞懸濁液の下層に10mlのFicoll-Hyp
aque濃溶液を入れる。
【００８０】３．室温で300gで30分間遠心する。
【００８１】４．Ficoll-Hypaque：培地の界面からパス
ツールピペットで単核細胞を収集し、新しい15mlの管に
移す。
【００８２】５．15mlのウォッシュ培地に懸濁させてセ
ルの洗浄を３回繰返し、４℃で300gの遠心を10分間行な
う。
【００８３】６．ウォッシュ培地に再び懸濁させて細胞
数をカウントする。
【００８４】ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） 付加的所要材料 １．100 ×15mmのMinisorp試験管 ２．ＲＰＭＩ 1640 ３．ナトリウムアジド 0.025％含有のｐＨ7.2 のＰＢＳ
中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５％ ４．正常ラビット血清（ＮＲＳ） ５．ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９モノクローナル抗体 ６．白色腹水液 ７． 125Ｉの抗マウスＩｇＧラジオイムノアッセイ−１ Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心によって未梢血単核細胞を
単離する。
【００８５】３組のテストを実施する。
【００８６】１．６個の試験管の夫々に２×106 〜３×
106 個の細胞を分け入れ、 300ｇで10分間遠心して細胞
をペレット化する。
【００８７】２．ＰＢＳで１：10に希釈したＮＲＳ20μ
l を添加し、４℃で60分間インキュベートする。
【００８８】３．３個の試験管の夫々に（５％ＢＳＡで
10-5に希釈した）腹水液30μl を添加する。
【００８９】Ａ＝腫瘍胎児性フェリチンと反応しない非
特異的 モノクローナル抗体ＩｇＧ1を含む対照腹水液 Ｂ＝ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９モノクローナル抗体 十分に混合して室温で２時間インキュベートする。
【００９０】４．10mlのＲＰＭＩ−1640と共に４℃で30
0gの遠心を10分間行なって細胞を２回洗浄する。
【００９１】５．0.1 μCiの125 Ｉラビット抗マウスＩ
ｇＧ（ 125Ｉ−ラビットＩｇＧ １μCi／μg ）を添加
し、４℃で60分間インキュベートし、冷たいＲＰＭＩ−
1640で４と同様に２回洗浄し、放射能をカウントする。
【００９２】（ＡのｃｐｍＡ）−（ＢのｃｐｍＢ）＜50
0 のとき、陽性（＋）と判定する。
【００９３】ラジオイムノアッセイ−２ ＲＩＡ−１の段階１の処理後に下記の方法でテストす
る。Utsumi及びKarush（Biochem. 1965, 4，1766）の方
法に従ってＣＭ−ＯＦ−Ｈ９をペプシン消化してＣＭ−
ＯＦ−Ｈ９のＦ′（ａｂ）2 を得、同様に非特異的Ｉｇ
Ｇ1 （ＲＩＡ−１の対照）のＦ（ａｂ）2 を得る。これ
らのＦ（ａｂ）2 断片を下記の如く使用する。
【００９４】試験管Ａ＝0.025 ％のナトリウムアジドを
含むpH7.2 のＰＢＳ中の５％ＢＳＡ中の対照Ｆ（ａｂ）
2 試験管Ｂ＝0.025 ％のナトリウムアジドを含むpH7.2 の
ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ中のＣＭ−ＯＦ−Ｈ９のＦ（ａ
ｂ）2 室温で60分間インキュベートし、ｐＨ 7.2のＰＢＳ中の
１％ＢＳＡ２mlで１回洗浄する。
【００９５】試験管Ａ，Ｂに125 Ｉ−標識腫瘍胎児性フ
ェリチン又は125 Ｉ−ポリクロナル抗腫瘍胎児性フェリ
チンと腫瘍胎児性フェリチンとの複合体を添加する（約
105cpm を与える）。抗原／抗体のモル比１：１又は
１：２までの複合体を調製し、室温で１時間夫々プレイ
ンキュベートする。標識腫瘍胎児性フェリチンを細胞と
共に室温で１時間インキュベートし、ｐＨ7.2 のＰＢＳ
中の１％ＢＳＡで２回洗浄し、未結合の標識腫瘍胎児性
フェリチンを取出してカウントする。
【００９６】Ｂのカウント数がＡより多いと陽性（＋）
と判定する。
【００９７】細胞障害アッセイ ２組のテストを実施する。
【００９８】１．濃度５×106 細胞／mlでＰＢＬをＲＰ
ＭＩ−1640に懸濁させる。
【００９９】２．12×75mmの試験管４本にＰＢＬを150
μl ずつ入れ、（希釈度10-4の）腹水液（30μl ）を添
加する。
【０１００】Ａ＝対照腹水液 Ｂ＝ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９ Ａを入れた試験管２本とＢを入れた試験管２本とを４℃
で45分間インキュベートする。
【０１０１】３．ラビット補体を添加し（ＰＢＳで１：
５に希釈して100 μl ）、穏やかに攪拌しながら37℃で
60分間インキュベートする。
【０１０２】４．トリパンブルーで生細胞をカウントす
る。
【０１０３】陽性テスト：
【０１０４】
【数１】
【０１０５】上記したアッセイ方法に従って、正常人ま
たは患者由来のフェリチンについてテストした結果は次
表の通りである。
【０１０６】モノクローナル抗体の反応性 CM-OF-H9 CM-OF-3 １．地中海貧血の成人脾 − ＋ ２．正常血清 − ＋ ３．乳癌（ＰＢＬ）* ＋ ＋ ４．乳癌（血清） ＋ ＋ ５．ホジキン氏患者（脾） ＋ ＋ ６．良性乳疾患（ＰＢＬ）* − − ７．良性乳疾患（血清） − ＋ * ＰＢＬ：未梢血リンパ球 ２種の抗体によって、乳癌とホジキン氏病とを迅速且つ
適切に発見し、更に、これらの病気と、やはりフェリチ
ンの増加を生じる地中海貧血とを判別することが可能で
ある。
【０１０７】細胞障害アッセイ用キット １．モノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９ ２．腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロー
ナル抗体 ３．ラビット補体 ４．標準溶液中の従来のアジュバントＲＩＡアッセイ用キット １．ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９のＦ（ａｂ）2 ２．腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロナ
ルのＦ（ａｂ）2 ３． 125Ｉ−標識腫瘍胎児性フェリチンＲＩＡ−１アッセイ用キット １．モノクローナル抗体ＣＭ−ＯＦ−Ｈ９ ２．腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合しないモノクロー
ナル抗体 ３． 125Ｉ−抗マウスＩｇＧ1 ４．アジュバント及び標準溶液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｊ Ｔ Ｃ０７Ｋ 16/18 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原と結合す
    るがヒトの脾フェリチン抗原又はヒトの肝フェリチン抗
    原とは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブ
    リドーマであって、 (a) ヒト患者の胎盤由来の腫瘍胎児性フェリチンをヒ
    ト腫瘍胎児性フェリチン及びヒト成人脾フェリチンの抗
    原上の共通の結合サイトと反応するモノクローナル抗体
    と反応させて、前記結合サイトを前記モノクローナル抗
    体との反応によりブロックしたフェリチンを形成し、 (b) ヒトを除く動物に、工程(a) の反応生成物である
    フェリチンを免疫接種し、 (c) 前記した動物の感作リンパ球をミエローマ細胞と
    融合し、 (d) ヒト腫瘍胎児性フェリチン抗原のエピトープと結
    合するがヒトの脾フェリチン抗原のエピトープ又はヒト
    の肝フェリチン抗原のエピトープとは結合しないモノク
    ローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択
    することからなる方法により製造されることを特徴とす
    るハイブリドーマ。
  2. 【請求項２】 前記免疫接種が、完全フロイントアジュ
    バント中の腫瘍胎児性フェリチンを用いる免疫接種の連
    続による請求項１に記載のハイブリドーマ。
  3. 【請求項３】 リンパ球とミエローマ細胞を20：1 〜
    1：1 の割合で用いる請求項１に記載のハイブリドー
    マ。
  4. 【請求項４】 前記割合が約10：1 である請求項３に記
    載のハイブリドーマ。
  5. 【請求項５】 免疫接種される動物がマウスである請求
    項１に記載のハイブリドーマ。
  6. 【請求項６】 マウスがBalb／c メスマウスである請求
    項５に記載のハイブリドーマ。
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