JPH0273022A - 組織プラスミノーゲン活性化因子を用いた薬学的製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子と活性化プ
ロティンＣとのコンビネーション、ツレらを含有する薬
学的製剤、及びヒト並びに獣医薬へのそれらの用途に関
する。

凝血を形成する酵素系、凝固系、及び凝血を溶解する酵
素系、即ち、開通性のある血管床を維持する線維素溶解
系との間には動的平衡状態が存在している。創傷部から
の血液流出によるロスを抑えるために、創傷部の血管Ｖ
Ｃおいて凝血が形成される。創傷が治癒した後には、線
維素溶解系の作用により余分な凝血が溶解される。時と
して、創傷とは無関係に凝血が形成されて主要血管中に
溜り、血液の循環が部分的にあるいは全体的に障害を受
ける場合がある。この、Ｊ：うな現象が心臓、肺あるい
は脳において起こった場合には、その結果として、心筋
梗塞、肺塞栓症、脳卒中などになる。

このような症状が先進国での主要な死亡原因となってい
る。

凝血シ工、蛋白質加水分解活性を有する酵素プラスミン
てよって溶解される繊維網からなっている。

このプラスミンは、プラスミノーゲン活性ｆヒ因子の作
用により、血液プラズマの一成分である非活性プロエン
ディムのプラスＳノーダンから誘導される。哺乳動物に
おいては、免疫学的に異なる２つのプラスミノーゲン活
性１ヒ因子が存在する。その１つは内因性プラスミノー
ケ９ン活性比因子であり、これはつａキナーゼとしても
知られており、腎臓によって産生きれる酵素であり尿中
から単離することができろ。また、多くの組織培養源か
らも調製することができる。他の１つは、外因性プ２ス
ミノーｒン活性化因子であり、これは血管ゾ２スミノー
ｒン活性比因子あるいは組織デラスミノーデン活性化因
子（ｔ−ＰＡ、ｌとしても知られており、多くの組織ホ
モジェネート（特にヒトの子宮）、血管細ｆ＠壁及びあ
る種の培養細胞から単離することができる。更に、これ
ら２種類のプラスミノ−ｒン活性比因子ＩＣＤＯえて、
バクテリア産生物の１つであるストレプトキナーゼがあ
り、これはベータ溶血性連鎖球菌から得ることができる
。これらつａキナーゼ及びストレゾ、トキナーゼの主た
る欠点は、これらは凝血部位においてのみ活性を示すも
のではなく循環系の全てにおいて活性を示すと言う点で
ある。これに対して、ｔ−ＰＡの生物学的活性はフィブ
リンの存在に依存しており、フィブリンに結分してそこ
でｆ′！５性１ヒされろ。従って、ｔ−ＰＡの王たる活
ｆｆｌ：は凝血部位においてのみ発揮され、即ち、溶解
丁べきフィブリン網の存在下においてのみ発揮され、こ
のため出血傾向を引き起こ丁とい５危険性が著しく少な
い。

プロティンＣは、血液プラズマ中に存在するビタミンに
依存性チモーゲンの１つである。プロティンＣは循環系
においては非活性であるが、そのＮ末端からト９デカベ
プチーがυσ水分解的に解裂することによって活性型に
変換され、この活性型は活性化プロテインＣとしても知
られている。１ｎ７１ｖＯ蛋白加水分解は、スａンビン
／スａンヴモジュリン補足因子経路にまり内皮表面上に
おいて引き起こされる。非活性型のプロティンＣの蛋白
η０水分解は、各種のプロテアーゼによりｉｎ　ｖｉｔ
ｒ。

で引き起ご丁ことも可能である。活性ｆヒデロティンＣ
は２つの生理作用を持っている。即ち、その１つはプラ
スミノ−ｒン活性比因子インヒビターを非活性化するゾ
ロ線維素溶解活性であり、−他の１つはｉｎ　ＶｉＶＯ
においてプラスミノーゲン活性比因子の遊離を誘導する
ゾ０線維素浴解活性である（文献１−６）。また、活性
化プロティンＣは、活性比凝固因子ＶａとＶ口ｌａの蛋
白卯水分解的非活注ｆヒな引き起こ丁抗凝固剤でもある
（文献６−９）。

ｔ−ＰＡによる血栓症治療の主たる問題点の１つは、他
のプラスミノーデン活性化因子の場合と同様に、血栓溶
解後に血管の再閉塞がどの程度起こるかという点である
。ヘパリン（文献゛１０及び１１）、抗血小板剤（文献
１２）、ナイトレート（文献１５）、ｔ−ＰＡ　（文献
１３及び１４）などの各種の薬剤が血管の開通性を維持
するために使用されている。しかしながら、この点に関
しては、より有効な治療法の開発が望まれている。

本発明者により、ｔ−ＰＡと活性化プロテインＣトノコ
ンビネーションが血管の再閉塞を阻止する共働効果を有
することが見出された。

しかして、本発明によれば、哺乳動物での血管の再閉塞
を阻止するために用いるｔ−ＰＡと活性化プロティンＣ
とのコンビネーションが提供される。

本発明に用いるｔ−ＰＡは、哺乳動物特にヒトのｔ−Ｐ
Ａに実質的に対応する生物活性な有する蛋白であればい
ずれでもよく、またグリコジル比されていてもされてい
なくともよい。ｇｐ−Ａ−１１２１２２に記載されてい
るように、１本鎖または２末鎖ｔ−ＰＡでもよく、また
それらの混合物であってもよい。十分にグリコジル比さ
れたヒトｔ−ＰＡは、ポリアクリルアミｖｒル電気泳動
で測定した見かけの分子量が約７０．０００であり、７
．５と８．０の間の等電点な有している。ｔ−ＰＡは約
３００．０００−６００．０００ＩＵ／■の比活性を有
しているのが好ましい。国際単位（工Ｕ）は、ＷＨＯＮ
ａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　　ｆｏｒ　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　５ｔａｎｄａｒｄｓ　　ａｎｄ（
！０ｎｔｒＯ１（ＨＯ１１７Ｈｉｌｌ、　Ｈａｍｐｓｔ
ｅａｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　ＮＷ３６　ＲＢ、σＫ）Ｋ
よって定義された活性の国際単位であり、凝血溶解アッ
セイにより測定してスタンダーＶ調製品と比較して得ら
れたものである。

ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は、８ｇ１図に示したアミノ酸
配列と実質的に対応するものが望ましい。従って、ｔ−
ＰＡのアミノ酸配列は第１図と同じであってもよい。ま
た１つもしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入
もしくは介在あるいは対立遺伝子もしく（１他のアミノ
酸の付り口があり、その結果得られるアミノ酸配列がＷ
Ｊ１図のアミノ酸配列と少なくとも８０％好ましくは少
なくとも９０傷の相同性を有し且つ本質的に同様の生物
学的特性及び免疫学的特性を有するものであってもよし
）￥Ｐに、アミノ酸配夕ＩＪは第１図と同じ配列、ある
いはそのＮ末端のセリンから２４５番目のアミノ酸がメ
チオニンの代わりにバリンとなった配列、あるいは最初
の３つのアミノ酸のいずれかが任意に除去された配列も
しくはＮ末端の先Ｋ　Ｇ１７−Ａｊａ−Ａｒｇのポリ被
デチｒが任意に付〃口された配列が望ましくゝ。

第１図に示したアミノ酸配列には６５個のシスティン残
基が含まれており、従って１７個のジスルフィド結合を
形成し得る可能性がある。その構造が詳細に決定されて
いる他の蛋白との類似性に基いて、９０番目のアミノ酸
とＣ末端のゾＯＩＪンとの間のジスルフィド結合が形成
されたアミノ酸配列の構造を推定すると第２図に示した
如き構造となる。Ｎ末端領域の構造についてはこれまで
にいくつかの構造が提案されているが［Ｐｒｏｇｒｅｓ
θｉｎ　Ｆｉｔ）ｒｉｎｏｌｙｓｉｇ、　１９８３　、
６　、２６９−２７３ｐ及びｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、、　１９８４　＊　８１　＊５３
５５−５３５９　］、未だ確定的なもので（工ない。ｔ
−ＰＡの渚も重要な特徴は、９２番目と１７３番目の間
及び１８０番目と２６１番目の間のアミノ酸配列の２つ
のクリングル領域と、セリンゾロテアーゼ領域であり、
クリングル領域はフィブリンへの結合に関与しており、
セリンデａテアーゼ領域はＢ鎖の主要部分を含んでいて
プラスミノ−ｒンの活性化に関与している。セリンゾロ
テアーゼにおいて特に意義のあるアミノ酸は、触媒的な
三組のアミノ酸Ｈ１θ／Ａｓｐ／ｓθｒである。ｔ−Ｐ
Ａにおいては、これらのアミノ酸は、３２２．３７１及
び４６３番目に存在する。２６４番目と３９５番目のシ
スティン残基の間のジスルフィド結合も重要な意義を有
しており、２本鎖のｔ−ＰＡＩＣおけるＡ鎖とＢ鎖とを
保持てる役割りを果たしている。

第１因及び第２図では、慣用的な１文字コーー及び３文
字コードを用いており、これらは以下に示すアミノ酸な
表わ丁。

ｈ８ｐ　　Ｄ　　：アスパ：７ヤン酸 Ｔｈｒ　　Ｔ　　：スレオニン Ｂｅｒ　　８　　：セリン ＢＪｕ　　Ｅ　　：グルタミン酸 ｐｒｏ　　ｐ　　：デロリン ０１７　　Ｇ　　　：　り＝　ＩＪシンｕａ　　Ａ　　
：アラ二ン ａｙｓ　　ｃ　　ニジスティン ｖａ、ｚ　　Ｖ　　：バリン エＬθ　■　：イソロイシン Ｉ、ｓｕ　　Ｌ　　：ロイシン Ｔｙｒ　　Ｙ　　：チロシン Ｐｂ０　Ｆｌ：フェニルアラニン ｓｉｓ　　［（：ヒスチジン ＡｒｇＲ：アルギニン Ｌ７８　　Ｋ　　：リシン ＴｒｐＷニトリシトファン ｏ４ｎ　　Ｑ　　：グルタミン Ｍｓｔ　　Ｍ　　：メチオニン ＡＳｎ　　Ｎ　　：アスパラギン ｔ−ＰＡは、当業界において知られた方法あるいは文献
に報告されている方法のいずれの方法によっても得ろこ
とができる。例えば、ＢｉｏｃｈＬｍｉｃａｅｔ　　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉ、ａ　　ＡＣｔａ、　　　１　９　７　
９　　＋　　　５　８　０　　ｓ　　　１　４　０−　
１　５３　　；　　ｇｐ−Ａ−４１７６６；ｘｐ−Ａ−
１１３３１９またはＥＰ−Ａ−２２７１０２などに記載
された正常もしくは＠瘍セルラインから得ることができ
ろ。

しかしながら、例えば、Ｅｐ−Ａ−９３６１９；ｇｐ−
＊−１１７０５９；　ｇ’ｐ−Ａ−１１７０６０；ｚｐ
−Ａ−１７３５５２；　Ｆ、Ｐ−Ａ−ｉ　７４８３５　
；ＥＰ−Ａ−１７８１Ｄ　５　；　ＥＰ−Ａ−２２５１
７７；ｇｐ−Ａ−２２５２８６；　ｒｐ−ｈ−２２７０
６４；ｇｐ−Ａ−２３７１５７；　Ｆ！Ｐ−Ａ−２４５
９４９；ＷＯ３６１０１５３８；ＷＯ３６１０５５１４
；またはＷＯ３６１０５８０７などに記載された組換え
ＤＮＡ技術を用いて誘導されろ形質転換セルＢ１０１０
ｇ７．　１　９８５．　５　　（７）、　　１　７５０
−１　７５９に記載されたようにして誘導されるチャイ
ニーズハムスター卵巣（ＯＨＯ）セルラインなｔ−ＰＡ
の産生に用いるのが望ましい。この方法では、ジヒ２０
ホレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコーνする遺伝子
とともてクローンｆヒ遺伝子をｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に
トランスフェクトする。ｄｈｆｒを発現する形質転換体
をヌクレオチド欠損培地で選択し、メトトレキセ−１・
の濃度を上昇させながらメトトレキセートにさらす。こ
のようにしてｄｈｆ　ｒ及びｔ−ＰＡ遺伝子をともに増
幅させ、高レベルのｔ−ＰＡを発現し得る安定なセルラ
インを得る。例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂ
ｉｏｐｈｙａｉｃａ　Ａｃｔａ、　ｉ　９７９　＊５８
０　＊　１４０−１５３　；　：ｒ、　ＢＩＯｌ、　Ｏ
ｈｅｍ、。

１９７９．２５４（６）、１９９８−２０Ｃ］３；ｔ’
ｂ１ｄ、　　１　９８１　　、　２５　６　（１３ン、
　　７０３５−７０４　　号Ｋｕｒ、Ｊ、ＢｉＯｃｂｅ
ｍ、　１９８３　、１３２．６８１−６８６；ｇＰ−Ａ
−２３８６０；　ｗｐ−ｈ−４１７６６；ＥＰ−Ａ−１
１３３１９；　ＥＰ−Ａ−１６７１５２；ｗｏ　８８　
／　００６１５　ｐまた）ｓＧＢ−Ａ−２１２２２１９
などに記載された方法のいずれＤ）を用いてｔ−ＰＡを
精製するのが好ましい。

本発明で用いる活性化７°ロチインＣは、哺乳動物Ｗに
ヒトの活性ｆヒプロテイン（３に実質的に対応する生物
学的活性を有する蛋白であればいずれでもよく、またグ
リコジル化されていてもグリコジル比されていなくとも
よい。活性ｆヒプａティンＣシエ、９個のｒ−力ルボキ
シグルタミン酸残基と１個のｒ−ヒダａキシアスパラヤ
ン酸残基とを含むのが望ましい。また活性ｆヒゾａティ
ンＣは１本鎖もしくは２木鎖の形態で存在する。十分に
グリコジル化されたプロティンＣの場合には、ポリアク
リルアミｖｒル亀気泳動で測定した見かけの分子Ｗｋハ
約６２．０００であり、２本鎖プロティンＣの重鎖の分
子前は約４１，０００であり軽鎖の分子看は約２１．０
００であり、またそのプロティンＣの等電点は４．４−
４．８である。

活性化プロティンＣのアミノ酸配列は、Ｆ○θｔａｒθ
ｔ　ａｌ、、　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ、Ｓ
Ｃ１，１９８５＊８２．４６７３−４６７７；またはＢ
ｅｃｋｍａｎ　ａｔａｌ、　、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ
、　Ｒθ８．１９８５．１３．５２３３−５２４７に記
載されたアミノ酸配列と実質的に対応するものが望まし
い。従って、活性化プロテインＣのアミノ酸配列はこれ
らの文献に記載されたものと同じ配列、または１つもし
くはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは介
在あるいハ対立遺伝子もしくは他のアミノ酸の付ｎ口が
あり、その結果得られるアミノ酸配列が上記いずれかの
文献のアミノ酸配列と少なくとも８０４好ましくは少な
くとも９０係の相同性を有し且つ木質的に同様の生物学
的特性及び免疫学的特性を有するものが好ましい。

活性化プロティンＣは２４個のシスティン残基を含有し
ており、従って１２個のジスルフイｖ結合を形成し得る
可能性を持っている。他のビタミンに依存性蛋白との構
造の類似性に基いて活性化プロティンＣの構造が推定さ
れており［ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、、　１９８５．８２
．４７６３−７７〕、それは第３図に示した通りである
。このアミノ酸配列には、ＧＬＡ−メン、表皮成長因子
２メイン及び触媒Ｖメインが含まれており、この触媒Ｖ
メインにはＡａｐ　８８、Ｈｌｓ　４２及びｓｅｒ　１
９１からなる活性部位がある。重鎖と軽鎖と＆工、重鎮
の１０８番目のａｙｓと軽鎖の１４１番目のＯｙｓとの
間で結合している。

活性化プロティンＣは、当業界において公知の方法ある
いは文献に記載された方法のいずれによっても得ろこと
ができる。例えば、Ｋｉａｉ８１θｔａ１１Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　ｐｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９８１　＋　
８０　＋３２０−３３２；または８ｔｅｎｆｌｎ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｑｌｌｅｍ、　１１９７６．２５１．
３５５−３６３に記載された慣用的方法によりヒトのプ
ラズマから単離することができる。あるいは、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて適当な宿主中でクローン比ＤＮＡを発
現させることによって得ることもできる（ＥＰ−Ａ−１
９１６０６及びｙｂＰ−Ａ−２１５５４８）。いずれの
方法の場合でも、プロティンＣを活性化して本発明に用
いることができ、活性化プロティンＣは、スロンピン、
トリジシンまたはＲｕ５ｓθ１１のヨーロッパクサリヘ
ビの毒液中のプロテア−ぜを用いて７ＪＯ水分解するこ
とにより得ることができる［０ｒｔｈｎθｒθｔａ１．
、　Ｂ１００ｈθｍ１８ｔｒ７．１９８８　＋　２７　
＋　２５５８−２５６４］。活性化プロティンＣ１ｔ工
、当業界において公知の方法あるいは文献に記載された
方法を用いて好ましく精製することができる。

木発明においてｔ−ＰＡと活性化プロテインＣとを用い
るに際しては、これらを薬剤または薬学的展剤の形態で
用いるのが好ましい。木発明の用途に用いるに際しては
、活性成分を工それぞれ分離した薬剤もしくはＭ剤の形
態で、あるいはそれらが１緒になった単一の薬剤もしく
は製剤の形態で用いることができる。後者の場合には、
活性成分はいずれも安定で且つ相互に親和性を有してい
なければならない。

また本発明によれば、ｔ−ＰＡ及び活性化プロティンＣ
並びに薬学的に許容し得る担体を含む薬学的製剤が提供
される。

ｔ−ＰＡ及び活性化プロティンＣは、点滴または単回大
量（がラス）注射により、通常は血管内に投与される。

従って非経口投与用製剤が望ましい。

輸送性及び保存性の点から、凍結乾燥製剤の形態で医師
もしくは獣医師に提供するのが好ましい。

医師もしくは獣医師は、使用時に必要に応じて適当な量
の溶媒を用いてこの凍結乾燥製剤を再調製することがで
きる。

ｔ−ＰＡを含有する非経口投与用凍結乾燥展剤は当業界
において公知である。このような例は、例えば、ＥＰ−
Ａ−４ｊ　７６６　；　ｚｐ−Ａ−９３６１９；ｚｐ−
ｈ−１１２１２２；　ＩＰ−Ａ−１１３３１９ｐｚｐ−
Ａ−１２３３０４；　ｗｐ−ｈ−１４３０８１；ｚｐ−
Ａ−１５６１６９；　ｗｐ−ｈ−２１１５９２；’ｚｐ
−ｈ−２１７３７９；　１！！Ｐ−Ａ−２１８１１２；
ｗｏ８６１０１１０４　；特開昭５７−１２０５２３（
出願番号５６−６９３６）及び特開昭５８−６５２１８
（出願番号５６−１６３１４５）などに記載されている
。更には、ＧＢ−Ａ−２１７６７０２゜（）Ｂ−Ａ−２
１７６７０３；及びＧＢ−Ａ−２１８４３５４などに記
載されている。

活性化プロテインＣを含有する非経口投与用凍結乾燥展
剤は当業界において公知であり、例えばｐｐ−Ａ−１９
１６０６などに記載されている。

ｔ−ＰＡ及び活性化プロテインＣをともに単一の製剤中
に含有する非経口投与用凍結乾燥製剤は、ｔ−ＰＡｉた
は活性化プロティンＣそれ自体の製剤を調製する方法と
同様にして調製することができる。しかしながら、前記
したように、活性成分の安定性及びそれらの相互の親和
性を考慮に入れる必要がある。

血管内点滴は、点滴バッグもしくは点滴ボトルあるいは
電動性点滴シリンジ内に非経口投与用溶液を入れこれを
用いて通常行なわれる。非経口投与用溶液は、重力てよ
りあるいは点滴ポンプにより、点滴バッグもしくはざト
ルから患者に供給される。重力により供給する点滴シス
テムを用いた場合には、非経口投与用浴液の投与速度を
十分にコントロールてるが困難であり、従って、点滴ポ
ンプを用いて且つ比較的高濃度の活性成分溶液を用いて
投与するのが好ま１−い。しかしながら、投与速度をよ
り十分にコントロールするごとのできろ電動性点滴シス
テムを用いるのがより好ましい。

また本発明によれば、有効量のｔ−ＰＡ及び活性化プロ
テインＣを哺乳動物に投与すること１：Ｊ）らなる、哺
乳動物の血管での再閉塞を阻止する方法が提供される。

あるいは、本発明によれば、ヒト及び獣医用特に哺乳動
物の血管の再閉塞を阻止するために用いろｔ−ＰＡと活
性化プロテインＣとのコンビネーションが提供されろ。

本発明においてｔ−ＰＡと活性化プロティンＣとを用い
るに際しては、活性成分は、分離した製剤の形態である
いは単一の製剤の形態で一緒にもしくは連続して投与す
ることができる。連続して投与する場合には、活性成分
のコンビネーションによる増強された抗血栓効果が損な
われないように、第２番目の活性成分の投与を遅らせな
いことが重要である。

有孔動物において凝血を除去するあるいは凝血形成を阻
止するために必要なｔ−ＰＡ及び活性化プロテインＣの
有効清げ、例えば投与対象の年令及び体重、治療を必要
とする正確な症状、その重症度、投与ルート、用いるｔ
−ＰＡ及び活性化プロテインＣの形態及び効力などによ
って変動するものであり、また最終的には医師もしくは
獣医師の意図によるものである。しで１しながら、ｔ−
ＰＡの場合の有効量は、体重−当り１時間で２０．００
０−２００．０００ＩＵであり、活性化プロティンＣの
場合の有効量は、体重ゆ当９１時間で０．０１−０．５
哩である。従って、７０ゆのヒト底入の場合には、１時
間当りの有効量は、ｔ−ＰＡの場合には１．４００．０
００−１４，０００，０００工Ｕであり、活性化プロテ
ィンＣの場合には、０．７−３５１１ｇである。

以下の実施例により本発明の詳細な説明するが、これら
実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

例１ 体重３５０−４５０．９の雄性ギニアビッグ（Ｄｕｎｋ
ｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ）をベンドパルビタールで麻酔に
かけた。組換えｔ　−Ｆ　Ａ　（ｒｔ−ＰＡ、）及び活
性化プロティンＣをそれぞれ点滴投与するために、両方
の頚静脈にカニユーレを挿入した。右側の頚動脈１αを
取出し、結合組織を除去した。このさらされた動脈を、
３．７％緩衝化ホルマリン溶液０．０５ｔＲ１を添加し
た吸着紙１ＣＷ１２で包んだ。活性化プロテインＣの６
％を投与し次いで残りの活性（’ＣプロティンＣもしく
（工等号のそのビークルを右側の頚静脈から継続的に点
滴投与しながら、上記の吸着紙で包む直前［ｒｔ−ＰＡ
もしくはそのビークルの点滴を１方の頚静脈から開始し
た。切り出したこの動脈を閉じ、５時間点滴を続けた。

点滴の最後に、右側の頚動脈を再びさらして、動脈中の
血液が流れないことによって生じるホルマリン吸着紙の
下側の凝血の存在を調べた。次いで、動脈のこの断片を
切り出し、血管から凝血が押し出されるか否かＶＣよっ
て血栓の存在を確認した。凝血形成のメカニズムは、先
ず内皮が破裂して血小板の粘着凝集が生じ次いでフィブ
リンが形成されて赤血球が取り込まれることによって凝
血が形成することか示されている（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ
、、　１９８０　、３９　。

４２３）。

ＧＢ−Ａ−２１７６７０２ＶＣ記載さレタ方法ニ従って
、組換えｔ　−ＰＡ　（ｒｔ−ＰＡ　）を得て製剤化し
た。

ｒｔ−ＰＡを再構成して、点滴用に生理食塩水に希釈し
た。活性化プロティンＣを、クエン酸バリウム沈殿及び
イムノアフイニテイーク口マトグラフイ−（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ　ＦｅｄＣｒｏｓｓ）によりヒトプラズマ力ら単
離した。Ｂｕｓθｅｌｌのヨーａツパクサリヘビの毒液
から単離したデａテアーゼを用いて活性化プロティンＣ
を得た。Ｑ、　Ｑ　５　Ｍ　Ｔｒｉ８−ＨＣｊ（ｐＨ７
−４）ｙＯ−１５Ｍ　ＮａＴｊ　ｊ　Ｏ，ＯＱ　２Ｍ　
Ｃ！ａｃｊ２の溶液として活性化プロテインＣを得、更
にウシ血清γルプミンを含む同様のバッファーで希釈し
て点滴用とした。

活性化プロテインＣは別の静脈より点滴投与した。

結果 ｒｔ−ＰＡ単独、あるいは活性化プロティンＣ単独で点
滴した場合の結果、及び両者を一緒に投与した場合の結
果を表１に示した。テストした全動物数に対する、血栓
形成から保護された動物数の比として、その結果を示し
た。表に示した投与量で活性化デミティンＣを単独で投
与した場合には、血栓形成から有効に保護された動物は
いなかった。

ｒｔ−ＰＡを単独で投与した場合には、７匹のうち１匹
だけが血栓形成から保護された。両者を一緒に投与した
場合には、テストした動物８匹のうち６匹が血栓形成か
ら保護された。この結果は、いずれＤ）一方の数分を用
いた結果に比べて、カイ２乗分布テストを用いた場合統
計的に有意差がある（Ｐ＜０．０２）。

表１ （１０６工１７＃）　　Ｃ■／１９ン Ａ　　　　　２　　　　　　０　　　　　　　　１／７
Ｂ　　　　　０　　　　　０．４３　　　　　　　０／
６畳：活性比ゾａティンＣ 結論 ｒｔ−ＰＡ及び活性化デミティンＣは、それぞれ単独で
用いた場合には血栓に対して保護作用を示さないかある
いはほんのわずかの保護作用しか示さないが、これらを
−緒に用いた場合ＶＣは有意な保護作用が観察された。

従って、これら２つの蛋白は、抗血栓剤として共動的に
作用する、引用文献 鎖ｔ−ＰＡの開裂部位を表わ丁。

笛３図はプレゾロプロティンＣのアミノ酸配列を示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物の血管の再閉塞を阻止するために用いる
   組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）と活性化
   プロテインＣとのコンビネーション。
2. （２）ｔ−ＰＡのアミノ酸配列が第１図に示したアミノ
   酸配列に対応しているか、あるいはＮ末端から２４５番
   目のアミノ酸がメチオニンの代わりにバリンに置換され
   ている以外は第１図に示したアミノ酸配列と同じである
   請求項１記載のコンビネーション。
3. （３）活性化プロテインＣのアミノ酸配列が第３図に示
   したアミノ酸配列に対応している請求項１または２記載
   のコンビネーション。
4. （４）ｔ−ＰＡまたは活性化プロティンＣが、組換えＤ
   ＮＡ技術を用いて得られるものである請求項１〜３のい
   ずれか記載のコンビネーション。
5. （５）哺乳動物の血管の再閉塞を阻止するために用いる
   ２０，０００−２００，０００ＩＵ／ｋｇ／ｈｒのｔ−
   ＰＡと０．０１−０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロ
   テインＣとのコンビネーション。
6. （６）請求項１〜５のいずれか記載のコンビネーション
   と薬学的に許容し得る担体とを含有する薬学的製剤。
7. （７）哺乳動物の血管の再閉塞を阻止する薬剤製造のた
   めのｔ−ＰＡと活性化プロティンＣの使用。
8. （８）ｔ−ＰＡのアミノ酸配列が第１図に示したアミノ
   酸配列に対応しているか、あるいはＮ末端から２４５番
   目のアミノ酸がメチオニンの代わりにバリンに置換され
   ている以外は第１図に示したアミノ酸配列と同じである
   請求項７記載の使用。
9. （９）活性化プロテインＣのアミノ酸配列が第３図に示
   したアミノ酸配列に対応している請求項７または８記載
   の使用。
10. （１０）ｔ−ＰＡまたは活性化プロティンＣが組換えＤ
    ＮＡ技術を用いて得られるものである請求項７〜９のい
    ずれか記載の使用。
11. （１１）２０，０００−２００，０００ＩＵ／ｋｇ／ｈ
    ｒのｔ−ＰＡと０．０１−０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活
    性化プロテインＣとを投与することによつて哺乳動物の
    血管の再閉塞を阻止する薬剤製造のためのｔ−ＰＡと活
    性化プロテインＣの使用。
12. （１２）哺乳動物の血管の再閉塞を阻止するための２０
    ，０００−２００，０００ＩＵ／ｋｇ／ｈｒのｔ−ＰＡ
    と０．０１−０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロティ
    ンＣの使用。