JPH049334A - 線溶活性増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリオキノエチレン−ポリオキシプロピレン
共重合体を有効成分とする一本鎖ウロキナーゼの線溶活
性の増強剤に関する。

（従来技術・発明が解決しようとする課題〕現在、スト
レプトキナーゼやウロキナーゼが、血栓？容解剤として
脳血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、象性心筋
梗塞等の血栓、閉塞性疾患の治療に広く使用されるよう
になっている。

しかし、これらの薬剤の使用においては、副作用として
、循環フィブリノゲンの減少や出血傾向が指摘されてき
た。このような理由から、より安全で、しかもより効果
的な、フィブリンに特異的な血栓溶解剤の開発の試みが
なされてきた。

−末鎖ウロキナーゼはフィブリンに特異的な血栓溶解剤
の一つである。この−末鎖ウロキナーゼはプラスミン処
理により、−本鎖構造が切れて一木鎖型のウロキナーゼ
（従来から知られているいわゆるウロキナーゼであり、
以下二本鎖ウロキナゼともいう）に変換する。

ウロキナーゼのようなプラスミノゲンアクチヘーター（
ＰＡ）は、血中を循環するプラスミノゲンを活性化し、
プラスミンに変えることにより血栓を溶解する。しかし
、血栓溶解に重要な意味を持つのは血栓中に存在するプ
ラスミノゲンの活性化に基づく血栓溶解作用である。

末鎖型ウロキナーゼは、活性型であるため、主として血
中プラスミン処理を活性化し、血栓を溶解する。従って
、循環中プラスミンによるフィブリノゲンの分解など全
身ｖＡ溶も引き起こす。それに対し一本鎖ウロキナーゼ
は、二本鎖型ウロキナーゼに比して、プラスミノゲンの
活性化能が著しく弱い、たとえ循環中プラスミノゲンを
活性化し、プラスミンが微量生成したとしても、既時型
の強力なプラスミン阻害因子であるα、ＰＩによって阻
害されるので循環中プラスミノゲンをほとんど活性化し
ない。フィブリンへの親和性が高いことから主として血
栓中のプラスミノゲンを活性化することによって血栓溶
解を引き起こし、全身線溶は生しない。

一方、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重
合体は、商品名プルロニックとしてよく知られた非イオ
ン系界面活性剤であるが、溶血防止作用、赤血球凝集抑
制作用、血小板凝集抑制作用を有しており、人工心肺を
用いる関心術時の溶血を防止する目的で体外循環用回路
充填液に添加して用いられ、その有効性が認められてい
る。

ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体は
、それ自身でも弱い血栓溶解作用を持ち、これまでに、
二本鎖型ウロキナーゼとポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレン共重合体とを併用することにより、ｖＡ溶
活性を増強させることが試みられている（特表千１−５
００５９２号公報）。

しかし、二本鎖型ウロキナーゼとポリオキンエチレン−
ポリオキシプロピレン共重合体の併用においても、前述
の理由により、二本鎖型ウロキナーゼが副作用として全
身線？容をひきおこすという問題があった。

そこで、本発明の目的は全身線溶をおこさない一本鎖ウ
ロキナーゼの線溶活性の増強剤を提供することである。

〔課題を解決するための手段］ このような目的を達成すべく、本発明者らは種々研究を
重ねた結果、−末鎖ウロキナーゼとポリオキシエチレン
−ポリオキシプロピレン共重合体とを併用することによ
って、−末鎖ウロキナーゼの線溶活性が増強されること
、さらに全身線溶の回避ができることを見出した。

本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであり
、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体
を有効成分とする一本鎖ウロキナーゼの線溶活性の増強
剤を提供するものである。

以下、本発明を詳述する。

（１）−末鎖ウロキナーゼ 本発明で使用される一本鎖ウロキナーゼは、そのままで
はほとんど、％Ｉ　？８活性を有しないが、プラスミン
等の酵素処理により、二本鎖ウロキナーゼに変換されて
線溶活性を示すものである。また、フィブリン存在下で
も若干の線溶活性を示すものである。

本発明で使用される一本鎖ウロキナーゼのまず第１の代
表例は、分子量５００００〜５５０００で、−末鎖のペ
プチド結合構造を有するものである。

このような−末鎖ウロキナーゼとしては、たとえば構成
アミノ酸４１１個（アミノ酸配列は後記実施例・実験例
における一本鎖ウロキナーゼの調製の項参照）のものが
挙げられる（特開昭６０６２９８１号公報参照）。

上記−末鎖ウロキナーゼの由来には特に制限はなく、た
とえば、細胞培養法、遺伝子工学法などにより調製され
たものが例示される。細胞培養法は特開昭６０−６２９
８１号公報等に、遺伝子工学法は特開昭６０−１８０５
９１号公報等に開示されている。

本発明でいう一本鎖ウロキナーゼは上記のものに限定さ
れず、その誘導体をも包合する概念である。かかる誘導
体としては一本鎖ウロキナーゼのエビダーマルグロース
ファクタートメインの全領域もしくはその一部を欠失、
または該全領域もしくはその一部を他のアミノ酸残基で
置換されている蛋白質分子等が挙げられる。従って、特
に言及しない限り、本願明細書において一本鎖ウロキナ
ーゼとは一本鎖ウロキナーゼ自体および上記のごとき一
本鎖ウロキナーゼ誘導体を意味するものである。

この−末鎖ウロキナーゼ誘導体は、通常分子量４万〜５
万程度で一本鎖ウロキナーゼ自体と同様に一本鎖のペプ
チド結合構造を有する。また、その線溶活性の発現様式
も上記−末鎖ウロキナーゼ自体と同しである。

この誘導体は、たとえば遺伝子工学的な手法により調製
される（特開昭６３−１４６７８９号公報、特願平１−
１２６４３３号公報または特願平１−１２６４３４号公
報）。

一本鎖ウロキナーゼの比活性としては、合成基質法〔森
田等、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８２．１４９５−１
４９８（１９７７）；笠井等、　Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃ
ｈｅｎ、　２６０．１２３７７−１２３８［１９８５）
　）で測定した場合にそのままでは活性を示さず、フィ
ブリン存在下で１００〜１００ＯＵＫ単位／■程度、プ
ラスミン処理時に８万〜２０万ＵＫ単位／■程度が例示
される。

（ｉｉ　）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
共重合体 本発明で使用されるポリオキシエチレン−ポリオキシプ
ロピレン共重合体は、一般式 ％式％） （式中、重合度係数はそれぞれ、ａ＋ｃ−１３２〜１６
６　、ｂ　＝２８〜３４である）で表される分子量７，
６００〜９．１００の水に易溶解性の化合物である。

（ｉｉｉ　）用法・用量 本発明において、−本領ウロキナーゼは、それ自体で、
または担体、安定化剤（例えば、アルブミン、クエン酸
ナトリウム、アルギニン、デキストラン等）、賦形剤、
ｐＨ調整剤（例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二
水素ナトリウム等〕、その他の添加剤等とともに、通常
注射剤、点滴剤等として調製される。当該製剤は、通常
江射用仄留水、生理食塩液、ブドウ糖注射液等に溶解、
分散して製造される。

一本鎖ウロキナーゼの投与ルートとしては、たとえば静
注、点滴静注または冠動脈的投与が挙げられる。

一本鎖ウロキナーゼの投与量は、患者の体重、性別、症
状等により異なるが、例えば成人−回当たり、１〜１０
００万ＵＫ単位（ウロキナーゼ変換時）程度である。

本発明において、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレン共重合体は、それ自体で、または水、乳化剤、亜
硫酸水素ナトリウム等とともに、通常注射剤等として調
製される。当該製剤は、たとえば水性溶媒（たとえば、
注射用蒸留水、無菌水、糖液、電解室液等）に溶解する
ことによって、またリン脂質等の乳化剤等を使用して自
体既知の手段にて乳化剤とすることによって、またさら
にパーフルオロデカリン、パーフルオロトリプロピルア
ミン、パーフルオロ−Ｎ−メチルデカハイドロイソキノ
リン等のパーフルオロカーボン化合物と共に乳剤として
もよい。

ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の
具体的製剤としては、たとえばフルオシ−ルーＤＡ（商
品名、ミドリ十字社）、エキソコルボール（商品名、ミ
ドリ十字社）　、Ｒｈｅｏｔｈ　ＲＸ（Ｃｙｔ　ＲＸ社
）、プルロニンクＦ６８、ポロクサマ−１８８（−船名
）等が例示される。なお、エキソコルポールは１０％Ｗ
／Ｗ、フルオシ−ルーＯＡは２．７％Ｗ　／　Ｗのポリ
オキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を含有
する。

ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の
投与ルートとしては、たとえば静注または冠動脈的投与
が例示される。

ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の
投与量は、患者の体重、性別、症状に応じて異なるが、
例えば成人−回当たり０．１〜１０ｇ程度である。

一本鎖ウロキナーゼとポリオキンエチレンーポリオキシ
ブロビレン共重合体は、別々または同時ニー、同一ルー
トまたは別個のルートによって投与される。別々に投与
する場合、どちらを先に投与してもよい。投与方法とし
てはたとえば下記のような例が挙げられる。

■ポリオキンエチレンーポリオキンブロビレン共重合体
を静注または冠動脈内投与後、ある程度時間を経てから
（１分〜数十分後）−本領ウロキナーゼを静注または冠
動脈的投与する方法。

■−一本鎖ロキナーゼを静注または冠動脈内投与後、あ
る程度時間を経てから（１分〜数十分後）ポリオキシエ
チレン−ポリオキシプロピレン共重合体を静注または冠
動脈的投与する方法。

■ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレン共重合体
を静注または冠動脈内投与後、−本鎖ウロキナーゼを点
滴静注する方法。

■−一本鎖ロキナーゼを点滴静注している間にポリオキ
シエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を１回〜数
回静注または冠動脈内投与する方法。

〔作用・効果］ 一本鎖ウロキナーゼとポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレン共重合体とを併用することにより、−本領ウ
ロキナーゼによるｗＡ溶活性の異常亢進（全身線溶）を
来すことなく、−末鎖ウロキナーゼの線溶活性を増強す
ることができる。

従って、本発明の線溶活性の増強剤を使用することによ
って、−本領ウロキナーゼの投与量の軽減をはかること
ができ、ひいては副作用である全身線溶が軽減される。

以上のことから、本発明に係わる一本鎖ウロキナーゼの
線溶活性の増強剤の使用は、−本領ウロキナーゼによる
血栓溶解療法にとって極めて有用と考えられる。

〔実施例・実験例〕

本発明をより詳細に説明するために実験例を挙げて説明
するが、本発明はこれらによって何ら限定されるもので
はない。

なお、実験方法は以下のようにした。

（実験方法） 人工血詮皇訓エ ヒト血漿１−当たりに＋２′Ｉ標識ヒトフイブリノゲン
２μＣｉを添加し、十分に混和した。この１２５Ｉ標識
ヒトフィブリノゲン添加ヒト血％　０．２　ｍｌにＣａ
Ｃｌ　２およびヒトトロンビンをそれぞれ終濃度が２５
１および１０Ｕ＃になるように添加し混和した。この混
液を３７゛Ｃで３０分間放置し凝固させた。その後、生
成した血栓を取り出し、生理食塩液で十分に洗浄し、血
栓溶解実験に供した。

ニ第１゛ウロキ　−ゼのｆＬＬ！ 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐ）１５．
５に調製した後、ＣＭ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０に
接触した。０．１６　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，５）で
カラムを洗浄した後、０．１６　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，５）で吸着していた一本鎖ウロキナーゼを溶出させ
た。

一方、−本領ウロキナーゼで予め免疫しておいたマウス
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃの牌臓細胞とマウスミエローマ
細胞をポリエチレングリコールにより融合させたハイブ
リドーマのうち、−本領ウロキナーゼに対する抗体産生
の高いクローンを選択した。この融合細胞の培養液から
、−末鎖ウロキナーゼモノクローナル抗体を回収した。

このモノクローナル抗体をＢｒＣＮ活性化５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　４　Ｂ　（Ｐｈａｒ閣ａｃｉａ社）に固定した
。

このモノクローナル抗体カラムを０．４　Ｍ　ＮａＣ１
含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
、これに前記の一本鎖ウロキナーゼ前駆体を含有する溶
出液を接触した。０．４　Ｍ　Ｎａ（：ｌ含有０．１　
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）でカラムを洗浄した後、
吸着していたウロキナーゼ前駆体を０．５　Ｍ　ＮａＣ
１含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌＣｌ水液８液Ｈ２，５
）で溶出させた。溶出液を除菌ｉ１過した後、凍結乾燥
し比活性が１５０．０００ＵＫ単位／ｍｇ（ウロキナー
ゼ変換時）の高度精製−本領ウロキナーゼを得た。この
−本領ウロキナーゼのアミノ酸配列は後記第３表に示す
通りである。

ｉ夕」コに亙１ぼし匹外足 Ｇｌｔ４１ｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ｐ−メチルクマリルア
ミド）を用いた合成基質法によって測定した。

実験例１ 血栓存在下で一本鎖ウロキナーゼもしくは二本類型ウロ
キナーゼとエキソコルポールを併用したときの線溶活性
をｉｎ　　ｖｉｔｒｏで検討した。

（実験方法） １．７５ｄのヒト血漿に調製した人工血栓を加え、エキ
ソコルポール２５０μゼを終濃度が１２５　μ！／ｌｄ
となるよう添加した。その後、−本領ウロキナーゼ、二
本類型ウロキナーゼをそれぞれ２００μｌ添Ｈし、３７
℃でインキュベートした。添加後０〜５時間まで１時間
ごとに上記溶液を採取し、放射活性を測定した。なお、
血栓溶解率は開始時の人工血栓中の放射活性から各時間
の血漿中に漏出した放射活性を滅じることによって算出
した。

その結果を第１図に示す。

一本鎖ウロキナーゼ５０　Ｔ　Ｕ／ｄにエキソコルボー
ルを１２５μｅ　／　ｄ併用すると適用後２時間を過ぎ
てより血栓溶解率が上昇し始め、適用後５時間では６３
％の血栓溶解率を示した。これに対して、−本領ウロキ
ナーゼ５０１　Ｕ／ｄ単独適用での血栓溶解率は適用後
５時間で１３．５％であり、エキソコルポール１２５μ
ｌ／Ｍ１併用により血栓溶解率が４．７倍に増幅された
ことを示す。

実験例２ ラット肺栓塞モデルで一本鎖ウロキナーゼとエキソコル
ボールを併用したときの線溶活性を検討した。

（実験方法） ＩＺＪ−フィブリンクロットを液体窒素冷却下で粉砕し
て調製した＋２５１−フィブリンサスペンションをラッ
トに静脈内投与し、その後各薬削を２５分間持続静脈内
投与した。薬剤投与を終了して３０分後ラットを層殺し
、その肺放射活性を測定した。血栓溶解率は実験終了時
の肺放射活性残存率を１２５１−フィブリンサスペンシ
ョン投与直後に層殺したラットの肺放射活性残存率で除
することにより求めた。その結果を第１表に示す。

〔以下余白〕

一本鎖ウロキナーゼ１０万ＩＯ／ｋｇ単独でば血栓溶解
率は３８．０％であったが、エキソコルボール６０ｍ１
／ｋｇを併用することにより６２．９％ニ向上した。

実験例３ ラット肺栓塞モデルで一本鎖ウロキナーゼとフルオシ−
ルーＤＡを併用したときの線溶活性を検討した。

（実験方法） 薬剤にフルオシ−ルーＤＡを用いて実験例２と同様の方
法で行なった。その結果を第２表に示す。

（以下余白〕 −末鎖ウロキナーゼ１０万ＩＵ／ｋｇ単独では血栓溶解
率は４９．６％であったが、フルオゾールＤＡ６０ｄ／
ｋｇを併用することにより７２．８％に向上した。以上
の結果から、ｉｎ　　ｖｉｖｏにおいてもポリオキシエ
チレン−ポリオキシプロピレン共重合体と併用すること
により、−末鎖ウロキナーゼの線溶活性が増強されるこ
とが証明された。

［以下余白］

【図面の簡単な説明】

第１図は、−末鎖ウロキナーゼもしくは二本鎖型ウロキ
ナーゼとエキソコルボールを併用したときの血栓溶解率
の経時的変化を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を
   有効成分とする一本鎖ウロキナーゼの線溶活性の増強剤
   。