JPH05368B2 - - Google Patents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は組織プラスミノーゲン賦活物質(t−
PA)およびオキシプリノールまたはその医薬と
して許容されうる塩を有効成分として含有する、
ヒトを含む哺乳動物における血液再灌流期間中の
虚血性心臓組織に対する損傷を阻止するための医
薬組成物に関する。 血塊を形成できる酵素系と凝血系と血塊を溶解
できる酵素系、フイブリン溶解性系との間には動
的平衡が存在し、これは完全開放性血管床を維持
している。損傷からの血液の損失を制限するため
に、損傷した血管に血塊が形成される。損傷の自
然の回復の後に、余分の血塊はフイブリン溶解性
系の作用により溶解される。場合によつては、血
塊が外傷的損傷がなくても形成され、この血塊は
主要血管内に留まり、血液流の部分的なまたは全
体的なことさえある閉塞をもたらすことがある。
これが心臓、肺または脳で生じると、心筋梗塞、
肺塞栓または卒中を発症させることがある。これ
らの症状の組合せは工業国における罹患率および
死亡率の主要病因である。 血塊は線維網よりなり、この線維網はタンパク
分解酵素プラスミンにより溶解させることができ
る。この酵素は不活性前酵素、プラスミノーゲン
(血漿の成分)から、プラスミノーゲン賦活体の
作用により誘導される。2種の免疫学的に異なる
哺乳動物プラスミノーゲン賦活体が存在する。ウ
ロキナーゼとしても知られている内在性プラスミ
ノーゲン賦活体は腎臓により生産される酵素であ
り、尿から単離できる。これはまた、多くの組織
培養源からも調製できる。血管プラスミノーゲン
賦活体として、および組織プラスミノーゲン賦活
物質(t−PA)としても知られている外在性プ
ラスミノーゲン賦活体はかなりの組織ホモジネー
ト(特にヒト子宮)、血管細胞壁および或る種の
細胞培養物から単離できる。これらの2種のプラ
スミノーゲン賦活体に加えて、ベーター−溶血性
ストレプトコツシから生産される細菌生成物、ス
トレプトキナーゼがある。両ウロキナーゼおよび
ストレプトキナーゼが有する主要欠点は、これら
が循環の全体を通して活性であり、血塊の部位だ
けで活性であるものではないことにある。たとえ
ば、これらはフイブリノーゲン、プロトロンビ
ン、フアクターおよびフアクターのようなそ
の他の血液タンパクを破壊し、血液凝固能力を減
少させ、そして出血の危険を増大させる。これに
対して、t−PAの生物学的活性はt−PAが結合
し、活性化されるフイブリンの存在に依存してい
る。従つて、最大活性は血塊の部位、すなわち溶
解されるべきフイブリン網の存在する部位だけで
発現され、これにより出血の危険性が極めて回避
される。 血管内の血液流動の中断は一般に虚血状態を導
く。この状態では、組織は酸素を奪われ、危険に
さらされるようになる。この状態の組織は損傷さ
れているが、まだ潜在的に生きている。しかしな
がら、この状態が或る期間、すなわち3時間また
はそれ以上の間保持されると、組織は壊死状態に
なり、この状態に一度なると、回復はできない。
従つて、血液流の再灌流、すなわち回復ができる
だけ早く生じて、組織が永久的損傷を受ける前に
組織を救うことが重要である。皮肉なことに、血
流再灌流が組織の壊死の前に行なわれたとして
も、この再灌流それ自体が低酸素状態の組織に対
して有害な作用を有する超酸化物基の予想される
生成を含む複合した現象をもたらす。従つて、再
灌流は危険にさらされている組織の部分的回復を
導くことはできるが、組織の残りの部分はこれら
の現象の一種または二種以上が生じることにより
永久的損傷を受ける。 正常状態下に、キサンチンおよびヒポキサンチ
ンは筋肉細胞中に低濃度で存在し、電子受容体と
してNAD(ニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チド)を使用するキサンチンデヒドロゲナーゼに
より尿酸に酵素的に変換される。しかしながら、
虚血状態では、キサンチンおよびヒポキサンチン
の濃度は膨大またはそれ以上の程度にまで一般に
増大する。血液再灌流が生じた場合に、酵素キサ
ンチンデヒドロゲナーゼがそれ自体でキサンチン
オキシダーゼに変換されるものとする知見が提出
されている。キサンチンオキシダーゼの生成は順
に、NADの代りに電子受容体として使用される
酸素によりキサンチンおよびヒポキサンチンを尿
酸に代謝する。この場合には、超酸化物基が副生
成物として生成される〔The New England
Journal of Medicine,1985年、312(3)、159〜
163頁〕。 ここに、t−PAとオキシプリノールまたはそ
の医薬として許容されうる塩との組合せが血液再
灌流期間中の危険にさらされている組織に対する
損傷を阻止することが見い出された。t−PAと
オキシプリノールとの組合せはt−PAまたはオ
キシプリノール各それ自体により付与されるもの
に比較して有意に強力なレベルの阻止を生じさせ
ることが見い出された。従つて、本発明はt−
PAとオキシプリノールまたはその医薬として許
容されうる塩とを有効成分として含有する、ヒト
を含む哺乳動物における血液再灌流期間中の虚血
性心臓組織に対する損傷を阻止するための医薬組
成物に関する。本発明は特に、血塊の排除および
それに続く血液再灌流期間中の危険にさらされて
いる組織に対する損害を阻止するための両方に対
して都合が良い手段を提供する。すなわち、t−
PAおよびオキシプリノールの投与は先ず、t−
PAの既知の血栓溶解作用による血塊の排除を生
じさせ、次いでt−PAとオキシプリノールとの
組合せ作用による組織損傷の阻止を生じさせる。
本発明はいづれか危険にさらされている組織の防
護に使用できるが、特に危険にさらされている心
筋組織に対する損傷の阻止に有用である。 本発明で使用されるt−PAは哺乳動物、特に
ヒトt−PAに実質的に相当するいづれかの生物
活性タンパク質であることができ、グリコシル化
を付随するものおよび付随していないものの両方
を包含する。t−PAはEP−A−112 122に記載
されているような一鎖状または二鎖状t−PAあ
るいはその混合物であることができ、約70000の
ポリアクリルアミドゲルにもとづく見掛け上の分
子量および7.5〜8.0の等電点を有する。好ましく
は、t−PAは約500000IU/mgの比活性を有する
(IU/mgは国際単位/mgであり、国際単位は
WHO、National Institute for Biological
Standards and Control.Holly Hill,
Hampstead,London,NW3 6RB、英国により
定義されているとおりの活性の単位である)。 t−PAのアミノ酸配列は好ましくは第1図に
記載の配列に実質的に相当する。従つて、この配
列は第1図の配列と同一であるか、あるいは対立
形質遺伝子起源またはその他に由来する1個また
は2個以上のアミノ酸の欠落、置き換え、挿入、
転位または付加を含むものであり、生じる配列は
第1図の配列と少なくとも80%、好ましくは90%
の相同性を有し、そしてタンパク質の同一の生物
学的および免疫学的性質を基本的に保有するもの
である。特に、この配列は第1図に示されている
配列と同一であるか、またはセリンN−末端から
245番目の位置に存在するアミノ酸がメチオニン
の代りにバリンである以外は同一の配列を有し、
どちらの配列も場合により、初めの3個のアミノ
酸のいづれかが存在していないか、または場合に
よりGly−Ala−Argの追加のポリペプチドN−
末端前配列を有することができる。 第1図に示されているアミノ酸配列は35個のシ
ステイン残基を有し、従つて、17個のジスルフイ
ド架橋を形成する可能性を有する。その構造がさ
らに詳細に決定されている別のタンパク質からの
類推にもとづき、90番目の位置に存在するアミノ
酸とプロリンC−末端との間の配列(ジスルフイ
ド結合形成から生じる)に係る仮定構造を第2図
に示す。このN−末端領域の構造は、いくつかの
提案がなされているが確実性に乏しい
〔Progress in Fidrinolysis,1983年、6,269〜
273頁およびProc.Natl.Acad.Sci.、1984年、81,
5355〜5359頁〕。t−PAの構造の最も重要な特徴
は2つの環状(Kringle)領域(92番目のアミノ
酸と173番目のアミノ酸との間および180番目のア
ミノ酸と261番目のアミノ酸との間)にあり、こ
の領域はこのタンパク質のフイブリンへの結合に
関与し、そしてもう一つの重要な特徴はセリンプ
ロテアーゼ領域であり、この領域はB−鎖の主要
部分を含み、そしてプラスミノーゲンの賦活に関
与する。セリンプロテアーゼ中の特別に重要なア
ミノ酸は触媒的トリアド(triad),His/Asp/
Serである。t−PAにおいては、これらは322番
目、371番目および463番目の位置に生じる。264
番目と395番目のシステインアミノ酸残基間のジ
スルフイド架橋はまた重要であり、二鎖状形のt
−PAのA鎖とB鎖とを一体に保持する。 第1図および第2図において、慣用の一字コー
ドおよび三字コードを下記のとおりにアミノ酸残
基について使用する: AspDアスパラギン酸 IleIイソロイシン ThrTスレオニン LeuLロイシン SerSセリン TyrYチロシン GluEグルタミン酸 PheFフエニルアラニン ProPプロリン HisHヒスチジン GlyGグリシン LysKリジン AlaAアラニン ArgRアルギニン CysCシステイン TrpWトリプトフアン ValVバリン GlnQグルタミン MetMメチオニン AsnNアスパラギン t−PAは従来技術で開示されているかまたは
知られている方法のいづれかにより得ることがで
きる。一例として、t−PAはBiochimica et
Biophysica Acta,1979年、580,140〜153頁;
EP−A−41766またはEP−A−113319に記載さ
れている種類の正常または新生物セルラインから
得ることができる。しかしながら、t−PAは、
たとえばEP−A−93619,EP−A−117059,EP
−A−117060,EP−A−173552,EP−A−
174835,EP−A−178105,WO86/01538,
WO86/05514またはWO86/05807に記載されて
いるような組換えDNA技法を使用して誘導され
た培養形質転換またはトランスフエクシヨされた
セルラインを得ると好ましい、チヤイニーズ ハ
ムスター卵巣(CHO)細胞をt−PAの製造に使
用し、この細胞をMolecular and Cellular
Biology,1985年、5(7),1750〜1759頁に記
載の方法で誘導すると特に好ましい。この方法で
は、クローン化した遺伝子を、遺伝子をコードす
るジヒドロホレートリダクターゼ(dhfr)によ
り、dhfr-CHO細胞中にコトランスフエクシヨン
する。dhfrを発現する形質転換体はヌクレオシド
欠落メデイアで選択し、増加する濃度のメトトレ
キセートにさらす。dhfrおよびt−PA遺伝子は
このようにして一緒に増副され、高レベルのt−
PAを示すことができる安定なセルラインが得ら
れる。 t−PAは好ましくは、下記の文献に記載され
ているような従来開示されたまたは従来既知の方
法のいづれかを使用して精製する:Biochimica
et Biophysica Acta,1979年、580、140〜153
頁、J.Biol.Chem.1979年、254(6),1998〜2003
頁、同1981年、256(13)、7035〜7041頁、Eur.J.
Biochem.、1983年、132、681〜686頁、EP−A
−41766、EP−A−113319、またはGB−A−
2122219。 別名アロキサンチンとして知られているオキシ
プリノールは4,6−ジヒドロオキシピラゾロ
〔3,4−d〕ピリミジンの名称であり、米国特
許第3624205号の主題であるアロプリノールの主
要代謝物質である。これは従来開示されているま
たは従来既知のいづれか適当な合成方法により製
造でき、またSigma Chemical社(St.Louis、
Missouri、米国)から市販されている。 オキシプリノールの医薬として許容されうる塩
の例にはアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩
が含まれる。ナトリウム塩が特に好ましい。 本発明において、t−PAおよびオキシプリノ
ールまたはその医薬として許容されうる塩を使用
するに際しては、これらの成分を医薬組成物の形
で使用すると好ましい。これらの活性成分は別々
の製剤に使用することができ、あるいは単一の組
合せ製剤の形で使用することもできるが、単一の
製剤の場合には、両活性成分は使用される特定の
製剤内で安定であり、そして相互に両立できなけ
ればならないことは勿論のことである。従つて、
本発明はt−PAおよびオキシプリノールまたは
その医薬として許容されうる塩並びに医薬上で許
容されうる担体を含有する医薬組成物を提供す
る。 一般に、t−PAおよびオキシプリノールまた
はその医薬として許容されうる塩は注入による
か、または全量を一度に注射することによるかの
どちらかで、静脈経路で投与する。従つて、非経
口用組成物が必要である。有意の輸送および貯蔵
上の利益が得られることから、医師または獣医師
に、凍結乾燥した組成物として提供すると好まし
い。医師または獣医師は必要に応じて、適量の溶
剤中でこの凍結乾燥組成物を再構成できる。 t−PAを含有する非経口用の凍結乾燥した医
薬組成物は当技術で知られている。このような従
来技術の例には、EP−A−41766,EP−A−
93619,EP−A−112122,EP−A−113319,EP
−A−123304,EP−A−143081,EP−A−
156169,WO86/01104、日本国特公昭57−
120523号(特願昭56−6936)および日本国特公昭
58−65218号(特願昭56−163145)が含まれる。
追加の例にはGB−A−2176702およびGB−A−
2176703が含まれる。 オキシプリノールを含有する非経口用医薬組成
物は水性および非水性溶液および懸濁液を包含
し、これらはまた酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、
等張剤または生体内利用性を増進させるその他の
成分を含有できる。オキシプリノールの凍結乾燥
医薬組成物は慣用の方法で凍結乾燥させることに
より殺菌溶液から調製できる。 単一の組合せ製剤中にt−PAおよびオキシプ
リノールを一緒に含有する非経口用の凍結乾燥し
た組成物はt−PAまたはオキシプリノールそれ
自体に適する組成物の調製と類似の方法で調製で
きる。しかしながら、前記したように、特定の組
成物中の活性成分の安定性および相互適合性を考
慮して、組成物を適合させる必要がある。 静脈注入は正常、注入用袋またはビン内、ある
いは電気的に作動する注入用器内に含有されてい
る非経口投与用溶液を用いて行なわれる。溶液は
重力供給により、または注入ポンプを使用して、
注入用袋またはビンから患者に与えることができ
る。重力供給注入システムの使用は非経口投与用
溶液の投与速度を全体にわたつて充分に調節でき
ない。従つて、注入ポンプの使用が、特に比較的
高濃度で活性成分を含有する溶液の場合に好適で
ある。しかしながら、投与速度を全体にわたつて
さらに調節することができる電気的に作動する注
入用器を使用すると、特に好ましい。 本発明はヒトおよび動物医療に使用するため
の、特に哺乳動物における再灌流期間中の危険に
さらされている組織に対する損傷の阻止に使用す
るための、t−PAとオキシプリノールまたはそ
の医薬として許容されうる塩との組合せを提供す
る。 本発明は血塊の発生から生じる危険にさらされ
ている組織に対する損傷の阻止において特に有利
であり、前記したように、血塊の排除および危険
にさらされている組織の防護の両方が達成でき
る。 本発明の方法において、t−PAおよびオキシ
プリノールまたはその医薬として許容されうる塩
を使用する場合に、これらの活性成分は別々の組
成物としてまたは単一の組合せ組成物として、同
時的にまたは順次的に投与できる。順次的に投与
する場合には、先ずオキシプリノールを、たとえ
ば静脈注射により投与し、次いでt−PAを連続
静脈内注入により投与すると好ましい。いづれに
しても、t−PAの投与が遅れると、組織損傷阻
止におけるインビボでのこれら2種の成分の組合
せによる増強効果の利益が損なわれるので、遅れ
てはならない。 再灌流期間中の危険にさらされている組織に対
する損傷を阻止するためのt−PAおよびオキシ
プリノールの有効量は、たとえば哺乳動物の年令
および体重、処置を必要とする正確な状態および
その重篤度、投与経路を包含する多くの因子によ
り変わることは勿論のことであり、最終的には担
当医師または獣医師の裁量にまかせられる。しか
しながら、有効投与量は、t−PAの場合に、
150000〜1000000IU/患者の体重Kg/日、好まし
くは300000〜500000IU/患者の体重Kg/日の範
囲が適当であり、そしてオキシプリノールの場合
は、0.5〜10mg/患者の体重Kg/日、好ましくは
2.5〜5mg/Kg/日の範囲が適当である。 次例は本発明を説明するものであり、本発明を
いづれかの点で制限するものと考えられるべきで
はない。 例 1 オキシプリノールの製造 ピラゾール−3,4−ジカルボン酸(7.5g)
(この化合物はChem.Ber.、1899年、32、2292以
降に記載されている)に、塩化チオニル(150ml)
を加える。混合物を10時間還流させる。塩化チオ
ニルを減圧で除去し、生成する粉末状残留物を、
予め0℃でアンモニアを飽和させたt−ブタノー
ルの冷い、攪拌溶液に、1時間にわたり少しづつ
加える。混合物を5時間放置する。沈澱を分離
し、濃水酸化アンモニウム溶液(100ml)と1時
間沸とうさせる。溶液を水蒸気浴上で蒸発乾燥さ
せ、残留物を沸とう水から結晶化させる。このよ
うにして生成された化合物(ピラゾール−3,4
−ジカルボキシアミド)は無色枝状物であり、
327℃で分解を伴ない溶融する。 0.4M次亜塩素酸ナトリウム溶液(16.6ml)の
冷い溶液に、ピラゾール−3,4−ジカルボキシ
アミド(500mg)を加える。反応混合物はピンク
色に変り、次いで淡い黄色に変わる。0℃で1時
間放置した後に、混合物を2N塩酸でPH3に酸性
にし、綿状沈殿を分離する。生成物を沸とう水か
ら再結晶させ、オキシプリノールのバラ花様の無
色針状物を得る。 例 2 オキシプリノールの注射製剤の調製 成分 mg/バイアル オキシプリノール 150.0 水酸化ナトリウム、IN PHを12.5にする適量 注射用水 全量を15mlにする適量 オキシプリノールを水10ml中の水酸化ナトリウ
ム溶液に加える。溶液のPHを水酸化ナトリウム
(IN)を用いて12.5に調製する。追加の水を加え
た後に、溶液を濾過し、殺菌し、次いで無菌バイ
アルに分配する。溶液を凍結乾燥させて無菌の無
水ケーキ状物を生成し、バイアルを無菌条件下に
密封する。溶液は注射のすぐ前に水で再構成す
る。 例 3 t−PAの注射製剤の調製 t−PAの凍結乾燥した注射製剤をGB−A−
2176702に実質的に記載のとおりにして調製する。 例 4 危険にさらされている組織の防護におけるt−
PAおよびオキシプリノールの相乗効果の証明 (a) 方法 雄のビーグル犬(10〜12Kg)をペントバルビタ
ールナトリウムで麻酔させ、挿管し、Haruard呼
吸器を経て室内空気で呼吸させる。注入用および
動脈血圧測定用カテーテルを左頸静脈および左頸
動脈に植え込む。開胸術を第4肋骨内面間隙の部
位で行ない、心臓を心膜離被架に吊し、左下行動
脈(LAD)を第一主要対角枝(diagonalbranch)
のすぐ下の位置で単離する。LAD上に電磁流動
探触子をつける。流動探触子から速い位置に1/0
絹糸係蹄をほどこして、LADの90分閉塞を生じ
させる。処置はこの係締による閉塞の開放前の15
分に静脈投与により開始し、開放後の45分間継続
する。開胸を閉め、動物を手術状態から回復させ
る。動物は係締後の24時間に再び麻酔し、LAD
における血流を再評価する。次いで、心臓を梗塞
サイズの死後定量用に分離する。 5群の犬を評価する。第1群は塩類溶液対照用
にする。第2群にはt−PA1.5mg/Kgを投与す
る。第3群にはt−PA3mg/Kgを投与する。第4
群にはオキシプリノールのナトリウム塩10mg/Kg
を投与する。第5群にはt−PA1.5mg/Kgおよび
オキシプリノールのナトリウムの塩10mg/Kgの両
方を投与する。t−PAは例3の凍結乾燥製剤か
ら水で再構成して得られた非経口投与用製剤とし
て投与する。同様に、オキシプリノールは例2の
凍結乾燥製剤から水で再構成し、塩酸とすりまぜ
ることにより9.3のPHに戻して得られた非経口投
与用製剤を投与する。t−PAは440000IU/mgの
比活性を有した。 心筋梗塞のサイズは生体外二重再灌流技法によ
り定量する。カテーテルを係締部位からすぐ離れ
て、LAD中に挿入し、冠状動脈口上の大動脈中
に挿入する。LAD冠状動脈床は0.02Mリン酸カ
リウム緩衝液(PH7.4)中の1.5%トリフエニルテ
トラゾリウム塩酸塩(TTC)を灌流させる。大
動脈には100mm水銀の一定圧力で、それらの各ス
テインを5分間灌流させる。心臓をその先端−底
部軸に対して垂直に8mmの厚さに切る。血液流が
LADに依存する解剖学的依存性による梗塞の危
険がある左心室領域はこの領域にEvans青が欠落
していることにより同定される。危険域内の梗塞
心筋の領域はデヒドロゲナーゼ酵素の損失によ
り、TTCを灌流させた場合に組織が染色されな
いことにより証明される。 心室横断面を透明なアクリル製被覆板を通して
注意深く検査し、梗塞形態の永久的記録を作りそ
して梗塞サイズを測面法で確認する。次いで心室
面の右心室筋肉、弁および脂肪組織を切り取る。
左心室の危険領域および梗塞領域の全てを注意深
く切除して分離し、重量を測定する。梗塞サイズ
は危険状態の解剖学的領域のパーセントとして表
わす。薬物処置群の対照群に対する統計学的比較
は多重比較に係るBonferroniの方法
(Circulation Research,1980年、47,1〜9頁)
を使用するワン ウエイ分散分析法(one way
analysis of variance)(ANOVA)を用いて行
なう。0.05より小さいp値を有意の規準とする。 (b) 結果
PA)およびオキシプリノールまたはその医薬と
して許容されうる塩を有効成分として含有する、
ヒトを含む哺乳動物における血液再灌流期間中の
虚血性心臓組織に対する損傷を阻止するための医
薬組成物に関する。 血塊を形成できる酵素系と凝血系と血塊を溶解
できる酵素系、フイブリン溶解性系との間には動
的平衡が存在し、これは完全開放性血管床を維持
している。損傷からの血液の損失を制限するため
に、損傷した血管に血塊が形成される。損傷の自
然の回復の後に、余分の血塊はフイブリン溶解性
系の作用により溶解される。場合によつては、血
塊が外傷的損傷がなくても形成され、この血塊は
主要血管内に留まり、血液流の部分的なまたは全
体的なことさえある閉塞をもたらすことがある。
これが心臓、肺または脳で生じると、心筋梗塞、
肺塞栓または卒中を発症させることがある。これ
らの症状の組合せは工業国における罹患率および
死亡率の主要病因である。 血塊は線維網よりなり、この線維網はタンパク
分解酵素プラスミンにより溶解させることができ
る。この酵素は不活性前酵素、プラスミノーゲン
(血漿の成分)から、プラスミノーゲン賦活体の
作用により誘導される。2種の免疫学的に異なる
哺乳動物プラスミノーゲン賦活体が存在する。ウ
ロキナーゼとしても知られている内在性プラスミ
ノーゲン賦活体は腎臓により生産される酵素であ
り、尿から単離できる。これはまた、多くの組織
培養源からも調製できる。血管プラスミノーゲン
賦活体として、および組織プラスミノーゲン賦活
物質(t−PA)としても知られている外在性プ
ラスミノーゲン賦活体はかなりの組織ホモジネー
ト(特にヒト子宮)、血管細胞壁および或る種の
細胞培養物から単離できる。これらの2種のプラ
スミノーゲン賦活体に加えて、ベーター−溶血性
ストレプトコツシから生産される細菌生成物、ス
トレプトキナーゼがある。両ウロキナーゼおよび
ストレプトキナーゼが有する主要欠点は、これら
が循環の全体を通して活性であり、血塊の部位だ
けで活性であるものではないことにある。たとえ
ば、これらはフイブリノーゲン、プロトロンビ
ン、フアクターおよびフアクターのようなそ
の他の血液タンパクを破壊し、血液凝固能力を減
少させ、そして出血の危険を増大させる。これに
対して、t−PAの生物学的活性はt−PAが結合
し、活性化されるフイブリンの存在に依存してい
る。従つて、最大活性は血塊の部位、すなわち溶
解されるべきフイブリン網の存在する部位だけで
発現され、これにより出血の危険性が極めて回避
される。 血管内の血液流動の中断は一般に虚血状態を導
く。この状態では、組織は酸素を奪われ、危険に
さらされるようになる。この状態の組織は損傷さ
れているが、まだ潜在的に生きている。しかしな
がら、この状態が或る期間、すなわち3時間また
はそれ以上の間保持されると、組織は壊死状態に
なり、この状態に一度なると、回復はできない。
従つて、血液流の再灌流、すなわち回復ができる
だけ早く生じて、組織が永久的損傷を受ける前に
組織を救うことが重要である。皮肉なことに、血
流再灌流が組織の壊死の前に行なわれたとして
も、この再灌流それ自体が低酸素状態の組織に対
して有害な作用を有する超酸化物基の予想される
生成を含む複合した現象をもたらす。従つて、再
灌流は危険にさらされている組織の部分的回復を
導くことはできるが、組織の残りの部分はこれら
の現象の一種または二種以上が生じることにより
永久的損傷を受ける。 正常状態下に、キサンチンおよびヒポキサンチ
ンは筋肉細胞中に低濃度で存在し、電子受容体と
してNAD(ニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チド)を使用するキサンチンデヒドロゲナーゼに
より尿酸に酵素的に変換される。しかしながら、
虚血状態では、キサンチンおよびヒポキサンチン
の濃度は膨大またはそれ以上の程度にまで一般に
増大する。血液再灌流が生じた場合に、酵素キサ
ンチンデヒドロゲナーゼがそれ自体でキサンチン
オキシダーゼに変換されるものとする知見が提出
されている。キサンチンオキシダーゼの生成は順
に、NADの代りに電子受容体として使用される
酸素によりキサンチンおよびヒポキサンチンを尿
酸に代謝する。この場合には、超酸化物基が副生
成物として生成される〔The New England
Journal of Medicine,1985年、312(3)、159〜
163頁〕。 ここに、t−PAとオキシプリノールまたはそ
の医薬として許容されうる塩との組合せが血液再
灌流期間中の危険にさらされている組織に対する
損傷を阻止することが見い出された。t−PAと
オキシプリノールとの組合せはt−PAまたはオ
キシプリノール各それ自体により付与されるもの
に比較して有意に強力なレベルの阻止を生じさせ
ることが見い出された。従つて、本発明はt−
PAとオキシプリノールまたはその医薬として許
容されうる塩とを有効成分として含有する、ヒト
を含む哺乳動物における血液再灌流期間中の虚血
性心臓組織に対する損傷を阻止するための医薬組
成物に関する。本発明は特に、血塊の排除および
それに続く血液再灌流期間中の危険にさらされて
いる組織に対する損害を阻止するための両方に対
して都合が良い手段を提供する。すなわち、t−
PAおよびオキシプリノールの投与は先ず、t−
PAの既知の血栓溶解作用による血塊の排除を生
じさせ、次いでt−PAとオキシプリノールとの
組合せ作用による組織損傷の阻止を生じさせる。
本発明はいづれか危険にさらされている組織の防
護に使用できるが、特に危険にさらされている心
筋組織に対する損傷の阻止に有用である。 本発明で使用されるt−PAは哺乳動物、特に
ヒトt−PAに実質的に相当するいづれかの生物
活性タンパク質であることができ、グリコシル化
を付随するものおよび付随していないものの両方
を包含する。t−PAはEP−A−112 122に記載
されているような一鎖状または二鎖状t−PAあ
るいはその混合物であることができ、約70000の
ポリアクリルアミドゲルにもとづく見掛け上の分
子量および7.5〜8.0の等電点を有する。好ましく
は、t−PAは約500000IU/mgの比活性を有する
(IU/mgは国際単位/mgであり、国際単位は
WHO、National Institute for Biological
Standards and Control.Holly Hill,
Hampstead,London,NW3 6RB、英国により
定義されているとおりの活性の単位である)。 t−PAのアミノ酸配列は好ましくは第1図に
記載の配列に実質的に相当する。従つて、この配
列は第1図の配列と同一であるか、あるいは対立
形質遺伝子起源またはその他に由来する1個また
は2個以上のアミノ酸の欠落、置き換え、挿入、
転位または付加を含むものであり、生じる配列は
第1図の配列と少なくとも80%、好ましくは90%
の相同性を有し、そしてタンパク質の同一の生物
学的および免疫学的性質を基本的に保有するもの
である。特に、この配列は第1図に示されている
配列と同一であるか、またはセリンN−末端から
245番目の位置に存在するアミノ酸がメチオニン
の代りにバリンである以外は同一の配列を有し、
どちらの配列も場合により、初めの3個のアミノ
酸のいづれかが存在していないか、または場合に
よりGly−Ala−Argの追加のポリペプチドN−
末端前配列を有することができる。 第1図に示されているアミノ酸配列は35個のシ
ステイン残基を有し、従つて、17個のジスルフイ
ド架橋を形成する可能性を有する。その構造がさ
らに詳細に決定されている別のタンパク質からの
類推にもとづき、90番目の位置に存在するアミノ
酸とプロリンC−末端との間の配列(ジスルフイ
ド結合形成から生じる)に係る仮定構造を第2図
に示す。このN−末端領域の構造は、いくつかの
提案がなされているが確実性に乏しい
〔Progress in Fidrinolysis,1983年、6,269〜
273頁およびProc.Natl.Acad.Sci.、1984年、81,
5355〜5359頁〕。t−PAの構造の最も重要な特徴
は2つの環状(Kringle)領域(92番目のアミノ
酸と173番目のアミノ酸との間および180番目のア
ミノ酸と261番目のアミノ酸との間)にあり、こ
の領域はこのタンパク質のフイブリンへの結合に
関与し、そしてもう一つの重要な特徴はセリンプ
ロテアーゼ領域であり、この領域はB−鎖の主要
部分を含み、そしてプラスミノーゲンの賦活に関
与する。セリンプロテアーゼ中の特別に重要なア
ミノ酸は触媒的トリアド(triad),His/Asp/
Serである。t−PAにおいては、これらは322番
目、371番目および463番目の位置に生じる。264
番目と395番目のシステインアミノ酸残基間のジ
スルフイド架橋はまた重要であり、二鎖状形のt
−PAのA鎖とB鎖とを一体に保持する。 第1図および第2図において、慣用の一字コー
ドおよび三字コードを下記のとおりにアミノ酸残
基について使用する: AspDアスパラギン酸 IleIイソロイシン ThrTスレオニン LeuLロイシン SerSセリン TyrYチロシン GluEグルタミン酸 PheFフエニルアラニン ProPプロリン HisHヒスチジン GlyGグリシン LysKリジン AlaAアラニン ArgRアルギニン CysCシステイン TrpWトリプトフアン ValVバリン GlnQグルタミン MetMメチオニン AsnNアスパラギン t−PAは従来技術で開示されているかまたは
知られている方法のいづれかにより得ることがで
きる。一例として、t−PAはBiochimica et
Biophysica Acta,1979年、580,140〜153頁;
EP−A−41766またはEP−A−113319に記載さ
れている種類の正常または新生物セルラインから
得ることができる。しかしながら、t−PAは、
たとえばEP−A−93619,EP−A−117059,EP
−A−117060,EP−A−173552,EP−A−
174835,EP−A−178105,WO86/01538,
WO86/05514またはWO86/05807に記載されて
いるような組換えDNA技法を使用して誘導され
た培養形質転換またはトランスフエクシヨされた
セルラインを得ると好ましい、チヤイニーズ ハ
ムスター卵巣(CHO)細胞をt−PAの製造に使
用し、この細胞をMolecular and Cellular
Biology,1985年、5(7),1750〜1759頁に記
載の方法で誘導すると特に好ましい。この方法で
は、クローン化した遺伝子を、遺伝子をコードす
るジヒドロホレートリダクターゼ(dhfr)によ
り、dhfr-CHO細胞中にコトランスフエクシヨン
する。dhfrを発現する形質転換体はヌクレオシド
欠落メデイアで選択し、増加する濃度のメトトレ
キセートにさらす。dhfrおよびt−PA遺伝子は
このようにして一緒に増副され、高レベルのt−
PAを示すことができる安定なセルラインが得ら
れる。 t−PAは好ましくは、下記の文献に記載され
ているような従来開示されたまたは従来既知の方
法のいづれかを使用して精製する:Biochimica
et Biophysica Acta,1979年、580、140〜153
頁、J.Biol.Chem.1979年、254(6),1998〜2003
頁、同1981年、256(13)、7035〜7041頁、Eur.J.
Biochem.、1983年、132、681〜686頁、EP−A
−41766、EP−A−113319、またはGB−A−
2122219。 別名アロキサンチンとして知られているオキシ
プリノールは4,6−ジヒドロオキシピラゾロ
〔3,4−d〕ピリミジンの名称であり、米国特
許第3624205号の主題であるアロプリノールの主
要代謝物質である。これは従来開示されているま
たは従来既知のいづれか適当な合成方法により製
造でき、またSigma Chemical社(St.Louis、
Missouri、米国)から市販されている。 オキシプリノールの医薬として許容されうる塩
の例にはアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩
が含まれる。ナトリウム塩が特に好ましい。 本発明において、t−PAおよびオキシプリノ
ールまたはその医薬として許容されうる塩を使用
するに際しては、これらの成分を医薬組成物の形
で使用すると好ましい。これらの活性成分は別々
の製剤に使用することができ、あるいは単一の組
合せ製剤の形で使用することもできるが、単一の
製剤の場合には、両活性成分は使用される特定の
製剤内で安定であり、そして相互に両立できなけ
ればならないことは勿論のことである。従つて、
本発明はt−PAおよびオキシプリノールまたは
その医薬として許容されうる塩並びに医薬上で許
容されうる担体を含有する医薬組成物を提供す
る。 一般に、t−PAおよびオキシプリノールまた
はその医薬として許容されうる塩は注入による
か、または全量を一度に注射することによるかの
どちらかで、静脈経路で投与する。従つて、非経
口用組成物が必要である。有意の輸送および貯蔵
上の利益が得られることから、医師または獣医師
に、凍結乾燥した組成物として提供すると好まし
い。医師または獣医師は必要に応じて、適量の溶
剤中でこの凍結乾燥組成物を再構成できる。 t−PAを含有する非経口用の凍結乾燥した医
薬組成物は当技術で知られている。このような従
来技術の例には、EP−A−41766,EP−A−
93619,EP−A−112122,EP−A−113319,EP
−A−123304,EP−A−143081,EP−A−
156169,WO86/01104、日本国特公昭57−
120523号(特願昭56−6936)および日本国特公昭
58−65218号(特願昭56−163145)が含まれる。
追加の例にはGB−A−2176702およびGB−A−
2176703が含まれる。 オキシプリノールを含有する非経口用医薬組成
物は水性および非水性溶液および懸濁液を包含
し、これらはまた酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、
等張剤または生体内利用性を増進させるその他の
成分を含有できる。オキシプリノールの凍結乾燥
医薬組成物は慣用の方法で凍結乾燥させることに
より殺菌溶液から調製できる。 単一の組合せ製剤中にt−PAおよびオキシプ
リノールを一緒に含有する非経口用の凍結乾燥し
た組成物はt−PAまたはオキシプリノールそれ
自体に適する組成物の調製と類似の方法で調製で
きる。しかしながら、前記したように、特定の組
成物中の活性成分の安定性および相互適合性を考
慮して、組成物を適合させる必要がある。 静脈注入は正常、注入用袋またはビン内、ある
いは電気的に作動する注入用器内に含有されてい
る非経口投与用溶液を用いて行なわれる。溶液は
重力供給により、または注入ポンプを使用して、
注入用袋またはビンから患者に与えることができ
る。重力供給注入システムの使用は非経口投与用
溶液の投与速度を全体にわたつて充分に調節でき
ない。従つて、注入ポンプの使用が、特に比較的
高濃度で活性成分を含有する溶液の場合に好適で
ある。しかしながら、投与速度を全体にわたつて
さらに調節することができる電気的に作動する注
入用器を使用すると、特に好ましい。 本発明はヒトおよび動物医療に使用するため
の、特に哺乳動物における再灌流期間中の危険に
さらされている組織に対する損傷の阻止に使用す
るための、t−PAとオキシプリノールまたはそ
の医薬として許容されうる塩との組合せを提供す
る。 本発明は血塊の発生から生じる危険にさらされ
ている組織に対する損傷の阻止において特に有利
であり、前記したように、血塊の排除および危険
にさらされている組織の防護の両方が達成でき
る。 本発明の方法において、t−PAおよびオキシ
プリノールまたはその医薬として許容されうる塩
を使用する場合に、これらの活性成分は別々の組
成物としてまたは単一の組合せ組成物として、同
時的にまたは順次的に投与できる。順次的に投与
する場合には、先ずオキシプリノールを、たとえ
ば静脈注射により投与し、次いでt−PAを連続
静脈内注入により投与すると好ましい。いづれに
しても、t−PAの投与が遅れると、組織損傷阻
止におけるインビボでのこれら2種の成分の組合
せによる増強効果の利益が損なわれるので、遅れ
てはならない。 再灌流期間中の危険にさらされている組織に対
する損傷を阻止するためのt−PAおよびオキシ
プリノールの有効量は、たとえば哺乳動物の年令
および体重、処置を必要とする正確な状態および
その重篤度、投与経路を包含する多くの因子によ
り変わることは勿論のことであり、最終的には担
当医師または獣医師の裁量にまかせられる。しか
しながら、有効投与量は、t−PAの場合に、
150000〜1000000IU/患者の体重Kg/日、好まし
くは300000〜500000IU/患者の体重Kg/日の範
囲が適当であり、そしてオキシプリノールの場合
は、0.5〜10mg/患者の体重Kg/日、好ましくは
2.5〜5mg/Kg/日の範囲が適当である。 次例は本発明を説明するものであり、本発明を
いづれかの点で制限するものと考えられるべきで
はない。 例 1 オキシプリノールの製造 ピラゾール−3,4−ジカルボン酸(7.5g)
(この化合物はChem.Ber.、1899年、32、2292以
降に記載されている)に、塩化チオニル(150ml)
を加える。混合物を10時間還流させる。塩化チオ
ニルを減圧で除去し、生成する粉末状残留物を、
予め0℃でアンモニアを飽和させたt−ブタノー
ルの冷い、攪拌溶液に、1時間にわたり少しづつ
加える。混合物を5時間放置する。沈澱を分離
し、濃水酸化アンモニウム溶液(100ml)と1時
間沸とうさせる。溶液を水蒸気浴上で蒸発乾燥さ
せ、残留物を沸とう水から結晶化させる。このよ
うにして生成された化合物(ピラゾール−3,4
−ジカルボキシアミド)は無色枝状物であり、
327℃で分解を伴ない溶融する。 0.4M次亜塩素酸ナトリウム溶液(16.6ml)の
冷い溶液に、ピラゾール−3,4−ジカルボキシ
アミド(500mg)を加える。反応混合物はピンク
色に変り、次いで淡い黄色に変わる。0℃で1時
間放置した後に、混合物を2N塩酸でPH3に酸性
にし、綿状沈殿を分離する。生成物を沸とう水か
ら再結晶させ、オキシプリノールのバラ花様の無
色針状物を得る。 例 2 オキシプリノールの注射製剤の調製 成分 mg/バイアル オキシプリノール 150.0 水酸化ナトリウム、IN PHを12.5にする適量 注射用水 全量を15mlにする適量 オキシプリノールを水10ml中の水酸化ナトリウ
ム溶液に加える。溶液のPHを水酸化ナトリウム
(IN)を用いて12.5に調製する。追加の水を加え
た後に、溶液を濾過し、殺菌し、次いで無菌バイ
アルに分配する。溶液を凍結乾燥させて無菌の無
水ケーキ状物を生成し、バイアルを無菌条件下に
密封する。溶液は注射のすぐ前に水で再構成す
る。 例 3 t−PAの注射製剤の調製 t−PAの凍結乾燥した注射製剤をGB−A−
2176702に実質的に記載のとおりにして調製する。 例 4 危険にさらされている組織の防護におけるt−
PAおよびオキシプリノールの相乗効果の証明 (a) 方法 雄のビーグル犬(10〜12Kg)をペントバルビタ
ールナトリウムで麻酔させ、挿管し、Haruard呼
吸器を経て室内空気で呼吸させる。注入用および
動脈血圧測定用カテーテルを左頸静脈および左頸
動脈に植え込む。開胸術を第4肋骨内面間隙の部
位で行ない、心臓を心膜離被架に吊し、左下行動
脈(LAD)を第一主要対角枝(diagonalbranch)
のすぐ下の位置で単離する。LAD上に電磁流動
探触子をつける。流動探触子から速い位置に1/0
絹糸係蹄をほどこして、LADの90分閉塞を生じ
させる。処置はこの係締による閉塞の開放前の15
分に静脈投与により開始し、開放後の45分間継続
する。開胸を閉め、動物を手術状態から回復させ
る。動物は係締後の24時間に再び麻酔し、LAD
における血流を再評価する。次いで、心臓を梗塞
サイズの死後定量用に分離する。 5群の犬を評価する。第1群は塩類溶液対照用
にする。第2群にはt−PA1.5mg/Kgを投与す
る。第3群にはt−PA3mg/Kgを投与する。第4
群にはオキシプリノールのナトリウム塩10mg/Kg
を投与する。第5群にはt−PA1.5mg/Kgおよび
オキシプリノールのナトリウムの塩10mg/Kgの両
方を投与する。t−PAは例3の凍結乾燥製剤か
ら水で再構成して得られた非経口投与用製剤とし
て投与する。同様に、オキシプリノールは例2の
凍結乾燥製剤から水で再構成し、塩酸とすりまぜ
ることにより9.3のPHに戻して得られた非経口投
与用製剤を投与する。t−PAは440000IU/mgの
比活性を有した。 心筋梗塞のサイズは生体外二重再灌流技法によ
り定量する。カテーテルを係締部位からすぐ離れ
て、LAD中に挿入し、冠状動脈口上の大動脈中
に挿入する。LAD冠状動脈床は0.02Mリン酸カ
リウム緩衝液(PH7.4)中の1.5%トリフエニルテ
トラゾリウム塩酸塩(TTC)を灌流させる。大
動脈には100mm水銀の一定圧力で、それらの各ス
テインを5分間灌流させる。心臓をその先端−底
部軸に対して垂直に8mmの厚さに切る。血液流が
LADに依存する解剖学的依存性による梗塞の危
険がある左心室領域はこの領域にEvans青が欠落
していることにより同定される。危険域内の梗塞
心筋の領域はデヒドロゲナーゼ酵素の損失によ
り、TTCを灌流させた場合に組織が染色されな
いことにより証明される。 心室横断面を透明なアクリル製被覆板を通して
注意深く検査し、梗塞形態の永久的記録を作りそ
して梗塞サイズを測面法で確認する。次いで心室
面の右心室筋肉、弁および脂肪組織を切り取る。
左心室の危険領域および梗塞領域の全てを注意深
く切除して分離し、重量を測定する。梗塞サイズ
は危険状態の解剖学的領域のパーセントとして表
わす。薬物処置群の対照群に対する統計学的比較
は多重比較に係るBonferroniの方法
(Circulation Research,1980年、47,1〜9頁)
を使用するワン ウエイ分散分析法(one way
analysis of variance)(ANOVA)を用いて行
なう。0.05より小さいp値を有意の規準とする。 (b) 結果
【表】
* このデータは平均値±標準誤差とし
て表わす。
LADの機械的係締により虚血状態にされた左
心室の割合は処置群のいづれかと対照群との間に
ANOVAによる有意O差違はなかつた。 (c) 結論 t−PAとオキシプリノールとの組合せは血流
再灌流期間中の危険にさらされている組織におけ
る損傷を阻止する作用において相乗的効果を達成
した。
て表わす。
LADの機械的係締により虚血状態にされた左
心室の割合は処置群のいづれかと対照群との間に
ANOVAによる有意O差違はなかつた。 (c) 結論 t−PAとオキシプリノールとの組合せは血流
再灌流期間中の危険にさらされている組織におけ
る損傷を阻止する作用において相乗的効果を達成
した。
第1図はt−PAのアミノ酸配列を示すもので
あり、そして第2図は二鎖状形t−PAの構造特
徴を示すものであり、〓部位は二鎖状形t−PA
を生じさせる一鎖状形t−PAの***部位を示し、
A鎖は2個の環状域を有し、そしてB鎖はセリン
プロテアーゼ域を有する。
あり、そして第2図は二鎖状形t−PAの構造特
徴を示すものであり、〓部位は二鎖状形t−PA
を生じさせる一鎖状形t−PAの***部位を示し、
A鎖は2個の環状域を有し、そしてB鎖はセリン
プロテアーゼ域を有する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 t−PAおよびオキシプリノールまたはその
医薬として許容されうる塩を有効成分として含有
する、ヒトを含む哺乳動物における血液再灌流期
間中の虚血性心臓組織に対する損傷を阻止するた
めの医薬組成物。 2 t−PAが一鎖状形である、特許請求の範囲
第1項に記載の医薬組成物。 3 t−PAが二鎖状形である、特許請求の範囲
第1項に記載の医薬組成物。 4 t−PAが以下に記載のアミノ酸配列を有す
るが、またはセリンN−末端から245番目の位置
に存在するアミノ酸がメチオニンの代りにバリン
である以外は以下に記載のアミノ酸配列を有し、
これら両配列は場合により、初めの三個のアミノ
酸が存在していなくてもよく、またはGly−Ala
−Argの追加のポリペプチドN−末端部分配列を
有していてもよい、特許請求の範囲第1項〜第3
項のいずれか一項に記載の医薬組成物。 【表】 【表】 (5) オキシプリノールの医薬として許容されうる
塩がナトリウム塩である、特許請求の範囲第1項
〜第4項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8606283 | 1986-03-13 | ||
GB868606283A GB8606283D0 (en) | 1986-03-13 | 1986-03-13 | Cell protection |
GB8623835 | 1986-10-03 | ||
GB8701976 | 1987-01-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62230730A JPS62230730A (ja) | 1987-10-09 |
JPH05368B2 true JPH05368B2 (ja) | 1993-01-05 |
Family
ID=10594577
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62057859A Granted JPS62230730A (ja) | 1986-03-13 | 1987-03-12 | 新規な医薬組成物 |
JP5869987A Pending JPS62230725A (ja) | 1986-03-13 | 1987-03-13 | 細胞防護剤 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5869987A Pending JPS62230725A (ja) | 1986-03-13 | 1987-03-13 | 細胞防護剤 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JPS62230730A (ja) |
GB (1) | GB8606283D0 (ja) |
ZA (1) | ZA871814B (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0594573A1 (en) * | 1989-11-18 | 1994-05-04 | AgrEvo UK Limited | Preparation of propenoic acid derivatives |
-
1986
- 1986-03-13 GB GB868606283A patent/GB8606283D0/en active Pending
-
1987
- 1987-03-12 JP JP62057859A patent/JPS62230730A/ja active Granted
- 1987-03-12 ZA ZA871814A patent/ZA871814B/xx unknown
- 1987-03-13 JP JP5869987A patent/JPS62230725A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS62230725A (ja) | 1987-10-09 |
ZA871814B (en) | 1988-10-26 |
JPS62230730A (ja) | 1987-10-09 |
GB8606283D0 (en) | 1986-04-16 |
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