JPH02500247A - シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ，その製法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ、その製法および使用 艮土立肛 本発明はシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ、その製法、これを 産生しうる微生物菌株およびデンプン液化ならびにシクロデキストリン製造にお けるその使用に関する。

征】Ｕえ紅 シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（１゜４−α−Ｄ−グルカン ４−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、Ｅ、Ｃ，２ ，４，１，１９）（以後、シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼま たはＣＧＴアーゼと称する）は、デンプンまたはデンプン加水分解物の環化によ りシクロデキストリンを形成しうる能力により特徴ずけられる。

すなわち、酵素による環化反応はシクロデキストリン（ＣＤと略されるかまたは シャルディンガーデキストリンとしても知られている）を製造し、これはα−１ ，４結合により連結された６、７または８個のα−Ｄ−グリコピラノース残基か らなる環状分子である。これらは、それぞれ６．７または８個のグルコース残基 の数によってα−１β−またはＴ−シクロデキストリンとして知られている。

一般に、シクロデキストリンはこれまでイー、ビイ、ティルデン（Ｅ、Ｂ、Ｔｉ １ｄｅｎ　）およびシイ、ニス、ハドソン（Ｃ，Ｓ。

Ｈｕｄｓｏｎ　）により記載された方法（Ｊ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ＋６４：　１４３２（１９４２）　）の変法により作られ てきた。これらの方法はバチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　＋ｎａｃｅ ｒａｎｓ）からのシクロデキストリン　グリコジルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ アーゼ）酵素を用いて液化デンプンを処理することを含む。この方法の変法のす べてには幾つかの欠点がある。第一に、ＣＧＴアーゼはデンプンのゼラチン化温 度以上で用いられるのに十分熱的安定性ではないので、デンプンをたとえばα− アミラーゼで予備処理してデンプンを可溶化しなければならない。

デンプンを比較的低ＤＥ（デキストロース等量）まで液化することが重要であり 、そのためデンプン液化方法の実施後に、処理剤、通常はα−アミラーゼを不活 化して良好なシクロデキストリン収率を得る必要がある。第二に、バチルス　マ セランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧＴアーゼは高められた 温度で使用するには十分安定でなく、従って、酵母によるシクロデキストリン化 方法は約５０°Ｃで行なわれ、ここでは微生物による汚染を受ける恐れがある。

第三に、バチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧ Ｔアーゼによるデンプンのシクロデキストリンへの転化（５０°Ｃ，ｐＨ７，０ ）は、合理的収率を達成する前に延長した反応時間を必要とする。

これまで当該技術で公知のＣＧＴアーゼ酵素は、たとえばバチルス　マセランス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　、バチルス　サーキュランス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）　、バチルス　ステアロテルモフィルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　、バチルスメガ テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　、バチルス　オーベン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｏｈｂｅｎｓｉｓ）　、好アルカリ性バチルス属（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）、ミクロコツカス　ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ 　１ｕｔｅｕｓ）、ミクロコツカス　パリアンス（旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓνａｒ ｉａｎｓ　）およびクレブシェラ　ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）のような微生物により作られる。しかしながら、これらの微 生物により作られるＣＧＴアーゼ酵素のいずれも微生物汚染の可能性を避けるた めに十分高められた温度でシクロデキストリン製造するのに用いられる６０°Ｃ 以上で十分安定ではない。

水性デンプンスラリーの酵素液化は、デンプンのデキストロース（グリコース） への転化における第一段階として広（行なわれている。かなりの程度までデンプ ン工業は米国特許第３９２１５９０号の液化方法を採用してきた。一般的条件は 、１０５°Ｃで５分間のジェットクツキングとそれに続くデンプン濃度３５％Ｄ Ｓ（乾物重量）で９５°Ｃにて９０分間の維持である。

この方法で使用される酵素はターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）”　（ノボインダ ストリイＡ／Ｓの製品）、バチルス　リチェニホルミス（Ｂ、　ｌ　ｉｃｈｅｎ ｉｆｏｒｍｉｓ　）からのα−アミラーゼである。液化はｐＨ約６．０で行なわ れ、続いて約４．５〜５．０のｐ）ｌでグリコアミラーゼを用いて糖化が行なわ れる。

中間ｐｎ調整の必要性を除くために、技術上長いことｐｉｔ５で液化しうるデン プン液化酵素が捜しめられてきていた。

バチルス　ステアロテルモフィルス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ）からのα−アミラーゼがこの目的に対し提案されてきていたが、しかし本明 細書のデータでは４．５はどの低ｐＨでは十分液化しないことがわかる。米国特 許第４，５７８，５３２号および同第４．６１３，５７０号にはクロストリジウ ム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）がらの好酸性α−アミラーゼが記載されているが 、しかし前記特許のデータではｐ）１４．５における１００°Ｃ以上での安定性 が不十分であることがわかる。

主肌企旦舵 本発明の目的は、微生物感染の危険がわずがである６０’Ｃまたはそれ以上でＣ Ｄ製造に使用されるのに十分熱安定性であり、そしてデンプンが完全にゼラチン 化する９０°Ｃ以上でのデンプン液化に使用されるのでさえ十分熱的安定性を有 するシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼを提供するものである。

また本発明の目的は、ｐＨ４，５で１００°Ｃ以上の温度でデンプンを液化しう る酵素を提供するものである。

本発明の他の目的は前記熱安定性酵素およびこれを産生しうる微生物菌株を作る 方法を準備することである。さらに別の目的は、前記酵素を用いて６０°Ｃ以上 でＣＤを製造する方法およびｐＨ４，５〜５．０付近でデンプン液化のために前 記酵素を用いる方法を提供するものである。

１里■脱里 本発明者らは驚くべき熱安定性のＣＧＴアーゼを産生する幾つかの好熱性の真性 嫌気性菌株を単離した。

したがって、その最初の観点において本発明は、テルモアナエロバクタ−（Ｔｈ ｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　）またはテルモアナエロビウム（Ｔｈｅｒ ｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕ粕）の菌株に由来するものであり、ｐ）１５．０で測定 された約９５°Ｃの最適温度；約５．０の最適ｐＨ；およびデンプンとＣａ”の 不存在下に８０°Ｃでｐｔ１５．０で４０分間インキュベーション後約９５％の 残留活性を有することが特徴的なシクロデキストリングリコジルトランスフェラ ーゼを提供するものである。

本発明の第二の観点は、適当な栄養素含有培地中で嫌気性条件下にテルモアナエ ロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）またはテルモアナエロビ ウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　）のＣＧＴアーゼ産生性菌株を培養 するか、または好気性条件下にこれから適当な遺伝子情報を含む形質転換宿主微 生物を培養し、その後発酵培地からＣＧＴアーゼを回収することからなるシクロ デキストリングリコジルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の製造方法を提供 するものである。

本発明の第三の観点は、シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼを産 生ずる能力および非−運動性により特徴ずけられるテルモアナエロバクター（Ｔ ｈｅｒ＋ｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　）またはテルモアナエロビウム（Ｔｈ ｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）の菌株の生物学的に純粋な培養物を提供するも のである。

本発明の第四の観点は、前記シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ の存在下に約４．０〜５．５の範囲のｐ）ｌにて好ましくは約１００°Ｃを越え る温度にて水性デンプンスラリーに酵素液化を行なうことからなるデンプン液化 方法を提供するものである。

本発明の第五の観点は、６０°Ｃ以上の温度で前記シクロデキストリングリコジ ルトランスフェラーゼを用いてデンプン加水分解物溶液を酵素処理し、その後反 応混合物からシクロデキストリン生成物を回収することからなるシクロデキスト リン製造方法を提供するものである。

最後に、本発明の第六の観点は、約１００°Ｃ以上の温度にて４．０〜５，５の 範囲のｐＨにて好ましくはカルシウム塩をほとんど添加することなく請求項１に 記載のシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼで水性デンプンスラリ ーを酵素的に処理し、その後得られたシロップを約２８時間以下の間８０゜〜９ ０°Ｃの範囲の温度に保持し、該シロップは前記保持期間の少なくとも一部の間 ２０〜３０ＤＳの範囲であり、次いで反応混合物からシクロデキストリン生成物 を回収することからなるシクロデキストリン製造方法を提供するものである。

尤■至立狙皇主里 微生１ 本発明の微生物は好熱性の真正嫌気性細面であって、テルモアナエロバクター属 （ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）〔ジェイ、ウ ィーゲル（Ｊ、Ｗｉｅｇｅｌ）とエル、シイ、ルイングダール（Ｌ、Ｇ、Ｌｊｕ ｎｇｄａｈｌ）、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｒｏｂｉｏｌ、　（１９８１）　１２８： 　３４３−３４８〕またはテルモアナエロビウム属（ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｔｈ ｅｒｍｏ−ａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）　（ジエイ、ジ仁ゾイクス（Ｊ、Ｇ、Ｚｅｉ ｋｕｓ）ら、八ｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２２．４ｌ−４８（１９ ７９））に属するものである。

これらの属に対する分類法は確立されておらず、多分２つの属が大変類催してい るのでこの分野の熟練者でされこれらを差別化することができないので２つの属 が１つの同じ属として適切に分類されるように考えられる。

テルモアナエロバクターおよびテルモアナエロビウムの公知菌株と対照的に、本 発明の微生物株はＣＧＴアーゼ産生能力ならびに非運動性により特徴ずけられる 。本発明菌株の幾つかはまた公知菌株と対照的にインドール陽性である。公知菌 株Ｔ、ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ　ＤＳＭ　３３８９およびＴ、ｆｉｎｉｉ　ＤＳ Ｍ　２２４６は熱的安定性ＣＧＴアーゼの産生者ではないことが見出された。

本発明者らにより８個の菌株が単離され、ブダペスト条約の権限下に特許を受け る目的でアメリカンタイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）およびナショナ ル　コレクションズオブ　インダストリアル　マリンバクテリア（ＮＣＩＭＢ） に次のように寄託された： 炙圧嵐　！託旦　！丘１対皿 １、　ＡＴＣＣ５３，６２７６月３，１９８７　ＡＮＯ−１５−７−５Ａ、２− ７０２、　ＮＣＩＢ　４０．０５３　１０月６．１９８８　ＡＮＯ−１６−７− ２Ａ−７０４、ＮＣＩＢ　４０．０５５　１０月　６，１９８８　ＡＮＯ−３６ −７−１５、ＮＣＩＢ　４０．０５６　１０月　６．１９８８　ＡＮＯ−３８− ７−１６、ＮＣｌ３４０．０５７　１０月６，１９８８　ＡＮＯ−４４−５−１ −５５７、ＮＣｒＢ　４０．０５８　１０月６．１９８８　ＡＮＯ−５１−７− １−７０８、ＮＣｌ３４０．０５９　１０月　６．１９８８　ＡＮＯ−５５−７ −１−７０上記菌株の突然変異体および変異体もまた本発明の範囲内である。

これら８つの菌株はスコツトランドのＮＣＬＭＢによりテルモアナエロバクタ一 種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、）またはテルモアナエロビ ウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕ＋ａ　ｓｐ、）としてすべて分類され 、属は未分割である。別の分類学的データを次に示す：注（ａ）〜（ｆ）は次ペ ージ参照 記： （ａ）鎖中、変化する長さの粒状環体 （ｂ）一定の棒体、“粒状体′染色、一本および短鎖（Ｃ）（デンプン寒天、３ 日）：丸し１、一定、分力１れて１１なし）、平滑、低い（？）、凸状（？）、 不透明、黄−淡黄色、直径２．５ｍ （ｄ）　（Ｒ，Ｃ，Ｍ、、３日間）；丸し）、一定、分力）れてｂｌなし）、平 滑、光沢あり、半透明、扁平、白色、直径３鵬（ｅ）　＋　（遅い７日間） （ｆ）ペプトン水シュガー：酸またむまガスなしＮｉｌ　ｍ定せず ＡＰＩ２０Ａ　””′　’ ム１１■！ ＮＣインキュベーション後変化なし ±　わずかに反応 ＊　たぶん高温により起きる人為的物質であろう旦旦エヱニ叉皮生 ＣＧＴアーゼ酵素の調製は、本発明の微生物株（たとえばＡＴＣＣ５３，６２７ ）を、嫌気性条件下で、炭素源としてのマルトデキストリン、酵母抽出物および 無機質溶液を含む培地中で培養することにより行なわれる。ＣＧＴアーゼの製造 に最適なｐＨおよび温度はｐ）１７．０と６７°Ｃである。酵素は発酵培地へ分 泌されこれは細胞外酵素であることを示す。

これに代わり、本発明のＣＧＴアーゼは、適当な遺伝子情報を含む形質転換細胞 の好気性培養により産生されうる。一般に、この産生方法は次の段階からなるで あろう：（ａ）形質発現を促進する機能をエンコードするＤＮＡ配列とテルモア ナｘｏバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　）およびチルーＥ７ ナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）株のＣＧＴアーゼをエンコ ードするＤ　Ｎ　Ａ配列とからなる適当な組換体ＤＮＡクローニングベクターを 準備し； （ｂ）　（ａ）段１ｉＷからのクローニングベクターで適当な宿主微生物を形質 転換し； （ｃ）形質転換した宿主を好気性条件下で適当な栄養素含有培地中にて培養し、 その後培地からＣＧＴアーゼを回収する。

適当な宿主微生物の例は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）　、ストレプト ミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ま たはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ　）の菌株、好ましくは大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｘｌｉｓ）　、バチルス　リチェ ニホルミス（Ｂ、］ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはアスペルギルス　オリザ エ（Ａ、ｏｒｚａｅ）である。

ＣＧＴアーゼは発酵培地から細胞を除き、次いでプロスをたとえば限外濾過によ り濃縮することにより回収される。

ＣＧＴアーゼの　制 特性づけの目的のために、ＡＴＣＣ５３，６２７からの粗製ＣＧＴアーゼ調製物 の均質物への精製は、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィ、クロマトフオ ーカシング貢およびアカルボースーセフ７０−スアフィニティクロマトグラフィ により達成された。３つの成分１．ＩＩおよびｍを精製した。１つのＣＧＴアー ゼ成分のみが５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、他の菌株か らの粗製調製物に見出された。

ＣＧＴアーゼの軌８ 本発明のＣＧＴアーゼは、先行技術の酵素によりはるかに優れた熱的安定性によ り特徴ずけられる。５％リンドナー（Ｌｉｎｔｎｅｒ）デンプン−０，１Ｍ！” ￥酸ナトリウムｐＨ５，０（５０ｐｐｍＣａ”）にて５０分間９５°Ｃでインキ ュベーション後、本発明のＣＧＴアーゼ（ＡＴＣＣ５３，６２７）はその活性を ほぼ１００％保持し第３図に、基質およびＣａ”の不存在下に様々な温度でｐＨ ５，０にて４０分間インキュベーション後ＡＴＣＣ５３，６２７からの粗製ＣＧ Ｔアーゼの残留活性を示す。図示するように、これらの条件にて８０°Ｃにてそ の活性の約９５％を保持する。比較として２つの先行技術による液化酵素につい てのデータもまた示す：バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉ ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）。

（ターマミル　Ｔｅｒｍａｍｙｌ？Ｍ）からのα−アミラーゼおよびバチルス　 ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌｕｓ）からのα−アミラーゼ。

成分１．１１および■はＡＴＣＣ５３，６２７の粗製ＣＧＴアーゼと同様な熱的 安定性を有する。比較のために、バチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍ ａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧＴアーゼが５０°Ｃ以下の温度でのみ安定であり５０° Ｃ以上では直ちに活性が失なわれることが報告されている〔スタヴン、ニー、（ Ｓｔａｖｎ、　Ａ）およびグラナムピー、イー、（Ｇｒａｎｕｍ、　Ｐ、Ｅ、） ＋　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

７５　（１９７９）　２４３）。

ＣＧＴアーゼの　−ヒ ｔＪｉＸＬ　ＣＧＴアーゼ活性における温度の効果を測定した。　ＡＴＣＣ５３ ，６２７からのＣＧＴアーゼは０．１　Ｍ酢酸ナトリウム−１００ｐｐｏ＋　Ｃ ａ”においてｐＨ５，０で９５°Ｃにて最適温度を有する（第１図参照）。この 最適値はバチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧ Ｔアーゼのもの、すなわちｐｎｓ、。

にて５５°Ｃであると報告されているものと対照的である（スタブイン。ニー、 とグラナム、ビイ、イー＋ｌ　ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ、　 ７５　（１９７９）　２４３）。

ｕ星１望　ＣＧＴアーゼ活性におけるｐＨの効果を６０°Ｃにて測定した。　Ａ ＴＣＣ５３，６２７からのＣＧＴアーゼのｐＨ最適値は、クエン酸ホスフェート −０，５％リンドナーデンプン−１００ｐｐ＋ｍＣａ”緩衝液系において試験す ると酸性範囲で広い活性を備えて５．０である（第２図参照）。この値は、バチ ルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　＋ｎａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧＴアーゼに ついて報告された５、　２−５．７のｐＨ最適値と同様である〔スタヴン、ニー 、とグラナム、ビイ−、イー、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　７５　（１９７９）２４３）。

丘王ｌ　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続＜ｐＨ６，０，５ ５℃での０．８％リンドナーデンプン−ヨウ素ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）　 ”積層材により測定されたＣＧＴアーゼの分子量は次のようであった： ＡＴＣＣ５３，６２７１１１７，０００ダルトンＡ丁ＣＣ５３，６２７ＩＩ　１ １０，０００　−ＡＴＣＣ５３，６２７Ｉ［１１’０８．ＯＯｏ　−ＮＣＩＢ　 ４０，０５３　９９，０００　−ＮＣＩＢ　４０，０５４　１０６．０００　− ＮＣＩＢ　４０，０５５　１０４．０００　−ＮＣＩＢ　４０，０５６　１０１ ，０００　−ＮＣＩＢ　４０．０５７　１２６，０００　−ＮＣＩＢ　４０，０ ５８　２１０，０００　−ＮＣＩＢ　４０，０５９　１５４．０００　−これら の結果はＣＧＴアーゼがすべて異なることを示す。

豊里立　ＬＫＢアンホリンＰＡＧプレー）ｐｆ（３，５−９，５を用い続いてｐ Ｈ６，０で５５°Ｃにて０．８％リンドナーデンプンヨウ素寒天積層材を用いた 等電点電気泳動によりＣＧＴアーゼＩ。

■および■の等電点はそれぞれ４．５５　、４．５０および４．５０であること がわかる。

ｒユＺ　検出のために屈接率を用いたアミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）”　ＨＰＸ −４２Ａ（バイオ−ラッド）Ｈｐｔ、ｃにより、ＡＴＣＣ５３、６２７からの各 々のＣＧＴアーゼによるリンドナーデンプンの分解から作られる作用パターンは 同一であることが示された（第４図参照）。それゆえ３つのＣＧＴアーゼは触媒 的に同じである。右の３つのピークは加水分解後に現われ、ＮＭＲによりそれぞ れ（左から右へ）α、Ｔ−およびβ−シクロデキストリンであることがわかる。

第７図は、本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）　Ｃｔ：、　Ｔアーゼと先行技術の 液化酵素すなわちバチルス　ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのα−アミラーゼとにより作られる作 用パターンを比較する。

−゛ンブンのシクロ−゛キスト１ンへの二４．４６フアデバス（Ｐｈａｄｅｂａ ｓ）　Ｕ／ｇ　ＤＳの標準投与量にてＡＴＣＣ５３，６２７からのＣＧＴアーゼ を用いて液化の間α−γ−またはβ−シクロデキストリンへの転化率％の測定を 次に示す。

条件はｐＨ４，５にて３５％ＤＳ）ウモロコシデンプンを第一に１０５°Ｃで１ ４分間液化し第二に９０°Ｃで４時間液化することであった。

また５％ＤＳリンドナーデンプンー０．１Ｍ酢酸ナトリウム（５０１）Ｉ）０１ 　’Ｃａ　”　’　）を用いてｐＨ５，０および９５°Ｃにて５０分間ＣＧＴア ーゼ（６，８ファデバスＵ／ｇ　ＤＳ）に対する転化率％も示す。液化において α−およびＴ−シクロデキストリンの等量が作られ一方はとんど２倍量のβ−シ クロデキストリンが形成する。

リンドナーデンプン反応において、β−シクロデキストリンはＴ−シクロデキス トリンの２倍量作られ、α−シクロデキストリンはＴ−シクロデキストリンの３ 倍量が作られる。

シクロ−゛キストリングリコシルトランスフエラーゼの　六本発明ＣＧＴアーゼ と幾つかの公知ＣＧＴアーゼにおける発表されたデータの比較を次表に示す。幾 つかの明らかな差異、特に最適温度と安定性が立証される。

デ」グ乙Ｚ３ゴＬ汰 デンプンの液化はデンプンを部分的に脱型台化し可溶化しこれにより次のたとえ ばグルコアミラーゼのような酵素による糖化を容易に受け入れられるようにする のに役立つ。かなりの程度まで工業は米国特許第３．９２１．５９０号の液化方 法を採用してきた。代表的条件は、たとえばジェットクツキングのような方法で １０５”Ｃまで加熱し、続いて約ｐＨ６にてバチルスリチェニホルミス（Ｂ、Ｉ ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）　ｃｘ−アミラーゼを用いて前記温度で５分間続い て９５°Ｃで９０分間保持する。グルコアミラーゼはｐ）Ｉ約４．０−５．５で 使用されるので、この範囲のｐＨで液化するのが望ましい。バチルス　ステアロ テルモフィラス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）からのα−ア ミラーゼはｐＨ５，８で十分液化するがしかし前記α−アミラーゼの両方ともｐ Ｈ５，０以下で液化することができない。本発明で提供される液化方法は約ｐＨ ４，０−５，５（好ましくは４．５−５．５　＞で行なわれ、続いて中間ｐ）１ ８ｍ整を行なうことなく糖化が行なわれうる。

本発明ＣＧＴアーゼは低ｐＨでさえもＣａ”を安定のために必要とせず、このた めカルシウム塩の添加は一般に必要ではない。

適当な液化条件は約１〜６０分間約１００−１１５°Ｃであり、好ましくは続い て約５０分間〜４時間約８０−１００°Ｃに保持することである。連続方法が好 ましく、ジェット−クツキングにより加熱するのが最も好ましい。本発明ＣＧＴ アーゼは、デンプンＤＳ（乾物重量）Ｉｇにつき２〜５フアデバスＵ（以下参照 ）の投与量レベルでデンプンを十分に液化する。デンブン濃度は一般に１５〜４ ０％ＤＳ（−へ％乾燥物質）の範囲内であり、最も一般には２５−３５％ＤＳで ある。

デンプンのα−アミラーゼ触媒化加水分解は、還元糖の増加に伴ない粘度が減少 するという結果になる。ＣＧＴアーゼはデンプンを分解するが、しかし還元糖の 発生はほとんどない。酵素反応は重合程度をほとんど減少させ、これによりα− １β−およびγ−シクロデキストリンのかなりの量とともに高分子量マルトデキ ストリンを含む溶液が得られる。したがって、ｐＨ４，５にて１０５°Ｃで１４ 分間液化し９０°Ｃでの保持時間４時間により３５％ＤＳトウモロコシデンプン のα−１β−およびγ−シクロデキストリンへの転化は、それぞれ３．８％、６ ．４％および３．６％である。

本発明液化方法は、湿式粉砕したトウモロコシデンプンまたは他の精製したデン プンからＣＧＴアーゼで液化し続いてグルコアミラーゼ単独またはプルラナーゼ とともに糖化することにより高収率でデキストロース（グルコース）を作るのに 使用される。

本発明の液化方法はまたデンプン含有バイオマスからエタノールを作るのにも使 用される。この場合バイオマスはＣＧＴアーゼを用いてｐＨ４，５−５，５で液 化され続いてグルコアミラーゼを用いて糖化してグルコースを形成し同時または 順次の酵母を用いたグルコースの発酵でエタノールとする。その後、アルコール を当該技術で公知の方法により回収される。

全方法をいかなる中間ｐＨ調節を行なうことなく５．０付近のｐＨで行ない、そ して同時糖化および発酵を約３０°Ｃにて７２時間までで行なうのが好ましい。

液化は低ＤＳレベル（１５−２０％）または高ＤＳレベル（２０％−４０％）の いずれかで行なうことができる。高ＤＳ方法において、ＤＳレベルは約２０％濠 で減らしてから発酵を行ない約１０％アルコール容量の最大酵母許容量を得るよ うにしなければならない。

アルコール製造のための粗原料は精製デンプンたとえば湿式粉砕トウモロコシデ ンプン：未加工粗原料たとえばトウモロコシ、コムギ、コメ、モロコシ、キャラ サバおよびジャガイモ（そのデンプン含有量１５〜８０％の範囲）；および他の デンプン含有物質たとえば工場からの廃棄物または副産物を含む。精製デンプン の場合、液化方法は１００°Ｃ以上の最初の処理とそれに続く液化完了のための より低い温度での保持を含む。他の粗原料（より低いデンプン含有量）の場合、 液化を６０−１００°Ｃの範囲で行なうのが好ましい。

シクロデキストリンの１１゛告 本発明は熱的に安定なＣＧＴアーゼを用いたシクロデキストリンの製造方法を提 供するものである。本発明方法において、液化デンプンは約６０°Ｃを越えない 温度で好ましくは２４時間以内にＣＧＴアーゼで酵素処理され、その後シクロデ キストリンを反応混合物から回収される。

本発明の好ましい態様において、方法は、約ｐ）１５．０にて約１００°Ｃを越 えない最初の処理温度でＣＧＴアーゼ酵素を用いてデンプンスラリーを液化し、 続いて液化デンプンを保持工程において約２４時間までで約８０”−９０°Ｃに 保持し、好ましくはｐ）ｌｆｆｌ整せずそして好ましくは酵素でやり直すことな く行なうことを含む。

先行技術の方法と対照的に、本発明方法は十分に高めた温度を使用して微生物汚 染の深刻な危険性を避けており、これは勿論利点である。別の（しかしながら関 連した）利点は、高められた転化温度でＣＧＴアーゼを用いて酵素転化がより素 早く行なわれることである。すでに液化されたデンプン基質における約２４時間 を越えない処理時間は本発明の実施のために意図されるものである。上述の有利 な特徴にもかかわらず、すでに液化したデンプンの転化は特に好ましい本発明の 実施態様ではない。さらにより有利には本発明方法を粗デンプンたとえばデンプ ンスラリーを用いて開始し、そしてＣＧＴアーゼを用いてこれから液化デンプン を発生させることである。

ＣＧＴアーゼ酵素を用いて、添加カルシウム不存在下に標準デンプン液化条件（ 上述したもの）下にｐＨ４，０−５，５の範囲でデンプンを液化（すなわち、デ ンプンスラリーから注入性シロップが生じる）してもよい。ＣＯＴアーゼを用い てデンプンスラリーを液化し次いで液化デンプンをシクロデキストリンへ転化す ることは最も有利な方法を構成しそして本発明の好ましい実施態様を構成する。

ＣＧＴアーゼによるデンプンの液化はデンプンのシクロデキストリンへの転化を 伴なう。すなわち、シクロデキストリンのほとんどの量が得られそして液化デン プンのシクロデキストリンへの別の酵素転化の実施の前に液化デンプンに存在す る。

全体からみて、デンプン液化方法から直接入手できうるシクロデキストリンの収 量は適切とは考えられない。さらに、ＣＧＴアーゼを用いた液化デンプンの酵素 転化はシクロデキストリンの収量をほとんど増加させる。

標準条件のデンプン液化方法の一部を形成する（ジェット）タックされたデンプ ンの高温維持処理は、約２４時間延長するであろうし、望ましくは、しかしなが らより多量の液化デンプンをシクロデキストリンへ転化するために約９０°Ｃで 行なわれ、転化段階は液化デンプンの望ましくはより最適ＤＳレベルになるまで 穏やかな希釈により行なわれる。シクロデキストリンへの最適酵素添加に望まし いｐＨ調節はいずれも初期デンプンスラリーまたは付随する希釈物のいずれかで 行なわれる。しかしながら、デンプン液化段階後より多量のＣＧＴアーゼ酵素を 用いて再びやり直すことは必要ではないようである。

先行技術の酵素に対して可能性のあるものより高い酵素添加温度（通常、限界温 度が５０°Ｃであるバチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎ ｓ）よりも高い）での使用を可能にする本発明シクロデキストリングリコジルト ランスフェラーゼの熱的安定性により、組合わされた液化および転化方法をシロ ップの重要な中間冷却を行なうことな〈実施することができる。

幾り返すと、高温でのシクロデキストリン製造のこの可能性はこれまで使用され た反応時間延長を避けそして本発明Φ実際において液化デンプンの酵素転化に対 し約２４時間以下の反応時間が予想される。

本発明を実施するのに使用されるデンプンは、たとえばワタシーメイヅ（誓ａｘ ｙ　ｍａｉｚｅ）、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ジャガイモ、タピオカ、 コメまたはサゴのようないかなる植物供給源からも得られうる。デンプンの未変 性形に加えて、デンプンを酵素、酸、アルカリ等で処理したものから誘導される 変性形もまた基質として使用される。シクロデキストリン産生反応は１％〜４０ ％ＤＳ範囲のＤＳ１度で液化デンプンにおいて行なわれるが、しかし転化の最大 効率に対しては２０−３０％ＤＳ固体溶液が好ましい。所望により、より高濃度 のデンプンスラリーを液化しく標準条件は３５％ＤＳ）、次いでシクロデキスト リンへの転化のために２０−３０％ＤＳデキストリン溶液へ希釈される。

出発物質が粗製デンプンである全体的方法の用語を要約すると、本発明のＣＧＴ アーゼは、広い範囲の条件たとえば３５％ＤＳスラリー、１０５°Ｃでのジェッ トクツキングおよびＣａ”なしでｐＨ４，０−５，５で９５゛Ｃにおいて９０分 間の保持とそれに続く約２４時間までの５５°Ｃ以上での長時間保持のような厳 しい標準液化条件下で使用されうる。最大の転化および／または最低のＣＯＴ使 用量のために、両方の保持段階（これは勿論−回の延長した保持でもよい）は８ ０°Ｃ−９０°Ｃの範囲内で行なわれ、そしてデンプン濃度は２０−３０％ＤＳ 範囲（初期デンプンスラリーまたは液化デンプンの希釈を通して）である。

別に要約すると、シクロデキストリンは、温度範囲５０−９５°Ｃ１好ましくは ８０−９０°Ｃで本発明ＣＯＴアーゼを用いてシロップをインキュベーションし 、ｐ）Ｉ範囲４−９最も好ましくは約ｐ）１５．０で約２４時間未満の間反応さ せることにより液化デンプンから作られうる。シクロデキストリン生成物はこれ までのように反応溶液から回収される。さらに、回収され°たシクロデキストリ ンは当該技術分野で公知のものにしたがって、たとえばディ、フレンチら（Ｄ、 Ｆｒｅｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ）によりジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　 ソサイアティ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ ｏｃｉｅｔｙ）　７１　：　３５３　（１９４９）に記載された方法で、α−１ β−およびＴ−シクロデキストリンへ分画される。

バチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧ　Ｔアー ゼによるデンプン加水分解物のシクロデキストリンへのバッチ式転化は、これま でのところ、しばしば適当な複合体の存在下に行ない生成物組成の方向が平衡に シフトするようにしてきた。望ましくは、シクロデキストリンキレートは不溶で あり、このため反応混合物における溶液から沈でんする。複合化したシクロデキ ストリンは濾過または遠心分離により回収され、次いで複合体は当該技術で公知 の方法により消散させる。適当なシクロデキストリン複合体は、シクロオクタン 、ヘキサン、１−ブタノール、１−デカノール等が含まれる。

幾つかの複合体は、α−またはβ−形で選択的に複合化することが確認された（ たとえば米国特許第３，６４０，８４７号参照）。

特に、シクロオクタンはβ−シクロデキストリンに対し選択的であり、一方１− デカノールはα−シクロデキストリンに対し選択的である。本発明の実施は複合 体の存在下でＣＧＴアーゼを用いて転化を行なうことを意図するものである。

シフロブキストリグリコシルトランスフェラーゼ分析ＣＧＴアーゼデンプンデキ ストリン化活性は、ｐ）１６．０．６０℃でのファルマシアファデハス（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｄｅｂａｓ）（Ｒ）アミラーゼ試験により測定される。こ れは酵素溶液２００　ｕｌを４、０　ａｉｌ　０．　Ｉ　Ｍ酢酸ナトリウム（１ ００ｐｐｍ　Ｃａ”）＋ファデハスタブレット（Ｐｈａｄｅｂａｓ　Ｔａｂｌｅ ｔ）で１５分間インキュベーションすることによる。検定溶液を室温にてエソペ ンドルフ（Ｅｐｐｅｎ−ｄｏｒｆ　）遠心分離器で２分間遠心分離し、上澄液の 吸光度を６２Ｏｒ＋ｏ＋で読み取り、１．０−３０の吸光度を達成するべきであ る。

標準物としてバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ ｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼを用いた標準曲線を作成し、ここで１フ工デバス単 位は、６０°ＣｐＨ６，０で１分間当りリンドナーデンプンのグリコシド結合１ ．０μｍｏｌｅの加水分解を触媒するであろう酵素の量として定義される。

シクロデキストリン生成物の定量 α−９β−およびＴ−シクロデキストリンの収量は、パイオラドアミネックス（ ＢｉｏＲａｄ　Ａｍ１ｎｅｘ）　（Ｒ）カルボハイドレート）ＩＲＸ−４２Ａ高 性能液体クロマトグラフィにより測定される。２つのカラム（３００Ｘ　７．８ 　ｍｍ）を継列で使用し、８５°Ｃにて０．６　ｍ１７分の流速で溶出液として ガラス蒸留水を用いた。検出は屈折率による。標準曲線は、α−９β−およびＴ −シクロデキストリンの信頼すべきサンプル（シグマ　ケミカルカンパニー、セ ントルイス、ミズーリ−）を用いて作られる。

２ｍ直連スｄＬ肌 第１図はＣＣ，Ｔアーゼに対する相対活性と温度のプロットである； 第２図はＣＧＴアーゼに対する相対活性とｐＨのプロットである； 第３図はバチルス　ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　ａ−アミラーゼとターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ） 　ＴＭに比較したＡＴＣＣ５３，６２７からのＣＧＴアーゼの熱的安定性のプロ ットである； 第４図はＣＧＴアーゼＩ、Ｉｌ、ＩＩＩの作用パターンを示すＨＰＬＣプロット である； 第５図はＣＧＴアーゼ、ターマミルＴ”およびバチルス　ステアロテルモフィル ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　α−アミラ ーゼを用いたデンプン液化を比較する粘度対時間のプロットである； 第６図はＣＧＴアーゼの様々な投与レベルで得られる液化デンプンの粘度におけ る変化を示すトルク対回転スピード測定値のプロットを示す； 第７図はＣＧＴアーゼとバチルス　ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα−アミラーゼの作用パターンを 比較するＨＰＬＣプロットである。

１施■ 例１ 嫌気性培養によるＣＧＴアーゼの製造 菌株ＡＴＣＣ５３，６２７を、初期ｐＨ７でアルゴン下に次の成分（ｇ／ｆ）か らなる予め還元した液体培地で培養する：マルトリン（Ｍａｌｔｒｉｎ）Ｍ−１ ００，５，Ｏ；　ＫＨｚＰＯａ＋　２．　Ｏ；　Ｋ２ＨＰＯ４，６，Ｏ；ＮａＣ ｔ’　＋　１．　Ｏ；　（ＮＨ４）２Ｓ０４１２．５　；Ｍｇ５Ｏ，−７ＨｚＯ ，０，５：ＣａＣ１ｚ　・２Ｈ２０１０，０５；酵母抽出液、２．　Ｏ；Ｎａ２ ５Ｉ　０．５　；　システィン−ＨｆＪ　、０．５　；レザズリン（レドックス 指示剤）、２ｎｇ；および微量金属５．０ｄ、微量金属溶液は次の成分（ｇ／乏 ）からなる：　Ｆｅｃ　ｌ　ｚ　・６Ｈｚ０．　５．４０　；　Ｚｎ５Ｏａ　・ ７Ｈ２０゜１．４５　；　Ｍｎｃ　ｊｌ！　ｚ　・４Ｈ２Ｃ１＋　１−００　＋ 　Ｃｕ５Ｏａ　・５Ｈ２０＋　Ｏ−２５＋およびＨＪＯ３，ｏ、１ｏ。微量金属 溶液は濃ＨＣ１で酸性化され塩を溶かす。

菌株を撹拌することなく４０時間６７°Ｃでインキュベートした。

４０時間後の最大活性レベルは２００フアデバスＵ／ｆ・ブロスであった。培養 液を遠心分離し、次いで濾過し、最後に濃縮してミリポアミニタンシステム（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｎｉｔａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いることにより３０− ５０フアデバスＵ　／　ｒ、Ｉｌの容積測定活性であった。

ＡＴＣＣ５３，６２７からのＣＧＴアーゼ精製は、ＤＥＡＥ−セファロースクロ マトグラフィ、クロマトフオーカシングおよびアカルポースーセファロースアフ ィニティクロマトグラフィからなる連続工程により達成された。ＤＥＡＥ−セフ ァロースクロマトグラフィは、ｐＨ７，５にて１０ｍＭ　）リス−ＨＣｆ　（２ ，５＋＋ＭＣａＣ１２２）中、４°Ｃで直線状ＮａＣｊ２勾配（０−２００ｍＭ ）を用いて行なわれた。クロマトフオーカシング（ファルマシア）は４°Ｃにて ｐＨ７〜５の直線状ｐＨ勾配を用いて行なわれた。アカルボースアフィニティク ロマトグラフィはｐＨ６，０で４°Ｃにて行なわれ、溶出は０．１　Ｍ酢酸ナト リウム（１００ｐｐｍ　Ｃａ”）緩衝液で洗浄することにより達成された。１． Ｉ［および■と称する３つの個々のＣＧＴアーゼ成分は、クロマトフオーカシン グにより得られ、そしてアカルボースアフィニティクロマトグラフィにより精製 されて均質化された。クロマトフオーカシングに続く３つのＣＧＴアーゼの相対 量はＣＧＴアーゼ１−２０％、ＣＧＴアーゼ■−６０％およびＣＧＴアーゼ−２ ０％で例２ 形質転換した宿主微生物の好気性培養によるＣＧＴアーゼ製造 染色体ＤＮＡを次のように菌株ＡＴＣＣ５３，６２７の細胞から単離した。細胞 （３，１ｚ湿式重量）を２５％ショ糖−５０ｍＰｌ　）リスｐＨ８，０４０ｍＭ 　ＥＤＴＡ　４．５　ｍｌ中に懸濁させた。懸濁液を水中で３０分間続いて室温 で３０分間リゾチーム（２■／ｄ）で処理した。プロナーゼ（１■／ｄ）を加え そして懸濁液を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。溶解物を、１０ｍＭ　 ）リス−１ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡｐ）１７．４緩衝液３ｍを加えた後、３０分間フェ ノール８ｄで２度抽出した。次いでクロロホルム１０ｍで２度水層を抽出した。

３Ｍ酢酸ナトリウム−ＩＲＩＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，ｏ　０．４５ｍｅとイソプ ロパツール２．７５ｍを加えそして５分間水中でインキュベートすることにより ＤＮＡが沈でんした。遠心分離することによりＤＮＡをベレット化し、７０％エ タノールで一回洗浄した。ベレットを１０分間減圧下に乾燥し次いで１０ｍＭ　 ）リス−１ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ７，４緩衝液１５ｄ中に再度溶解した。

ＤＮＡ調製物を、４０時間１５°Ｃ，１９２，０００ｇで塩化セシウム勾配遠心 分離した。染色体ＤＮＡバンドを集め、塩化セシウム飽和イソプロパツールで３ 回抽出し、４°ＣにてｌＱｍ？ｌ）リス−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐｌ　７．４緩衝 液に対し透析した。全体で５９０ｇの染色体Ｄ　Ｎ　Ａが回収された。

ＤＮＡは、３７°Ｃで１２分間５０ｍ！１　）リスｐＨ８，０１０ｍＭ　ＭｇＣ Ｉ！、ｚ−１００ｍＭ　ＮａＣ１１５０ｊ１１中でＥｃｏＲＩ　３３単位を用い て２００■をインキュベートすることにより制限酵素ＥｃｏＲＩで部分的に消化 された０部分的消化ＤＮＡに、１３５．０００　ｇにて１５℃で１６時間１０− ４０％シー！糖勾配遠心分離を受けさせた。１８０ＩＪ１のフラクションを集め そして５Ｉアリコートを１％アガロースゲル電気泳動により分析した。７〜１５ ｋｂのサイズ範囲のフラクションをプールし、１０ｍＭ　）リス−１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　ｐＨ７，４緩衝液１℃に対し透析し、エタノール沈でんし、１０ｍＭ　） リス−１ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ７，４緩衝液１００Ｊｉ１に溶解した。

ベクターｐＢＲ３２２は、３７°Ｃで２時間５０ｍＭ　）リスｐＨ８，０−１０ ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　−１００ｍＭ　ＮａＣｆ　１２５ｍ中でＥｃｏＲＩ　３０単 位を用いて２．５汀をインキュベートすることによりＥｃｏＲｌで消化した。

アガロースゲルにおけるＤＮＡの分析により、消化が完了したことがわかる。消 化されたベクターをフェノールで２度、エーテルで一度抽出し、エタノールで沈 澱した。

ベクターを１００ｍＭ　）　’）　スｐＨ８，０−１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　１００ Ｊ！１に溶かし、３０分間３７°Ｃにて子牛腸アルカリ性ホスファターゼ２０単 位で脱ホスホリル化した。脱ホスホリル化したベクターをフェノールで２度抽出 し、クロロホルムで２度抽出しそしてエタノールで沈でんした。脱ホスホリル化 ｐＢＲ３２２を１０ｍＭ　）リス−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４緩衝液５０ｍ に溶かした。

消化したｐＢＲ３２２と菌株ＡＴＣＣ５３，６２７ＤＮＡの連結は、ＥｃｏＲＩ で部分的に消化された染色体ＤＮＡ　（７−１５ｋｂ）　０．４Ｊｒｇと、Ｅｃ ｏＲＩで消化された脱ホスホリル化ｐＢＲ３２２０，１ｕｇとをＴ、ＤＮＡリガ ーゼ１０単位とともに、５ｇＢＳＡ／ｄを含む５０＋ｎＭ　）リスｐＨ７，４− １０ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　−２０ｍＭ　ＤＴＴ　−１ｍＭ　ＡＴＰ　２０　ｔｌ中 で混合し、１４゛Ｃで一晩インキユベートすることにより達成された。

コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　）ＩＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３，６９４ ）細胞を、ティ、マニアタス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｕｓ）　、イー、　！”７．７ リツチ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ）およびジエイ、サムプルツク（Ｊ、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ）によるモレキュラー　クローニングーア　ラボラトリイ　マニュアル （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ ａｌ）　ｐ、２５０の方法で形質転換のために調製した。

上記のように調製した連結ＤＮＡの半分をマニアタスらの方法（同上）にしたが って大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩのコンピテント細胞へ形質転換した。

細胞は、ルリアーベルタニイ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）　（ＬＢ）培地お よびテトラサイクリンを１５ｎ／−の濃度で含むプレート中で３７°Ｃにて一晩 培養された。次いで、テトラサイクリン耐性コロニーを、１％アミロペクチン− ＬＢ培地およびテトラサイクリン（１５ｌ！ｇ／　ｍＲ）を含むデンプンプレー トへレプリカし、そして３７°Ｃで一晩インキユベートした。ＣＧＴアーゼ製造 は、７０°Ｃで１時間熱処理後ヨウ素蒸気にデンプンプレートを暴露しここで透 明ゾーンを観察することにより測定された。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＮＶ６０１で消化された１つのＣＧＴアーゼ陽性形質 転換体を５０００を超えるコロニーから回収した。菌株はアンピシリン−および テトラサイクリン耐性の両方であった。

標準アルカリ溶菌手法により組換型プラスミドを回収しそしてコンピテント大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩ細胞を再形質転換するとＣＧＴアーゼ陽性形質 転換体が生じた。

１２、ｓｋｂサイズのＤＮＡフラグメントを表す組換体プラスミドの制限地図を ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。制限酵素ＢａｍＨＩを用いた欠失分 析はＣＧＴアーゼをエンコードする遺伝子が６．０　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　Ｂａｍ ＨＩフラグメントに位置することを示している。

ＣＧＴアーゼは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＮＶ６０１をテトラサイクリン１５ ．ｗ／ｍを含むルリアーベルタニ培地において３７°ＣＣ１３００ｒｐで２４時 間培養することにより作られた。細胞を遠心分離により集め次いで超音波処理に より溶菌した。

天然ＣＣ，Ｔアーゼと関連する組換体ｃＧＴアーゼの分子量（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ ）　、等電点、熱的安定性、作用パターン、液化活性およびシクロデキストリン 製造に関する特徴は、酵素間に差異を示さなかった。抗体と交さ反応した組換体 ＣＧＴアーゼは天然ＣＧＴアーゼ（成立■）に対し膨張していた。

例３ シクロデキストリン製造 本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）のＣＧＴアーゼとバチルス　マセランス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）からのＣＧＴアーゼにより得られるシクロデ キストリン収量の比較を行なった。バチルス　マセラ７，１Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＯＴアーゼは通常のシェアドクツカー条件下ではデンプ ンを液化できないので、予備処理したデンプン、すなわちリンドナーデンプンが 使用された。

酵素は、５０°Ｃおよび９０°ＣにてｐＨ５，０で２４時間１５％ＤＳリンドナ ーデンプン（＋４０ｐｐｍ　Ｃａ”）と反応させる。投与量は４．４６フアデバ スＵ／ｇ　−ＯＳデンプンであった。バチルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＣＧＴアーゼはまた上述のようにｐ）Ｉ７．０で反応さ せて対照とする。

結果により、本発明ＣＧＴアーゼは先行技術で最適である５０゛Ｃでより優れた 転化率を示すことがわかる。本発明ＣＧＴアーゼは、先行技術の酵素がほとんど 不活性であるらしい９０°Ｃにてもほぼ同様の高転化率を示す。本発明ＣＧＴア ーゼはα−１β−およびＴ−シクロデキストリンを０．７４　：　１．　Ｏ：　 ０．４１の比（５０°Ｃ）で、すなわちバチルス　マセランス（Ｂ、　ｎ＋ａｃ ｅｒａｎｓ〕酵素よりも比較的α−ＣＤを多く製造する。

例４ 様々なｐＦｌにおけるデンプン液化 ４０ｐｐｍ　Ｃａ”を有するかまたは有しない３５％ＤＳ）ウモロコシデンプン を、１０５℃で１４分分間−て９０°Ｃで４時間液化した。

酵素を４．４６フアデバスＵ／ｇ　ＤＳ　（６０°Ｃ，ｐＨ６，０）で投与した 。

本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）のＣＧＴアーゼを、ターマミル丁Ｍ（バチルス 　リチェニホルミス　Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　α−アミラーゼ、ノ ボインダストリイＡ／Ｓから入手）およびバチルスステアロテルモフィルスＢ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａ−アミラーゼ（Ｇ−ザイム（Ｚｙｍ ｅ）丁’　Ｇ９９５　、エンザイムバイオーシステム社（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｂｉｏ −Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｌｔｄ、製））と比較した。

デキストロース等量（ＤＥ）を液化後に測定し、そしてデンプンが液化後のデン プンシロップが注入可能である（かなりの糖度低下を示す）場合、液体と判定し た。

本液化として評価するが、しかし非常に粘性である本発明ＣＧＴアーゼはＣａ” 添加なしでｐＨ４，５程の低ｐＨでさえも良好な液化を達成し、そして還元糖の 形成もほとんどないことがわかる。

例５ 様々な酵素投与量におけるデンプン液化３５％ＤＳ）ウモロコシデンプンを、添 加Ｃａ”の不存在下にｐＨ４，５にてＣＧＴアーゼ（ＡＴＣＣ５３，６２７）を 用いて液化した。酵素投与量０．２２３．０．４４６．０．８９２．２．２３お よび４．４６７７７”ハスＵ／ｇ　ＤＳを使用した。比較のために、ターマミル をｐＨ６，２でバチルス　ステアロテルモフィルスアミラーゼをｐ）１５．８で 、両方とも４．４６　Ｕ／ｇ　ＤＳと４０ｐｐｍ　Ｃａ”の存在下に使用した。

液化条件は１００″Ｃまたは１０５°Ｃ（以下に指示）にて１４時間、続いて９ ０°Ｃにて４時間であった。液化後、液化の各々のｐＨにおいてＮＶセンサシス テムとＭ　５００測定運転装置を備えたハッケロートビスコ（Ｈｏａｋｅ　Ｒｏ ｔｏｖｉｓｃｏ）　ＲＶ１２粘度計を用いて６０°Ｃで粘度を測定した。結果を 以下に示し第６図に表わす。

傘）　この速度で測定不可能 結果によりＣＧＴアーゼ２〜５０／ｇＤＳの投与レベルが適当であることが示さ れる。

例６ 液化デンプンの糖化 例４の液化デンプンを６０″ＣにてｐＨ４，３または４．５に調節し、そしてデ キストロザイム（Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ）”　１５０１５０を投与量１．２ｆ／ ｌｏｓで加えた。デキストロザイムは、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼとバチルスアミドプルリティロ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｊｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）からのプルラナ ーゼの混合物である；これはノボインダストリイＡ／Ｓから入手可能である。糖 化は４８Ｖｆ間６０’Ｃで行なわれ、そしてデキストロースはバイオ−ラド　ア ミネソクス３ＨＰＸ−８７ＣＨＰＬＣにより測定された。

結果により、本発明による液化デンプンのすべての良好な糖化が示される。ｐＨ ４，５の液化デンプンを糖化するための能力は、バチルス　リチェニホルニス（ Ｂ、Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｓ）またはバチルス　ステアロテルモフィルス（ Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ２ｕｓ）からのα゛−アミラーゼ用いた先 行技術の液化以上に本発明の明らかな方法の利点を示す。なぜならば本発明によ るデンプン液化の場合糖化の前にわずかなｐＨｔＰ５節が必要なだけがまたは全 く必要がないからである。

例７ 様々なデンプン濃度におけるシクロデキストリンの製造トウモロコシデンプンは １５％〜４０％ＤＳまで変化した。スラリーを、投与量４．４６フアデバスＬｌ ／、　ＤＳデンプンのＣＧＴアーゼ（ＡＴＣＣ５３，６２７）を用いて、最初に ｐＨ５，０でカルシウムを添加することなく１４分間１０５°Ｃで処理し続いて ９０℃で４時間保持することにより最初に液化した。酵素含有デキストリン溶液 をインキュベートするためにさらに２４時間ｐＨ５，０で９０℃にてデンプン液 化方法の保持部分を続けた後シクロデキストリンの製造をモニターした。シクロ デキストリン収量はバイオ−ラッド　アミネックス　カルボハイトレー）　ＨＰ χ−４２Ａ　）ＩＰＬｃにより測定された。結果： 約２０〜３０％の初期デンプン濃度は、全ＣＤ％とｇＣＤ／１００　Ｉ！ｆｔに 基ずいてシクロデキストリンの製造に最適であった。それゆえ濃度２５％ＤＳが 別の例に対し選択される。β−シクロデキストリンがすべてのデンプン濃度にお いて主に産生された。

β：α：Ｔシクロデキストリンの比は、２５％ＤＳで１．０　：　０．４７：０ ．３９であった。２５％ＤＳデンプンからのシクロデキストリンの最も高い観察 された収率はほぼ３０％であった。

ＣＧＴアーゼを用いた再処理および反応時間４８時間までの延長は収率を増加し なかった。

例８ 様々なｐＨにおけるシクロデキストリンの製造シクロデキストリン製造における ｐ）ｌ効果は、２５％ＤＳ）ウモロコシデンプンスラリーを用いて測定された。

デンプンスラリーは指示されたｐＨ値で液化されるがしかしその他は例７に示し たものであり、そして液化デンプンを次いで同じｐＨ値にて９０°Ｃで２４時間 インキュベートした。

以下に表わす結果は、ｐＨ５，０がデンプン液化とシクロデキストリン製造の組 合わせ方法に対し最適であることを示す。

例９ 様々な温度におけるシクロデキストリンの製造本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７） のＣＧＴアーゼによるシクロデキストリン製造における温度の効果は添加カルシ ウムの不存在下に、以下に示すような様々な温度にてｐＨ５，０で２４時間イン キュベートを行なうことにより調べられた。トウモロコシデンプンの１５％ＤＳ または２５％ＤＳスラリーは、最初に投与量４．４６フアデバス１１／ｇ　ＤＳ デンプンにて例７の条件下でＣＧＴアーゼを用いて液化された。

結果： 結果により、１５％ＤＳおよび２５％ＤＳ　（２４時間インキュベーション後） の両方とも８０〜９０°Ｃが最適であることがわかる。５０℃までの温度低下は 収率を低めた。

例１０ 酵素の再処理を含むかまたは含まない高温でのシクロデキストリン製造 平衡が達しなかった可能性は、９０°Ｃおよび９５°Ｃにて、２４時間インキュ ベーション前にＣＧＴアーゼを用いて１５％ＤＳデンプンを含む例９の反応混合 物をもう一度処理し、そして反応をさらに２４時間続けることにより調べられた 。結果（以下参照）は９０゛Ｃで平衡が達成したことを示す。９５°Ｃではやり 直しがシクロデキストリンの同じ収率を達成するのに必要であり、これにより９ ５°Ｃでの延長されたインキュベーションの間酵素活性の幾らかの損失が示され た。

例１１ カルシウム添加または無添加のシクロデキストリン製造シクロデキストリン製造 におけるカルシウムの効果を調査した。２５％ＤＳ）ウモロコシデンプンスラリ ーを、投与量４．４６フアデバス１１７ｇ　ＤＳデンプンにてカルシウム４０ｐ ｐｍの存在および不存在下にてｐＨ５，０で本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）の ＣＧＴアーゼを用いて液化した。次いで液化デンプンを９０°Ｃにて２４時間イ ンキュベートした。結果（以下参照）はカルシウムイオンの存在が全体の収率に 何の効果も有さないことを示している。

例１２ 様々な酵素投与量におけるシクロデキストリン製造シクロデキストリン収率にお けるＣＧＴアーゼ投与量の変化の効果を２５％ＤＳ）ウモロコシデンプンを用い て測定した。

投与量は２．２３〜６．６９ファデバスＵ／ｇ　ＤＳデンプンへ変化した。

デンプンを、ＡＴＣＣ５３，６２７のＣＧＴアーゼを用いて添加したカルシウム の不存在下に上述の投与量を用いてｐＨ５，０で液化した。液化デンプンを次い で２４時間または４８時間９０°Ｃでｐ）１５．０にてインキュベートした。他 の条件は例５に記載したようであった。

結果（以下参照）は、２４時間後および４８時間後に４．４６および３．３５フ ァデバスＵ／ｇ　ＤＳデンプンの投与量で最も高い収率が達成されることを示し ている。

例１３ 複合体を用いたシクロデキストリンの製造シクロデキストリンの転化におけるβ −シクロデキストリン複合体としてのシクロオクタンの効果を調査した。例７の 条件下で投与量４．４６フアデバス１１／ｇ　ＤＳデンプンにてＡＴＣＣ５３， ６２７のＣＧＴアーゼを用いて添加カルシウムの不存在下にｐＨｓ、ｏで２５％ ＤＳ）ウモロコシデンプンスラリーを液化した。

次いで２４時間９０°Ｃでシクロデキストリンへの転化を続けるが、しかし２４ 時間インキュベーションの始まる前に０．６ｇ／ｇＤＳデンプンのレベルでシク ロオクタンを加えた。

転化結果（以下参照）は、シクロオクタンの添加が最終シクロデキストリン収率 、特にβ−シクロデキストリンの収率を増加することを示している。

□ 例１４ 様々なデンプンからのシクロデキストリンの製造幾つかのデンプンの比較を行な った。トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、コメおよびワタシイメイヅ（ｗａｘ ｙ　ｍａｉｚｅ）のスラリー（２５％ＤＳ）を、例７の条件下に投与量４．４６ フアデバスＵ／ｇ　ＤＳデンプンで本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）のＣＧＴア ーゼを用いて添加カルシウムの不存在下にｐ）１５．０で液化した。次いて液化 デンプン溶液を９０°Ｃで２４時間インキュベートした。

結果（以下に示す）は最終シクロデキストリン収率に差異がありそしてβ−シク ロデキストリンがすべての場合形成される主要生成物であることを示す。

例１５ 液化デンプンのエタノール発酵 湿式ミルしたトウモロシデンプンの３１．５％ＤＳスラリーを、ｐＨ５，０にて カルシウムを添加することなく本発明（ＡＴＣＣ５３，６２７）のＣＧＴアーゼ で１０５°Ｃにて１４分間続いて９０°Ｃで４時間液化した。ターマミルＴＩ″ を用いた対照もまたカルシウム４０ｐｐｍの存在下にｐＨ６，２である以九は上 記のように行なった。各々の場合の酵素投与量は５．０ファデバスＵ／ｇ　ＤＳ デンプンであった。

液化の最後に、薄くシたデンプンを酵母栄養分混合物を用いて２２．４％ＤＳま で希釈した。栄養分混合物における成分の最終濃度は１１に対し、酵母抽出分４ ．０ｇ、リン酸アンモニウム１．６ｇ、硫酸マグネシウム０．４ｇ、クエン酸３ ．２ｇおよびクエン酸ナトリウム０．６ｇであった。最終ｐＨは５．２であった 。

Ａ？ｌＧ　２０ＯＬ　（ノボインダストリイ社、ダンバリー、ＣＴ）をデンプン に基ずいて０．４４％ｉ＜ｔ／ｗｔの投与量で添加した。ペニシリンＧとｇ酸ス トレプトマイシンを２００ｎ／ｍのレベルで含む。発酵を３０°ＣＣ１３００ｒ ｐで６４時間インキュベートした。

エタノールの製造は間接的に二酸化炭素製造、すなわち時間の関数としての重量 損失により測定された。最終エタノール収率は、バイオ−ラド　アミネックスＨ ＰＸ−４２Ａ高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により確認された。

６４時間後、二酸化炭素製造に基ずくエタノール収率は、ＣＯＴアーゼおよびタ ーマミル液化デンプンのそれぞれに対し８７．３％および８９．７％であった。

これらの収率はバイオ−ラド　アミネックスＨＰＸ−４２Ａ　ＨＰＬＣにより確 認きれた。工業的標準収率は一般に約８６−９０％である。

例１６ ＮＣＩＢ　４０，０５３−４０，０５９の嫌気性培養によるＣＧＴアーゼの産生 菌株ＮＣＩＢ　４０，０５３〜４０．０５３を例１で記載したように培養するが ただし培養温度は５５°Ｃであった。

約４０時間培養後の最大活性レベル（ファデバスＵ／ｆプロス）は次のとおりで あった：　ＮＣＩＢ　４０，０５３　；　１Ｂ、　ＮＣＩＢ　４０，０５４：５ ３、　ＮＣＩＢ　４０．０５５　：　２６．　ＮＣＩＢ　４０，０５６　；　２ ２．　ＮＣＩＢ　４０，０５７　；２７、　ＮＣＩＢ　４０，０５８　ニア８． 　ＮＣＩＢ　４０．０５９　；　１０．培養ブロスを遠心分離し、次いで濾過し 、最後にミリボア　ミニクンシステムの使用により濃縮して３０−５０フアデバ スＵ／ｄの容量活性とした。

例１７ ＮＣＩＢ　４０，０５３〜４０，０５９０ＣＧＴアーゼを用いたデンプン液化例 １６におけるように調製されたＣＧＴアーゼ調製物を、ｐＨ４，５にて３５％Ｄ Ｓトウモロコシデンプンを液化しうる能力に関して比較した。デンプンを１０５ °Ｃで１４分間続いて９０″Ｃで４時間酵素投与量４．４６７７デハスＵ／ｇ　 ＤＳ　（６０°Ｃ，ｐＨ６，０）　テ液化した。

デキストロース等量（ＤＥ）を液化後に測定し、液化後のデンプンシロップが粘 度がかなり低下していることを示す注入可能であれば液化されたと判定した。

結果はＣＧＴアーゼのすべてが菌株ＡＴＣＣ５３，６２７がらのＣＯＴアーゼと 同様にｐＨ４，５で良好な液化を達成しろることを示した。すべての場合、はと んどのＤＥはＣＯＴ活性の測定可能な指標ではなかった。

検出のために屈折率を用いたアミネソクスｆ′ゝＨＰχ−４２Ａ（バイオ−ラド ）　ＨＰＬＣによれば、トウモロコシデンプンの液化から生ずる作用パターンは ＣＧＴアーゼの代表的なものであ気ここで３つのピークはα−１Ｔ−およびβ− シクロデキストリンであった。各酵素により作られたシクロデキストリンの相対 比における主な差異はＡＴＣＣ５３，６２７のＣＧＴアーゼと比較して見られな かった。

例１８ クローン化ＣＧＴアーゼを用いた液化 ３５％ＤＳ）ウモロコシデンプンスラリーを、添加Ｃａ”を用いることなくｐＨ ４，５にて例２におけるように調製されたクローン化ＣＯＴアーゼを８．９２フ ァデバスＬｌ／ｇ　ＤＳの投与量で用いて処理した。噴出を、１０５°Ｃで５分 間行ない（最初の液化）、次いで９５°Ｃにて２時間または９０°Ｃで４時間保 持した（第二の液化）。９５°Ｃまたは９０°Ｃでの第二の液化の間、粘度にお いて迅速な低下が見られた。９０°Ｃで、ナメトレ（Ｎａｏ＋ｅｔｒｅ）粘度計 を用いて粘度低下を期間にわたってモニターした。結果は第二の液化まで７分間 はど粘度が４００センチポアＸｇ／ｃｆｆｌまで迅速に減少することを示した。

パイオーラド　アミネ・７クスｆｉｌ）ＨＰＸ−４２Ａ　ＨＰＬＣにより測定さ れた第二の液化後の液化デンプンの作用パターンは両方の温度で特徴的なシクロ デキストリンパターンを示した。１．０未満のＤＥ値がネオクジロイン法（ｎｓ ｏｃｕｐｒｏｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ）により得られこれは還元末端基の不存在が ＣＧＴアーゼの機構と一致することを示す。

例１９ クローン化ＣＧＴアーゼで液化されたデンプンの糖化例１８においてｐＨ４，５ でＣＧＴアーゼで液化したデンプン溶液を、ＡＭＣおよびデキストロザイムを用 いてｐＨ４，５，６０°Ｃで４８時間投与量０．１８ＡＧ／ｇ　ＤＳで糖化した 。デキストロース収率はパイオーラドアミネックス１）肝Ｘ−８７ＣＨＰＬＣに より測定した。

結果はすべての場合デキストロースの良好な収率を示す。

最も高い収率は９５°Ｃで第二の液化を行ないデキストロザイムで糖化すること により達成された。

＝醍出君番号　ＰＣＴ／ Ｉ際出願番号　ＰＣＴ／ 国際出Ｉｔ１ｆｒ号ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ 国際出願番号　ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ ＩＥｉ際出願番号ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　１４ ｏ　ｏ　ロ　０　０　ｏ　ロ　Ｑ い　Ｏｕ’）Ｏｕ’）Ｏｆ） つ　ｎ　Ｎ　Ｎ　−、− α−アミラーゼ ＦＩＧ、７ 国際調査報告 ＩＮＳ”ＭＩ１６ＭＩ　Ａｌｌ１’ｌｌ＋４＄　Ｍ、　ＰＣＴ／ＤＫεＢ１０Ｏ １６ｆｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テルモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）または テルモアナリロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）の菌株に由来し、 ｐＨ５．０で測定された約９５℃の最適温度；約５．０の最適ｐＨ；およびデン プンとＣａ＋＋不存在下で８０℃およびｐＨ５．０で４０分間のインキュベーシ ョン後約９５％の残留活性を有することからなるシクロデキストリングリコシル トランスフェラーゼ。 ２．菌株ＡＴＣＣ５３，６２７または菌株ＮＣＩＢ４０，０５３〜ＮＣＩＢ４０ ，０５９の１つから産生するものである請求項１に記載のシクロデキストリング リコシルトランスフェラーゼ。 ３．適当な栄養素含有培地において、嫌気性条件下でテルモアナエロバクター（ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）またはテルモアナリロビウム（Ｔｈｅ ｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）のＣＧＴアーゼ産生菌株を培養するか、または好 気性条件下でそこからの適当な遺伝子情報を含む形質転換宿主微生物を培養し、 その後発酵培地からＣＧＴアーゼを回収することからなるシクロデキストリング リコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の製造方法。 ４．菌株がＡＴＣＣ５３，６２７、菌株ＮＣＩＢ４０，０５３〜ＮＣＩＢ４０， ０５９の１つ、またはそれらの突然変異体もしくは変異体である請求項３に記載 の方法。 ５．宿主微生物が大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス属 （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはアスペ ルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌株、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉ ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはアスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ） の菌株である請求項３に記載の方法。 ６．シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ産生能力がありそして非 運動性であるテルモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）またはテルモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）の菌株の 生物学的に純粋な培養物。 ７．菌株ＡＴＣＣ５３，６２７、菌株ＮＣＩＢ４０，０５３〜ＮＣＩＢ４０，０ ５９の１つまたはこれらの突然変異体もしくは変異体の請求項６に記載の培養物 。 ８．水性デンプンスラリーに、請求項１または２のＣＧＴアーゼの存在下にて約 ４．０〜５．５の範囲のｐＨで好ましくは約１００℃を超える温度で酵素液化を 行なうことからなるデンプン液化方法。 ９．デンプンスラリーへカルシウム塩をほとんど添加しない請求項８に記載のデ ンプン液化方法。 １０．その後、グルコアミラーゼの存在下に、ほとんど中間ｐＨ調整を行なうこ となく酵素糖化を液化デンプンへ行なうことからなる請求項８または９に記載の 方法。 １１．さらに酵母を用いてエタノール発酵を行ないこれと同時にまたは続いて前 記糖化を行なうことからなる請求項１０に記載の方法。 １２．請求項１に記載のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを用 いて液化デンプン溶液に６０℃以上の温度で酵素処理を行ない、続いて反応混合 物からシクロデキストリン生成物を回収することからなるシクロデキストリンの 製造方法。 １３．前記酵素処理を約２４時間未満で行なう請求項１２に記載の方法。 １４．デンプンスラリーを前記ＣＧＴアーゼを用いて酵素液化することにより前 記液化デンプン溶液が生ずる請求項１２または１３に記載の方法。 １５．前記酵素液化を約４．０〜５．５の範囲のｐＨで行ない、そして続くデン プン加水分解物の酵素処理をほとんど中間ｐＨ調整することなく行なう請求項１ ４に記載の方法。 １６．デンプン加水分解物の酵素処理を、ＣＧＴアーゼを用いて液化デンプンを 再処理することなく行なう請求項１４または１５に記載の方法。 １７．水性デンプンスラリーを請求項１に記載のシクロデキストリングリコシル トランスフェラーゼを用いて約１００℃以上の温度にて４．０〜５．５の範囲の ｐＨにて、好ましくは実質的にカルシウム塩を添加することなく酵素処理し、そ の後得られたシロップを約２８時間以下で８０〜９０℃の範囲の温度に保持し、 該シロップは前記保持時間の少なくとも一部の間２０−３０ＤＳの範囲であり、 次いで反応混合物からシクロデキストリン生成物を回収することからなるシクロ デキストリンの製造方法。