JPH0118717B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明は、澱粉糖化酵素の製造方法に関するも
のである。 〔従来技術〕 プルラナーゼはプルランのα―１，６―グルコ
シド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放射菌などに
広く存在することが知られている。プルラナーゼ
はアミロペクチンあるいはこれを含む澱粉に作用
させたとき、その分岐結合は（α―１，６―グル
コシド結合）を切断してアミロース様多糖を生成
することから沃度反応の増加をともなうことが知
られているが、α―１，４―グルコシド結合は切
断することはできない。一方、α―１，４―グル
コシド結合を切断するα―アミラーゼやβ―アミ
ラーゼなどのアミラーゼはα―１，６―グルコシ
ド結合は切断することはできない。極めて、まれ
な例外として、グルコアミラーゼはα―１，４―
グルコシド結合のみでなく、α―１，６―グルコ
シド結合も切断することができる。 α―１，６―グルコシド結合を切断する酵素に
はプルラナーゼの他に、イソアミラーゼ、Ｒ―酵
素、アミロ―１，６―グルコシダーゼと呼ばれる
種々な酵素があり、総称してα―１，６―グルコ
シダーゼ、あるいは、一般に、枝切り酵素
（debranching enzyme）と呼ばれている。 プルラナーゼなど枝切り酵素は、最近、β―ア
ミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させる
ことにより、マルトースを収量よく生産するのに
使用したり、また、グルコアミラーゼの分岐（α
―１，６―グルコシド結合）切断能力をおぎなう
ために、グルコアミラーゼと併用することによ
り、澱粉からグルコースを収量よく製造するため
に使用される有用な酵素である。 しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためにはグルコアミラーゼがPH４
〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため、少
なくとも55℃〜60℃で長時間使用できる熱安定性
をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素であるこ
とが要求される。 しかるに、従来知られている多くの枝切り酵素
は、一部の微生物のもの｛バシルス・ステアロサ
ーモフイラス（日本農芸化学会大会昭和47年度講
演要旨集 第88頁、最適温度65〜67.5℃）バシル
ス・アシドプルリテイカス（特開昭57−174089、
Starch 34、340（1982）、最適温度60℃｝を除き、
殆んどは最適作用温度が40〜50℃付近にあつて、
熱安定性に劣ることが欠点であつた。 〔目 的〕 本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、土壌中より分離し、
バシルス・ズブチルスと同定した細菌の生産する
プルラナーゼ様酵素が、最適作用PHが約５〜約
7.5の広いPH範囲にあり、且つ最適作用温度が60
〜63℃の高い温度にあることを認めた。そして、
本酵素を商業的に生産すべく、プルラナーゼ活性
増強のための微生物変異を行なつた結果、同酵素
を高力価に生産するツニカマイシン耐性のバシル
ス・ズブチルスTU株を得ることができた。本発
明はこの知見にもとずいてなされたものである。 〔構 成〕 本発明は、広作用PH域をもつ耐熱性プルラナー
ゼ様酵素を生産するバシルス・ズブチルス
（Bacillus subtilis）TU株を培養し、培養物から
同酵素を採取することを特徴とするプルラナーゼ
様酵素の製造方法にをするものである。 本発明により生産されるプルラナーゼ様酵素
は、プルランを基質とするとき、最終的に、主と
してマルトトリオースを生成するプルラナーゼ活
性を示すが、同時に、アミロース、アミロペクチ
ン、グリコーゲンなどのα―１，４―グルコシド
結合分解活性をもち、マルトースとマルトトリオ
ースを主成分として生成するα―アミラーゼ活性
をもつている。このプルラナーゼ活性とα―アミ
ラーゼ活性は、硫安分画、各種有機溶剤による分
画、陰イオン交換体による吸着クロマトグラフイ
ー、ゲル濾過、無機担体などへの吸着などのタン
パク質精製方法によつて分離されず、Sephadex
Ｇ―200（Pharmacie Fine Chemicals 製）、
Cellulofine GC700m（チツソ(株)製）Biogel Ａ―
0.5m（Bio―Rad Lab.製）などを用いたゲル濾過
法により測定された分子量が45〜55万の高分子量
である（通常のプルラナーゼの分子量は10万前
後）ことから、それぞれの活性をもつ複数個のサ
ブユニツトがかなり強固に結合し、複合酵素を形
成していることが考えられる（第３図は、
Biogel Ａ 1.5mによるα―アミラーゼ活性、プ
ルラナーゼ活性及びタンパク質の溶出曲線を示し
ているが、これら三者の溶出パターンは完全に一
致している）。 本発明により生産されるプルラナーゼ様酵素の
プルラン分解活性の酵素的性質を以下に記載す
る。 (1) 作用；プルランのα―１，６―グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオース
を生成する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30
分間反応したとき、約80℃まで作用し、
最適作用温度は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約3.5
〜約11の広いPH範囲に作用する。第１図
に示す通り、PH５付近とPH７〜7.5のピ
ークが認められ、最適作用PHは約５〜約
7.5の広い範囲にあると考えられる（ク
エン酸―リン酸二ナトリウム緩衝液とリ
ン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分
反応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルラン
を基質として残存活性を測定した。その
結果、50℃、10分間の加熱までは殆んど
失活が認められず、55℃、10分間の加熱
で約30％失活した。そして、60℃、10分
間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時
間放置後、プルランを基質としして残存
活性を測定した結果、PH約５〜約10で安
定であつた。 (6) 阻害剤；１×10^-3MのHgCl₂、AgNO₃で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO₄
により約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
性が著しく増加する。１×10^-2M塩化カ
ルシウムの存在下で、最適作用温度は約
65℃に認められた（１％プルラン、30分
反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾液か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、
蒸留水で洗滌後0.5MKClまたはリン酸
一カリウム溶液で抽出し、次いで、
DEAE―セフアロース カラムクロマト
グラフイー、Biogel Ａ 1.5mによるカ
ラムクロマトグラフイー、同カラムによ
る再クロマトグラフイー等によりクロマ
ト的、電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。 (9) 分子量；Biogel Ａ 0.5mで測定した分子量
は約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼ活性の測定は、
0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％プ
ルラン溶液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応
させる。この条件で１分間に1μmolのグ
ルコースに相当する還元力を生成する酵
素量を１単位とした。 以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ活性はPH約５〜約7.5の極めて広いPH範囲に最
適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60〜
63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であり、
本発明以前に知られているバシルス属のプルラナ
ーゼ｛例えば、Agric Biol.Chem.40，1523
（1976）（最適PH６〜6.5、最適温度50℃）、特公昭
59−39630（最適PH7.0、最適温度45℃）、特開昭57
−174089（最適PH3.5〜5.5、活性温度約60℃）｝と
は異つた新規なプルラナーゼ様酵素であるという
ことができる。 本発明において、例示菌として使用されるバシ
ルス・ズブチルスTU株の菌学的性質は下記の通
りであり、本菌は微工研条寄第684号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態的性質 桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ、 非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円
形。 (2) 培養的性質 (a)肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b)グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培養
よりも生育劣る。 (c)肉汁液体培養；生育はよくないが混濁を生生
じ、沈降する。 (d)クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育する。 (e)ペプトン―ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液化
する。 (f)ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次いで
ペプトン化する。 (g)ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学性質 (a)硝酸塩の還元； 陰性 (b)カタラーゼ； 陽性 (c)チロシナーゼ； 陰性 (d)インドール； 生成しない (e)クエン酸の利用； 陽性 (f)硫化水素の生成； 陽性 (g)ウレアーゼ； 陰性 (h)澱粉の加水分解； 陽性 (i)炭水化物の利用；Ｄ―グルコース、Ｄ―フラ
クトース、Ｄ―マンノース、Ｄ―ガラクトー
ス、シユークロース、マルトース、ラクトー
ス、デンプン、デキストリン、グリコーゲ
ン、Ｄ―キシロース、Ｄ―アラビノース、Ｌ
―アラビノースなどの炭水化物から酸を生成
するが、ガスの発生は認められない。 (4) 生育PH及び生育温度 本菌は中性付近よりも、弱アルカリ性のPH
7.5〜PH8.5で良好に生育する。生育最適温度は
35゜〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃であ
る。 〔効 果〕 本発明により生産される新規なプルラナーゼ様
酵素はプルランをマルトトリオースに分解するα
―１，６―グルコシド結合分解活性の他に、アミ
ロース、アミロペクチンやグリコーゲンなどに存
在するα―１，４―グルコシド結合を分解して、
主としてマルトースとマルトトリオースを生成す
る新規なα―アミラーゼ活性をもつているため、
この活性をもたないプルラナーゼやイソアミラー
ゼなどに比べ、グルコアミラーゼと併用して澱粉
の糖化を行つた場合、澱粉の糖化反応を促進し、
且つ最終的なグルコースの収量も、通常、0.5〜
３％高く収得することができる。例えば、グルコ
アミラーゼ単独で30％濃度の液化澱粉に作用させ
た場合、グルコースの収量は94〜95％である。そ
して、グルコアミラーゼに市販のプルラナーゼを
共存させた場合、グルコースの収量は約96.5％で
あつたが、同一プルラナーゼ活性の本発明の酵素
剤を共存させた場合は97.0〜97.5％の収量でグル
コースが得られた。このように、グルコースの収
量が高いばかりでなく、最高の糖化率に到達する
時間も、本発明の酵素剤を使用する場合、著しく
短縮することができる。すなわち、このことはグ
ルコアミラーゼの使用量を節減できることを意味
している。 また、本発明の酵素はアミロース、アミロペク
チン、デンプン、グルコーゲンなどに作用させた
場合、主として、マルトースとマルトトリオース
を生成するが、本酵素がα―１，６―グルコシド
結合分解活性をもつているため、マルトースとマ
ルトトリオースは極めて高い収量で得ることがで
きる。例えば、本酵素剤を液化デンプンに作用さ
せたとき、マルトースとマルトトリオースは、い
ずれも約40〜約50％の高収量で得られる。マルト
ースとマルトトリオースを、このような糖組成で
生成するアミラーゼは未だ知られていない。本発
明の酵素剤を使用して得られるこのような糖化物
はマルトースとマルトトリオースの両方の特性を
もつものであり、甘味料、甘味調整剤、食品増量
剤など、種々の食品の添加剤として利用できるも
のである。また、本発明の酵素は、極めて熱安定
性に優れ、グルコアミラーゼの限界温度である60
℃においても長時間の反応をおこなうことができ
るばかりか、PH4.5〜5.0のグルコアミラーゼの良
好な作用PH範囲でも好適に利用することができ
る。 このように、本発明により生産される酵素は、
種々の効果をもつものである。 本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素のよう
な無機窒素源のいずれか、または両方を使用す
る。 炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガン、鉄化合物が添加さ
れる。 培養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃前後
で２〜４時間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈殿物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。 本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ―アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH４〜９、温度40℃〜70℃で
行われる。 以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ 大豆粕５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.4％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性デンプン２％、尿素0.3
％、ソデイウム・ドデシルサルフエート0.1％、
硫酸銅５×10^-5M、塩化マンガ2.5×10^-6M、塩
化カルシウム１×10^-3M、硫酸亜鉛１×10^-4M、
硫酸鉄１×10^-5Mからなる培地（PH7.2）30mlを
200ml容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、
バシルス・ズブチルスTU株（FERM BP―684）
を接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、
遠心分離して得た上澄液中のプルラナーゼ活性は
培地１ml当り9.6単位であつた。またα―アミラ
ーゼ活性は培地１ml当り45.2単位であつた。 ここでα―アミラーゼ活性は以下のようにして
測定した。 0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％可溶性澱
粉液（PH7.0）0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１
分間に1μmolのグルコースに相当する還元力を生
成する酵素量を１単位とした。 実施例 ２ 実施例１で使用した培地で使用した培地と同じ
組成の培地で培養した、バシルス・ズブチルス
TU株（FERM BP―684）の培養上澄25mlに、
0.4Mリン酸二ナトリウム溶液及び0.4M塩化カル
シウム溶液各150mlを滴下しながら添加してリン
酸カルシウムゲルを形成させるとともに、これに
酵素を吸着させた。次いで、ガラスフイルターで
濾過して吸着物を回収し、蒸溜水で充分洗滌後、
0.5Mリン酸一カリウム溶液200mlで酵素を溶出
し、透析、濃縮した。 次いで、2.5×10^-3Mトリス緩衝液（PH7.0）で
緩衝化したDEAE・セフアロースカラムにで処理
し、同緩衝液で流出するプルラナーゼ活性区分を
集め、濃縮、透析後、2.5×10^-3Mトリス緩衝液
（PH7.0）で緩衝化したBiogel Ａ 1.5mカラムで
ゲル濾過を行い、活性区分を集め、同カラムで再
クロマトグラフイーを繰返した。第３図は
Biogel Ａ 1.5mカラム（1.5×87cm）による溶出
曲線を示している。精製された酵素はタンパク質
曲線、プルラナーゼ活性曲線及びα―アミラーゼ
活性曲線は完全に一致している。最終的に回収さ
れた酵素標品のプルラナーゼ活性は585単位そし
てアミラーゼ活性は1070単位であつた。 実施例 ３ イワシミール５％、コーン・ステイープ・リカ
ー0.4％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム
0.1％、可溶性デンプン２％、尿素0.1％、ソデイ
ウム・ドデシルサルフエート0.06％、硫酸銅５×
10^-5M、塩化マンガン2.5×10^-6M、塩化カルシ
ウム１×10^-3M、硫酸亜鉛１×10^-4M、硫酸鉄１
×10^-5Mからなる培地（PH7.2）30mlを200ml容三
角フラスコに入れ、常法により殺菌後、バシル
ス・ズブチルスTU株（FERM BP―684）を接
種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心
分離して得た上澄液について生産されたプルラナ
ーゼ活性を測定した結果、培地１ml当り6.9単位
であつた。 実施例 ４ 実施例２で調製した酵素剤を市販のグルコアミ
ラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行つた。 基質としては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液
化したDE7.7のものを使用した（グルコアミラー
ゼ、液化酵素は、天野製薬(株)、ノボ・ジヤパン(株)
などにより入手することができる。）。固形分とし
て各３ｇの液化澱粉に、グルコアミラーゼ（ノボ
社製工業用酵素）を液化澱粉固形分に対して、
0.2％量と実施例２で調製した本発明の酵素剤ま
たは市販のプルラナーゼを加え、１×10^-2M塩化
カルシウムの存在下、PH4.8〜5.0で、57.5℃で糖
化反応を行つた（各プルラナーゼ剤は、前記の活
性測定法おいて、リン酸緩衝液の代りに、酢酸緩
衝液を用い、PH5.0で測定する以外、同じ条件で
行ない、基質１ｇに対し0.5ｇ単位の酵素量を添
加した）。得られた結果は第１表及び第２表に示
す通りであつた。

【表】 第１表は、糖化開始１、２、３、５と20時間目
におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースと
して表わした値）を示す。全糖はフエノール硫酸
法で定量し、還元糖はフエリシアン化カリ法によ
り定量した。表から明らかなように、本発明の酵
素剤を用いた場合、糖化開始初期における糖化が
促進されていることがわかる。 第２表は、糖化開始後、22時間、25時間と28時
間目の糖化物を高速液体クロマトグラフイーによ
り糖組成を分析した結果を示している。表から明
らかなように、本発明のプルラナーゼを用いた場
合、最高97.1％の収量でグルコースが得られた。
また、糖化22時間目のグルコース収量から明らか
なように、糖化反応が著しく促進されていること
がわかる。

【表】 実施例 ５ 実施例４と同様にして、本発明の酵素を基質ｇ
当り0.5単位添加し、PH4.5〜5.3、温度55℃で糖化
した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成したグ
ルコース収量を高速液体クロマトグラフイーによ
り求めた。第３表は各糖化PHにおける最高値を示
したときのグルコース収量を示している。

【表】 表から明らかなように、本発明の酵素はPH4.5
〜５のグルコアミラーゼの最適作用PH条件下で効
果的に作用し、無添加の場合に比べ、グルコース
収量を約２％増加することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図；プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；Biogel Ａ 1.5mカラム
（1.5×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラー
ゼ活性及びタンパク質（280nmにおける吸収）の
溶出曲線を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 澱粉を、主成分としてマルトースとマルトト
   リオースに分解する新規なα―アミラーゼ活性を
   もつプルラナーゼ様複合酵素を生産するバシルス
   属菌株を培養し、培養物から該酵素を採取するこ
   とを特徴とする新規なα―アミラーゼ活性をもつ
   プルラナーゼ様複合酵素の製造法。