JPS62126974A - アミラ−ゼｇ２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、バシルス属細菌による新規なアミラーゼの製
造方法に関するものである。

〔従来技術〕

ｙＱ粉を加水分解する酵素として、分解様式や生成する
糖により１種々のアミラーゼのあることが知られている
。澱粉をマルトース単位に分解する酵素としては、大豆
、麦芽や小麦などの植物起源のβ−アミラーゼ（酵素研
究法、第２巻、１２０頁、朝食書店（昭和３０年））と
バシルス屈細菌の生産するβ−アミラーゼ（アミラーゼ
シンポジウム、６巻、３９頁（１９７１）、アグリカル
チャーバイオロジカルケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉ、ｓｔ、ｒｙ
）３８巻、１０２３（１９７４）、同４０巻、　１５１
５頁（１９７６）など）が知られている。これらの酵素
は。

α−１，４−グルカンの非還元末端より、厳密にマルト
ース単位で加水分解し、生成マルト−スはβ−型である
。

最近、Ｈ，０ｕｔｔｒｕｐと８．　Ｅ、　Ｎｏｒｍａｎ
は、バシルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｊｃａｒｏｕｈｃｒｍｏ　−ｐｈｉｌｕｓ）の生
産する新規なマルトース生成酵素について報告している
（第３５回ブトモルド　スターチコンベンション（３Ｓ
ｔ、ｈ　Ｄｃｊｍｏｌｄ　Ｓｔ、ａｒｃｈ　Ｃｏｎｖｅ
ｎｔｉｏｎ１９８４年４月２５日〜２７日））。この酵
素は、澱粉の非還元性末端からエキソ型でマルトースを
生成するが、生成マルトースはα−型であること、植物
β−アミラーゼのように、厳密にマルト−スｊ１１１位
で加水分解するものではなく、反応初期には、マルトテ
トラオース（Ｇ４）、マルｉ−トリオース（Ｇ３）とマ
ルトース（Ｇ２）の他に、少量のフル１〜ペンタオース
（Ｇ５）やマルトヘキサオース（Ｇ６）も生成すること
、シャーディンガー（Ｓｈａｒｄｉｎｇｅｒ）デキスト
リンをフル１〜−スとグルコースに分解すること、及び
マルトトリオースをマルトースとグルコースに分解する
と報告されている。このため、この酵素による澱粉分解
物中には６〜８％のグルコースが含まれる。

〔目的及び効果〕

本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生成するア
ミラーゼ生産菌を求めて、広く微生物の検索を行ってき
た結果、土壌中より分離し、バシルスメガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）と同定した細
菌が新規で、且つ耐熱性のマルトース生成酵素を生産す
ることを認めた。本酵素は、澱粉を、その非還元性末端
からマルトース単位で加水分解すると考えられるが、生
成糖はα−型であることを、生成物の変旋光及びガスク
ロマトグラフによる分析により確認した０本酵素はアミ
ロペクチンのα−１，６−グルコシド結合を分解するこ
とができないため、リミットデキストリンを残すが、ア
ミロペクチンのマルトースへの分解率は、β−アミラー
ゼの場合に比べて、２〜３％高く、より分岐結合（α−
１，６−グリコシ１〜結合）近くまで分解できるものと
考えられる。また、反応初期には、マルトース以外の生
成物はｋＪｌ　察されず、マルトトリオースに対する親
和性が小さいため、最終反応物中には、グルコースは殆
んど存在しないなど、新規な酵素と考えられた０本発明
者は、この酵素をアミラーゼＧ２と命名した。本発明は
この知見にもとずいてなされたものである。

〔構　　成〕

本発明は、バシルス属に属しアミラーゼＧ２を生産する
菌株を培養し、培養物からアミラーゼＧ２を採取するこ
とを特徴とするバシルス属アミラーゼＧ２の製造方法に
関するものである。

以下に、本発明の内容を更に鮮明に説明する。

（１）作用；　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その非還元性末
端からマルトース単位で加水分解する。生成糖はα−マ
ルトースであることがらα−アミラーゼの一種と考えら
れるが、エンド型の分解作用を示さず、アミロペクチン
、グリコーゲンからはリミットデキストリンを残す、サ
イクロデキストリンを分解せず、またマルトトリオース
の分解力も弱い。生成糖がα−型であることを除けば、
植物や細菌のβ−アミラーゼに似ているが、アミロペク
チンやこれを含む澱粉に対する分解限度は２〜３％高い
。

（２）作用温度範囲及び最適温度；　１％可溶性ｇｌ粉
、０．０５Ｍリン酸緩衝液の下で作用させたとき、約７
５℃まで作用し、最適温度は約６０℃である（第１図（
ａ））。

（３）作用ρ１１範囲及び最適ＰＨ；　　約３〜約１１
の広いρ１１範囲に作用する。最適ρＩ（は約７〜７．
５である（０．０５Ｍリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の
下で作用、（第１図（ｂ））。

（４）熱安定性；　　０．０５Ｍトリス緩衝液（ρ１１
７．０）の下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱
までは失活が認められない。６０℃ｌＯ分間の加熱で約
１０％失活し、６５°Ｃ１０分間の加熱で約７０％失活
し、そ−して、６０℃１０分間の加熱で９０％以上失活
した（第１図（Ｃ））。

（５）ｐＨ安定性；　　０．１Ｍ緩衝液の下、室温（３
０℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。その結果
、ｐｌ＋４．５〜８の範囲で安定であった（第１図（ｄ
））。

（６）安定化；　カルシウムイオンによる熱安定性の増
加は認められなかった。

（７）阻害剤；　本酵素は、１ｘｉｏ−’　Ｍのｌ１ｇ
ｃ１２、ＡｇＮ０３　、　Ｃｕ５Ｏ４、Ｎｉ５０４によ
り、それぞれ約８５％、約７５％、約７０％、約６０％
阻害された。また、ｌＸｌ０−３８のＰ−クロロマーキ
ュリベンゾエートにより約７０％阻害された。

（８）精製方法；　本酵素は、液体培養液の上澄から、
硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラ
フィー、同カラムによる再クロマトグラフィーとバイオ
ゲルＡ０．５ｍによるカラムクロマトグラフィーにより
、ディスク電気泳動的に均一まで精製することができる
。

（９）分子量；　セファデックスＧ−２００により測定
した分子量は約６０，０００であった。

（ｌＯ）力価測定法；　　０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
させた２％可溶性澱粉０．５ｍΩに、適量の酵素を加え
、水で全量１ＩＩＩＱとし、４０℃で反応させる。

この条件で、１分間に１μモルのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、本発明以前に知られている
、植物起源のβ−アミラーゼ、バシルス属細菌のβ−ア
ミラーゼ及びバシルスステアロサーモフィラスのマルト
ース生成アミラーゼと比較した結果は、第１表に示す通
りである。

すなわち、植物系β−アミラーゼ及びバシルス属のβ−
アミラーゼはβ−マルトースのみを生成するのに対し、
本発明の酵素はα−マルトースのみを生成する。バシル
スステアロサーモフイラスのアミラーゼは、本発明の酵
素と同様α−マルトースを生成するが、反応初期には、
マルトテトラオースやフル１−トリオース及び微量のマ
ルトヘキサオースやマルトペンタオースを生成すると報
告されている。従って、これら酵素は本発明の酵素とは
本質的に異なっている。また、最適ｐｌ＋、最適温度、
分子量などの酵素的性質においても差が認めらぬること
から、本発明の酵素は新規な酵素ということができる。

本発明の酵素を生産する例示菌として、バシルスメガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔ、ｃｒｉｕｍ）
を挙げる・本菌の菌学的性質は下記に示す通りであり、
微工研菌寄第７９７８号として、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。

（１）形態；　巾０．７〜１．３　Ｘ　２．４〜５．０
μ、通常、２個以上連なり、短鎖状に生成する。ダラム
陰性。

（２）胞子；　両末端近くに２個。胞子をもつ細胞のふ
くらみは殆んど認められない。

（３）生育：　好気的に生育、嫌気下では殆んど生育は
認められない。

（４）肉汁；　混濁、沈降する。

（５）肉汁寒天；　生育良好、表面なめらか、淡褐色を
示すが１色素の生成なし。

（６）グルコース肉汁寒天；　肉汁培地よりよく生育す
る。

（７）グルコース硝酸塩寒天；　よく生？Ｆする。表面
なめらか。淡褐色を示す。

（８）チロシン寒天；　褐色色素を生成する。

（９）グルコース・アスパラギン寒天；　かなりよく生
育する。

（ｌＯ）ホテト；　生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。

（１１）クエン酸の利用；　陽性。

（１２）澱粉の加水分解；　陽性。

（１３）アセチルメチルカルビノール；　生成しない。

（１４）ゼラチン；　分解する。

（１５）ミルク；　凝固し、ペプトン化する。

（１６）硝酸塩の還元；　陽性。

（１７）カタラーゼ；　陽性。

（１８）炭水化物の利用：　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リ
ボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ
ロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、フル１
〜−ス、蔗糖などを利用し、いずれもガスを生成するこ
とな二生産する。

（１９）最適生育温度；４０°Ｃ曲後。

（２０）最高生育温度；　約５０°Ｃ０（２１）死滅温
度；１００°Ｃｌ２Ｏ分間の加熱でも死滅しない。

以上の菌学的性質について、バージェイスマニュアルオ
フデタミネーティブバクテリオロジー（１３ｅｒｇｅｙ
’ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔ、ｅｒｍｉ
ｎａｊｉｖｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の第７版及び
第８版（ザウィリアムスアンドゥイルキンスカンパニー
（Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　
Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９５７年及び１９７４年）を参照
し、本菌をバシルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍ
ｃｇａｊｃｒｉｕｍ）Ｇ　−２と命名した。

バシルスメガテリウムＧ２を培養して、アミラーゼＧ２
を生産するための一般的培養は、次のようにして行われ
る。

培養は、通常、液体培地による通気、攪拌培養により行
われる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、カゼイン、コーンステイープリカー、大豆粕など
、通常、微生物の培養に際し、よく用いられる有機窒素
源、あるいはこれに補足する窒素源として、塩化アンモ
ン、リン酸アンモン、硝酸塩などの無機窒素源が用いら
れる。

炭素源としては、Ｈ１３）、デキストリン、マルトース
、グルコース、シュークロスなどが使用される。

培養はｐｔ１５〜９、温度２０〜６０°Ｃで好気的に行
われる。

アミラーゼＧ２は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。

培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモニウム、
硫酸ナトリウムなどによる塩析によるか、または、アセ
１−ン、インプロパツール、エタノール、メタノールな
どの有機溶媒を加えて、酵素を沈澱物として収得し、乾
燥、保存する。

アミラーゼＧ２を用いて、澱粉を糖化する反応は、次の
ようにして行う。

澱粉は、先ず、酸または澱粉液化酵素α−アミラーゼに
より液化される。澱粉の液化度（ＤＥ）は、フル１−−
スの収量に著しく影響し、液化度の小さい酸化澱粉を使
用する方が収量よくマルトースが得られる。　（ＤＥは
固形分中の還元力をグルコースとして表わした百分率）
。基質濃度は、通常、５〜４０％、反応ｐ１１は５〜８
、温度は５０〜６０°Ｃで行われる。

本酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合
を分解することができないので、アミロペクチン、ある
いはこれを含む澱粉又はその派生物を基質として用いる
ときには、α−１，６−グルコシド結合を分解するイソ
アミラーゼやプルラナーゼなどのα−１，６−グルコシ
ダーゼの存在下で反応を行うと、糖化反応を促進し、収
量よくマルトースを製造することができる。

次に、実施例により、本発明の詳細な説明する。

実施例１ 大豆タンパク２％、米ぬか２％、Ｋ２１１ＰＯ，、０，
３％、Ｍｇ５Ｏ４−７）１２００．１％、可溶性澱粉２
％、ＣａＣ１２１Ｘ１０−　’　Ｍ、ＭｎＣ１２１ＸＩ
Ｏ−’　Ｍ、ＣｕＳＯ４２，５ｘｌＯ−’　Ｍ。

ＦｅＣ１□２．５Ｘ１０−　’　Ｍ、ラウリル硫酸ナト
リウム２．５ＸＩＯ−”％からなる培地（ｐＨ７、０）
　３０ｍ　Ｑを２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、１
２０℃で１５分殺菌後、バシルスメガテリウム（微工研
菌寄第７９７８号）を接種し、３０℃で３日間振盪培養
（１６０ｒｐｍ）　シた。培養後、遠心分離して得た上
澄液について、生産されたアミラーゼＧ２活性を訓定し
た結果、培地１＋＋ｌ当り、９．０単位であった。

実施例２ 実施例１で得られた培養上澄液に、硫安を８０％飽和に
なるように添加し、生成した沈澱物を遠心分Ｍ機により
回収し、水に溶解し、ｌＸｌ０−’Ｈのし一システィン
を含む蒸留水に対し、−夜透析したものを澱粉糖化用酵
素液とした（酵素の回収率は約８２％であった）。

可溶性澱粉、短鎖アミロース（ＤＰ１７）、アミロペク
チン（Ｉ−ウモロコシ製）、グリコーゲン（カキ製）各
２０ｍ　ｇに、アミラーゼを６Ｘ１０−’単位加え、全
量２ＩＩＩＱとし、ｐ）１７．４０°Ｃで、３日間反応
をおこなった。反応後、糖化液の糖組成を液体クロマト
グラフ法により測定した結果は、第２表に示す通りであ
った。

第２表 実施例３ ＤＥ５．８１の液化ポテト澱粉各１００ｍｇに、１〜リ
ス緩衝液（Ｐ１１７．０）０．０４Ｍ、アミラーゼＧ２
または麦芽β−アミラーゼを液化澱粉固形分ｇ当り、そ
れぞれｌ、３．５．１Ｏ１１５，２０，３０単位を加え
、６０℃で３日間反応を行った。反応後、糖化液の糖組
成を分析した結果は、第２図に示す通りであり、β−ア
ミラーゼ（黒丸）に比へアミラーゼＧ２（白丸）は分解
力が優れ、約２％マルトースの収量が高かった。

【図面の簡単な説明】

第１図（、）、（ｂ）、（Ｃ）と（ｄ）は、それぞれア
ミラーゼＧ２の最適温度、最適ｐｌ＋、熱安定性とｐｌ
＋安定性を示している。 第２図は、ＤＨ５，８１の液化ポテト澱粉をアミラーゼ
Ｇ２と麦芽β−アミラーゼで糖化したとき酵素量とマル
トース生成率の関係を示してν）る。 ：：・ベニ゛： 」′１１デ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バシルス属に属し、アミラーゼＧ２を生産する菌株を培
   養し、培養物からアミラーゼＧ２を採取することを特徴
   とするバシルス属アミラーゼＧ２の製造方法。