JPH02439A - ヒトアプロチニン相同体、宿主株およびそれらの発現ベクター、それらの分離および薬物としてのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 末完ＩＪ１は、アミノ酸配列がヒト蛋白質のそれから誘
導されたアプロチニンの相同体、および遺伝子工学の方
法によるそれらの調製方法、および薬物としてのそれら
の使用に関する。

アプロチニン、基本的な膵１１　トリプシン阻害剤［ク
ニツ（Ｋｕｎｉｔｚ）］、はウシ器官からのセリンプロ
テイナーゼ阻害剤であり、長い間知られてきており、そ
して広い阻害特異性を有する。

そのアミノ酸配列は既知である。アプロチニンは、多年
にわたって、酵素の自然の阻害剤の不存在または欠乏に
よって引き起こされかつ維持される病気の治療における
薬物として使用されてきており、そして前記酵素はトラ
シロール（Ｔ　ｒ　ａ　５ｙｌｏｌ）によって阻害され
うる［参照、Ｈ，フリツ（Ｆｒｉｔｚ）およびＧ、ウン
デシル（Ｗｕｎｄｅｒｅｒ）、アルズネイミッテルフォ
ルシユング（Ａｒｚｎｅｉｍｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎ
ｇ）、３３．４７９−４９４　（１９８３）］　。

しかしながら、多数の病気はアプロチニンで阻害されえ
ない過剰の酵素によって引き起こされる。リンソームの
酵素、およびこれらのうちで。

とくに白血球エラスターゼは、これに関して重要な役割
を演する。細胞外に分泌されると、それらは、通常、内
因性トロ書割と錯化することによって直ちに不活性化さ
れ、そしてその阻害剤の例は次の通りである：α１−プ
ロテアーゼ（αＩ−ＰＩ）［Ｊ、）ラビス（Ｔｒａｖｉ
ｓ）およびＧ。

Ｓ、サルベセン（Ｓａｌｖｅｓｅｎ）　、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、（１９８３）、６５５−７
０９］　、抗白血珠エラスターゼ（ＨＵＳＩＩ）［Ｈ，
シエスラ−（Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒ）ら、ヒト多形核白
血球の中性プロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐｒｏｔ
ｅａｓｅｓ　　ｏｆＨｕｍａｎ　　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｏｎｕｃｌｅａｒ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、（１９
７８）、１９５−２０７；に、ヘイブマｙ（Ｈａｖｅｍ
ａｎｎ）およびＡ、シャツ７（Ｊａｎｏｆｆ）編、アー
バン＋シュワルゼンパーグ、バルチモアー（Ｕｒｂａｎ
＋Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｂａ１ｔ　ｉｍｏ　ｒ
ｅ）］または］α２−マクログロブリンＣｘ２　Ｍ）［
Ｇ、サルベルセン（Ｓａｌｖｅｒｓｅｎ）、Ｄ、ビル力
（Ｖｉｒｃａ）およびＪ。

トラビス（Ｔｒａｖｉｓ）、Ａｎｎ、　　Ｎ、Ｙ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、４２１，３１６−３２６　（
１９８３）］　、この阻害剤の逍伝的α、−ＰＩの欠乏
または酸化的不活性化［Ｊ、トラビス（Ｔｒａｖｉｓ）
およびＧ、Ｓ、サルベルセン（Ｓａｌｖｅｒｓｅｎ）、
Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ−１（１９８３）、６５５−７０９］ま
たは酵素、とくに顆粒球エラスターゼの大ｈ″Ｌ分泌は
、結合Ｍ１織および体液機能の蛋白質の過度の劣化に導
き、重大な臨床的症候、例えば、肺気１）Ｌ　Ｉｋ［ｉ
ショック、大人の呼吸困難症候群、凝固疾患および腎臓
および肝臓の不全を伴う［Ｍ、ジョクム（Ｊｏｃｈｕｍ
）ら編、炎症の診断学における新しい道（Ｎｅｕｅ　　
Ｗｅｄｇｅ　　ｉｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｎｔｚｕｎｄｕｎ
ｇＳｄｉａｇｎｏｓｔｉ　ｋ　ｓ）、ＰＮＭ−ｘラスタ
ーゼ、（１９８５）、ＧＩＴ　　フェルラーグ、ダーム
スタット；Ｗ、Ｗ、マクグアイア−（ＭｃＧ　ｕ　ｉ　
ｒ　ｅ）ら。

ジャーナル・オブＱクリニカル・イムノロジー（Ｊ、　
　Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、６９゜５４３、　（
１９８２）、およびＣ，Ｔ、ジー（Ｌｅｅ）ら、Ｎ、　
　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、　　Ｍｅｄ、、３０４．１９２−
１９６．（１９８１）］、白血球エラスターゼの決定的
な役割は、また、急性および慢性の炎症、例えば、リウ
マチ様関節炎において確証された［Ｋ、フレシェフ（Ｋ
　Ｉ　ｅ　ｓ　ｉ　ｅｋ）ら、炎症の診断学における新
しい道（Ｎｅｕｅ　　Ｗｅｄｇｅ　　ｉｎ　　ｄｅｒ　
　Ｅｎｔｚｔｌｎｄｕｎｇｓｄｉ　　ａｇｎｏｓＬ　　
１ｋｓ）　　、ＰＮＭ−エラスターゼ、（１９８５）、
７１−８２、ＧＩＴフェルラーグ、ダームスタット］。

実験の敗血症および気腫のモデルは１合成エラスターゼ
阻害剤（Ｊ、Ｃ，バワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）、Ａｎｎ、
Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉ　ｒ、ＤｉＳｌ、１２７．５５４−
５５８．（１９８３）］および遺伝子丁字によって調製
されたエラスターゼ阻害剤ニグリン（Ｅｇｌｉｎ）ｃ　
［Ｈ，Ｐ、ＳＨネブリ（Ｓｃｈｎｅｂｌｉ）ら、ユーロ
ピアン・ジャーナル舎オブーレスピレイタリー・ディジ
ージズ（Ｅｕｒｏｐ、　　Ｊ、　　Ｒｅ５ｐｉｒ。

Ｄｉｓ、）、６６、付録、６６−７０．（１９８５）］
の治療的効能をＩＪＩらかにするために使用されてきて
いる。しかしながら、ことに長期間の治療において、ヒ
ト由来の安定なエラスターゼ阻害剤の使用は、アレルギ
ー発生の危険がな（かつ耐性にすぐれるため、かなりの
利点を提供する。

アプロチニンの阻害スペクトルは、「活性部位」のアミ
ノ酸残基の置換によって、定性的および定贋的に変更で
きることは知られている［１９８３年７月２７日および
１９８３年１１月３日のドイツ国公開明細書（ＤＥ−Ｏ
Ｓ）　３　、３３９　。

６９３号：Ｈ，チェシ、（Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ）、Ｈ，
Ｒ，ウエンゼル（Ｗｅｎｚｅ＋）。

Ｒ、シ、：Ｌ　ム−７り（Ｓｃｈｕｍｕｃｋ）およびＥ
。

シュナベル（Ｓｃｈｎａｂｅｌ）および１９８６年３月
２６【］の欧州特許８７．１０３．９４２゜３号：Ｅ、
−Ａ、アウエルスワルド（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ）、Ｗ、
シュジーデル（Ｓｃｈｒ６ｄｅｒ）、Ｅ、シュナベル（
Ｓｃｈｎａｂｅｌ）、Ｗ、ブルンス（Ｂｒｕｎｓ）、Ｇ
、レインハルト（Ｒｅ　ｉ　ｎｈａｒｄｔ）およびＭ、
コチク（Ｋ。

ｔｉｃｋ）］。

こうして、アルギニンを位置１５に組込むとき、ヒトの
７ニオンおよびカチオン性トリプシン、ヒト血漿カリク
レインおよびヒト器官カリクレインに対して比較的高い
親和性を右するプロテイナーゼｊｌｌ書割が得られる。

ラッソン（Ｌａｓｓｏｎ）ら［Ａ、ラッソン（Ｌａｓｓ
ｏｎ）およびに、オールソン（Ｏｈｌｓｓｏｎ）、　ス
カンジナビカージャーナルΦオブーガストロエンテロジ
−（Ｓｃａｎｄ、　　Ｊ。

Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．．１１．７０７、（１９
８４）］によると、トトリシンは肝臓炎において決定的
な役割を演する。カリクレインは。

また、大きな生理学的および病理生理学的重要性を有す
る［Ｒ，ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）、Ｖ。

ターフ（Ｔ　ｕ　ｒ　ｋ）およびり、ビライル（Ｖｉｔ
ａｌｅ）Ｎ、プロテイナーゼ類およびそれらの阻害剤（
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｉｒ　　
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、ムラジンスカクジガーペルガ
モンΦプレス（Ｍｌａｄｉｎｓｋａ　　ｋｕｊｉｇａ−
Ｐｅｒｇａｍｏｎ　　ＰｒｅｓＳ）オクスフォード、ル
ジュブリジャナ（Ｌｊｕｂｌｊａｎａ）、（１９８１）
、３５３−３７６１、それらは凝固の制御系、線維素溶
解、補体の活性化およびレニンアンギオテンシン系にお
いておよび炎症に関連して重複した機能を有する［Ｈ，
ベルストレアテ（ＶｅｒｓＬｒａｅｔｅ）、薬物（Ｄｒ
ｕｇＳ）、２９，２３６、（１９８５）］　、Ｈ，−ｙ
イア−（Ｍａｉｅｒ）およびり、７ドラー（Ａｄｌｅｒ
）、　　リンゴロギー、す１０ギー、オトロギー（Ｌａ
ｒｙｎｇ、　　Ｒｈ１ｎｏ１．　０ｔｏ１．）、６５，
１９１．　　（１９８６）１によれば、慢性の再発性耳
下服炎は器官カリクレインによって引き起こされる０例
えば、血漿カリクレインは、遺伝的脈管神経症性浮腫お
よび［Ｍ、シャピラ（Ｓｃｈａｐｉｒａ）ら、Ｎｅｗ　
　Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｊ、　　Ｍｅｄ、、３０８．１０５
０　（１９８３）およびリパフユージョン（ｒｅｐｅｒ
ｆｕｓｔｎｓ）損傷［Ｒ，Ｓ、ロイ（Ｒｏ　ｙ）および
Ｊ　、Ｍ、マクコード（ＭｃＣｏｒｄ）：Ｒ，Ａ、グリ
ーンワルド（Ｇ　ｒ　ｅ　ｅ　ｎｗａ　ｌ　ｄ）および
Ｇ、コーヘン（ＣＯｈｅｎ）編、オキシ基およびそれら
のスキャベンジャ−系（Ｏｓｙ　　Ｒａｄｉｃａｌｓ　
　ａｎｄ　　ｔｈｅｉｒ　　Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ　　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）、Ｖｏｌ、ＩＩ：、ｌ胞および医学の而
（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　　ａｎｃｌ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　
　ＡｓｐｅｃｔＳ）、アムステルダム、１９８３、エラ
スターゼ・サイエンス・パブリシングーカンパニー、１
４５−１５３］の原因であり、そして白血球の活性化に
Ｂｇを及ぼす［Ｍ、シャビラ（Ｓｃｈａｐｉｒａ）、Ｃ
，Ｆ、スコツト（Ｓｃｏｔ　ｔ）、Ｃ。

Ａ、ボクサー（Ｂｏｘｅｒ）およびＲ，Ｗ、コルマン（
Ｃｏｌｍａｎ）：Ｈ，７リツ（Ｆｒｉｔｚ）、Ｎ、バチ
（Ｂａｃｈ）、Ｇ、ジエン（Ｄｉｅｔｚ）およびＧ、Ｌ
、ヘイバーランド（Ｈａｂｅｒｌａｎｄ）Ｗ、キニン（
Ｋｉｎｉｎ）ＩＩｌ、部Ｂ、１９８３．７４７−７５３
．ニューヨーク、プレナム・プレス］、Ａｒｇ−１５相
同体は、その阻害がすぐれるので、これらの病気におい
てアプロチニンよりすぐれる。

Ｌｙｓ−１５残基をＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、１１ｅま
たはＶａｌの置換によってｆｉＩられる半合成アプロチ
ニン相同体のあるものおよび遺伝子工学によって調製さ
れた変異型（追加のＧｌｕを位置５２に右してもよい）
は、ヒト白血球エラスターゼの効力のある阻害剤であり
、そして白血球エラスターゼによって引き起こされかつ
維持される前述の病気の治療に適する。

構造的にアプロチニンに密接するクニツ（Ｋｕｎ　ｉ　
ｔ　ｚ）型の新しい多価プロテイナーゼ阻害剤は、最近
ヒト血漿から分離された［Ｅ−フィオレッチ（Ｆｉｏｒ
ｅｔｔ　ｉ）、Ｍ、アンゲテッチ（Ａｎｇｅ　ｌｅｔ　
ｔ　ｉ）　、Ｇ、シトロ（Ｃｉｔｒｏ）、Ｄ、パラ（Ｂ
　ａ　ｒ　ｒ　ａ）およびＦ、アスコリ（Ａｓｃｏｌｉ
）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、）、２６２．３
５８６−３５８９　（１９８７）］、ある抗アプロチニ
ン抗血清と交差反応する、これらの阻害剤のアミノ酸配
夕曜は、今回用らかにされ、そして、驚くべきことには
、第１図および第２図から理解できるように、ウシ同種
阻害剤（ｉｓｏｉｎｈｉｂｉＬｏｒ）ＩＩのそれと同一
であるか、あるいは相同である［Ｅ、フイイオレッチ（
Ｆｉｏｒｅｔ　ｔ　ｉ）、Ｇ、イアコピノ（Ｉａｃｏｐ
ｉｎｏ）、Ｍ、アンゲテッチ（Ａｎｇｅ　ｌｅｔ　ｔ　
ｉ）、Ｄ、バラ（Ｂ　ａ　ｒ　ｒ　ａ）およびＦ、アス
コリ（Ａｓｃｏｌｉ）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）
、２６０．１１４５１−１１４５５　（１９８５）］。

この出願において、ヒトアプロチニンクニツ（Ｋｕｎｉ
ｔｚ）型のプロテイナーゼ阻害剤として理解され、これ
は１例えば、ヒト血清または動物組織から分離すること
ができ、そして第１図または第２図に示す配列の１つを
有する。

図面に示すように、２つの阻害剤は、ペプチド鎖のＮ−
末端延長ガクアミノ酸だけ異なる。

今回、このヒト阻害剤（以後ヒトアプロチニンと呼ぶ）
の阻害剤スペクトルは、アプロチニンのそれに類似し１
位２１１５におけるＬｙｓＪ７ｊ、基を他のプロトゲン
アミノ酸残基によってｎ検することによって修飾される
ことが発見された０位ｔｌ　５において変化するヒトア
プロチニンの得られる相同体は、それらがヒト由来であ
るために、アプロチニンから菖導される相同体よりも耐
性されうる。アレルギーまたは偽アレルギーの反応は、
アプロチニンを使用するとき（例えば、パッケージイン
サート）起こりうる０本発明による阻害剤を使用すると
き、親物質としてヒト由来のアプロチニンを使用するの
で、アレルギーの合併症はかなり減少するか、あるいは
存在しない。

遺伝子工学により調製された本発明のヒトアプロチニン
相同体において、位置１５における活性部位の残基に加
えて、ｌまたは２以」二の追加のアミノ酸残基を他のプ
ロトゲンアミノ酸残ス（で置換することができる。置換
のための好ましい位置は、次の通りである： 位置１５（活性部位の位置）： Ｖａｌ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇ
ｌｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＡｒ位置１６： Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒ 位置１７： Ｌｅｕ、Ｖａｔ、Ｉ　Ｉｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、
　Ｇ　Ｉ　ｎ、　Ｐｈ　ｅ、　Ｔ７　ｒまたはＡｒｇ位
こ１８： Ａｌａ、Ｖａｌ、　　Ｌｅｕ、　Ｉ　　Ｉｅ、Ｓｅｒ、
Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＰｈ位
置１９： Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎま
たはＧｌｎ 位置３４： Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、
Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒ位７１３　
ｇ　。

Ｖａｔ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇ 位置５２： Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、
Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇ。

ジサルファイド架橋を形成する位２１１４および３８に
おける２つの準シスチン残基に加えて、次のものによっ
て置換されることができる：ＧＩｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｇ
ｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅ　；これらの２つの
位置におけるアミノ酸残基が同一であるかあるいは異な
ることができる。

未発１１による阻害剤は、さらに１位置ｌにＭｅｔ基を
含有することができ、あるいはジペプチドＡ　ｌ　ａ−
Ｇ　ｌ　ｎによる構造ＩＩに相当するＮ−末端延長部を
含有することができ、この延長部の前にＭｅｔが存在す
ることができる。阻害剤は、必要に応じて、シグナルお
よび／またはリンカ−配列をもつＮ−末端リーダーペプ
チドを含有することができ、このリーダーペプチドは高
い程度の発現を保証しおよび／または分離および／また
は精製を促進する。

次は未発ＩＪＪに関連してとくに好ましい：Ｖａｌ−１
５−ヒトアプロチニン、Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−
Ｉ　Ｉｅ−１８−Ｔｈｒ−５２−ヒトアブロチ＝ン、　
　Ｌｅ　ｕ　−１５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｉ　１ｅ−１
８−Ｔｈｒ−５２−ヒトアプロチニン、Ｖａｔ−１５−
Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８−Ｇｌｕ−３９−Ｔｈ　
ｒ−５２−ヒトアプロチニンＶａ１−１５−ヒトアプロ
チニンおよびＡｒｇ−１５−Ａｒｇ−１７−Ｉ　Ｉｅ−
１８−Ｇｌｕ−５２−ヒトアプロチニン。

本発明によるある阻害剤の阻害スペクトルを、表１に要
約する。

未発明は、また５本発明によるプロテイナーゼｊｌｌ書
割をエンコードする合成デオキシリポ核酸に関する。定
義したアミノ酸配列の蛋白質を遺伝子丁字によって調製
できることは知られている０個々のアミノ酸残基の２１
換は、それ自体既知の方法において２つの道筋によって
可能である＝１．ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから［部
位特異的（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｊ突然変異に
より出発するか、あるいは２．それぞれのコドンを含有
する遺伝子の合成。

ＭＥ換え微生物および／または真核細胞中で異質ＤＮＡ
を発現する方法は、同様に知られている。

こうして、アプロチニンまたはアプロチニン変異型は、
組換え微生物中において、合ｌｌ１ｌ、遺伝子を使用し
て、非融合形態で［Ｂ、フォノ・ウィルケン−ベルブマ
ン（ｗｏｎ　　Ｗｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎｎ）ら
、ＥＮＢＯＪ、、３２１９（１９８６）］、あるいはバ
クテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつ融合蛋白
質とじて［Ｅ、−Ａ、アウエルスワルド（Ａｕｅｒｓｗ
ａＩｃｉ）ら、１９８６年３月２６日の欧州特許出願２
７　１０３　９４２．３号］発現することができること
が知られている。さらに、アプロチニンの自然の解読領
域はアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列をもつ融
合物として発現させることができることは知られている
［Ｓ、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）および１．Ｂ
、キングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）ら、プロシーディ
ンクス中オブ・ナショナル會アカデミーーオブ・サイエ
ンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ　、）ＵＳＡ、８０．６３６８．（１９８３）
Ｊ、ヒトアプロチニンに対して相同的である。ウシイソ
阻害剤（ｉｓｏｉｎｈｉｂｉｔ。

ｒ）ＩＩの遺伝子は、また１分離されたが、発現されな
かった［Ｃ、Ｂ　、　？−クス（Ｍａｒｋｓ）ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルＱケミスト　リ　−　（
Ｊ、　　　　Ｂｉｏｌ、　　　　Ｃｈｅｍ、）、　　　
２６１．７１１５．（１９８６）］、置換シタ位ｉｆ５
に活性部位のアミノ酸残基をもつこの阻害剤の相同性お
よび変異型は、今日まで分離されてきていない。

未発ＩＩノは、とくにまた、第３図に要約する次の配列
をもつデオキシリポ核酸に関する。

他の［コドン用途（ｃｏｄｏｎ　　ｕｓａｇｅＳ）Ｊを
もつデオキシリポ核酸配列（その翻訳は本発明による阻
害剤を与える）は、また１本発明に包含される。

第４図は、位ｉ１５にＶａｌをもつヒトアプロチニンを
エンコード（ｅ　ｎ　ｃ　ｏ　ｄ　ｅ）するＤＮＡ変異
型域を示す、この遺伝子は、すでに知られているＤＮＡ
配列ブロックのライゲーションによって［参照、Ｅ、−
Ａ、アウエルスワルド（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ）ら、欧州
特許出願２７　１０３　９４２　、３Ｓ月、あるいは第
３図に記載するＤＮＡ配列ブロックのライゲーションに
よって合成された。この遺伝子を構成する４つの配列ブ
ロックは、また、この図面において見ることができる。

また、第４図に示されているように、ＤＮＡブロックは
制限酵素の単一の切断点によって天底される：ＥｃｏＲ
１，ＡｐａＩ、５ｔｙｒおよび５ａｃＩＩ、１．たがっ
て、それらは便利にｎ！！！！することができる０本発
明における他の阻害剤に要求されるＤＮＡ変異型は１合
成的に、あるいは「部位特異的突然変異Ｊによって得ら
れた。

本発明のいくつかの阻害剤のための第３図からのＤＮＡ
ブロックの組み合わせを１表２に例示する。

発現系の性質に依存して、本発明におけるプロテイナー
ゼ阻害剤の発現のための本発明による遺伝子は、さらに
、Ｍｅｔのための先行開始コドンまたはり一ター配列を
エンコードするヌクレオチド配列を右することができる
。

本発明は、さらに、また、実施例ベクターに反し、この
発現ベクターは、プラスミドから誘導され１本発明にお
けるプロテイナーゼ阻害剤をエンコードする本発明によ
る遺伝子をその中に挿入し、そして適当な宿主株中に形
質転換に使用される。

所望の異質蛋白質をエンコードする遺伝子を。

光度に発現可詣である微生物の蛋白質をエンコードする
遺伝子と融合する場合、バクテリア宿主株中において吐
乳動物の蛋白質についての発現が増大することは、既に
知られている１選択的切断を適当な試薬を用いて実施で
きるＣ−末端をもつアミノ酸（Ｍｅｔ、Ｔｒｐ）を介し
て融合を結合する場合、所望の非融合調製は選択的酵素
的切断によって、好ましくは化学的切断によって、融合
蛋白質から得ることができる１、条件は、このアミノ酸
が、また、本発明によるプロテイナーゼ阻害剤の構成成
分でないということである。

本発明におけるブロテイナーゼ阻害剤の好ましい融合相
手は、′ｅ生物蛋白質の分泌シグナル配列、例えば、ｏ
ｍｐＡ［グライド（Ｇｈｒａｙｅｄ）ら、ＥＭＢＯＪ、
、３．２４３７−２４４２、　（１９８４）またはｐｈ
ｏ　　Ａ［プレイ（Ｇｒａｙ）ら、遺伝子ＣＧｅｎｅ）
、３９．２４７−２５４、（１９８５）］のようなもの
である。

次いで、融合蛋白質は、発酵の間細胞質または増殖培地
の中に分泌され、そしてそれ自体既知の方法によって培
養ろ液から分離される。適当な融合相手を分泌系のため
に選択すると、プロテイナーゼ阻害剤は自然構造をもつ
融合蛋白質中に分泌される。臭化シアン切＃ｆ後の復元
［Ｅ、グロス（Ｇ　ｒ　ｏ　ｓ　ｓ）およびＢ、ウィト
１−／プ（Ｗｉｔｋｏｐ）、ジャーナルφオブｅアメリ
カン醗ケミカル・ソサイアティ（Ｊ　、　　Ａｍｅｒ、
　　Ｃｈｅｍ、　　　Ｓｏｃ、）、８３．１５１０−１
５１１゜（１９６１）は、Ｖを通過する正しい処理の場
合においてＵ除される。未発ＩＩによるプロテイナーゼ
阻害剤は、反応混合物から、それ自体既知の方υ：によ
って分離され、そして精製される。

遺伝子発現の別のｉＩＴ能性は、細胞中の融合蛋白質が
「細胞封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　　ｂｏｄｉｅｓ）
」として不溶性の形７Ｌで分泌される場合、未発ＩＪ＋
によるプロテイナーゼ阻害剤の場合において実現される
。不溶性蛋白質のこのような封入体は、例えば、バタテ
リオファージＭＳ２のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ部分
配列と［Ｅ、レマルト（Ｒｅｍａｕ　Ｉ　ｔ）、Ｐ、ス
タフ７センス（Ｓａｔａｎｓｓｅｎｓ）およびＷ、フィ
ーアス（ＦｉｅｒＳ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１５．８
１、（１９８１）］またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉのＩａｃ　　Ｚ遺伝子と［Ｅ、−Ａ。

アウエルスワルド（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ）、１９８６年
３月２６［１の欧州特許用１＠ｊ８７　１０３９４２．
３号］阻書割逍伝子を融合させると、およびまたラムダ
バクテリオファージノｃＩＩ遺伝子と［Ｋ、ナガイ（Ｎ
ａｇａｉ）およびＨ、Ｃ。

ソーガーソ７（Ｔｈｏｒｇｅｒｓｏｎ）、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、３０９．８１０．（１９８４）］阻害
剤遺伝子を融合させると、産生ずることができる。

細胞封入体による本発明によるブロテイナーゼ阻害剤の
産生は、次の工程からなる： ■、適当な条件下の宿主株のブレ７デイング（Ｂｒｅａ
ｄｉｎｇ）および培養； ２、宿主細胞からの細胞封入体の分離；３、融合蛋白質
の精製： ４、融合蛋白質の切断； ５、阻害剤の復元： ６、阻害剤の分離および精製。

個々の工程は、実施例において詳述する。

可溶性融合蛋白質の精製のため、酸性または塩基性のア
ミノ酸を切離し可能な融合相手の中に組込み、こうして
イオン交換クロマトグラフィーによる分離を促進するこ
とが有利であることがあ未発ＩＪＪによるブロテイナー
ゼ阻害剤の最後の精製は、それ自体既知の方法１例えば
、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフ
ィニティクロマトグラフィーまたは電気泳動によって実
施する。

形質転換のための多数の種々の微生物は現在知られてい
る；これらは、とくに、培養または発酵のブロス中で増
殖できる単分子有機体である。形質転換のために好まし
い有機体は、バクテリア酵／＋７および菌・力ど（ｆｕ
ｎｇｉ）を包含する。

ここに記載する研究において使用する特定の有機体は、
Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ△Ｍ１５であり、これはア
メリカンΦタイプ・カルチャ一番コレクシ、ン（Ａｍｅ
ｒｊｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ、３５１０２で寄託さ
れている。

プラスミドｐＲＫ　　１５１．１．８　（Ｖａｔ　−１
５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８−Ｔｈｒ−５２−ヒ
トアプロチニン、実施例３参照）で形質転換されたＥ、
　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩΔＭ１５は、１９８７年６月２
６日に、ドイツ国微生物収果所（Ｇｅｒｍａｎ　　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｊｓｍ
、Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｒｅ、８．Ｄ−３４００Ｇｏｔ
ｔｉｎｇｅｎ）にＮｏ、ＤＳＭ　　４１６０で寄託され
、ソシてプラスミドｐＲＫ　　１５５．１．４（Ｌｅｕ
−１５−Ｌｅｕ−１７−ｒ　Ｉｅ−１８−Ｔｈｒ−５２
−ヒトアプロチニン）で形質転換されたＥ。

ｃｏｌｉ　　ＲＲ１ΔＭ１５はＮｏ、ＤＳＭ　　４１６
１で寄託されている。

本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に加
えて１本発明の化合物の１または２種以上を含んでなる
製薬学的！ｌＬ＆物または本発明の化合物の１または２
種以上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学
的組成物を調製する方法を包含する。

本発明は、また、投与単位の形態の製薬学的調製物を包
含する。これは、製薬学的′ｉＡ製物が個々の部分の形
態、例えば１錠剤、被覆された錠剤カプセル剤、ビル、
坐薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、その
活性化合物の含量は個々の投グ、ｊ、ニーの数分の１あ
るいは多数倍に相当する。役グー弔位は、例えば、ｌ、
２．３または４倍の個々の投与ｒ＋１、あるいは個々の
投与量の１／２．１／３または１／４を含有することが
できる０個々の投ｊｊ　、７は、好ましくは、１回の投
与でり゛えられかつ通常１１１　ｊ＋’ｌの全部、半分
または３分の１または４分の１に相当する！１１の活性
化合物を含有する。

無Ｉ；ｉの不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは。

すへての種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填
剤および配合助剤であると解釈すべきである。

述べることのできる好ましい製薬学的：Ａ製動は１錠剤
、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル。

火剤、坐薬、溶液、懸濁液および乳濁液、配合、軟膏、
ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレーであ
る。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび！￥ｔｒＬ剤は、
活性化合物の１種または２挿具−ヒを、次の普通の賦形
剤と一緒に含有できる＝　（ａ）充填剤および増４士剤
、例えば、を粉、ラクトース、グルコース、マンニトー
ルおよびシリカ、　（ｂ）結合剤１例えば、カルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポ
リビニルピロリドン、（Ｃ）保湿剤、例えば、グリセロ
ール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムお
よび正炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤１例えば、パ
ラフィン、および（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アン
モニウム化合物、（ｇ）湿潤剤１例えば、セチルアルコ
ールまたはグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸着
剤１例えば、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ
　）　Ｉ’ｌｌ滑剤、例えば、タルク、ステアリン酩カ
ルシウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリ
エチレングリコール、または上の（ａ）〜（ｉ）に記載
した物質の混合物。

錠剤、Ｐｉ剤、カプセル剤、ビルおよび顆粒剤は、普通
の被膜および外殻を含有することができ、これらは不透
ＩＪ化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物
の１種または２種以上のみを、あるいは優先的に、腸管
の特定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、
放出するようなＭ１成物であることができ、ここで使用
できる埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワック
スである。

ｌ＋’ｉ性化合物化合物または２種以上は、心安に応じ
て前述の賦形剤の１種または２種以上と一緒に、マイク
ロカプセル化した形態にすることもできる。

坐薬は、活性化合物の１種または２種以上に加えて　ｆ
？通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば。

カカオ脂肪、高級エステル、（例えば、Ｃｌ４−アルコ
ールとＣｌ６−脂肪酸とのエステル）またはこれらの物
質の混合物を含有することができる。

軟・計、泥ｉ′ｆ、クリームおよびゲルは、活性化合物
の１種または２！Ｉ！以りに加えて、汀通の賦形剤、例
えば、動物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィ
ン、Ｅ粉、　　トラガカント、セルソース誘導体、ポリ
エチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリ
カ、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有
することができる。

散剤およびスプレーは、活性化合物の１種または２挿具
」二に加えて、汀通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。スプレーは、慣用の噴射剤１例え
ば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することがで
きる。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種または２種以上
に加えて、償用の賦形剤、例えば、溶媒、１ｊ丁溶化剤
および乳化剤、例えば、氷、エチルアルコール、イソプ
ロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジル
アルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール
、１．３−ブチレンゲリコール、ジメチルホルムアミド
、油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ肝油、オ
リブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセ
ロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール
、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エ
ステル、またはこれらの混合物を含有することができる
。

非経［１的投与のために、溶液および乳濁液は、また、
血液と等張物の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種または２挿具１−に加えて
、慣用の賦形剤１例えば、液状希釈剤、例えば、水、エ
チルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁剤、
例えば、エトキシル化インステアリルアルコール、ポリ
オキシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエステ
ル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベ
ントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらに
混合物を含有することができる。

前述の配合形態は、また、染料、防腐剤および、芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、およびＩｔ味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。

治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製薬学
的調製物中に、全混合物の約０．１〜９９．５屯州％、
好ましくは約０．５〜９５重Ｉ１１％の量で存在する。

前述の製薬学的調製物は、また、未発ＩＪＩによる化合
物に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有するこ
とができる。

前述の製薬学的７Ｊ製物は、既知の方法に従い通常の方
法で、活性化合物の１種または２挿具］二を賦形剤の１
種または２種以」−と混合することによってつくられる
。

一般に、人間の医学および獣医学において、所望の結果
を得るためには、本発明による活性化合物の１種または
２種以上を２４時間毎に約０．５〜約５００　ｍ　ｇ　
／　ｋ　ｇ体重、好ましくは４〜ｌＯＯｍ　ｇ　／　ｋ
　ｇ体重の合計量で、適当ならば数回に分けて投１ｊ、
することが右利であることがわかった０個々の投薬物は
、好ましくは、本発明による活性化合物の１種または２
種以上を約１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体屯、とくに３〜６
０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体毛の＋１鼾で含有する。しか
しながら、前述の投薬呈からはずれなければならないこ
とがあり、特にそのことは処置すべき患者の性質および
体重、病気の性質および改さ、調製物の性質および薬剤
の投Ｉｔ、方Ｖ：、投ゲを行う時間または間隔に依存す
る。

かくして、ある場合には、活性化合物は前述の星よりも
少早二で１分であり、−万能の場合には前記：Ｉ：を超
えなければならない場合も起こるであろう、必要な特定
の最適な役！７−！、Ｘ：および活性化合物の役Ｊｊ、
方法は、この分野に精通するものにとっては、その等円
知識に基づき容易に決定することができる。

本発明による活性化合物は、エイズ（Ｅ　Ｉ　ＤＳ）、
急性炎症１例えば、リウマチ様関節炎、遺伝性脈管神経
症性浮腫、肺炎および肝臓炎、およびショックの状７９
の処置にとくに有用である。Ａｒｇ−１５相同体は、そ
の上１人工膜の助けによる透析の間、一般に対外の循環
において、保護機能を有する。

材料および方法 Ａ、　合成遺伝子および組換えクローニングおよび発現
ベクターの構成 材料 ■、試薬 アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、反応ｗ析液
および培地のＤＪ製に必要な試薬は、ベーリンガー（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、デ（７＝
＋　（Ｄｉ　ｆｃｏ）、　　メルク（Ｍｅｒｃｋ）、サ
ーｚ＜（Ｓｅｒｖａ）、ジグ−ｙ（５ｉｇｍａ）および
バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）から人手した。

２、酵泰 分子生物学のクローニングの研究のための酵票は、ベー
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）、ｚ−イオラブス（ＢｉｏｌａｂＳ）およびＢＲＬか
ら入手した。

３　　　ＤＮＡ 債伝ｆ“およびベクターの構成のためのプラスミドおよ
びファージのＤＮＡおよびＤＮＡアダプターは、ヘーリ
ンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
、バイオラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＢＲＬおよびフ７
−マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から１次の例外を除い
て、入毛した。

例外 プラスミドｐＵＲ２７８：Ｕ、リュータ−（Ｒｕｔｈｅ
ｒ）およびＢ、ミュラー−ヒル（Ｍｔｊｌ　Ｉｅｒ−Ｈ
ｉ　ｌ　ｌ）、ＥＭＢＯＪ、、２．１７９１−１７９４
．（１９８３）ニブラスミドｐＥｘ　　３１．ｂ、：ス
トレベル（Ｓｔｒｅｂｅｌ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、　
　Ｖｉｒｏｌ、）５７．９８３−９９１．（１９８６）
。

４、Ｅ、ｃｏｌｉ株 Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩΔＭｌ　５　（ＡＴＣＣＮｏ、
３５１０２）：リューター（Ｒｕｔｈｅｒ）、核酸の研
究（Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓＲｅ　ｓ　、）　　、　
１０．５７６５−５７７２　　（１９８２）、Ｅ、　　
　ｃｏｌｉ　　　５３７−Ｗ６、　ｒｅｘ：Ｗ、フィー
アス（Ｆｉｅｒｓ）、ジェント大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　　ｏｆ　ＧｅｎＬ）、ベルギー、Ｅ、Ｌ／マウル
ト（Ｒｅｍａｕ　Ｉ　ｔ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１
５．８１−９３　（１９８１）。

５、培地 ＬＢ−、Ｍ９ｓ−およびカッパ　１７７６−培地の製法
は、次の文献中のデータに相当する：Ｔ、−ｙ＝アチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら５分子クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリン
クーハーパー、　Ｘ１１４（１９８２）、ｌｓｇのパク
トー寒天を寒天下板のための培地に添加した。

６、放射性同位元素 ゲル電気泳動のためのＬ　　［３５Ｓ］−メチオニン、
アデノシン５°−α［３５Ｓ］−チオトリホスフェート
および［＋　４　（：］蛋白質分子拵マーカーは、アマ
−シャムーブヒラ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｕｃｈｌｅ
ｒ）から入−トした。

７、抗生物質 次の抗生物質を選択ｊ８地の調製に使用した：りＯラフ
フェニコールおよびカナマイシンはベーリンカー（１３
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）から入手し、そしてアンピシリン
およびテトラサイクリンはサーバ（Ｓｅｒｖａ）から大
トした。

方Ｖ、 クローニング実験のための１常の技術１例えば。

プラスミド−ＤＮＡの分離および才古製、ＤＮＡ断ノ１
の分）、制限分析、アガロースゲルおよびアクリルアミ
ドゲル１．のＤＮＡ断片の分箸なとは、次の文献に記載
されている：Ｔ、マニアチス（ＭａｎｉａＬｉｓ）ら１
分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）１ｍｌ−ルド・スプリング・ハーバ−１米国、（
１９８２）。

８、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学的合成プロティナ
ーゼｊｌ＋書割遺伝子の構成に必要なりＮＡオリゴヌク
レオチドは、アプライド・バイオシステハス３８０型か
らの自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成した。−木ｆｆ
１ＤＮＡオリゴヌクレオチドの精製は、ＨＰＬＣカラム
または調製用アクリルアミドゲルの電気泳動によって達
成した。各場合においテ、０　、５〜５　、０　０Ｄ２
６　ｏｎｍ単位の個々のオリゴマーを分離した。

９、ＤＮＡ配列決定 分析すべきＤＮＡ断片は１Ｍ１３フγ−ジベクターまた
はｐＵＣ系列のプラスミドベクターを使用してクローニ
ングし１次いでＤＮＡ配列を検査した。ＤＮＡの配列決
定は、Ｎ、ハラトリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）およびＳ、サカ
キ（Ｓａｋａｋｉ）、アナリティカルーパイオケミスト
リー（Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５２．２
３２２３８　（１９８６）　のＹ順、オヨび＜−リンｉ
−ａ　７７　ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）からの配列決定ハンドブック［迅速かつ容
易なプラスミド配列決定のマニュアル（Ｌｅｉｔｆａｄ
ｅｎ　　ｚｕｍ　　５ｃｈｎｅｌｌｅｎｕｎｄ　　ｅｉ
ｎｆａｃｈｅｎ　　ＰｌａｓｍｉｄＳｓｅｑｕｅｎｚｉ
ｅｒｅｎ）］　　（１９８６）に従って実施した。

１０、ヒトアプロチニン変異型の標準の発現細胞質細胞
封入体の産生のための分泌ベクターおよび発現ベクタの
両者を、ヒトアプロチニン変異型の発現に使用した。

種々の発現ペクタ中へのヒトアプロチニン遺伝ｆ変異η
１の１１．シい挿入は、ＤＮＡ配列決定によって検査し
た。

Ｍｌ換え分泌ベクターおよびＩ　ａｃＺベクターは、Ｅ
、　　ｃｏｌｉ株ＲＲＩΔＭｌｓ中に挿入した。Ｐ−Ｍ
Ｓ２ポリメテーゼベクターは、Ｅ。

ｃｏｌｉ株５３７中に挿入した。

ａ）形質転換したＥ、　　ｃｏｌｉ株の新鮮な１夜のＪ
？ｊ、Ｉｉ物を、ｌｏｍｌのＬＢ培地中（分析の目的で
）であるいは１リツトルのＬＢ培地中（：Ａ製のＩＩ的
で）でｌ　：　１００に希釈した。ｉｏｏ終ｇ／ｍｌの
アンピシリンを培地に添加した。

Ｊ？ｔ、ｒｉ物を、３７℃および２００ｒｐｍにおいて
、２．５４ｃｍ（１，０インチ）のコニカルフラスコ中
でＯＤ５Ｓｏｎｍまでインキュベーションした０発現系
（ｌ　ａｃプロモーター）を、ミリモルのＩ　ＰＴＧ　
（インプロイブチオガラクトース）の添加により誘発し
た。

３７℃において１６〜２４時間語発した後、Ｊ？１養物
を遠心（１０分：１５〜２０，０００ｇ、４℃）により
収穫した０分泌ベクターを使用してＪ８養懸濁液中に分
泌されたヒトアプロチニン変異型の含ム２を酵素−阻害
活性の助けによって試験した（方法の箇Ｂ、１０）。

融合相手としてβ−ガラクトシダーゼで発現したヒトア
プロチニン変異型を、バクテリアの破壊後、５Ｏ５−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により検出した［Ｕ　、
　Ｋ　、ラレムミ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー　（
Ｎａｔ　ｕ　ｒｅ）、２７７．６８０、（１９７０）］
、このために、０．０１モルのＥＤＴＡを含有する４０
ＪＬＩの０．１モルのトリス緩衝液　ｐＨａ　、Ｏ中に
１Ｘ１０９／ゲルトラツクの細胞を懸濁しそして、１０
ｇ１のＳＤＳ試験緩衝液（０，３モルのトリス　ＨＣＩ
、ＰＨ８，８，５０％のグリセロール、５％のＳＤＳ、
２５％のβ−メルカプトエタノールした後，この混合物
を３分間沸慧させた．電気泳動後、蛋白質の７ーンドを
クーマー、シーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　Ｂｌｕ
ｅ）で着色し、そして融合蛋白質の含ｊ賃％をデンシト
メーターで決定した．　　　ｂ）ファージＭＳ２のＤＮ
Ａポリメラーゼの配列の一部をもつ融合蛋白質としての
ヒトアプロチニン変異η！の発現を、ｐＥｘベクター［
ストレベル（Ｓｔｒｅｂｅｌ）ら、ウィルス字詰（Ｊ．
　　Ｖｉｒｏｌ．）、５７、９８３−９９１（１９８６
）］　を使用してラムダファージのＰ　Ｌープロモータ
ーのル制御下に実施した。

形質転換したＥ．　　ｃｏｌｉ株（Ｅｃ　　５３７の誘
導体）を、ｌ　Ｏ　Ｏ　ＪＬｇ　／　ｍ　ｌのアンピシ
リンを含むＬ　Ｂ　Ｊ９　Ｊｉ！！のＩＯｍ＋または１
リツトル中で２００ｒｐｍおよび２８℃において培養し
た．ＯＤ５５（１ｎｍ＝１．０の細胞密度において，温
度を４２℃（加熱誘発）に増加し、水溶液培養を２０Ｏ
ｒｐｍでざらに３時間インキュベーションし細胞を遠心
（上を参照）により収穫し、そしてＳＤＳ試験緩衝液中
で破壊し，そしてアリコートをＳＯＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動により分離した。

ｆｔＨｊ泡封入泡封形体で若苗した融合蛋白質を、ゲル
をクーマフシーブルーで着色することによって検出し，
そして融合蛋白質の含賃％をデンシトメトリーによりΔ
に足した。

Ｂ）　本発明によるプロティナーゼ阻害剤の分離および
特性づけ ｌ，酵素 ヒト白血球エラスターゼ（Ｓ　Ｅ　　５　６　３）およ
びヒト力テプシンＧ（ＳＧ　　４５）は、エラスチン・
プロダクツ番インコーポレーテッド（Ｅ　ｌ　ａｓｔｉ
ｎ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｉｎｃ．、Ｐ。

０、Ｂｏｘ．Ｐａｃｉｆｉｃ，Ｍａ．６３０６９、ＵＳ
Ａ）から入手し，トリプシン（ウシ）はＥ．メルク（Ｍ
ｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から入・トシ、ヒト血
漿力すクレン（８０−１３１１０１）はプロトンゲン社
（ＰｒｏｔｏｇｅｎＡＧ、Ｗｅｉｄｅｎｍａｔｔｗｅｇ
　　４．Ｐ。

５ｔｆａｃｈ、ＣＨ−４４４８Ｌａｕｆｅｌｆｉ　ｎｇ
ｅｎ、Ｓｗｉ　ｔ　ｚｅ　ｒ　１ａｎｄ）から入手した
。ヒト尿カリクレンは、Ｒ，ガイガー（Ｇｅｉ　ｇｅ　
ｒ）ｔｌ：（ミュンヘン大学、外科病院における臨床化
学および化学生物学部、Ｎｕｓｓｂａｕｍｓｔｒ、　　
２０．８０００　　Ｍｕｎｉｃｈ２）、そしてヒトアニ
オン性およびカチオン性トリプシンはに１オールソン（
Ｏｈｌｓｓｏｎ）ト！７１・［マルメ（Ｍａ１ｍσ）総
合病院、臨床化学および外科部、スエーデン国マルメ２
−２１４０Ｉ］によって提供された。

２、　ノ、（ｒＩ Ｓ　ｕ　ｃ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｖａ　Ｉ　−ｐ
ＮＡおよびＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−ｐＮＡ　（ＨＬＥ）およびＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ　（ＨＣＧ）は、ベ
ケム、フェインケミカリエン社（Ｂ　ａ　ｃ　ｈｅｍ、
Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ　　ＡＧスイス国プー
ベントルフＣＨ−４４１６、ハウプストラッセ　１４４
）から入手し、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡＸ
２ＨｃＩ＝ｓ−２３０２（血漿カリクレイ７）　、Ｄ−
Ｖａｌ−ＬｅｕＡｒｇ−ｐＮＡＸ２ＨｃＩ＝ｓ−２２６
０（泰官カリクレイン）およびＰｙ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−
Ａ　ｒｇ　−ｐＮＡＸ２ＨＣＩ＝Ｓ−２４４４（）リプ
シン）はトイチエψカビ社（ＤｅｕＬｓｈｅ　　Ｋａｂ
ｉＧｍｂＨ、ミュンヘン８０レーフエリングストラツセ
　１９．Ｄ−８０００）から購入した。

３、抗アプロチニン抗体 抗アプロチニン抗体を、Ａ、エベン（Ｅｂｅｎ）および
Ｅ、ツラシェイト（ＴｒｕｓｃｈｅｉＬ）に記載される
ようにして４ウサギにおいて産生じそして血清から分離
し［８照、Ｇ、Ｌ、ヘイ／ヘーランド（Ｈａｂｅｒｌａ
ｎｄ）：合成および天然プオイテナーゼ阻害剤：基本的
および臨床画面の国際シンポジウム、東京、１９６７年
１１７’３２０日、日本医学学会誌、１９６７年、４７
−５５］そしてさらに精製するため、抗体をセファロス
・（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ−ＣＩ上に固定化された
アプロチニンを充填したカラムのクロマトグラフィーに
かけた。このために、カラムを塩類リン酸用緩衝液で洗
浄し、次いで２００ｍ１の０．２モルのシアン酸カリウ
ムで洗浄し、そして２００ｍ１の塩類リン酸用緩衝液で
＋Ｉｆび洗？’７１　した、脱ｒ１を０．２モルのグリ
シン−塩酩緩衝液、ｐＨ２，４で実施した。抗体を含有
する分画を飽和トリス溶液で直ちに中和し、そして５０
体積の０．１モルの重炭酸ナトリウム溶液に対して４℃
において１夜透析した。

方υ、 ４、　セファ０−スＣｌ−４ＢＩ−のウサギ抗アプロチ
ニン抗体の固定化 ２００ｇのセファロース４ＢをＪ、コーン（Ｋｈｏｎ）
およびＭ、ウィルチ１　”／り（Ｗｉｔｃｈｅｋ）、ア
ブアライド・／＜イオケミストリー・アンド・バイオテ
クノロジー（Ａｐｐｌ、　　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、）、９．２８５
、（１９８４）の「、順に従い活性化し、次いで２ｇの
抗アプロチニン抗体と反応させた。

５、ＨＰＬＣ 調製様および分析用のＨＰＬＣを適当なカラムで、個々
の実施例に記載するように実施した。

６、アミノ酸配列の決定 本発明によるプロテイナーゼｉｌｌ書割のアミノ酸配列
を決定するために、０．５〜２ナノモルの材＃１をポリ
ブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎの）で予備処置したガラス繊
維のフィルター−にに適用し、そして配列の分析を気相
蛋白質配列決定装置（アプライド・パインシステムス　
４７０）で実施シた。

各サイクルにおいて解放されたアミノ酸フェニルチオヒ
ダントインを、ペイレウサ−（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ）
の方υ、［Ｋ、ペイレウサ−（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ）
、Ｂ、ビースラー（Ｂ　ｉ　ｅ　ｓ　１ｅｒ）、Ｊ、ポ
ウベンス（Ｂｏｖｅｎｓ）、Ｒ。

シルトｏ　７プ（Ｄｉ　Ｉｄｒｏｐ）、に、ネイ７７−
（Ｎｅｉｆｅｒ）、に、スチュｔ’　　（Ｓ　ｔ　ｕｂ
ｅｒ）、Ｓ、ザイス（Ｚａ　ｉ　ｓ）、Ｒ，ニーリング
（Ｅｈｒｉｎｇ）およびＰ、ザーベル（Ｚａｂｅｌ）：
ｉ白質化学における現代の方法（Ｍ。

ｄｅｒｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　　Ｃｈｅｍｉ　ｓＬ　ｒｙ）、３０３−３２５　（
１９８３）、ウォルター・デ・グルイタ−（Ｗａｌｔｅ
ｒ　　ｄｅ　　Ｇｒｕｙｔｅｒ）、ベルリン］に従って
インクラティックエリューションによるゾルパックス（
Ｚｏ　ｒｂａｘ）ＣＮカラム（７）ＨＰＬＣにより同定
しかつ定ｊ、タシた。

７、　定＋、＋的アミノ酸組成の決定 各場合において、１ナノモルの阻害剤を、Ｊ。

■、ポッッ（Ｐｏｔ　ｔ　ｓ）Ｊ　ｒ、、アナリティカ
ル１１／＜イオケミストリ−（Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１３１．１−１５、（１９６９）に従い、
密閉しく才気したパイレックス管内で、０゜０５％のメ
ルカプトエタノールを含有する２００ｐ１の−・定廓点
の塩酸１１０℃に２２時間とともに加熱した。蒸発残留
物を１５０ｇ１の０．２モルのクエン酸ナトリウム緩衝
液　ｐＨ２，２中に取り、そして不溶性部分をろ過によ
り除去した。

加水分解物中に存在するアミノ酸を、蛍光検出塁および
シマズＣＲ２ＡＣ分析器を装備したビオトロニツタ（Ｂ
ｉｏｔ　ｒｏｎｉｃ）ＬＣ５０００アミノ酩分析装置に
おいて分離した。定？、）はＪ　、Ｒ，ベンゾン（Ｂ　
ｅ　ｎ　ｚ　ｏ　ｎ）およびＰ。

Ｅ、ヘアー（Ｈａｒｅ）、プロシーデインゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔ　Ｉ　、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）
、７２．６１９−６２２．（１９７５）中に記載される
ように、Ｏ−フタル酸ジアルデヒドで誘導体化した後、
実施した０未発ＩＩによろいくつかの阻害剤の定１′−
に的アミノ酸組成を表３に示す。

８、　　ポリアクリルアミドゲルの電気泳動ＳＤＳゲル
電匁電動泳動ラエムリ（Ｌａｅｍｌｉ）の方法［Ｕ　、
　Ｋ　、ラエ１、す（Ｌａｅｍｌｉ）、ネイチャー　（
Ｎａｔ　ｕ　ｒｅ）　、２７７．６８０、　　（１９７
０）］に従い実施した。蛋白質のバンドを、Ｊ、Ｌ、ス
テ７７／　（ＳｔｅｐｈａｎＯ）およびり、ロジャスカ
リシア（ＲｏｊａｓＧａｌｉｃｉａ）、アナリティ力ル
・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）、１５２、　　（１９８６）に記載されるようにし
て着色した。

９、　衰化シアン！／１断後の不活性な阻害剤の復元 臭化シアン切断後の不活性な阻害剤の復元は、クレイト
ン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）がアプロチニンについて最初
に記載した方法［Ｔ　、　Ｅ　、クレイ）７　（Ｃｒｅ
　ｉｇｈＬ　ｏｎ）、分子および細胞生物学に関するＵ
ＣＬＡシンポジウム（ＵＣＬＡＳｙｍｐｏｓｉａ　　ｏ
ｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、３９．２４９−２４７、　（１
９８６）、Ｄ、Ｌ。

オキセンダー（Ｏｘｅｎｄｅｒ）編、Ａ、Ｒ，リス（Ｌ
ｉｓｓ）インコーボジーテット、ニューヨー−りＪに従
い、わずかの変更を加えた尿ぶ勾配を使用するイオン交
換体で実施した。請確な条件は個々の実施例に記載ぎれ
ている。

酵素の試験 １０、　阻害剤を正しく処理して、あるいは可溶性ミニ
融合蛋白質として含有する微 生物試料中の阻害剤含ら１の決定 発酵グロスの試ｔ１を１次のようにして、遠心により透
ＩＪＪにし、そして上澄みおよび細胞の中の阻害剤活性
を決定した： ａ）培養ろ液 ＬＯｐＬｌのツイーン８０の５％水溶液および４０μｌ
の過塩素酸７０％を、１ｍｌの培養ろ液に、よく攪拌し
ながら添加した。この混合物を室温に３０分間保持し、
そして形成した沈殿を遠心により分離した。透明な上澄
みを１８０ＪＬ＋の飽和トリス溶液の添加によって中和
した。

８μＩの新しく調製したヒト白血球エラスターゼ（０，
０５モルの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５、５−エチレン
グリコール（１：　ｌ）の１ｍｌにつき１ｍｇの酵素を
含有する溶液を試験緩衝液でｌ　Ｑ　Ｏ（：’、に希釈
して（Ｉ）られた）および、濃度の系列で、所９！の中
和した懸′／ｃＪ液を、０．０５％のアジ化ナトリウム
および０．１％のライ−７８０を含有する０、２モルの
トリス−Ｊ′！！酸緩衝液ｐＨ８，０の４２０ＪＬｌの
添加した０次いで、６試ｔ１の体積を試験緩衝液で５５
０ｐＬ１にし、１００％の試料は試験緩衝液のみを含有
した。室温で３０分間インキュベーションした後、６．
５Ｂｌ（７）０．１モルのＭｅｓｓ　ｕ　ｃ−Ａ　Ｉ　
ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡの溶液を添加
し、モしてＰニトロアニリンの酵素の解放により生ずる
４０５ｎｍにおける吸光の増加を決定した。阻害％は次
の等式から計算する： 阻害剤を添加しないＯＤ 阻害剤含ｊ１艷の定１．：的決定は１組換えＶａｌ−１
５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンを使用して得られた計
算曲線を使用して実施した。

ｂ）細胞 培養ブロスの遠心で得られた細胞を、もとの体積の１／
１００５０ミリモルのトリス−ＭＣＩ緩衝液　ｐＨ７，
５（これは０．０５％のツイーン８０を含有する）中に
懸濁した。

細胞は超ａ波装置［ブランソン・ソニファイア−（Ｂｒ
ａｎｓｏｎ　　５ｏｎｉｆｉｅｒ）、−＋＝ニル−デイ
スラブターＣｅｌｌ　　Ｄｉｓｒｕｐｔ。

ｒ）Ｂ１５］を使用しＴＥ”Ｃにおいて破壊した（４０
０ワツト、試料体積の１ｍｌにつき１分の超音波処理）
、内因性阻害剤を前述の方法において過塩素酸で沈殿さ
せた後、阻害剤含量を同様に決定した。

１１、　　阻害剤の阻害特異性の決定 酵素力テプシンＧ、白血球エラスターゼ、器官（尿）カ
リクレイン、血漿カリクレインおよびトリプシンについ
ての阻害活性について、純粋な物質を試験する条件を、
表４に要約する。酵素の活性および酵素の阻害の決定は
。

それ自体既知のｆ 順で実施した（参照。

表４中の文献）。

実施例 実施例Ｉ Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニン ａ）　　Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニンの構造遺伝子
の構成（ベクターｐＩＵ　　１６゜４、Ｃ Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニン変異型の遺伝子−を構
成するため、対応するＣ１．β１、γ１およびδ電遺伝
−ｆ・ブロックの相補的−末鎖断片の１ナノモルを、２
００．１の部分のポリヌクレオチドキナーゼの反応Ｗｔ
衝液中に溶解し、そしてポリヌクレオチドキナーゼでＡ
ＴＰの存在下にリン酸化した［Ｔ−−ｙ＝７ナス（Ｍａ
ｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ）ら、分子クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド−スプリ
ング・バー八−（１９８２）］、ＤＮＡをエタノールで
沈殿させ、そして各場合２００ｇ１のＴＥ［析液（１０
ミリモルのトリスＸＨＣｌ衝液、０．１ミリモルのＥＤ
ＴＡ　　ｐＨ７，５）中の１ナノモルの量でＨｌｊ　懸
濁した。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを一緒にし、
そして、ハイブリダイゼーションのため、４００弘１の
ＴＥ＃衝液中で９５℃に５分間加熱し、そして水浴中で
３０℃にゆっくり冷却した。結合のため、各場合におい
て、５００ピロモルノハイブリダイゼーションした遺伝
子ブロックα１／β電およびγＩ／δ１を使用し、そし
て結合したα１＋β１およびγ１＋δ１を引続いて制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびｓｔ　ｙＩで、あるいは５ｔｙｌ
およびＢａｍＨＩで切断した。このようにしてＰ産生さ
れた遺伝子セグメントを２％の７ガロースゲル中のＷ製
用電気泳動後分離し、そして互いに結合した０次いで、
結合したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
で切断し、２００ｂｐのＶａｔ−１５−ヒトアプロチニ
ン遺伝子を調製用゛１１２気泳動により２％の７ガロー
スゲル中で精製し、次いでゲルから分離した。

合成Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニン遺伝子をプラスミ
ドベクターｐＵＣ８とクローニングした［Ｊ、ビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）およびＪ、スプリング（Ｍｅ　ｓ　ｓ
　ｉ　ｎｇ）　、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１９．２５９．
（１９８２）］、このために、１０ｐ−ｇＯ’）ｐＵｃ
Ｂ−ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そ
してＤＮＡをアルカリ性ホスファターゼ（仔ウシ）で脱
リン酸化した。欠失したｐＵＣ８−ＤＮＡを調製用ゲル
電気泳動により精製し、そして分離した。このようにし
て１１１られた０　、４ＪＬｇ（７）ｐＵＣ８−ＤＮＡ
および０．１ｐｇのＶａｌ−１５−ヒトアプロチニンＤ
ＮＡを、２単位のＴ４リガーゼとともに５０ｐ１の結合
緩衝液中で１夜インキユベーシヨンした。Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ　　ＲＲＩΔＭ１５をこのようにしてＭ］換えたＤ
ＮＡで形質転換した。形質転換体のＳ　択は、ｌ　ＯＯ
ｐ−ｇ　／　ｍ　Ｉのアンピシリンを含むＬＢ乎板上で
実施した。

１００コロニーのプラスミド−ＤＮＡを、ＨｌＣ，バー
ンポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびＪ、ドリー（Ｄｏ
ｌｙ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ、）、７．１５１３゜（１９７９）の方υ：に従っ
て分離し、そして制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
で分析した。３つのプラスミドクローンは、大きさが合
成Ｖａｌ１５−ヒトアプロチニンに相当するＤＮＡ断片
を組込んでいた。３つのクローニングしたＶａｌ−１５
−ヒトアプロチニン遺伝子の正しい配列は、配列決定で
確証された。プラスミドのクローンｐＩＵ　　１６．４
．Ｃ（第４［ｊ）を、それ以１：の構成のために使用し
た。

ｂ）　α−アミラーゼの分泌ベクターｐＣＨ２３７およ
びｐＣＨ２８６のＷ成 同様なベクターの構成は、１９８６年１２１１２２１１
の英国特許出願８，７００，２０４号に記載されている
。Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ（７）ａ−アミラーゼシグナル
配列は、ＤＳＭ　　７０４（ドイツ国微生物収集所、Ｇ
ｉ５ｔｔｉｎｇｅｎ）がら、ｐＭＫ　３によるＢａｍＨ
Ｉ部位中の染色体ＤＮＡの部分的Ｓａｕ　　３Ａの制限
バッチをクローニングすることによって得た［Ｍ、Ａ、
サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）
、２９゜２１−２６．（１９８４）］、アミラーゼ遺伝
子をもつ挿入された３ｋｂのＤＮＡ断片をもつクロ−ン
の１つを、α−アミラーゼ構造遺伝子中の欠失により修
飾し、そしてｐＡＬＫ　　１　　［Ｍ、Ａ。

コ〜トネイ（ｃｏｕｒｔｎｅｙｌｙ士、ロチニスター大
学、微生物学部、米国、からの個人的通信］に導いた。

ｐＡＬＫ　　１ｃ７）２３０ｂｐ（７）ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｓＬＥＩＩ断片のＤＮＡの配列決定は、’Ｉｒ１ｂなリ
ポソーム結合部位（ＲＢＳ）およびＢ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ　　ｌＡ２８９のα−アミラーゼに対する人相同性を
もつシグナル配列を示した［参照、第６図のＤＮＡ配列
およびＭ、ヤング（Ｙ　ａ　ｎ　ｇ）ら、核酸の研究（
Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、１１．２３
７−２４９、（１９８３）］、Ｅ、　　ｃｏｌｉｒｌの
α−アミラーゼシグナル配列の処理はアミノ酸残基りで
起こる［Ｗ、ブラソフ（Ｂｒｕｎｓ）、未公表の結果１
ので、ＮｈｅＩ制限部位はアラニンＪ、％３１に・９人
された。この］１的で、ＲＢＳおよびα−アミラーゼシ
グナル配列の大部分をもつ１８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈ
ａｅＩＩＩ断片（第６図中の断月）をｐＡＬＫ　　１　
［Ｍ、Ａ　、　コートネイ（Ｃ。

ｕｒｔｎｅｙ）博士、ロチニスター大学、微生物学部、
米国、から得た］から分離した。断片Ｂ（アラニン３１
　］二のＮｈｅＩ１位を産生ずる合成リンカ−）を、ｐ
ＢＲ３２２中でＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩの間で断片Ａ
と結合した（ＰＷＢ　　２２６）、ｐＷＢ　　２２Ｂを
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで切断し、そして、ｄＮＴＰとの反応
を充填した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−（バイオラプス
　１００２）をこのベクター中に結合し、そしてｐＷＢ
２０２４をこれによって産生した。

分泌ベクターｐＣＨ２３７は、α−アミラーゼシグナル
配列をＩａｃＺプロモーターの制御下にすることによっ
て構成した（第７図）、この構成において、１ａｃＺ’
はＴＡＡ停止コドンにおいて停止する（α−アミラーゼ
のＤＮＡ配列の位置−５８７−５６、第６図）。

次いで、蛋白質合成を１位置−１０における１ａｃＺ　
’の停止トコトンの背後の約５０塩基における。α−ア
ミラーゼの可能なＲＢＳにおいて再開する。

ｃ）　　Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニンをエンコード
する分泌ベクターｐＣＨ２３７ 中の配夕曜のクローニング Ｅ、　　ｃｏｌｆ中に分泌ベクターｐＣＨ２３７をクロ
ーニングするために、Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニン
の遺伝子配列（第４図）を、ｐＵＣ８（ＥｃｏＲＩとＨ
ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉとの間）においてＥｃｏＲｒ−
Ｈｉ　ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片としてサブクローニングした
（ｐＷＢ　　２８６１）、Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチ
ニンのための遺伝子を含有するｐｗｎ　　２８６１（第
８図）をＥｃｏＲＩで！／Ｊ断し、モしてｄＭＰとの反
応を充填した後、Ｘｂａリンカ−（パイロラプス　１０
１０）を制限部位において結合し、これによってｐＷＢ
　　２８６２を産生した６次いで、ｐＷＢ　　２８６２
をＸ　ｂ　ａ　ＩおよびＸ　ｈ　ｏ　Ｉで切断し、そし
てベクターを分離し、そして合成リンカ−配列ＷＢ　１
４および１５と結合し、ＸｂａＩ部位をアプロチニンの
Ａｒｇｌのためのコドントに産生じた（ｐＷ８２８６３
、第８図）。

Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニンの発現のため、遺伝子
配列おＸｂａＩ＝ＨｉｎｄｌＩＩ断片としてＰＷＢ　　
２８６３から分離し、α−アミラーゼシグナル配列の後
にｐＣＨ２３７中に組込み（ＮｈｅＩおよびＨｉ　ｎｄ
Ｉ　Ｉ　Ｉで切断する）、これにより発現ベクターｐＣ
Ｈ２８６が構成される（第９図）。

ｄ）　　　ｐＣＨ２８６で形質転換したＥ、　　ｃｏｌ
ｆ　　ＲＲ１ΔＭ１５（７）発酵および誘発 ｐＣＨ２８６で形質転換したＲＲＩΔＭ１５を、１夜の
培養物として、４％のＭＥＳ　　ｐ　　Ｈ６，０および
５０用ｇ　／　ｍ　Ｉのアンピシリン（ＭＥＳ＝モルホ
リノエタンスルホン酸）を含む蒸留水中の３％のビーフ
エキス（ギブコ）、１．５％の酵ｒＨエキス（ギブコ）
および０．５％のＫＨ２ＰＯ４中で発酵した０通気を良
好にするため、最大１００ｍ１の培地を１．０００ｍ１
のコニカルフラスコ中で使用し、そしてクーナー（Ｋ　
ｈ　ｎ　ｅｒ）振盪装７１（ＲＣ−６−Ｕ）上で２８℃
および１９０ｒｐｍで振盪した。１夜の培養物を新鮮な
培地でｌ：ｌｏｏに希釈し、そして２８℃または３７℃
で約２０時間続ｌのＯＤ５５（Ｉｎｍに発酵した０次い
で、ｌａｃプロモーターを１ミリモルのイソプロピルチ
オガラクトシダーゼ（シグマ）の添加によって誘発させ
た１発酵を約２０時間続け、次いで細ｌ抱を８．００Ｏ
ｒｐｍの遠心によって収穫した［ローターＡ　　６．１
４をもつコントロンΦセントリコン（Ｃｏｎｔｒｏｎ　
　ＣｎｅＬ　ｒｉｋｏｎ）Ｈ−４０中で４℃においテＩ
Ｏ分間］。

細胞を１０体積の０．０５モルのトリス緩衝液ｐＨ７，
５中に懸濁させた。この懸濁液をフレンチプレスに１８
，０ＯＯＰＳＩにおいて２１ｉ通過させて、細胞を破壊
した。細胞の破片を遠心（３０分間、８，０００ｇ）に
より除去し、そして遠心物を培養ろ液と一緒にした。

ｅ）　　Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニンの分離３５０
ｍ１の７０％の過１１！素酸を、１０リツトルの培養ろ
液および細胞リゼイト上清（株：ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣ
Ｈ２８６）懸濁液の混合物中に室温においてゆっくり攪
拌しながら入れた。２０分間静こした後、形成した沈殿
を遠心（２０分間、８．００Ｏｒｐｍ、４℃）により分
離した。

次いで、上澄みを８Ｎの水酸化カリウムで巾ＩζＩした
。この混合物を４℃で１夜放置した後、沈殿した塩化カ
リウムをろ過により除去した。

ろ液をカラム［２０Ｘ２．５ｃｍ、０．０２モルのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液ｐＨ６，５（ＨＥＰＥＳ＝４−（２−ヒド
ロキシエチル）−１−ピペラジン−エタン−スルホン酸
）と平衡化し、そしてＳ−セファ０−ス、ファスト・フ
ロー（Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｗ）を充填しである］のクロ
マトグラフィーにかけた。適用後、カラムを２５０ｍ１
の平衡化緩衝液で溶離し、最後に５００ｍ１の平衡化緩
衝液および５００ｍ１の塩化ナトリウム中の０．３モル
の平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。

０．１３モル〜０．１７モルのＮａＣｌで溶離された分
画は、エラスターゼ阻害活性を含有し、プールしそして
真空Ｉｅ縮して２０〜３０　ｍ　ｌの体積にした。

それ以りの精製のため、ｅ縮物をハイボア（ＨｉＰｏｒ
ｅ＠）逆相カラムＲＰ−３１８（２５０Ｘ４．６ｍｍ）
（バイオ−ラド、ミュンヘン、カタログＮｏ、１２５−
０５５１）のＨＰＬＣによってクロマトグラフィーにか
けた。このため、ＨＰＬＣカラムは、ｅ縮物の適用およ
び水による洗ｒｆ１後、まず０．１％のトリフルオロ酢
酸（溶離剤Ａ）で溶離し、１０分後、溶離Ａおよび０．
１％のトリプルオａｆｄ；酸（溶離剤Ｂ）の直線の勾配
で溶層した（勾配：０〜ｌＯＯ％の溶離Ｂ、θ〜２時間
、流速１ｍｌ／分、検出２１５ｎｍ）。

エラスターゼ阻害活性をもつＵＶ活性分画を一緒にし、
モしてアセトニトリルの一部を真空蒸発させた。このよ
うにして得られたｅ縮物の凍結乾仔は、３．８ｍｇの無
色の物質を与え、これは分析用ＨＰＬＣ（モノＳカラム
）によるとほとんど均質であった。この混合物を７ミノ
決定上澄み組成を第３図に示し、そしてその阻害スペク
トルを表１に記載する。アミノ酸分析は、この物質が約
７８％の精確に処理されたＶａｌ−１５−ヒトアプロチ
ニンから成り、そして約２２％のＡｌａ−（−）　−Ｖ
ａ　Ｉ−１５−ヒトアプロチニンを含有することを示し
た。

実施例２ Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８−ヒトア
プロチニ ａ）　　Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８
−Ｔｈ　ｒ−５２−ｔニドアプロチニンをエンコードす
るベクターＰＩＵ　　２４．４Ｃの構成 構造遺伝子の合成を、実施例１ｂ）に記載するように、
ブロックα１、δ２．γ１およびδ１から実施した。　
Ｖａｔ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　１ｅ−１８−Ｔｈｒ
−５２−ヒトアプロチニンをエンコードする配列を、実
施例１ｂ）に記載するように、ｐＵＣｇ中に組込んだ。

ｂ）　α−アミラーゼ分泌ベクターｐＣＨ２８７の構成 α−アミラーゼ分泌ベクターｐＣＨ２８７を、α−アミ
ラーゼ分泌ベクターｐＣＨ２８６と同様に構成する。

ｃ）　　Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−１１ｅ−１８−
ヒトアプロチニンをエンコードする分泌ベクターｐＣＨ
２８７中の配列 のクローニング Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８ヒトアプ
ロチニンをエンコードする配列をもつ発現ベクターｐＣ
Ｈ２８７を、ｐＣＨ２８６について記載したのと同一の
方法をもちいて構成した。

ｄ）　　ｐＣＨ２８７で形質転換したＥ、　　ｃｏｌｉ
　　ＲＲＩΔＭ１５ｃ７）発酵および誘発 ｐＣＨ２８７で形質転換したＥ、　　ｃｏｌｉＲＲＩΔ
Ｍ１５の発酵は、実施例１ｃ）に記載するようにしてて
施した。培養ブロスを、そこに記載するように、遠心に
より清浄にし、そして細胞を同様に破壊した。最後に、
細胞リゼイトおよび培養ろ液を一緒にした。

ｅ）　　Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　１ｅ−１８
−ヒトアプロチニンの分離 ３５０　ｍ　ｌの７０％の過塩素酸を、実施例２ｄ）か
らの−緒にした上澄み（約１０リツトル）に、室温にお
いて攪拌しながら１０分以内に添加した。この混合物を
２０分間放置した後、形成した沈殿を遠心により分離し
た。遠心物を８Ｎ＊酸化カリウム溶液で中和した。

中和した溶液を４℃でカラム（１０Ｘ２．５ｅｍ、セフ
ァロース４Ｂ上に固定化した抗アプロチニン抗体を適用
しかつ０．１モルのリン酸ナトリウム緩衝液　ＰＨ７，
０，塩化ナトリウム中１モル、で前もって平衡化した）
を通してろ過した。

適用後、カラムを１００ｍ１の平衡化緩衝液で溶離し、
そしてアプロチニン誘導体を０．２モルのグリシン−塩
酸緩衝液ｐＨ２，４で脱着した。溶離液を飽和トリス溶
液で直ちに中和し、そして真空濃縮して約２０ｍ１の体
積にした（浴温度３０℃）。

脱塩しかつ少量の蛋白質を除去するため、　ＰＲ３１８
ＨＰＬＣを、実施例１ｅ）に記載するようにして、濃縮
物を使用して実施した。阻害活性を右する溶離液をプー
ルし、そしてアセトニトリルを部分的に真空蒸留した。

凍結乾帰すると、３．２ｍｇの無色の物質が残った。Ｈ
ＰＬＣによる分析に従うと、阻害剤は事実上均質であっ
た。

この物質の阻害スペクトルを表１に示し、そして定量的
アミノ酸分析の結果を表３に記載する。アミノ酸配列を
決定すると、追加のＮ−末端Ａｌａ残基を含有する他の
物質（約１５％の量）が存在した。

分析用ＦＰＬＣ（溶奴Ａ：０．０２モルの酢酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ５，２、溶媒Ｂ：０．０２モルの酢酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ５，２、塩化ナトリウム中０．３モル
）において、阻害剤ハ七ノＳファーマシアカラムで均質
なピークとして０゜０６〜０．０８モルの塩化ナトリウ
ムにおいて溶離された。

実施例３ Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　　１ｅ−１８−Ｔｈ
ｒ−５２−ヒトアプロチニン ａ）　阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成（ベク
ターｐＩＵ２６．４Ｇ） 表２からのＤＮＡブロックα盲、β２、γ１およびδ２
を、実施例１ｂ）に記載するように、結合し、そしてベ
クターｐＵＣ８を組込んだ０組換えベクターをｐＩＵ２
６．４Ｃと表示した。

ｂ）　　　ＩａｃＺ遺伝子およびＶａｌ−１５−Ｌｅｕ
−１７−Ｉ　１ｅ−１８−Ｔｈｒ−５２−ヒトアプロチ
ニン遺伝子＝発現ベクターｐＲＫ　　１５１．１．８の
融合 Ｃ−末端をエンコードするＩ　ａｃＺ遺伝子末端との遺
伝子の融合をその中で行なうプラスミドベクターｐＵＲ
２７８［Ｕ、ルサー（Ｒｕｈｅｒ）およびＢ、ムラー−
ヒルＫ（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉ　ｌ　ｌａ）、ＥＭＢＯＪ
　、、２．１７９１（１９８３）］を、Ｅ、　　ｃｏｌ
ｉのガラクトーシダーゼとの融合蛋白質としてヒトアプ
ロチニンの上の変異型の発現のために選択した（Ｉ　ａ
ｃＺ遺伝子）、ＩａｃＺ融合蛋白質の発現は、１ａｃＺ
プロモーターの制御下に起こる。

ヒトアプロチニン変異型の遺伝子は、ｐＵＲ２７８の１
ａｃＺｉｎ伝子ノ？ｌｉ−のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉとの間の切断部位に挿入した。このために、５ＪＩ−
ｇのｐＵＲ２７８−ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、そして大きいベクター断片を分離した
（第１０図）。

ベクターｐＩＵ２６．４ＣのＤＮＡの１０＃ＬｇをＥｃ
ｏＲＩで直線化した。突起するＤＮＡ末端に、ｄＡＴＰ
およびｄＴＴＰの存在下に、ＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノー断片を酵素的に充填した。充填したＤＮＡ末端を１
０倍過剰量のＢａｍＨＩリンカ−（）γ−マシア、デカ
マー）と結合し、そして修飾した遺伝子をクローニング
ベクターからＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切出し
、そして、２％の７ガロースゲル中のゲル電気泳動後、
分離した。

０．２ルｇのベクター−ＤＮＡ８よび０．１＃ｇの修飾
したｐＩＵ２６．４Ｃ−ＤＮＡを、２０ルｇの結合緩衝
液中で、２単位のＴ４リガーゼと１夜結合した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉａＲＲ１ΔＭ１５の形質転換および組
換え発現ベクターの選択は、標準の方法に従って実施し
た。阻害剤とｌ　ａｃＺ遺伝子とのリーディングフレー
ムの融合は、このようにして得られた発現ベクターｐＲ
Ｋ　　１５１．１．８におけるＤＮＡ配列決定によって
確証された。Ｅ。

ｃｏｌｉａＲＲ１ΔＭ１５／ｐＲＫ　　１５１゜１．８
を発酵のために選択した。

Ｃ）　発酵 プラスミドｐＲＫ　　１５１．１．８で形質転換したＥ
、　　ｃｏｌｉ株ＲＲＩΔＭ１５の発酵は、３７℃にお
いて、実施例１ｄ）に記載した方法に類似する方法で、
振Ｑ　（２８０ｒ　ｐｍ）　ＬながらＬＢ−アンピシリ
ン栄養溶液中で実施した。

ｄ）　　Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　１ｅ−１８
−Ｔｈ　ｒ−５２−Ｌニドアプロチニンの分離 細胞は１０リツトルの培養ブロス［株ＲＲＩΔＭ１５／
ｐＲＫ　　１５１．１．８の発酵はＩＰＴＧで新しく？
Ａ発した］遠心［１５分、ａ　、　ｏｏ。

ｒｐｍ］によって分離した。沈殿物（２３ｇの湿潤化＋
１′Ｌ）を５０　ｍ　ｌの０．０５モルのトリス緩衝液
、０．１モルの塩化ナトリウム、０．０１モルの塩化マ
グネシウムおよび０．０１モルのメルカプトエタノール
　ｐＨ７，０中に懸濁した。細胞をフレンチプレス（１
８，０ＯＯＰＳ１．２回の通過）中で破壊し、そしてリ
ゼイトを２０　、０００ｒｐｍで３０分間遠心した。沈
殿物（１８ｇの湿潤化が）を１００ｍ１の０．０５モル
のトリス緩衝液ｐＨ７，７，２モルのグアニジニウム塩
酸ｔ１４．ｏ、ｉモルの塩化ナトリウムおよび０．０１
モルのメルカプトエタノール中に再＝ｉし、そして懸濁
液を遠心により２０．０００ｇで２０分間清浄にした。

沈殿物（１５ｇの湿潤重量）を、５０　ｍ　ｇのジチオ
スレイトールを含有する。５０ｍ１の０．０５モルのト
リス緩衝液ｐＨ７，７，６モルのグアニジニウム塩酸塩
および０．１モルの塩化ナトリウムで抽出した。このた
めに、懸濁液を５０℃に１時間攪拌しながら加熱した。

懸濁液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、１０分）により清
浄にした。遠心物を０．０１モルのメルカプトエタノー
ルを含有するｌＯリットルの水に対して透析した。これ
により沈殿した融合形質生成物を遠心（２０分、２０，
０００ｒｐｍ）によって分離した。

臭化シアンの切断 沈殿を３０ｍ１のギ酸中に窒素雰囲気中で溶解した。１
２．５ｍｌの水、次いで４ｇの臭化シアンをこの溶液に
添加した。この反応混合物を、窒麦下に光を遮断しかつ
攪拌しながら、室温に保持した。溶液を真空濃縮し、残
留物を水中に溶解し、溶液を再び真空濃縮し、残留物を
最後に水中に溶解し、そして溶液を凍結乾燥した。１．
８ｇの無色の物質が残った。

復元 ６００　ｍ　ｇの上の物質を３００ｍ１の０．０２モル
の酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，２（尿素中＆モルおよ
びメルカプトエタノール中０．０１モル）（出発緩衝液
）中に懸濁した。３６ｇの尿素および３ｍｌの懸濁液を
５０℃に１時間加熱した。それを遠心により清浄にし、
そして遠心物を２５体桔の出発緩衝液に対して１夜透析
した。１５ｍ１のＳ−セファロース（ファスト・フロー
出９：、緩衝液で平衡化した）を保持物中に攪拌しなが
ら入れ、そして、３０分後、このスラリーをカラム（１
，５Ｘ１２ｃｍ、５ｍｌの平衡化したＳセファロース、
）γスト・フロー、全充填した）中に注いだ、この方ラ
ムを出発緩衝液で、溶離液が光学的にブランクとなるま
で、洗浄した。

次いで、カラムを１８０　ｍ　ｌの出発緩衝液および１
８０ｍ１の０．０２モルの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５
，２（これはメルカプトエタノール中０．００モルであ
った）の直線の勾配で溶離した０次に、カラムを０．０
２モルの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，２（洗浄緩衝液
）で、溶離液が蛋白質を含有しなくなるまで、溶離し、
最後に０．５モル／Ｉの塩化ナトリウムを含有する上の
洗浄緩衝液で洗浄した。

粘製 エラスターゼ−阻害活性を含有する溶離液を一緒にし、
そしてそれらの体請を１５ｍ１に真空薄発させた。実施
例１ｄ）に記載するように、濃縮物をハイボア（ＨｉＰ
ｏｒｅ＠’）カラムを通すＨＰＬＣにより、０．１％の
トリフルオロ酢酸および５０％のア七ト二トリルを含有
する０、１％のトリフルオロ酢酸の直線の勾配を使用し
てクロマトグラフィーにかけた。阻害活性をもつ溶＃液
（約１０ｍｇ）の凍結乾仔後ｆＵられた物質を、モノＳ
カラムのＦＰＬＣにより、０．０２モルの酢酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ５，２および０．２モルの酢酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ５，２（これは０゜３モルの塩化ナトリウム
を含有する）の直線の勾配を使用してクロマトグラフィ
ーにかけた。０゜０５モル〜０，０７モルの塩化ナトリ
ウムで溶離した物質を、すでに前に述べたように、ＲＰ
−３１８のＨＰＬＣによって脱塩し、そして分析用ＨＰ
ＬＣにおいて事実上均質であった。収量は０゜５ｍｇで
あった。この阻害剤の阻害スペクトルは１表１において
、アプロチニンのそれと比較して、見ることができる。

定量的アミノ酸組成は表５から見ることができる０期待
した配列は配列決定によって確証された。

実施例４ Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　　１ｅ−１８Ｔｈｒ
−５２−ヒトアプロチニン ａ）　阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成（ベク
ターｐＩＵ　　２．６．Ｃ）の構成 表２に従うＤＮＡブロックα１．β３、δ！およびδ２
を、実施例１ｂ）に記載するようにして結合した。電気
泳動によって精ＴＡ後、ｐＩＵ２．６．Ｃが１’Ｊられ
た。

ｂ）　　Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　Ｉｅ１８−
Ｔｈｒ−５２−ヒトアプロチニンとＭＳ２レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成（ベクター
ｐＲＫ　　１５２．１．１） ベクターｐＥｘ　　３１．ｂ、［ストレベル（Ｓｔｒｅ
ｂｅｌ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、　　Ｖｉｒｏ　Ｉ　、
）、　　（１９８６）、５７．９８３−９９１１を、Ｍ
Ｓ２レプリカーゼの配列の一部との融合蛋白質としてＬ
ｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−ＩＩｅ−１８−Ｔｈｒ−５
２−ヒトアプロチニンの発現ベクターのための選択した
。このベクター中のＭＳ２融合蛋白質の発現は、ラムダ
ファージのＰ　プロモーターによって冷却される。

％Ｊｉｇ（７）ＰＩＵ　　２．６．Ｃ−ＤＮＡをＥｃ。

ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そしてヒトアプロチニ
ン変異型の遺伝子を慣用の方法で分離した。これによっ
て得られたＤＮＡの０．ＩＩＬｇを、ｐＥｘ　　３１．
ｂ、ベクターのＤＮＡの０゜４１１−ｇと結合した。ｐ
Ｅｘ　　３１．ｂ−ＤＮＡをまずＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩでつくり、そしてアルカリ性ホスファターゼ（仔
ウシ）で脱リン酸化した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ株５３７と組換えＤＮＡとの形質転換
および引続くクローンの分析は、標準方法によって実施
した。融合したＭＳ２遺伝子とクローニングにした正し
い［インフレーム（ｉｎｆ　ｒａｍｅ）Ｊ融合は、プラ
スミドクローンｐＲＫ　　１５２．１．１の配列分析に
よって確証された（第１１１４）。

Ｃ）　発酵 プラスミドｐＲＫ　　１５２．１．ｌで形質転換したＥ
、　　ｃｏｌｉ株５３７の発酵は、脱イオン水１リツト
ルにつき、３０ｇの酵母エキス、３０ｇの肉エキスおよ
び１ｇのリン酸水十二ナトリウム栄養溶液、ｐＨ７、中
で実施した。栄養溶液を減菌した後、ｌリーフトルの振
盪フラスコ中の１００ｍ１の部分を、各場合、同−培地
中で前もって８時間１８五増殖したものを接種した。培
養物を。

２８Ｏｒｐｍにおいて回転振盪機中で振阻しながら、２
８℃に保持した０次いで、それらを４２℃に３峙間加熱
し、その間融合蛋白質の収率は細胞の蛋白質含（１にの
１５％に上昇した（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）。

ｄ）　　　Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｉ　　１ｅ１
８−Ｔｈｒ−５２−ヒトアプロチニンの分離 細胞を遠心（１５分、ｓ　、ｏｏｏ　ｒｐｍ）によって
分離した。沈殿を１０体請の０．１モルのトリス塩酸緩
衝液ＰＨ７，５，０，０１モルのエイレンジアミノ四酢
酸、０．００５モルのメルカプトエタノールおよび０．
００５モルのベンズアミジン塩酸項中に懸濁させ、リゾ
チーム［フルシカ社（Ｆｌｕｋａ　　ＡＧ）、　スイス
国ブフスＪ（０，２ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、この懸
濁液をよ〈攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベー
ションした０次いで、この反応混合物を４℃に冷却し、
そして細胞をフレンチプレス（アミコ、米国）で１８，
０ＯＯＰＳＩにおいて破壊した。このホモジネートを１
０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心しくベックマン　ＪＡ
−１０）、そして遠心物を廃棄した。沈殿を上の緩衝液
（これは尿素中２モルであった）中に２回再懸濁し、そ
して各場合において得られた懸濁液を再び遠心によって
透明いにした。

融合蛋白質の分離 次いで、このようにして得られた沈降物を、磁気的に攪
拌しながら、０．０５モルのトリス緩衝液ｐＨ８，５（
これは塩酸グアニジウム中８モルおよびメルカプトエタ
ノール あった）で抽出し、そして不溶性の部分を遠心（３０分
，１８，ＯＯＯｒｐｍ）によッテ除去した．遠心物を各
場合１０ｍｌの部分でセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
　ｌ）Ｓ−３００カラム（５Ｘ９０ｃｍ）（これは０．
０５モルのトリス−塩酩緩楢液ｐＨ８　、５、尿素中６
モルおよびメルカプトエタノール中０．０１モルで平衡
化されている）でろ過し、そして平衡化緩衝液で溶離し
た。

融合蛋白質全含有する分画（還元性条件下のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる同定）をプールし、そして水に対して広く
透析した．これによって融合蛋白質はほとんど定ら１的
に沈殿し、そして遠心（３０分，１０．００Ｏｒｐｍ）
によって分離し，た。

臭化シアンの切断 ５００ｍｌの融合蛋白質を２１ｍｌのギ酸中に溶解した
，９ｍｌの水および５００ｍｇの臭化シアンを添加した
後，この混合物を室温において１８時間窒素雰囲気中に
光を遮断して保持した．次いで．３００ｍｌの水をこの
溶液に添加し、そして溶媒および過剰の臭化シアンを真
空蒸留した。

残留物を５０ｍ１の０９０５モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、６モルの尿素および０．０１モルのメルカプトエタ
ノール、ｐＨ５．２，ｒｌ−ｆｆに６ｇの尿素を添加し
て溶解した．この溶液を１夜２０体桔の愉快緩衝液に対
して透析した。

復元 保持物をカラム（２．５Ｘ１０ｃｍ，ＣＭ−セファロー
ス、ファスト・フロー、溶解緩衝液と平衡化されている
）に適用し、そしてこの方ラムを、まず、溶解緩衝液で
溶離し，次いで、３００ｍｌの溶解緩衝液および０．０
５モルの酢酸ナトリウム緩衝液、０．００２モルのメル
カプトエタノール、ｐＨ５．２．の直線の勾配で溶離し
、最後に、０，０５モルの酢酸ナトリウム緩衝液，ＰＨ
５，２，で溶離した。復元した阻害剤を、最後に、カラ
ムから０．０５モルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，２、Ｎａ
Ｃ１中０．５モル、で脱着した。

精製 エラスターゼ−阻害活性を右する分画をプールし、そし
て０．０２０モルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，２
，に対して広範に透析した。保持されたものをモノ−５
−ＦＰＬＣカラム（透析緩衝液と羽衡化しである）に適
用し、そしてこのカラムを格１００　ｍ　ｌの平衡化緩
衝液および０．３モルの塩化ナトリウムを含有する平行
化緩衝液の直線の勾配で展開した。阻害剤を含有する分
画を、すでに述べた方法で、ＲＰ−３１８カラムの；Ａ
装用ＨＰＬＣによって脱塩した。ヒトは、蒸発による７
セト二トリルの除去後、溶離液から凍結乾燥によって得
られた。収Ｍ：９．５ｍｇの無色の物質、調製物の阻害
スペクトルは表１から見ることができ、そして定量的ア
ミノ酸の組成は表３から見ることができる０期待する配
列は２２段階の配列決定によって確証された。

実施例５ Ａｒｇ−１５−Ａｒｇ−１７−Ｉ　Ｉｅ−１８−Ｇｌｕ
−５２−ヒトアプロチニン ａ）　阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成（ベク
ター＝ｐＩＵ　　４．６．Ｃ）ＰＩＵ　　４．６．Ｃを
もつｐＵＣ８誘導体は、実施例１ｂ）に記載する方法に
よって１表２からの合成遺伝子ブロックα１．β４．γ
２およびδ３の結合によって得た。

ｂ）　　Ａｒｇ−１５−Ａｒｇ−１７−１１ｅ−１８−
Ｇｌｕ−５２−ヒトアプロチニンとＭＳ２レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成（ベクター
ｐＲＫ　　１５３．１．ｌ） ＭＳ２レプリカーゼおよびＡｒｇ−１５−Ａｒｇ−１７
−Ｉ　１ｅ−１８−Ｇｌｕ−５２−ヒトアプロチニンの
ための遺伝子の融合は、実施例４ｂ）に記載する融合と
同様に実施し、そしてｐＲＫ　　１５３．１．１を得た
。

ｃ）　　ｐＲＫ　　１５３．１　、ｔ−’ｃ’形質転換
したＥ、　　ｃｏｌｉ株５３７の発酵 この発酵は実施例４ｃ）においてＥ、　　ｃｏｌｉ株５
３７／ｐＲＫ　　１５２．１．１について記載したよう
にして実施した。

ｄ）　　Ａｒｇ−１５−Ａｒｇ−１７−Ｉ　１ｅ１８−
Ｇｌｕ−５２−ヒトアプロチニンの分離 実施例４ｄ）と同様にして、プラスミドｐＲＫ１５３．
１．１で形質転換したｌｌニー　　ｃｏｌｉ株５３７の
発酵後得られたｍｌ泡を分離し、そして破壊した。

洗ｆ’ｌｌ　Ｌだ細胞封入体を、また、実施例４ｄ）に
記載した方法で臭化シアンで破壊した。阻害剤をＣＭ−
セファロース上でｐＨ５，２において再生した。精製は
モノ−Ｓ　（ＦＰＬＣ）（７）クロマトグラフィーによ
り、０．０２モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６，０、および０
．０２モルのＨＥＰＥＳ、０．３モルの塩化ナトリウム
、ｐＨ６，０，の直線の勾配を使用して実施した。阻害
剤はその抗トリプシン活性に基づく分画によって検出し
た。溶離は０．１５〜０．１８モルの塩化ナトリウムに
おいて起こった。阻害剤の阻害スペクトルは表１から見
ることができ、そして定量的アミ／＃の組成は表３から
見ることができる０期待する配列は２４段階の配列決定
によって確証された。

理解されるようにこの明細吉および特許請求の範囲は例
示を目的として記載され、限定を意味せず、そして種々
の変更および変化は本発明の精神および範囲を逸脱しな
いでなすことができる。

本／ＡＩＪ］の主なる特徴及び７Ｓ様は以下のとうりで
ある。

ｌ１位ｍｌ　５におけるＬｙｓ残基が他のプロトゲンア
ミノ酸ａ基によってご換されたヒトアプロチニン。

２、ｌまたは２以上の追加のアミノ酸残基が他のプロト
ゲンアミノ酸残基によって７１摸されている上記第１’
／ｉ記伎のヒトアプロチニン。

３、位１ｘ４．１６．１７．１８．１９，３４．３８．
３９および５２の１または２以上の位置においてアミノ
酸残基が置換されている上記第２項記載のヒトアプロチ
ニン。

４、Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅ、Ａｌａ、ＭｅｔＡｓｎ、
Ｇｉｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＡｒｇからなる
群からのアミノ酸残基によって位置１５におけるＬｙｓ
残基が置換されているヒトアプロチニン。

５、夕４応する位ｔにおける；！２換の場合において、
次のアミノ酸残基が、各場合において、存在することが
できる二位置１６： ＧＩｙ、ＳｅｔまたはＴｈｒ 位置１７： Ｌｅｕ、Ｖａｔ、Ｉ　Ｉｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、
Ｇｉｎ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇ位置１８： Ａｌａ、Ｖａｔ、Ｌｅｕ、Ｉ　ｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたｔまＰｈ位置１９
： Ｖａｌ　　Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎま
たはＧｉｎ 位置３４： Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、
Ｇｉｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒ位２２３９
： Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇ 位ｆｉ５２： Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、
Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、および 位置１４および３８において、これらの２つの位とにお
けるアミノ酸残ノ、（が同一であるかあるいは異なるこ
とができる場合、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙ
ｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅ。

上記第１〜４項のいずれかに記載のヒトアプロチニン ６、Ｊ−２第１〜５項のいずれかに記載のヒトアプロチ
ニンをエンコードする核酸。

７、上記第６項記・戒のＤＮＡを含有する発現系。

８、ヒトアプロチニンをエンコードする核酸を、ヒトア
プロチニンを発現する宿主有機体の中に組込み１次いで
発現産生物を分離することを特徴とする」二記第１〜５
項のいずれかに記載のヒトアプロチニンを調製する方法
。

９、　１−２第１〜５項のいずれかに記載のヒトアプロ
チニンを含有する薬物。

１０、薬物を調製するための北記第１〜５項のいずれか
に記載のヒトアプロチニンの使用。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトアプロチニンの配列の略図である。 第２図は、ヒトイソアプロチニンの配列の略図である。 第３図は、ヒトアプロチニンの変異型をエンコードする
遺伝子の調製において使用するデオキシリポ核酸（ＤＮ
Ａ配列ブロック）の配列である。 第４図は、制限酵素のための切断部位をもっＭｅｔ　−
（−１）−Ｖａｌ−１５−ヒトアプロチニン遺伝子の配
列を示す。 ：５５図は、プラスミドクローンｐｒｔｒ　　１６゜４
、Ｃの略図である。 ｆＪ、６図はＰＡＬＫ　　１のα−アミラーゼシグナル
配列である。 第７図は、ベクターｐＣＨ２３７の構成の略図である。 第８図は、ベクターｐＷ８　２８６３の構成の略図であ
る。 第９図は、ベクターｐＣＨ２８６の構成の略図である。 第１０図は、ベクターｐＲＫ　　１５１１．１の構成の
略図である。 第１１図は、ベクターｐＲＫ　　１５２．１．１の構成
の略図である。 ５＼ 手続補正書彷幻 平成１年１月２４日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１５９０５５号 ２、発明の名称 ３゜ らの使用 補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　バイエル・アクチェンゲゼルシャフト ５゜ 補正命令の日付 昭和６３年９月２７日（発送臼） 補正の対象 図面（第３図、第４図、第７図〜第９図）補正の内容

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、位置１５におけるＬｙｓ残基が他のプロトゲンアミ
   ノ酸残基によって置換されたヒトアプロチニン。