JPH02439A - ヒトアプロチニン相同体、宿主株およびそれらの発現ベクター、それらの分離および薬物としてのそれらの使用 - Google Patents
ヒトアプロチニン相同体、宿主株およびそれらの発現ベクター、それらの分離および薬物としてのそれらの使用Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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-
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- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
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-
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- A61P37/08—Antiallergic agents
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
末完IJ1は、アミノ酸配列がヒト蛋白質のそれから誘
導されたアプロチニンの相同体、および遺伝子工学の方
法によるそれらの調製方法、および薬物としてのそれら
の使用に関する。
導されたアプロチニンの相同体、および遺伝子工学の方
法によるそれらの調製方法、および薬物としてのそれら
の使用に関する。
アプロチニン、基本的な膵11 トリプシン阻害剤[ク
ニツ(Kunitz)]、はウシ器官からのセリンプロ
テイナーゼ阻害剤であり、長い間知られてきており、そ
して広い阻害特異性を有する。
ニツ(Kunitz)]、はウシ器官からのセリンプロ
テイナーゼ阻害剤であり、長い間知られてきており、そ
して広い阻害特異性を有する。
そのアミノ酸配列は既知である。アプロチニンは、多年
にわたって、酵素の自然の阻害剤の不存在または欠乏に
よって引き起こされかつ維持される病気の治療における
薬物として使用されてきており、そして前記酵素はトラ
シロール(T r a 5ylol)によって阻害され
うる[参照、H,フリツ(Fritz)およびG、ウン
デシル(Wunderer)、アルズネイミッテルフォ
ルシユング(Arzneimttelforschun
g)、33.479−494 (1983)] 。
にわたって、酵素の自然の阻害剤の不存在または欠乏に
よって引き起こされかつ維持される病気の治療における
薬物として使用されてきており、そして前記酵素はトラ
シロール(T r a 5ylol)によって阻害され
うる[参照、H,フリツ(Fritz)およびG、ウン
デシル(Wunderer)、アルズネイミッテルフォ
ルシユング(Arzneimttelforschun
g)、33.479−494 (1983)] 。
しかしながら、多数の病気はアプロチニンで阻害されえ
ない過剰の酵素によって引き起こされる。リンソームの
酵素、およびこれらのうちで。
ない過剰の酵素によって引き起こされる。リンソームの
酵素、およびこれらのうちで。
とくに白血球エラスターゼは、これに関して重要な役割
を演する。細胞外に分泌されると、それらは、通常、内
因性トロ書割と錯化することによって直ちに不活性化さ
れ、そしてその阻害剤の例は次の通りである:α1−プ
ロテアーゼ(αI−PI)[J、)ラビス(Travi
s)およびG。
を演する。細胞外に分泌されると、それらは、通常、内
因性トロ書割と錯化することによって直ちに不活性化さ
れ、そしてその阻害剤の例は次の通りである:α1−プ
ロテアーゼ(αI−PI)[J、)ラビス(Travi
s)およびG。
S、サルベセン(Salvesen) 、Ann。
Rev、Biochem、、(1983)、655−7
09] 、抗白血珠エラスターゼ(HUSII)[H,
シエスラ−(Schiessler)ら、ヒト多形核白
血球の中性プロテアーゼ(Neutral Prot
eases ofHuman Polymorph
onuclear Leukocytes)、(19
78)、195−207;に、ヘイブマy(Havem
ann)およびA、シャツ7(Janoff)編、アー
バン+シュワルゼンパーグ、バルチモアー(Urban
+Schwarzenberg、Ba1t imo r
e)]または]α2−マクログロブリンCx2 M)[
G、サルベルセン(Salversen)、D、ビル力
(Virca)およびJ。
09] 、抗白血珠エラスターゼ(HUSII)[H,
シエスラ−(Schiessler)ら、ヒト多形核白
血球の中性プロテアーゼ(Neutral Prot
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78)、195−207;に、ヘイブマy(Havem
ann)およびA、シャツ7(Janoff)編、アー
バン+シュワルゼンパーグ、バルチモアー(Urban
+Schwarzenberg、Ba1t imo r
e)]または]α2−マクログロブリンCx2 M)[
G、サルベルセン(Salversen)、D、ビル力
(Virca)およびJ。
トラビス(Travis)、Ann、 N、Y。
Acad、 Sci、、421,316−326 (
1983)] 、この阻害剤の逍伝的α、−PIの欠乏
または酸化的不活性化[J、トラビス(Travis)
およびG、S、サルベルセン(Salversen)、
Ann、 Rev。
1983)] 、この阻害剤の逍伝的α、−PIの欠乏
または酸化的不活性化[J、トラビス(Travis)
およびG、S、サルベルセン(Salversen)、
Ann、 Rev。
Biochem−1(1983)、655−709]ま
たは酵素、とくに顆粒球エラスターゼの大h″L分泌は
、結合M1織および体液機能の蛋白質の過度の劣化に導
き、重大な臨床的症候、例えば、肺気1)L Ik[i
ショック、大人の呼吸困難症候群、凝固疾患および腎臓
および肝臓の不全を伴う[M、ジョクム(Jochum
)ら編、炎症の診断学における新しい道(Neue
Wedge in der Entzundun
gSdiagnosti k s)、PNM−xラスタ
ーゼ、(1985)、GIT フェルラーグ、ダーム
スタット;W、W、マクグアイア−(McG u i
r e)ら。
たは酵素、とくに顆粒球エラスターゼの大h″L分泌は
、結合M1織および体液機能の蛋白質の過度の劣化に導
き、重大な臨床的症候、例えば、肺気1)L Ik[i
ショック、大人の呼吸困難症候群、凝固疾患および腎臓
および肝臓の不全を伴う[M、ジョクム(Jochum
)ら編、炎症の診断学における新しい道(Neue
Wedge in der Entzundun
gSdiagnosti k s)、PNM−xラスタ
ーゼ、(1985)、GIT フェルラーグ、ダーム
スタット;W、W、マクグアイア−(McG u i
r e)ら。
ジャーナル・オブQクリニカル・イムノロジー(J、
Cl1n、Immunol、)、69゜543、 (
1982)、およびC,T、ジー(Lee)ら、N、
Engl、 J、 Med、、304.192−
196.(1981)]、白血球エラスターゼの決定的
な役割は、また、急性および慢性の炎症、例えば、リウ
マチ様関節炎において確証された[K、フレシェフ(K
I e s i ek)ら、炎症の診断学における新
しい道(Neue Wedge in der
Entztlndungsdi agnosL
1ks) 、PNM−エラスターゼ、(1985)、
71−82、GITフェルラーグ、ダームスタット]。
Cl1n、Immunol、)、69゜543、 (
1982)、およびC,T、ジー(Lee)ら、N、
Engl、 J、 Med、、304.192−
196.(1981)]、白血球エラスターゼの決定的
な役割は、また、急性および慢性の炎症、例えば、リウ
マチ様関節炎において確証された[K、フレシェフ(K
I e s i ek)ら、炎症の診断学における新
しい道(Neue Wedge in der
Entztlndungsdi agnosL
1ks) 、PNM−エラスターゼ、(1985)、
71−82、GITフェルラーグ、ダームスタット]。
実験の敗血症および気腫のモデルは1合成エラスターゼ
阻害剤(J、C,バワーズ(Powers)、Ann、
Rev、Re5pi r、DiSl、127.554−
558.(1983)]および遺伝子丁字によって調製
されたエラスターゼ阻害剤ニグリン(Eglin)c
[H,P、SHネブリ(Schnebli)ら、ユーロ
ピアン・ジャーナル舎オブーレスピレイタリー・ディジ
ージズ(Europ、 J、 Re5pir。
阻害剤(J、C,バワーズ(Powers)、Ann、
Rev、Re5pi r、DiSl、127.554−
558.(1983)]および遺伝子丁字によって調製
されたエラスターゼ阻害剤ニグリン(Eglin)c
[H,P、SHネブリ(Schnebli)ら、ユーロ
ピアン・ジャーナル舎オブーレスピレイタリー・ディジ
ージズ(Europ、 J、 Re5pir。
Dis、)、66、付録、66−70.(1985)]
の治療的効能をIJIらかにするために使用されてきて
いる。しかしながら、ことに長期間の治療において、ヒ
ト由来の安定なエラスターゼ阻害剤の使用は、アレルギ
ー発生の危険がな(かつ耐性にすぐれるため、かなりの
利点を提供する。
の治療的効能をIJIらかにするために使用されてきて
いる。しかしながら、ことに長期間の治療において、ヒ
ト由来の安定なエラスターゼ阻害剤の使用は、アレルギ
ー発生の危険がな(かつ耐性にすぐれるため、かなりの
利点を提供する。
アプロチニンの阻害スペクトルは、「活性部位」のアミ
ノ酸残基の置換によって、定性的および定贋的に変更で
きることは知られている[1983年7月27日および
1983年11月3日のドイツ国公開明細書(DE−O
S) 3 、339 。
ノ酸残基の置換によって、定性的および定贋的に変更で
きることは知られている[1983年7月27日および
1983年11月3日のドイツ国公開明細書(DE−O
S) 3 、339 。
693号:H,チェシ、(Tschesche)、H,
R,ウエンゼル(Wenze+)。
R,ウエンゼル(Wenze+)。
R、シ、:L ム−7り(Schumuck)およびE
。
。
シュナベル(Schnabel)および1986年3月
26【]の欧州特許87.103.942゜3号:E、
−A、アウエルスワルド(Auerswald)、W、
シュジーデル(Schr6der)、E、シュナベル(
Schnabel)、W、ブルンス(Bruns)、G
、レインハルト(Re i nhardt)およびM、
コチク(K。
26【]の欧州特許87.103.942゜3号:E、
−A、アウエルスワルド(Auerswald)、W、
シュジーデル(Schr6der)、E、シュナベル(
Schnabel)、W、ブルンス(Bruns)、G
、レインハルト(Re i nhardt)およびM、
コチク(K。
tick)]。
こうして、アルギニンを位置15に組込むとき、ヒトの
7ニオンおよびカチオン性トリプシン、ヒト血漿カリク
レインおよびヒト器官カリクレインに対して比較的高い
親和性を右するプロテイナーゼjll書割が得られる。
7ニオンおよびカチオン性トリプシン、ヒト血漿カリク
レインおよびヒト器官カリクレインに対して比較的高い
親和性を右するプロテイナーゼjll書割が得られる。
ラッソン(Lasson)ら[A、ラッソン(Lass
on)およびに、オールソン(Ohlsson)、 ス
カンジナビカージャーナルΦオブーガストロエンテロジ
−(Scand、 J。
on)およびに、オールソン(Ohlsson)、 ス
カンジナビカージャーナルΦオブーガストロエンテロジ
−(Scand、 J。
Ga5troentero1..11.707、(19
84)]によると、トトリシンは肝臓炎において決定的
な役割を演する。カリクレインは。
84)]によると、トトリシンは肝臓炎において決定的
な役割を演する。カリクレインは。
また、大きな生理学的および病理生理学的重要性を有す
る[R,ガイガー(Geiger)、V。
る[R,ガイガー(Geiger)、V。
ターフ(T u r k)およびり、ビライル(Vit
ale)N、プロテイナーゼ類およびそれらの阻害剤(
Proteinases and Their
Inhibitors)、ムラジンスカクジガーペルガ
モンΦプレス(Mladinska kujiga−
Pergamon PresS)オクスフォード、ル
ジュブリジャナ(Ljubljana)、(1981)
、353−3761、それらは凝固の制御系、線維素溶
解、補体の活性化およびレニンアンギオテンシン系にお
いておよび炎症に関連して重複した機能を有する[H,
ベルストレアテ(VersLraete)、薬物(Dr
ugS)、29,236、(1985)] 、H,−y
イア−(Maier)およびり、7ドラー(Adler
)、 リンゴロギー、す10ギー、オトロギー(La
ryng、 Rh1no1. 0to1.)、65,
191. (1986)1によれば、慢性の再発性耳
下服炎は器官カリクレインによって引き起こされる0例
えば、血漿カリクレインは、遺伝的脈管神経症性浮腫お
よび[M、シャピラ(Schapira)ら、New
England、J、 Med、、308.105
0 (1983)およびリパフユージョン(reper
fustns)損傷[R,S、ロイ(Ro y)および
J 、M、マクコード(McCord):R,A、グリ
ーンワルド(G r e e nwa l d)および
G、コーヘン(COhen)編、オキシ基およびそれら
のスキャベンジャ−系(Osy Radicals
and their Scavenger S
ystems)、Vol、II:、l胞および医学の而
(Cellular ancl Medical
AspectS)、アムステルダム、1983、エラ
スターゼ・サイエンス・パブリシングーカンパニー、1
45−153]の原因であり、そして白血球の活性化に
Bgを及ぼす[M、シャビラ(Schapira)、C
,F、スコツト(Scot t)、C。
ale)N、プロテイナーゼ類およびそれらの阻害剤(
Proteinases and Their
Inhibitors)、ムラジンスカクジガーペルガ
モンΦプレス(Mladinska kujiga−
Pergamon PresS)オクスフォード、ル
ジュブリジャナ(Ljubljana)、(1981)
、353−3761、それらは凝固の制御系、線維素溶
解、補体の活性化およびレニンアンギオテンシン系にお
いておよび炎症に関連して重複した機能を有する[H,
ベルストレアテ(VersLraete)、薬物(Dr
ugS)、29,236、(1985)] 、H,−y
イア−(Maier)およびり、7ドラー(Adler
)、 リンゴロギー、す10ギー、オトロギー(La
ryng、 Rh1no1. 0to1.)、65,
191. (1986)1によれば、慢性の再発性耳
下服炎は器官カリクレインによって引き起こされる0例
えば、血漿カリクレインは、遺伝的脈管神経症性浮腫お
よび[M、シャピラ(Schapira)ら、New
England、J、 Med、、308.105
0 (1983)およびリパフユージョン(reper
fustns)損傷[R,S、ロイ(Ro y)および
J 、M、マクコード(McCord):R,A、グリ
ーンワルド(G r e e nwa l d)および
G、コーヘン(COhen)編、オキシ基およびそれら
のスキャベンジャ−系(Osy Radicals
and their Scavenger S
ystems)、Vol、II:、l胞および医学の而
(Cellular ancl Medical
AspectS)、アムステルダム、1983、エラ
スターゼ・サイエンス・パブリシングーカンパニー、1
45−153]の原因であり、そして白血球の活性化に
Bgを及ぼす[M、シャビラ(Schapira)、C
,F、スコツト(Scot t)、C。
A、ボクサー(Boxer)およびR,W、コルマン(
Colman):H,7リツ(Fritz)、N、バチ
(Bach)、G、ジエン(Dietz)およびG、L
、ヘイバーランド(Haberland)W、キニン(
Kinin)IIl、部B、1983.747−753
.ニューヨーク、プレナム・プレス]、Arg−15相
同体は、その阻害がすぐれるので、これらの病気におい
てアプロチニンよりすぐれる。
Colman):H,7リツ(Fritz)、N、バチ
(Bach)、G、ジエン(Dietz)およびG、L
、ヘイバーランド(Haberland)W、キニン(
Kinin)IIl、部B、1983.747−753
.ニューヨーク、プレナム・プレス]、Arg−15相
同体は、その阻害がすぐれるので、これらの病気におい
てアプロチニンよりすぐれる。
Lys−15残基をGly、Ala、Leu、11eま
たはValの置換によってfiIられる半合成アプロチ
ニン相同体のあるものおよび遺伝子工学によって調製さ
れた変異型(追加のGluを位置52に右してもよい)
は、ヒト白血球エラスターゼの効力のある阻害剤であり
、そして白血球エラスターゼによって引き起こされかつ
維持される前述の病気の治療に適する。
たはValの置換によってfiIられる半合成アプロチ
ニン相同体のあるものおよび遺伝子工学によって調製さ
れた変異型(追加のGluを位置52に右してもよい)
は、ヒト白血球エラスターゼの効力のある阻害剤であり
、そして白血球エラスターゼによって引き起こされかつ
維持される前述の病気の治療に適する。
構造的にアプロチニンに密接するクニツ(Kun i
t z)型の新しい多価プロテイナーゼ阻害剤は、最近
ヒト血漿から分離された[E−フィオレッチ(Fior
ett i)、M、アンゲテッチ(Ange let
t i) 、G、シトロ(Citro)、D、パラ(B
a r r a)およびF、アスコリ(Ascoli
)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J、 Biol、 Chem、、)、262.3
586−3589 (1987)]、ある抗アプロチニ
ン抗血清と交差反応する、これらの阻害剤のアミノ酸配
夕曜は、今回用らかにされ、そして、驚くべきことには
、第1図および第2図から理解できるように、ウシ同種
阻害剤(isoinhibiLor)IIのそれと同一
であるか、あるいは相同である[E、フイイオレッチ(
Fioret t i)、G、イアコピノ(Iacop
ino)、M、アンゲテッチ(Ange let t
i)、D、バラ(B a r r a)およびF、アス
コリ(Ascoli)、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(J、Biol、 Chem、)
、260.11451−11455 (1985)]。
t z)型の新しい多価プロテイナーゼ阻害剤は、最近
ヒト血漿から分離された[E−フィオレッチ(Fior
ett i)、M、アンゲテッチ(Ange let
t i) 、G、シトロ(Citro)、D、パラ(B
a r r a)およびF、アスコリ(Ascoli
)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J、 Biol、 Chem、、)、262.3
586−3589 (1987)]、ある抗アプロチニ
ン抗血清と交差反応する、これらの阻害剤のアミノ酸配
夕曜は、今回用らかにされ、そして、驚くべきことには
、第1図および第2図から理解できるように、ウシ同種
阻害剤(isoinhibiLor)IIのそれと同一
であるか、あるいは相同である[E、フイイオレッチ(
Fioret t i)、G、イアコピノ(Iacop
ino)、M、アンゲテッチ(Ange let t
i)、D、バラ(B a r r a)およびF、アス
コリ(Ascoli)、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(J、Biol、 Chem、)
、260.11451−11455 (1985)]。
この出願において、ヒトアプロチニンクニツ(Kuni
tz)型のプロテイナーゼ阻害剤として理解され、これ
は1例えば、ヒト血清または動物組織から分離すること
ができ、そして第1図または第2図に示す配列の1つを
有する。
tz)型のプロテイナーゼ阻害剤として理解され、これ
は1例えば、ヒト血清または動物組織から分離すること
ができ、そして第1図または第2図に示す配列の1つを
有する。
図面に示すように、2つの阻害剤は、ペプチド鎖のN−
末端延長ガクアミノ酸だけ異なる。
末端延長ガクアミノ酸だけ異なる。
今回、このヒト阻害剤(以後ヒトアプロチニンと呼ぶ)
の阻害剤スペクトルは、アプロチニンのそれに類似し1
位2115におけるLysJ7j、基を他のプロトゲン
アミノ酸残基によってn検することによって修飾される
ことが発見された0位tl 5において変化するヒトア
プロチニンの得られる相同体は、それらがヒト由来であ
るために、アプロチニンから菖導される相同体よりも耐
性されうる。アレルギーまたは偽アレルギーの反応は、
アプロチニンを使用するとき(例えば、パッケージイン
サート)起こりうる0本発明による阻害剤を使用すると
き、親物質としてヒト由来のアプロチニンを使用するの
で、アレルギーの合併症はかなり減少するか、あるいは
存在しない。
の阻害剤スペクトルは、アプロチニンのそれに類似し1
位2115におけるLysJ7j、基を他のプロトゲン
アミノ酸残基によってn検することによって修飾される
ことが発見された0位tl 5において変化するヒトア
プロチニンの得られる相同体は、それらがヒト由来であ
るために、アプロチニンから菖導される相同体よりも耐
性されうる。アレルギーまたは偽アレルギーの反応は、
アプロチニンを使用するとき(例えば、パッケージイン
サート)起こりうる0本発明による阻害剤を使用すると
き、親物質としてヒト由来のアプロチニンを使用するの
で、アレルギーの合併症はかなり減少するか、あるいは
存在しない。
遺伝子工学により調製された本発明のヒトアプロチニン
相同体において、位置15における活性部位の残基に加
えて、lまたは2以」二の追加のアミノ酸残基を他のプ
ロトゲンアミノ酸残ス(で置換することができる。置換
のための好ましい位置は、次の通りである: 位置15(活性部位の位置): Val、I Ie、Le、Ala、Met、Asn、G
ln、Phe、Tyr、TrpおよびAr位置16: Gly、SerまたはThr 位置17: Leu、Vat、I Ie、Ser、Thr、Asn、
G I n、 Ph e、 T7 rまたはArg位
こ18: Ala、Val、 Leu、 I Ie、Ser、
Thr、Asn、Gin、Asp、GluまたはPh位
置19: Val、I le、Leu、Ala、Thr、Asnま
たはGln 位置34: I Ie、Leu、Ala、Thr、Met、Asn、
Gln、Asp、Glu、PheまたはAr位713
g 。
相同体において、位置15における活性部位の残基に加
えて、lまたは2以」二の追加のアミノ酸残基を他のプ
ロトゲンアミノ酸残ス(で置換することができる。置換
のための好ましい位置は、次の通りである: 位置15(活性部位の位置): Val、I Ie、Le、Ala、Met、Asn、G
ln、Phe、Tyr、TrpおよびAr位置16: Gly、SerまたはThr 位置17: Leu、Vat、I Ie、Ser、Thr、Asn、
G I n、 Ph e、 T7 rまたはArg位
こ18: Ala、Val、 Leu、 I Ie、Ser、
Thr、Asn、Gin、Asp、GluまたはPh位
置19: Val、I le、Leu、Ala、Thr、Asnま
たはGln 位置34: I Ie、Leu、Ala、Thr、Met、Asn、
Gln、Asp、Glu、PheまたはAr位713
g 。
Vat、I Ie、Leu、Met、Asn、Gln、
Asp、Glu、Phe、Ser、ThrまたはArg 位置52: Val、I le、Leu、Gin、Glu、Thr、
Asp、Phe、LysまたはArg。
Asp、Glu、Phe、Ser、ThrまたはArg 位置52: Val、I le、Leu、Gin、Glu、Thr、
Asp、Phe、LysまたはArg。
ジサルファイド架橋を形成する位2114および38に
おける2つの準シスチン残基に加えて、次のものによっ
て置換されることができる:GIy、Ala、Val、
Leu、Pro、Ser、Thr、Asn、Gin、G
lu、Lys、ArgまたはPhe ;これらの2つの
位置におけるアミノ酸残基が同一であるかあるいは異な
ることができる。
おける2つの準シスチン残基に加えて、次のものによっ
て置換されることができる:GIy、Ala、Val、
Leu、Pro、Ser、Thr、Asn、Gin、G
lu、Lys、ArgまたはPhe ;これらの2つの
位置におけるアミノ酸残基が同一であるかあるいは異な
ることができる。
未発11による阻害剤は、さらに1位置lにMet基を
含有することができ、あるいはジペプチドA l a−
G l nによる構造IIに相当するN−末端延長部を
含有することができ、この延長部の前にMetが存在す
ることができる。阻害剤は、必要に応じて、シグナルお
よび/またはリンカ−配列をもつN−末端リーダーペプ
チドを含有することができ、このリーダーペプチドは高
い程度の発現を保証しおよび/または分離および/また
は精製を促進する。
含有することができ、あるいはジペプチドA l a−
G l nによる構造IIに相当するN−末端延長部を
含有することができ、この延長部の前にMetが存在す
ることができる。阻害剤は、必要に応じて、シグナルお
よび/またはリンカ−配列をもつN−末端リーダーペプ
チドを含有することができ、このリーダーペプチドは高
い程度の発現を保証しおよび/または分離および/また
は精製を促進する。
次は未発IJJに関連してとくに好ましい:Val−1
5−ヒトアプロチニン、Val−15−Leu−17−
I Ie−18−Thr−52−ヒトアブロチ=ン、
Le u −15−Le u −17−I 1e−1
8−Thr−52−ヒトアプロチニン、Vat−15−
Leu−17−I Ie−18−Glu−39−Th
r−52−ヒトアプロチニンVa1−15−ヒトアプロ
チニンおよびArg−15−Arg−17−I Ie−
18−Glu−52−ヒトアプロチニン。
5−ヒトアプロチニン、Val−15−Leu−17−
I Ie−18−Thr−52−ヒトアブロチ=ン、
Le u −15−Le u −17−I 1e−1
8−Thr−52−ヒトアプロチニン、Vat−15−
Leu−17−I Ie−18−Glu−39−Th
r−52−ヒトアプロチニンVa1−15−ヒトアプロ
チニンおよびArg−15−Arg−17−I Ie−
18−Glu−52−ヒトアプロチニン。
本発明によるある阻害剤の阻害スペクトルを、表1に要
約する。
約する。
未発明は、また5本発明によるプロテイナーゼjll書
割をエンコードする合成デオキシリポ核酸に関する。定
義したアミノ酸配列の蛋白質を遺伝子丁字によって調製
できることは知られている0個々のアミノ酸残基の21
換は、それ自体既知の方法において2つの道筋によって
可能である=1.ゲノムDNAまたはcDNAから[部
位特異的(Site−directed)J突然変異に
より出発するか、あるいは2.それぞれのコドンを含有
する遺伝子の合成。
割をエンコードする合成デオキシリポ核酸に関する。定
義したアミノ酸配列の蛋白質を遺伝子丁字によって調製
できることは知られている0個々のアミノ酸残基の21
換は、それ自体既知の方法において2つの道筋によって
可能である=1.ゲノムDNAまたはcDNAから[部
位特異的(Site−directed)J突然変異に
より出発するか、あるいは2.それぞれのコドンを含有
する遺伝子の合成。
ME換え微生物および/または真核細胞中で異質DNA
を発現する方法は、同様に知られている。
を発現する方法は、同様に知られている。
こうして、アプロチニンまたはアプロチニン変異型は、
組換え微生物中において、合ll1l、遺伝子を使用し
て、非融合形態で[B、フォノ・ウィルケン−ベルブマ
ン(won Wilcken−Bergmann)ら
、ENBOJ、、3219(1986)]、あるいはバ
クテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつ融合蛋白
質とじて[E、−A、アウエルスワルド(Auersw
aIci)ら、1986年3月26日の欧州特許出願2
7 103 942.3号]発現することができること
が知られている。さらに、アプロチニンの自然の解読領
域はアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列をもつ融
合物として発現させることができることは知られている
[S、アンダーソン(Anderson)および1.B
、キングストン(Kingston)ら、プロシーディ
ンクス中オブ・ナショナル會アカデミーーオブ・サイエ
ンシズ(Proc、 Natl、 Acad。
組換え微生物中において、合ll1l、遺伝子を使用し
て、非融合形態で[B、フォノ・ウィルケン−ベルブマ
ン(won Wilcken−Bergmann)ら
、ENBOJ、、3219(1986)]、あるいはバ
クテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつ融合蛋白
質とじて[E、−A、アウエルスワルド(Auersw
aIci)ら、1986年3月26日の欧州特許出願2
7 103 942.3号]発現することができること
が知られている。さらに、アプロチニンの自然の解読領
域はアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列をもつ融
合物として発現させることができることは知られている
[S、アンダーソン(Anderson)および1.B
、キングストン(Kingston)ら、プロシーディ
ンクス中オブ・ナショナル會アカデミーーオブ・サイエ
ンシズ(Proc、 Natl、 Acad。
Sc i 、)USA、80.6368.(1983)
J、ヒトアプロチニンに対して相同的である。ウシイソ
阻害剤(isoinhibit。
J、ヒトアプロチニンに対して相同的である。ウシイソ
阻害剤(isoinhibit。
r)IIの遺伝子は、また1分離されたが、発現されな
かった[C、B 、 ?−クス(Marks)ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルQケミスト リ − (
J、 Biol、 Chem、)、
261.7115.(1986)]、置換シタ位if5
に活性部位のアミノ酸残基をもつこの阻害剤の相同性お
よび変異型は、今日まで分離されてきていない。
かった[C、B 、 ?−クス(Marks)ら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルQケミスト リ − (
J、 Biol、 Chem、)、
261.7115.(1986)]、置換シタ位if5
に活性部位のアミノ酸残基をもつこの阻害剤の相同性お
よび変異型は、今日まで分離されてきていない。
未発IIノは、とくにまた、第3図に要約する次の配列
をもつデオキシリポ核酸に関する。
をもつデオキシリポ核酸に関する。
他の[コドン用途(codon usageS)Jを
もつデオキシリポ核酸配列(その翻訳は本発明による阻
害剤を与える)は、また1本発明に包含される。
もつデオキシリポ核酸配列(その翻訳は本発明による阻
害剤を与える)は、また1本発明に包含される。
第4図は、位i15にValをもつヒトアプロチニンを
エンコード(e n c o d e)するDNA変異
型域を示す、この遺伝子は、すでに知られているDNA
配列ブロックのライゲーションによって[参照、E、−
A、アウエルスワルド(Auerswald)ら、欧州
特許出願27 103 942 、3S月、あるいは第
3図に記載するDNA配列ブロックのライゲーションに
よって合成された。この遺伝子を構成する4つの配列ブ
ロックは、また、この図面において見ることができる。
エンコード(e n c o d e)するDNA変異
型域を示す、この遺伝子は、すでに知られているDNA
配列ブロックのライゲーションによって[参照、E、−
A、アウエルスワルド(Auerswald)ら、欧州
特許出願27 103 942 、3S月、あるいは第
3図に記載するDNA配列ブロックのライゲーションに
よって合成された。この遺伝子を構成する4つの配列ブ
ロックは、また、この図面において見ることができる。
また、第4図に示されているように、DNAブロックは
制限酵素の単一の切断点によって天底される:EcoR
1,ApaI、5tyrおよび5acII、1.たがっ
て、それらは便利にn!!!!することができる0本発
明における他の阻害剤に要求されるDNA変異型は1合
成的に、あるいは「部位特異的突然変異Jによって得ら
れた。
制限酵素の単一の切断点によって天底される:EcoR
1,ApaI、5tyrおよび5acII、1.たがっ
て、それらは便利にn!!!!することができる0本発
明における他の阻害剤に要求されるDNA変異型は1合
成的に、あるいは「部位特異的突然変異Jによって得ら
れた。
本発明のいくつかの阻害剤のための第3図からのDNA
ブロックの組み合わせを1表2に例示する。
ブロックの組み合わせを1表2に例示する。
発現系の性質に依存して、本発明におけるプロテイナー
ゼ阻害剤の発現のための本発明による遺伝子は、さらに
、Metのための先行開始コドンまたはり一ター配列を
エンコードするヌクレオチド配列を右することができる
。
ゼ阻害剤の発現のための本発明による遺伝子は、さらに
、Metのための先行開始コドンまたはり一ター配列を
エンコードするヌクレオチド配列を右することができる
。
本発明は、さらに、また、実施例ベクターに反し、この
発現ベクターは、プラスミドから誘導され1本発明にお
けるプロテイナーゼ阻害剤をエンコードする本発明によ
る遺伝子をその中に挿入し、そして適当な宿主株中に形
質転換に使用される。
発現ベクターは、プラスミドから誘導され1本発明にお
けるプロテイナーゼ阻害剤をエンコードする本発明によ
る遺伝子をその中に挿入し、そして適当な宿主株中に形
質転換に使用される。
所望の異質蛋白質をエンコードする遺伝子を。
光度に発現可詣である微生物の蛋白質をエンコードする
遺伝子と融合する場合、バクテリア宿主株中において吐
乳動物の蛋白質についての発現が増大することは、既に
知られている1選択的切断を適当な試薬を用いて実施で
きるC−末端をもつアミノ酸(Met、Trp)を介し
て融合を結合する場合、所望の非融合調製は選択的酵素
的切断によって、好ましくは化学的切断によって、融合
蛋白質から得ることができる1、条件は、このアミノ酸
が、また、本発明によるプロテイナーゼ阻害剤の構成成
分でないということである。
遺伝子と融合する場合、バクテリア宿主株中において吐
乳動物の蛋白質についての発現が増大することは、既に
知られている1選択的切断を適当な試薬を用いて実施で
きるC−末端をもつアミノ酸(Met、Trp)を介し
て融合を結合する場合、所望の非融合調製は選択的酵素
的切断によって、好ましくは化学的切断によって、融合
蛋白質から得ることができる1、条件は、このアミノ酸
が、また、本発明によるプロテイナーゼ阻害剤の構成成
分でないということである。
本発明におけるブロテイナーゼ阻害剤の好ましい融合相
手は、′e生物蛋白質の分泌シグナル配列、例えば、o
mpA[グライド(Ghrayed)ら、EMBOJ、
、3.2437−2442、 (1984)またはph
o A[プレイ(Gray)ら、遺伝子CGene)
、39.247−254、(1985)]のようなもの
である。
手は、′e生物蛋白質の分泌シグナル配列、例えば、o
mpA[グライド(Ghrayed)ら、EMBOJ、
、3.2437−2442、 (1984)またはph
o A[プレイ(Gray)ら、遺伝子CGene)
、39.247−254、(1985)]のようなもの
である。
次いで、融合蛋白質は、発酵の間細胞質または増殖培地
の中に分泌され、そしてそれ自体既知の方法によって培
養ろ液から分離される。適当な融合相手を分泌系のため
に選択すると、プロテイナーゼ阻害剤は自然構造をもつ
融合蛋白質中に分泌される。臭化シアン切#f後の復元
[E、グロス(G r o s s)およびB、ウィト
1−/プ(Witkop)、ジャーナルφオブeアメリ
カン醗ケミカル・ソサイアティ(J 、 Amer、
Chem、 Soc、)、83.1510−1
511゜(1961)は、Vを通過する正しい処理の場
合においてU除される。未発IIによるプロテイナーゼ
阻害剤は、反応混合物から、それ自体既知の方υ:によ
って分離され、そして精製される。
の中に分泌され、そしてそれ自体既知の方法によって培
養ろ液から分離される。適当な融合相手を分泌系のため
に選択すると、プロテイナーゼ阻害剤は自然構造をもつ
融合蛋白質中に分泌される。臭化シアン切#f後の復元
[E、グロス(G r o s s)およびB、ウィト
1−/プ(Witkop)、ジャーナルφオブeアメリ
カン醗ケミカル・ソサイアティ(J 、 Amer、
Chem、 Soc、)、83.1510−1
511゜(1961)は、Vを通過する正しい処理の場
合においてU除される。未発IIによるプロテイナーゼ
阻害剤は、反応混合物から、それ自体既知の方υ:によ
って分離され、そして精製される。
遺伝子発現の別のiIT能性は、細胞中の融合蛋白質が
「細胞封入体(inclusion bodies)
」として不溶性の形7Lで分泌される場合、未発IJ+
によるプロテイナーゼ阻害剤の場合において実現される
。不溶性蛋白質のこのような封入体は、例えば、バタテ
リオファージMS2のDNAポリメラーゼのDNA部分
配列と[E、レマルト(Remau I t)、P、ス
タフ7センス(Satanssens)およびW、フィ
ーアス(FierS)、遺伝子(Gene)、15.8
1、(1981)]またはEscherichia
coliのIac Z遺伝子と[E、−A。
「細胞封入体(inclusion bodies)
」として不溶性の形7Lで分泌される場合、未発IJ+
によるプロテイナーゼ阻害剤の場合において実現される
。不溶性蛋白質のこのような封入体は、例えば、バタテ
リオファージMS2のDNAポリメラーゼのDNA部分
配列と[E、レマルト(Remau I t)、P、ス
タフ7センス(Satanssens)およびW、フィ
ーアス(FierS)、遺伝子(Gene)、15.8
1、(1981)]またはEscherichia
coliのIac Z遺伝子と[E、−A。
アウエルスワルド(Auerswald)、1986年
3月26[1の欧州特許用1@j87 103942.
3号]阻書割逍伝子を融合させると、およびまたラムダ
バクテリオファージノcII遺伝子と[K、ナガイ(N
agai)およびH、C。
3月26[1の欧州特許用1@j87 103942.
3号]阻書割逍伝子を融合させると、およびまたラムダ
バクテリオファージノcII遺伝子と[K、ナガイ(N
agai)およびH、C。
ソーガーソ7(Thorgerson)、ネイチャー(
Nature)、309.810.(1984)]阻害
剤遺伝子を融合させると、産生ずることができる。
Nature)、309.810.(1984)]阻害
剤遺伝子を融合させると、産生ずることができる。
細胞封入体による本発明によるブロテイナーゼ阻害剤の
産生は、次の工程からなる: ■、適当な条件下の宿主株のブレ7デイング(Brea
ding)および培養; 2、宿主細胞からの細胞封入体の分離;3、融合蛋白質
の精製: 4、融合蛋白質の切断; 5、阻害剤の復元: 6、阻害剤の分離および精製。
産生は、次の工程からなる: ■、適当な条件下の宿主株のブレ7デイング(Brea
ding)および培養; 2、宿主細胞からの細胞封入体の分離;3、融合蛋白質
の精製: 4、融合蛋白質の切断; 5、阻害剤の復元: 6、阻害剤の分離および精製。
個々の工程は、実施例において詳述する。
可溶性融合蛋白質の精製のため、酸性または塩基性のア
ミノ酸を切離し可能な融合相手の中に組込み、こうして
イオン交換クロマトグラフィーによる分離を促進するこ
とが有利であることがあ未発IJJによるブロテイナー
ゼ阻害剤の最後の精製は、それ自体既知の方法1例えば
、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフ
ィニティクロマトグラフィーまたは電気泳動によって実
施する。
ミノ酸を切離し可能な融合相手の中に組込み、こうして
イオン交換クロマトグラフィーによる分離を促進するこ
とが有利であることがあ未発IJJによるブロテイナー
ゼ阻害剤の最後の精製は、それ自体既知の方法1例えば
、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフ
ィニティクロマトグラフィーまたは電気泳動によって実
施する。
形質転換のための多数の種々の微生物は現在知られてい
る;これらは、とくに、培養または発酵のブロス中で増
殖できる単分子有機体である。形質転換のために好まし
い有機体は、バクテリア酵/+7および菌・力ど(fu
ngi)を包含する。
る;これらは、とくに、培養または発酵のブロス中で増
殖できる単分子有機体である。形質転換のために好まし
い有機体は、バクテリア酵/+7および菌・力ど(fu
ngi)を包含する。
ここに記載する研究において使用する特定の有機体は、
E、 coli RRI△M15であり、これはア
メリカンΦタイプ・カルチャ一番コレクシ、ン(Ame
rjcan Type Cu1ture Co1
1ection)にATCCNo、35102で寄託さ
れている。
E、 coli RRI△M15であり、これはア
メリカンΦタイプ・カルチャ一番コレクシ、ン(Ame
rjcan Type Cu1ture Co1
1ection)にATCCNo、35102で寄託さ
れている。
プラスミドpRK 151.1.8 (Vat −1
5−Leu−17−I Ie−18−Thr−52−ヒ
トアプロチニン、実施例3参照)で形質転換されたE、
coli RRIΔM15は、1987年6月2
6日に、ドイツ国微生物収果所(German Co
11ection ofMicroorganjsm
、Grisebachsre、8.D−3400Got
tingen)にNo、DSM 4160で寄託され
、ソシてプラスミドpRK 155.1.4(Leu
−15−Leu−17−r Ie−18−Thr−52
−ヒトアプロチニン)で形質転換されたE。
5−Leu−17−I Ie−18−Thr−52−ヒ
トアプロチニン、実施例3参照)で形質転換されたE、
coli RRIΔM15は、1987年6月2
6日に、ドイツ国微生物収果所(German Co
11ection ofMicroorganjsm
、Grisebachsre、8.D−3400Got
tingen)にNo、DSM 4160で寄託され
、ソシてプラスミドpRK 155.1.4(Leu
−15−Leu−17−r Ie−18−Thr−52
−ヒトアプロチニン)で形質転換されたE。
coli RR1ΔM15はNo、DSM 416
1で寄託されている。
1で寄託されている。
本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に加
えて1本発明の化合物の1または2種以上を含んでなる
製薬学的!lL&物または本発明の化合物の1または2
種以上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学
的組成物を調製する方法を包含する。
えて1本発明の化合物の1または2種以上を含んでなる
製薬学的!lL&物または本発明の化合物の1または2
種以上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学
的組成物を調製する方法を包含する。
本発明は、また、投与単位の形態の製薬学的調製物を包
含する。これは、製薬学的′iA製物が個々の部分の形
態、例えば1錠剤、被覆された錠剤カプセル剤、ビル、
坐薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、その
活性化合物の含量は個々の投グ、j、ニーの数分の1あ
るいは多数倍に相当する。役グー弔位は、例えば、l、
2.3または4倍の個々の投与r+1、あるいは個々の
投与量の1/2.1/3または1/4を含有することが
できる0個々の投jj 、7は、好ましくは、1回の投
与でり゛えられかつ通常111 j+’lの全部、半分
または3分の1または4分の1に相当する!11の活性
化合物を含有する。
含する。これは、製薬学的′iA製物が個々の部分の形
態、例えば1錠剤、被覆された錠剤カプセル剤、ビル、
坐薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、その
活性化合物の含量は個々の投グ、j、ニーの数分の1あ
るいは多数倍に相当する。役グー弔位は、例えば、l、
2.3または4倍の個々の投与r+1、あるいは個々の
投与量の1/2.1/3または1/4を含有することが
できる0個々の投jj 、7は、好ましくは、1回の投
与でり゛えられかつ通常111 j+’lの全部、半分
または3分の1または4分の1に相当する!11の活性
化合物を含有する。
無I;iの不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは。
すへての種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填
剤および配合助剤であると解釈すべきである。
剤および配合助剤であると解釈すべきである。
述べることのできる好ましい製薬学的:A製動は1錠剤
、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル。
、被覆された錠剤、カプセル剤、ピル。
火剤、坐薬、溶液、懸濁液および乳濁液、配合、軟膏、
ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレーであ
る。
ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレーであ
る。
錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび!¥trL剤は、
活性化合物の1種または2挿具−ヒを、次の普通の賦形
剤と一緒に含有できる= (a)充填剤および増4士剤
、例えば、を粉、ラクトース、グルコース、マンニトー
ルおよびシリカ、 (b)結合剤1例えば、カルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポ
リビニルピロリドン、(C)保湿剤、例えば、グリセロ
ール、(d)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムお
よび正炭酸ナトリウム、(e)溶解遅延剤1例えば、パ
ラフィン、および(f)吸収促進剤、例えば、第四アン
モニウム化合物、(g)湿潤剤1例えば、セチルアルコ
ールまたはグリセロールモノステアレート、(h)吸着
剤1例えば、カオリンおよびベントナイト、および(i
) I’ll滑剤、例えば、タルク、ステアリン酩カ
ルシウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリ
エチレングリコール、または上の(a)〜(i)に記載
した物質の混合物。
活性化合物の1種または2挿具−ヒを、次の普通の賦形
剤と一緒に含有できる= (a)充填剤および増4士剤
、例えば、を粉、ラクトース、グルコース、マンニトー
ルおよびシリカ、 (b)結合剤1例えば、カルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポ
リビニルピロリドン、(C)保湿剤、例えば、グリセロ
ール、(d)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムお
よび正炭酸ナトリウム、(e)溶解遅延剤1例えば、パ
ラフィン、および(f)吸収促進剤、例えば、第四アン
モニウム化合物、(g)湿潤剤1例えば、セチルアルコ
ールまたはグリセロールモノステアレート、(h)吸着
剤1例えば、カオリンおよびベントナイト、および(i
) I’ll滑剤、例えば、タルク、ステアリン酩カ
ルシウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリ
エチレングリコール、または上の(a)〜(i)に記載
した物質の混合物。
錠剤、Pi剤、カプセル剤、ビルおよび顆粒剤は、普通
の被膜および外殻を含有することができ、これらは不透
IJ化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物
の1種または2種以上のみを、あるいは優先的に、腸管
の特定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、
放出するようなM1成物であることができ、ここで使用
できる埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワック
スである。
の被膜および外殻を含有することができ、これらは不透
IJ化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物
の1種または2種以上のみを、あるいは優先的に、腸管
の特定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、
放出するようなM1成物であることができ、ここで使用
できる埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワック
スである。
l+’i性化合物化合物または2種以上は、心安に応じ
て前述の賦形剤の1種または2種以上と一緒に、マイク
ロカプセル化した形態にすることもできる。
て前述の賦形剤の1種または2種以上と一緒に、マイク
ロカプセル化した形態にすることもできる。
坐薬は、活性化合物の1種または2種以上に加えて f
?通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば。
?通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば。
カカオ脂肪、高級エステル、(例えば、Cl4−アルコ
ールとCl6−脂肪酸とのエステル)またはこれらの物
質の混合物を含有することができる。
ールとCl6−脂肪酸とのエステル)またはこれらの物
質の混合物を含有することができる。
軟・計、泥i′f、クリームおよびゲルは、活性化合物
の1種または2!I!以りに加えて、汀通の賦形剤、例
えば、動物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィ
ン、E粉、 トラガカント、セルソース誘導体、ポリ
エチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリ
カ、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有
することができる。
の1種または2!I!以りに加えて、汀通の賦形剤、例
えば、動物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィ
ン、E粉、 トラガカント、セルソース誘導体、ポリ
エチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリ
カ、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有
することができる。
散剤およびスプレーは、活性化合物の1種または2挿具
」二に加えて、汀通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。スプレーは、慣用の噴射剤1例え
ば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することがで
きる。
」二に加えて、汀通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。スプレーは、慣用の噴射剤1例え
ば、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することがで
きる。
溶液および乳濁液は、活性化合物の1種または2種以上
に加えて、償用の賦形剤、例えば、溶媒、1j丁溶化剤
および乳化剤、例えば、氷、エチルアルコール、イソプ
ロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジル
アルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール
、1.3−ブチレンゲリコール、ジメチルホルムアミド
、油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ肝油、オ
リブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセ
ロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール
、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エ
ステル、またはこれらの混合物を含有することができる
。
に加えて、償用の賦形剤、例えば、溶媒、1j丁溶化剤
および乳化剤、例えば、氷、エチルアルコール、イソプ
ロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジル
アルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール
、1.3−ブチレンゲリコール、ジメチルホルムアミド
、油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ肝油、オ
リブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセ
ロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール
、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エ
ステル、またはこれらの混合物を含有することができる
。
非経[1的投与のために、溶液および乳濁液は、また、
血液と等張物の無菌の形態にすることができる。
血液と等張物の無菌の形態にすることができる。
懸濁液は、活性化合物の1種または2挿具1−に加えて
、慣用の賦形剤1例えば、液状希釈剤、例えば、水、エ
チルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁剤、
例えば、エトキシル化インステアリルアルコール、ポリ
オキシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエステ
ル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベ
ントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらに
混合物を含有することができる。
、慣用の賦形剤1例えば、液状希釈剤、例えば、水、エ
チルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁剤、
例えば、エトキシル化インステアリルアルコール、ポリ
オキシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエステ
ル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベ
ントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらに
混合物を含有することができる。
前述の配合形態は、また、染料、防腐剤および、芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、およびIt味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、およびIt味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。
治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製薬学
的調製物中に、全混合物の約0.1〜99.5屯州%、
好ましくは約0.5〜95重I11%の量で存在する。
的調製物中に、全混合物の約0.1〜99.5屯州%、
好ましくは約0.5〜95重I11%の量で存在する。
前述の製薬学的調製物は、また、未発IJIによる化合
物に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有するこ
とができる。
物に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有するこ
とができる。
前述の製薬学的7J製物は、既知の方法に従い通常の方
法で、活性化合物の1種または2挿具]二を賦形剤の1
種または2種以」−と混合することによってつくられる
。
法で、活性化合物の1種または2挿具]二を賦形剤の1
種または2種以」−と混合することによってつくられる
。
一般に、人間の医学および獣医学において、所望の結果
を得るためには、本発明による活性化合物の1種または
2種以上を24時間毎に約0.5〜約500 m g
/ k g体重、好ましくは4〜lOOm g / k
g体重の合計量で、適当ならば数回に分けて投1j、
することが右利であることがわかった0個々の投薬物は
、好ましくは、本発明による活性化合物の1種または2
種以上を約1〜約250mg/kg体屯、とくに3〜6
0 m g / k g体毛の+1鼾で含有する。しか
しながら、前述の投薬呈からはずれなければならないこ
とがあり、特にそのことは処置すべき患者の性質および
体重、病気の性質および改さ、調製物の性質および薬剤
の投It、方V:、投ゲを行う時間または間隔に依存す
る。
を得るためには、本発明による活性化合物の1種または
2種以上を24時間毎に約0.5〜約500 m g
/ k g体重、好ましくは4〜lOOm g / k
g体重の合計量で、適当ならば数回に分けて投1j、
することが右利であることがわかった0個々の投薬物は
、好ましくは、本発明による活性化合物の1種または2
種以上を約1〜約250mg/kg体屯、とくに3〜6
0 m g / k g体毛の+1鼾で含有する。しか
しながら、前述の投薬呈からはずれなければならないこ
とがあり、特にそのことは処置すべき患者の性質および
体重、病気の性質および改さ、調製物の性質および薬剤
の投It、方V:、投ゲを行う時間または間隔に依存す
る。
かくして、ある場合には、活性化合物は前述の星よりも
少早二で1分であり、−万能の場合には前記:I:を超
えなければならない場合も起こるであろう、必要な特定
の最適な役!7−!、X:および活性化合物の役Jj、
方法は、この分野に精通するものにとっては、その等円
知識に基づき容易に決定することができる。
少早二で1分であり、−万能の場合には前記:I:を超
えなければならない場合も起こるであろう、必要な特定
の最適な役!7−!、X:および活性化合物の役Jj、
方法は、この分野に精通するものにとっては、その等円
知識に基づき容易に決定することができる。
本発明による活性化合物は、エイズ(E I DS)、
急性炎症1例えば、リウマチ様関節炎、遺伝性脈管神経
症性浮腫、肺炎および肝臓炎、およびショックの状79
の処置にとくに有用である。Arg−15相同体は、そ
の上1人工膜の助けによる透析の間、一般に対外の循環
において、保護機能を有する。
急性炎症1例えば、リウマチ様関節炎、遺伝性脈管神経
症性浮腫、肺炎および肝臓炎、およびショックの状79
の処置にとくに有用である。Arg−15相同体は、そ
の上1人工膜の助けによる透析の間、一般に対外の循環
において、保護機能を有する。
材料および方法
A、 合成遺伝子および組換えクローニングおよび発現
ベクターの構成 材料 ■、試薬 アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、反応w析液
および培地のDJ製に必要な試薬は、ベーリンガー(B
oehringer)(Mannheim)、デ(7=
+ (Di fco)、 メルク(Merck)、サ
ーz<(Serva)、ジグ−y(5igma)および
バイオラド(Biorad)から人手した。
ベクターの構成 材料 ■、試薬 アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、反応w析液
および培地のDJ製に必要な試薬は、ベーリンガー(B
oehringer)(Mannheim)、デ(7=
+ (Di fco)、 メルク(Merck)、サ
ーz<(Serva)、ジグ−y(5igma)および
バイオラド(Biorad)から人手した。
2、酵泰
分子生物学のクローニングの研究のための酵票は、ベー
リンガー(Boehringer)(Mannheim
)、z−イオラブス(BiolabS)およびBRLか
ら入手した。
リンガー(Boehringer)(Mannheim
)、z−イオラブス(BiolabS)およびBRLか
ら入手した。
3 DNA
債伝f“およびベクターの構成のためのプラスミドおよ
びファージのDNAおよびDNAアダプターは、ヘーリ
ンガー(Boehringer)(Mannheim)
、バイオラプス(Biolabs)、BRLおよびフ7
−マシア(Pharmacia)から1次の例外を除い
て、入毛した。
びファージのDNAおよびDNAアダプターは、ヘーリ
ンガー(Boehringer)(Mannheim)
、バイオラプス(Biolabs)、BRLおよびフ7
−マシア(Pharmacia)から1次の例外を除い
て、入毛した。
例外
プラスミドpUR278:U、リュータ−(Ruthe
r)およびB、ミュラー−ヒル(Mtjl Ier−H
i l l)、EMBOJ、、2.1791−1794
.(1983)ニブラスミドpEx 31.b、:ス
トレベル(Strebel)ら、ウィルス字詰(J、
Virol、)57.983−991.(1986)
。
r)およびB、ミュラー−ヒル(Mtjl Ier−H
i l l)、EMBOJ、、2.1791−1794
.(1983)ニブラスミドpEx 31.b、:ス
トレベル(Strebel)ら、ウィルス字詰(J、
Virol、)57.983−991.(1986)
。
4、E、coli株
E、coli RRIΔMl 5 (ATCCNo、
35102):リューター(Ruther)、核酸の研
究(Nucl、 Ac1dsRe s 、) 、
10.5765−5772 (1982)、E、
coli 537−W6、 rex:W、フィー
アス(Fiers)、ジェント大学(Universi
ty of GenL)、ベルギー、E、L/マウル
ト(Remau I t)ら、遺伝子(Gene)、1
5.81−93 (1981)。
35102):リューター(Ruther)、核酸の研
究(Nucl、 Ac1dsRe s 、) 、
10.5765−5772 (1982)、E、
coli 537−W6、 rex:W、フィー
アス(Fiers)、ジェント大学(Universi
ty of GenL)、ベルギー、E、L/マウル
ト(Remau I t)ら、遺伝子(Gene)、1
5.81−93 (1981)。
5、培地
LB−、M9s−およびカッパ 1776−培地の製法
は、次の文献中のデータに相当する:T、−y=アチス
(Maniatis)ら5分子クローニング(Mole
cular Cloning)、コールド・スプリン
クーハーパー、 X114(1982)、lsgのパク
トー寒天を寒天下板のための培地に添加した。
は、次の文献中のデータに相当する:T、−y=アチス
(Maniatis)ら5分子クローニング(Mole
cular Cloning)、コールド・スプリン
クーハーパー、 X114(1982)、lsgのパク
トー寒天を寒天下板のための培地に添加した。
6、放射性同位元素
ゲル電気泳動のためのL [35S]−メチオニン、
アデノシン5°−α[35S]−チオトリホスフェート
および[+ 4 (:]蛋白質分子拵マーカーは、アマ
−シャムーブヒラ−(Amersham−Buchle
r)から入−トした。
アデノシン5°−α[35S]−チオトリホスフェート
および[+ 4 (:]蛋白質分子拵マーカーは、アマ
−シャムーブヒラ−(Amersham−Buchle
r)から入−トした。
7、抗生物質
次の抗生物質を選択j8地の調製に使用した:りOラフ
フェニコールおよびカナマイシンはベーリンカー(13
oehringer)から入手し、そしてアンピシリン
およびテトラサイクリンはサーバ(Serva)から大
トした。
フェニコールおよびカナマイシンはベーリンカー(13
oehringer)から入手し、そしてアンピシリン
およびテトラサイクリンはサーバ(Serva)から大
トした。
方V、
クローニング実験のための1常の技術1例えば。
プラスミド−DNAの分離および才古製、DNA断ノ1
の分)、制限分析、アガロースゲルおよびアクリルアミ
ドゲル1.のDNA断片の分箸なとは、次の文献に記載
されている:T、マニアチス(ManiaLis)ら1
分子クローニング(Molecular Cloni
ng)1ml−ルド・スプリング・ハーバ−1米国、(
1982)。
の分)、制限分析、アガロースゲルおよびアクリルアミ
ドゲル1.のDNA断片の分箸なとは、次の文献に記載
されている:T、マニアチス(ManiaLis)ら1
分子クローニング(Molecular Cloni
ng)1ml−ルド・スプリング・ハーバ−1米国、(
1982)。
8、DNAオリゴヌクレオチドの化学的合成プロティナ
ーゼjl+書割遺伝子の構成に必要なりNAオリゴヌク
レオチドは、アプライド・バイオシステハス380型か
らの自動DNA合成装置を使用して合成した。−木ff
1DNAオリゴヌクレオチドの精製は、HPLCカラム
または調製用アクリルアミドゲルの電気泳動によって達
成した。各場合においテ、0 、5〜5 、0 0D2
6 onm単位の個々のオリゴマーを分離した。
ーゼjl+書割遺伝子の構成に必要なりNAオリゴヌク
レオチドは、アプライド・バイオシステハス380型か
らの自動DNA合成装置を使用して合成した。−木ff
1DNAオリゴヌクレオチドの精製は、HPLCカラム
または調製用アクリルアミドゲルの電気泳動によって達
成した。各場合においテ、0 、5〜5 、0 0D2
6 onm単位の個々のオリゴマーを分離した。
9、DNA配列決定
分析すべきDNA断片は1M13フγ−ジベクターまた
はpUC系列のプラスミドベクターを使用してクローニ
ングし1次いでDNA配列を検査した。DNAの配列決
定は、N、ハラトリ(Hattori)およびS、サカ
キ(Sakaki)、アナリティカルーパイオケミスト
リー(Anal、 Biochem、)、152.2
32238 (1986) のY順、オヨび<−リンi
−a 77 ハイム(Boehringer Man
nheim)からの配列決定ハンドブック[迅速かつ容
易なプラスミド配列決定のマニュアル(Leitfad
en zum 5chnellenund ei
nfachen PlasmidSsequenzi
eren)] (1986)に従って実施した。
はpUC系列のプラスミドベクターを使用してクローニ
ングし1次いでDNA配列を検査した。DNAの配列決
定は、N、ハラトリ(Hattori)およびS、サカ
キ(Sakaki)、アナリティカルーパイオケミスト
リー(Anal、 Biochem、)、152.2
32238 (1986) のY順、オヨび<−リンi
−a 77 ハイム(Boehringer Man
nheim)からの配列決定ハンドブック[迅速かつ容
易なプラスミド配列決定のマニュアル(Leitfad
en zum 5chnellenund ei
nfachen PlasmidSsequenzi
eren)] (1986)に従って実施した。
10、ヒトアプロチニン変異型の標準の発現細胞質細胞
封入体の産生のための分泌ベクターおよび発現ベクタの
両者を、ヒトアプロチニン変異型の発現に使用した。
封入体の産生のための分泌ベクターおよび発現ベクタの
両者を、ヒトアプロチニン変異型の発現に使用した。
種々の発現ペクタ中へのヒトアプロチニン遺伝f変異η
1の11.シい挿入は、DNA配列決定によって検査し
た。
1の11.シい挿入は、DNA配列決定によって検査し
た。
Ml換え分泌ベクターおよびI acZベクターは、E
、 coli株RRIΔMls中に挿入した。P−M
S2ポリメテーゼベクターは、E。
、 coli株RRIΔMls中に挿入した。P−M
S2ポリメテーゼベクターは、E。
coli株537中に挿入した。
a)形質転換したE、 coli株の新鮮な1夜のJ
?j、Ii物を、lomlのLB培地中(分析の目的で
)であるいは1リツトルのLB培地中(:A製のII的
で)でl : 100に希釈した。ioo終g/mlの
アンピシリンを培地に添加した。
?j、Ii物を、lomlのLB培地中(分析の目的で
)であるいは1リツトルのLB培地中(:A製のII的
で)でl : 100に希釈した。ioo終g/mlの
アンピシリンを培地に添加した。
J?t、ri物を、37℃および200rpmにおいて
、2.54cm(1,0インチ)のコニカルフラスコ中
でOD5Sonmまでインキュベーションした0発現系
(l acプロモーター)を、ミリモルのI PTG
(インプロイブチオガラクトース)の添加により誘発し
た。
、2.54cm(1,0インチ)のコニカルフラスコ中
でOD5Sonmまでインキュベーションした0発現系
(l acプロモーター)を、ミリモルのI PTG
(インプロイブチオガラクトース)の添加により誘発し
た。
37℃において16〜24時間語発した後、J?1養物
を遠心(10分:15〜20,000g、4℃)により
収穫した0分泌ベクターを使用してJ8養懸濁液中に分
泌されたヒトアプロチニン変異型の含ム2を酵素−阻害
活性の助けによって試験した(方法の箇B、10)。
を遠心(10分:15〜20,000g、4℃)により
収穫した0分泌ベクターを使用してJ8養懸濁液中に分
泌されたヒトアプロチニン変異型の含ム2を酵素−阻害
活性の助けによって試験した(方法の箇B、10)。
融合相手としてβ−ガラクトシダーゼで発現したヒトア
プロチニン変異型を、バクテリアの破壊後、5O5−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により検出した[U 、
K 、ラレムミ(Laemmli)、ネイチャー (
Nat u re)、277.680、(1970)]
、このために、0.01モルのEDTAを含有する40
JLIの0.1モルのトリス緩衝液 pHa 、O中に
1X109/ゲルトラツクの細胞を懸濁しそして、10
g1のSDS試験緩衝液(0,3モルのトリス HCI
、PH8,8,50%のグリセロール、5%のSDS、
25%のβ−メルカプトエタノールした後,この混合物
を3分間沸慧させた.電気泳動後、蛋白質の7ーンドを
クーマー、シーブルー(Coomassie Blu
e)で着色し、そして融合蛋白質の含j賃%をデンシト
メーターで決定した. b)ファージMS2のDN
Aポリメラーゼの配列の一部をもつ融合蛋白質としての
ヒトアプロチニン変異η!の発現を、pExベクター[
ストレベル(Strebel)ら、ウィルス字詰(J.
Virol.)、57、983−991(1986
)] を使用してラムダファージのP Lープロモータ
ーのル制御下に実施した。
プロチニン変異型を、バクテリアの破壊後、5O5−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により検出した[U 、
K 、ラレムミ(Laemmli)、ネイチャー (
Nat u re)、277.680、(1970)]
、このために、0.01モルのEDTAを含有する40
JLIの0.1モルのトリス緩衝液 pHa 、O中に
1X109/ゲルトラツクの細胞を懸濁しそして、10
g1のSDS試験緩衝液(0,3モルのトリス HCI
、PH8,8,50%のグリセロール、5%のSDS、
25%のβ−メルカプトエタノールした後,この混合物
を3分間沸慧させた.電気泳動後、蛋白質の7ーンドを
クーマー、シーブルー(Coomassie Blu
e)で着色し、そして融合蛋白質の含j賃%をデンシト
メーターで決定した. b)ファージMS2のDN
Aポリメラーゼの配列の一部をもつ融合蛋白質としての
ヒトアプロチニン変異η!の発現を、pExベクター[
ストレベル(Strebel)ら、ウィルス字詰(J.
Virol.)、57、983−991(1986
)] を使用してラムダファージのP Lープロモータ
ーのル制御下に実施した。
形質転換したE. coli株(Ec 537の誘
導体)を、l O O JLg / m lのアンピシ
リンを含むL B J9 Ji!!のIOm+または1
リツトル中で200rpmおよび28℃において培養し
た.OD55(1nm=1.0の細胞密度において,温
度を42℃(加熱誘発)に増加し、水溶液培養を20O
rpmでざらに3時間インキュベーションし細胞を遠心
(上を参照)により収穫し、そしてSDS試験緩衝液中
で破壊し,そしてアリコートをSOS−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動により分離した。
導体)を、l O O JLg / m lのアンピシ
リンを含むL B J9 Ji!!のIOm+または1
リツトル中で200rpmおよび28℃において培養し
た.OD55(1nm=1.0の細胞密度において,温
度を42℃(加熱誘発)に増加し、水溶液培養を20O
rpmでざらに3時間インキュベーションし細胞を遠心
(上を参照)により収穫し、そしてSDS試験緩衝液中
で破壊し,そしてアリコートをSOS−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動により分離した。
ftHj泡封入泡封形体で若苗した融合蛋白質を、ゲル
をクーマフシーブルーで着色することによって検出し,
そして融合蛋白質の含賃%をデンシトメトリーによりΔ
に足した。
をクーマフシーブルーで着色することによって検出し,
そして融合蛋白質の含賃%をデンシトメトリーによりΔ
に足した。
B) 本発明によるプロティナーゼ阻害剤の分離および
特性づけ l,酵素 ヒト白血球エラスターゼ(S E 5 6 3)およ
びヒト力テプシンG(SG 45)は、エラスチン・
プロダクツ番インコーポレーテッド(E l asti
n Products Inc.、P。
特性づけ l,酵素 ヒト白血球エラスターゼ(S E 5 6 3)およ
びヒト力テプシンG(SG 45)は、エラスチン・
プロダクツ番インコーポレーテッド(E l asti
n Products Inc.、P。
0、Box.Pacific,Ma.63069、US
A)から入手し,トリプシン(ウシ)はE.メルク(M
erck,Darmstadt)から入・トシ、ヒト血
漿力すクレン(80−131101)はプロトンゲン社
(ProtogenAG、Weidenmattweg
4.P。
A)から入手し,トリプシン(ウシ)はE.メルク(M
erck,Darmstadt)から入・トシ、ヒト血
漿力すクレン(80−131101)はプロトンゲン社
(ProtogenAG、Weidenmattweg
4.P。
5tfach、CH−4448Laufelfi ng
en、Swi t ze r 1and)から入手した
。ヒト尿カリクレンは、R,ガイガー(Gei ge
r)tl:(ミュンヘン大学、外科病院における臨床化
学および化学生物学部、Nussbaumstr、
20.8000 Munich2)、そしてヒトアニ
オン性およびカチオン性トリプシンはに1オールソン(
Ohlsson)ト!71・[マルメ(Ma1mσ)総
合病院、臨床化学および外科部、スエーデン国マルメ2
−2140I]によって提供された。
en、Swi t ze r 1and)から入手した
。ヒト尿カリクレンは、R,ガイガー(Gei ge
r)tl:(ミュンヘン大学、外科病院における臨床化
学および化学生物学部、Nussbaumstr、
20.8000 Munich2)、そしてヒトアニ
オン性およびカチオン性トリプシンはに1オールソン(
Ohlsson)ト!71・[マルメ(Ma1mσ)総
合病院、臨床化学および外科部、スエーデン国マルメ2
−2140I]によって提供された。
2、 ノ、(rI
S u c−A I a−A I a−Va I −p
NAおよびMeOSuc−Ala−Ala−Pro−V
al−pNA (HLE)およびMeOSuc−Ala
−Ala−Pro−Met−pNA (HCG)は、ベ
ケム、フェインケミカリエン社(B a c hem、
Feinchemikalien AGスイス国プー
ベントルフCH−4416、ハウプストラッセ 144
)から入手し、D−Pro−Phe−Arg−pNAX
2HcI=s−2302(血漿カリクレイ7) 、D−
Val−LeuArg−pNAX2HcI=s−226
0(泰官カリクレイン)およびPy r−G I y−
A rg −pNAX2HCI=S−2444()リプ
シン)はトイチエψカビ社(DeuLshe Kab
iGmbH、ミュンヘン80レーフエリングストラツセ
19.D−8000)から購入した。
NAおよびMeOSuc−Ala−Ala−Pro−V
al−pNA (HLE)およびMeOSuc−Ala
−Ala−Pro−Met−pNA (HCG)は、ベ
ケム、フェインケミカリエン社(B a c hem、
Feinchemikalien AGスイス国プー
ベントルフCH−4416、ハウプストラッセ 144
)から入手し、D−Pro−Phe−Arg−pNAX
2HcI=s−2302(血漿カリクレイ7) 、D−
Val−LeuArg−pNAX2HcI=s−226
0(泰官カリクレイン)およびPy r−G I y−
A rg −pNAX2HCI=S−2444()リプ
シン)はトイチエψカビ社(DeuLshe Kab
iGmbH、ミュンヘン80レーフエリングストラツセ
19.D−8000)から購入した。
3、抗アプロチニン抗体
抗アプロチニン抗体を、A、エベン(Eben)および
E、ツラシェイト(TruscheiL)に記載される
ようにして4ウサギにおいて産生じそして血清から分離
し[8照、G、L、ヘイ/ヘーランド(Haberla
nd):合成および天然プオイテナーゼ阻害剤:基本的
および臨床画面の国際シンポジウム、東京、1967年
117’320日、日本医学学会誌、1967年、47
−55]そしてさらに精製するため、抗体をセファロス
・(Sepharose)4B−CI上に固定化された
アプロチニンを充填したカラムのクロマトグラフィーに
かけた。このために、カラムを塩類リン酸用緩衝液で洗
浄し、次いで200m1の0.2モルのシアン酸カリウ
ムで洗浄し、そして200m1の塩類リン酸用緩衝液で
+Ifび洗?’71 した、脱r1を0.2モルのグリ
シン−塩酩緩衝液、pH2,4で実施した。抗体を含有
する分画を飽和トリス溶液で直ちに中和し、そして50
体積の0.1モルの重炭酸ナトリウム溶液に対して4℃
において1夜透析した。
E、ツラシェイト(TruscheiL)に記載される
ようにして4ウサギにおいて産生じそして血清から分離
し[8照、G、L、ヘイ/ヘーランド(Haberla
nd):合成および天然プオイテナーゼ阻害剤:基本的
および臨床画面の国際シンポジウム、東京、1967年
117’320日、日本医学学会誌、1967年、47
−55]そしてさらに精製するため、抗体をセファロス
・(Sepharose)4B−CI上に固定化された
アプロチニンを充填したカラムのクロマトグラフィーに
かけた。このために、カラムを塩類リン酸用緩衝液で洗
浄し、次いで200m1の0.2モルのシアン酸カリウ
ムで洗浄し、そして200m1の塩類リン酸用緩衝液で
+Ifび洗?’71 した、脱r1を0.2モルのグリ
シン−塩酩緩衝液、pH2,4で実施した。抗体を含有
する分画を飽和トリス溶液で直ちに中和し、そして50
体積の0.1モルの重炭酸ナトリウム溶液に対して4℃
において1夜透析した。
方υ、
4、 セファ0−スCl−4BI−のウサギ抗アプロチ
ニン抗体の固定化 200gのセファロース4BをJ、コーン(Khon)
およびM、ウィルチ1 ”/り(Witchek)、ア
ブアライド・/<イオケミストリー・アンド・バイオテ
クノロジー(Appl、 Bi。
ニン抗体の固定化 200gのセファロース4BをJ、コーン(Khon)
およびM、ウィルチ1 ”/り(Witchek)、ア
ブアライド・/<イオケミストリー・アンド・バイオテ
クノロジー(Appl、 Bi。
chem、 Biotechnol、)、9.285
、(1984)の「、順に従い活性化し、次いで2gの
抗アプロチニン抗体と反応させた。
、(1984)の「、順に従い活性化し、次いで2gの
抗アプロチニン抗体と反応させた。
5、HPLC
調製様および分析用のHPLCを適当なカラムで、個々
の実施例に記載するように実施した。
の実施例に記載するように実施した。
6、アミノ酸配列の決定
本発明によるプロテイナーゼill書割のアミノ酸配列
を決定するために、0.5〜2ナノモルの材#1をポリ
ブレン(Polybrenの)で予備処置したガラス繊
維のフィルター−にに適用し、そして配列の分析を気相
蛋白質配列決定装置(アプライド・パインシステムス
470)で実施シた。
を決定するために、0.5〜2ナノモルの材#1をポリ
ブレン(Polybrenの)で予備処置したガラス繊
維のフィルター−にに適用し、そして配列の分析を気相
蛋白質配列決定装置(アプライド・パインシステムス
470)で実施シた。
各サイクルにおいて解放されたアミノ酸フェニルチオヒ
ダントインを、ペイレウサ−(Beyreuther)
の方υ、[K、ペイレウサ−(Beyreuther)
、B、ビースラー(B i e s 1er)、J、ポ
ウベンス(Bovens)、R。
ダントインを、ペイレウサ−(Beyreuther)
の方υ、[K、ペイレウサ−(Beyreuther)
、B、ビースラー(B i e s 1er)、J、ポ
ウベンス(Bovens)、R。
シルトo 7プ(Di Idrop)、に、ネイ77−
(Neifer)、に、スチュt’ (S t ub
er)、S、ザイス(Za i s)、R,ニーリング
(Ehring)およびP、ザーベル(Zabel):
i白質化学における現代の方法(M。
(Neifer)、に、スチュt’ (S t ub
er)、S、ザイス(Za i s)、R,ニーリング
(Ehring)およびP、ザーベル(Zabel):
i白質化学における現代の方法(M。
dern Methods in Protei
n Chemi sL ry)、303−325 (
1983)、ウォルター・デ・グルイタ−(Walte
r de Gruyter)、ベルリン]に従って
インクラティックエリューションによるゾルパックス(
Zo rbax)CNカラム(7)HPLCにより同定
しかつ定j、タシた。
n Chemi sL ry)、303−325 (
1983)、ウォルター・デ・グルイタ−(Walte
r de Gruyter)、ベルリン]に従って
インクラティックエリューションによるゾルパックス(
Zo rbax)CNカラム(7)HPLCにより同定
しかつ定j、タシた。
7、 定+、+的アミノ酸組成の決定
各場合において、1ナノモルの阻害剤を、J。
■、ポッッ(Pot t s)J r、、アナリティカ
ル11/<イオケミストリ−(Anal、 Bioc
hem、)、131.1−15、(1969)に従い、
密閉しく才気したパイレックス管内で、0゜05%のメ
ルカプトエタノールを含有する200p1の−・定廓点
の塩酸110℃に22時間とともに加熱した。蒸発残留
物を150g1の0.2モルのクエン酸ナトリウム緩衝
液 pH2,2中に取り、そして不溶性部分をろ過によ
り除去した。
ル11/<イオケミストリ−(Anal、 Bioc
hem、)、131.1−15、(1969)に従い、
密閉しく才気したパイレックス管内で、0゜05%のメ
ルカプトエタノールを含有する200p1の−・定廓点
の塩酸110℃に22時間とともに加熱した。蒸発残留
物を150g1の0.2モルのクエン酸ナトリウム緩衝
液 pH2,2中に取り、そして不溶性部分をろ過によ
り除去した。
加水分解物中に存在するアミノ酸を、蛍光検出塁および
シマズCR2AC分析器を装備したビオトロニツタ(B
iot ronic)LC5000アミノ酩分析装置に
おいて分離した。定?、)はJ 、R,ベンゾン(B
e n z o n)およびP。
シマズCR2AC分析器を装備したビオトロニツタ(B
iot ronic)LC5000アミノ酩分析装置に
おいて分離した。定?、)はJ 、R,ベンゾン(B
e n z o n)およびP。
E、ヘアー(Hare)、プロシーデインゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ(Pro
c、 Nat I 、 Acad、 Sci、)
、72.619−622.(1975)中に記載される
ように、O−フタル酸ジアルデヒドで誘導体化した後、
実施した0未発IIによろいくつかの阻害剤の定1′−
に的アミノ酸組成を表3に示す。
ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ(Pro
c、 Nat I 、 Acad、 Sci、)
、72.619−622.(1975)中に記載される
ように、O−フタル酸ジアルデヒドで誘導体化した後、
実施した0未発IIによろいくつかの阻害剤の定1′−
に的アミノ酸組成を表3に示す。
8、 ポリアクリルアミドゲルの電気泳動SDSゲル
電匁電動泳動ラエムリ(Laemli)の方法[U 、
K 、ラエ1、す(Laemli)、ネイチャー (
Nat u re) 、277.680、 (197
0)]に従い実施した。蛋白質のバンドを、J、L、ス
テ77/ (StephanO)およびり、ロジャスカ
リシア(RojasGalicia)、アナリティ力ル
・バイオケミストリー(Anal、 Biochem
、)、152、 (1986)に記載されるようにし
て着色した。
電匁電動泳動ラエムリ(Laemli)の方法[U 、
K 、ラエ1、す(Laemli)、ネイチャー (
Nat u re) 、277.680、 (197
0)]に従い実施した。蛋白質のバンドを、J、L、ス
テ77/ (StephanO)およびり、ロジャスカ
リシア(RojasGalicia)、アナリティ力ル
・バイオケミストリー(Anal、 Biochem
、)、152、 (1986)に記載されるようにし
て着色した。
9、 衰化シアン!/1断後の不活性な阻害剤の復元
臭化シアン切断後の不活性な阻害剤の復元は、クレイト
ン(Creighton)がアプロチニンについて最初
に記載した方法[T 、 E 、クレイ)7 (Cre
ighL on)、分子および細胞生物学に関するU
CLAシンポジウム(UCLASymposia o
n Mo1ecularand Ce1lular
Biology)、39.249−247、 (1
986)、D、L。
ン(Creighton)がアプロチニンについて最初
に記載した方法[T 、 E 、クレイ)7 (Cre
ighL on)、分子および細胞生物学に関するU
CLAシンポジウム(UCLASymposia o
n Mo1ecularand Ce1lular
Biology)、39.249−247、 (1
986)、D、L。
オキセンダー(Oxender)編、A、R,リス(L
iss)インコーボジーテット、ニューヨー−りJに従
い、わずかの変更を加えた尿ぶ勾配を使用するイオン交
換体で実施した。請確な条件は個々の実施例に記載ぎれ
ている。
iss)インコーボジーテット、ニューヨー−りJに従
い、わずかの変更を加えた尿ぶ勾配を使用するイオン交
換体で実施した。請確な条件は個々の実施例に記載ぎれ
ている。
酵素の試験
10、 阻害剤を正しく処理して、あるいは可溶性ミニ
融合蛋白質として含有する微 生物試料中の阻害剤含ら1の決定 発酵グロスの試t1を1次のようにして、遠心により透
IJJにし、そして上澄みおよび細胞の中の阻害剤活性
を決定した: a)培養ろ液 LOpLlのツイーン80の5%水溶液および40μl
の過塩素酸70%を、1mlの培養ろ液に、よく攪拌し
ながら添加した。この混合物を室温に30分間保持し、
そして形成した沈殿を遠心により分離した。透明な上澄
みを180JL+の飽和トリス溶液の添加によって中和
した。
融合蛋白質として含有する微 生物試料中の阻害剤含ら1の決定 発酵グロスの試t1を1次のようにして、遠心により透
IJJにし、そして上澄みおよび細胞の中の阻害剤活性
を決定した: a)培養ろ液 LOpLlのツイーン80の5%水溶液および40μl
の過塩素酸70%を、1mlの培養ろ液に、よく攪拌し
ながら添加した。この混合物を室温に30分間保持し、
そして形成した沈殿を遠心により分離した。透明な上澄
みを180JL+の飽和トリス溶液の添加によって中和
した。
8μIの新しく調製したヒト白血球エラスターゼ(0,
05モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5、5−エチレン
グリコール(1: l)の1mlにつき1mgの酵素を
含有する溶液を試験緩衝液でl Q O(:’、に希釈
して(I)られた)および、濃度の系列で、所9!の中
和した懸′/cJ液を、0.05%のアジ化ナトリウム
および0.1%のライ−780を含有する0、2モルの
トリス−J′!!酸緩衝液pH8,0の420JLlの
添加した0次いで、6試t1の体積を試験緩衝液で55
0pL1にし、100%の試料は試験緩衝液のみを含有
した。室温で30分間インキュベーションした後、6.
5Bl(7)0.1モルのMess u c−A I
a−A I a−Pro−Val−pNAの溶液を添加
し、モしてPニトロアニリンの酵素の解放により生ずる
405nmにおける吸光の増加を決定した。阻害%は次
の等式から計算する: 阻害剤を添加しないOD 阻害剤含j1艷の定1.:的決定は1組換えVal−1
5−Glu−52−アプロチニンを使用して得られた計
算曲線を使用して実施した。
05モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5、5−エチレン
グリコール(1: l)の1mlにつき1mgの酵素を
含有する溶液を試験緩衝液でl Q O(:’、に希釈
して(I)られた)および、濃度の系列で、所9!の中
和した懸′/cJ液を、0.05%のアジ化ナトリウム
および0.1%のライ−780を含有する0、2モルの
トリス−J′!!酸緩衝液pH8,0の420JLlの
添加した0次いで、6試t1の体積を試験緩衝液で55
0pL1にし、100%の試料は試験緩衝液のみを含有
した。室温で30分間インキュベーションした後、6.
5Bl(7)0.1モルのMess u c−A I
a−A I a−Pro−Val−pNAの溶液を添加
し、モしてPニトロアニリンの酵素の解放により生ずる
405nmにおける吸光の増加を決定した。阻害%は次
の等式から計算する: 阻害剤を添加しないOD 阻害剤含j1艷の定1.:的決定は1組換えVal−1
5−Glu−52−アプロチニンを使用して得られた計
算曲線を使用して実施した。
b)細胞
培養ブロスの遠心で得られた細胞を、もとの体積の1/
10050ミリモルのトリス−MCI緩衝液 pH7,
5(これは0.05%のツイーン80を含有する)中に
懸濁した。
10050ミリモルのトリス−MCI緩衝液 pH7,
5(これは0.05%のツイーン80を含有する)中に
懸濁した。
細胞は超a波装置[ブランソン・ソニファイア−(Br
anson 5onifier)、−+=ニル−デイ
スラブターCell Disrupt。
anson 5onifier)、−+=ニル−デイ
スラブターCell Disrupt。
r)B15]を使用しTE”Cにおいて破壊した(40
0ワツト、試料体積の1mlにつき1分の超音波処理)
、内因性阻害剤を前述の方法において過塩素酸で沈殿さ
せた後、阻害剤含量を同様に決定した。
0ワツト、試料体積の1mlにつき1分の超音波処理)
、内因性阻害剤を前述の方法において過塩素酸で沈殿さ
せた後、阻害剤含量を同様に決定した。
11、 阻害剤の阻害特異性の決定
酵素力テプシンG、白血球エラスターゼ、器官(尿)カ
リクレイン、血漿カリクレインおよびトリプシンについ
ての阻害活性について、純粋な物質を試験する条件を、
表4に要約する。酵素の活性および酵素の阻害の決定は
。
リクレイン、血漿カリクレインおよびトリプシンについ
ての阻害活性について、純粋な物質を試験する条件を、
表4に要約する。酵素の活性および酵素の阻害の決定は
。
それ自体既知のf
順で実施した(参照。
表4中の文献)。
実施例
実施例I
Val−15−ヒトアプロチニン
a) Val−15−ヒトアプロチニンの構造遺伝子
の構成(ベクターpIU 16゜4、C Val−15−ヒトアプロチニン変異型の遺伝子−を構
成するため、対応するC1.β1、γ1およびδ電遺伝
−f・ブロックの相補的−末鎖断片の1ナノモルを、2
00.1の部分のポリヌクレオチドキナーゼの反応Wt
衝液中に溶解し、そしてポリヌクレオチドキナーゼでA
TPの存在下にリン酸化した[T−−y=7ナス(Ma
n i at i s)ら、分子クローニング(Mol
ecular Cloning)、コールド−スプリ
ング・バー八−(1982)]、DNAをエタノールで
沈殿させ、そして各場合200g1のTE[析液(10
ミリモルのトリスXHCl衝液、0.1ミリモルのED
TA pH7,5)中の1ナノモルの量でHlj 懸
濁した。相補的DNAオリゴヌクレオチドを一緒にし、
そして、ハイブリダイゼーションのため、400弘1の
TE#衝液中で95℃に5分間加熱し、そして水浴中で
30℃にゆっくり冷却した。結合のため、各場合におい
て、500ピロモルノハイブリダイゼーションした遺伝
子ブロックα1/β電およびγI/δ1を使用し、そし
て結合したα1+β1およびγ1+δ1を引続いて制限
酵素EcoRIおよびst yIで、あるいは5tyl
およびBamHIで切断した。このようにしてP産生さ
れた遺伝子セグメントを2%の7ガロースゲル中のW製
用電気泳動後分離し、そして互いに結合した0次いで、
結合したDNAを制限酵素EcoRIおよびBamHI
で切断し、200bpのVat−15−ヒトアプロチニ
ン遺伝子を調製用゛112気泳動により2%の7ガロー
スゲル中で精製し、次いでゲルから分離した。
の構成(ベクターpIU 16゜4、C Val−15−ヒトアプロチニン変異型の遺伝子−を構
成するため、対応するC1.β1、γ1およびδ電遺伝
−f・ブロックの相補的−末鎖断片の1ナノモルを、2
00.1の部分のポリヌクレオチドキナーゼの反応Wt
衝液中に溶解し、そしてポリヌクレオチドキナーゼでA
TPの存在下にリン酸化した[T−−y=7ナス(Ma
n i at i s)ら、分子クローニング(Mol
ecular Cloning)、コールド−スプリ
ング・バー八−(1982)]、DNAをエタノールで
沈殿させ、そして各場合200g1のTE[析液(10
ミリモルのトリスXHCl衝液、0.1ミリモルのED
TA pH7,5)中の1ナノモルの量でHlj 懸
濁した。相補的DNAオリゴヌクレオチドを一緒にし、
そして、ハイブリダイゼーションのため、400弘1の
TE#衝液中で95℃に5分間加熱し、そして水浴中で
30℃にゆっくり冷却した。結合のため、各場合におい
て、500ピロモルノハイブリダイゼーションした遺伝
子ブロックα1/β電およびγI/δ1を使用し、そし
て結合したα1+β1およびγ1+δ1を引続いて制限
酵素EcoRIおよびst yIで、あるいは5tyl
およびBamHIで切断した。このようにしてP産生さ
れた遺伝子セグメントを2%の7ガロースゲル中のW製
用電気泳動後分離し、そして互いに結合した0次いで、
結合したDNAを制限酵素EcoRIおよびBamHI
で切断し、200bpのVat−15−ヒトアプロチニ
ン遺伝子を調製用゛112気泳動により2%の7ガロー
スゲル中で精製し、次いでゲルから分離した。
合成Val−15−ヒトアプロチニン遺伝子をプラスミ
ドベクターpUC8とクローニングした[J、ビエイラ
(Vieira)およびJ、スプリング(Me s s
i ng) 、遺伝子(Gene)、19.259.
(1982)]、このために、10p−gO’)pUc
B−DNAをEcoRIおよびBamHIで切断し、そ
してDNAをアルカリ性ホスファターゼ(仔ウシ)で脱
リン酸化した。欠失したpUC8−DNAを調製用ゲル
電気泳動により精製し、そして分離した。このようにし
て111られた0 、4JLg(7)pUC8−DNA
および0.1pgのVal−15−ヒトアプロチニンD
NAを、2単位のT4リガーゼとともに50p1の結合
緩衝液中で1夜インキユベーシヨンした。E、 co
li RRIΔM15をこのようにしてM]換えたD
NAで形質転換した。形質転換体のS 択は、l OO
p−g / m Iのアンピシリンを含むLB乎板上で
実施した。
ドベクターpUC8とクローニングした[J、ビエイラ
(Vieira)およびJ、スプリング(Me s s
i ng) 、遺伝子(Gene)、19.259.
(1982)]、このために、10p−gO’)pUc
B−DNAをEcoRIおよびBamHIで切断し、そ
してDNAをアルカリ性ホスファターゼ(仔ウシ)で脱
リン酸化した。欠失したpUC8−DNAを調製用ゲル
電気泳動により精製し、そして分離した。このようにし
て111られた0 、4JLg(7)pUC8−DNA
および0.1pgのVal−15−ヒトアプロチニンD
NAを、2単位のT4リガーゼとともに50p1の結合
緩衝液中で1夜インキユベーシヨンした。E、 co
li RRIΔM15をこのようにしてM]換えたD
NAで形質転換した。形質転換体のS 択は、l OO
p−g / m Iのアンピシリンを含むLB乎板上で
実施した。
100コロニーのプラスミド−DNAを、HlC,バー
ンポイム(Birnboim)およびJ、ドリー(Do
ly)、核酸の研究(Nucl、 Ac1ds R
es、)、7.1513゜(1979)の方υ:に従っ
て分離し、そして制限酵素EcoRIおよびBamHI
で分析した。3つのプラスミドクローンは、大きさが合
成Val15−ヒトアプロチニンに相当するDNA断片
を組込んでいた。3つのクローニングしたVal−15
−ヒトアプロチニン遺伝子の正しい配列は、配列決定で
確証された。プラスミドのクローンpIU 16.4
.C(第4[j)を、それ以1:の構成のために使用し
た。
ンポイム(Birnboim)およびJ、ドリー(Do
ly)、核酸の研究(Nucl、 Ac1ds R
es、)、7.1513゜(1979)の方υ:に従っ
て分離し、そして制限酵素EcoRIおよびBamHI
で分析した。3つのプラスミドクローンは、大きさが合
成Val15−ヒトアプロチニンに相当するDNA断片
を組込んでいた。3つのクローニングしたVal−15
−ヒトアプロチニン遺伝子の正しい配列は、配列決定で
確証された。プラスミドのクローンpIU 16.4
.C(第4[j)を、それ以1:の構成のために使用し
た。
b) α−アミラーゼの分泌ベクターpCH237およ
びpCH286のW成 同様なベクターの構成は、1986年12112211
の英国特許出願8,700,204号に記載されている
。B、5ubtilis(7)a−アミラーゼシグナル
配列は、DSM 704(ドイツ国微生物収集所、G
i5ttingen)がら、pMK 3によるBamH
I部位中の染色体DNAの部分的Sau 3Aの制限
バッチをクローニングすることによって得た[M、A、
サリバン(Sullivan)ら、遺伝子(Gene)
、29゜21−26.(1984)]、アミラーゼ遺伝
子をもつ挿入された3kbのDNA断片をもつクロ−ン
の1つを、α−アミラーゼ構造遺伝子中の欠失により修
飾し、そしてpALK 1 [M、A。
びpCH286のW成 同様なベクターの構成は、1986年12112211
の英国特許出願8,700,204号に記載されている
。B、5ubtilis(7)a−アミラーゼシグナル
配列は、DSM 704(ドイツ国微生物収集所、G
i5ttingen)がら、pMK 3によるBamH
I部位中の染色体DNAの部分的Sau 3Aの制限
バッチをクローニングすることによって得た[M、A、
サリバン(Sullivan)ら、遺伝子(Gene)
、29゜21−26.(1984)]、アミラーゼ遺伝
子をもつ挿入された3kbのDNA断片をもつクロ−ン
の1つを、α−アミラーゼ構造遺伝子中の欠失により修
飾し、そしてpALK 1 [M、A。
コ〜トネイ(courtneyly士、ロチニスター大
学、微生物学部、米国、からの個人的通信]に導いた。
学、微生物学部、米国、からの個人的通信]に導いた。
pALK 1c7)230bp(7)EcoRI−B
sLEII断片のDNAの配列決定は、’Ir1bなリ
ポソーム結合部位(RBS)およびB、5ubtili
s lA289のα−アミラーゼに対する人相同性を
もつシグナル配列を示した[参照、第6図のDNA配列
およびM、ヤング(Y a n g)ら、核酸の研究(
Nucl、 Ac1ds Res、)、11.23
7−249、(1983)]、E、 colirlの
α−アミラーゼシグナル配列の処理はアミノ酸残基りで
起こる[W、ブラソフ(Bruns)、未公表の結果1
ので、NheI制限部位はアラニンJ、%31に・9人
された。この]1的で、RBSおよびα−アミラーゼシ
グナル配列の大部分をもつ180bpのEcoRI−H
aeIII断片(第6図中の断月)をpALK 1
[M、A 、 コートネイ(C。
sLEII断片のDNAの配列決定は、’Ir1bなリ
ポソーム結合部位(RBS)およびB、5ubtili
s lA289のα−アミラーゼに対する人相同性を
もつシグナル配列を示した[参照、第6図のDNA配列
およびM、ヤング(Y a n g)ら、核酸の研究(
Nucl、 Ac1ds Res、)、11.23
7−249、(1983)]、E、 colirlの
α−アミラーゼシグナル配列の処理はアミノ酸残基りで
起こる[W、ブラソフ(Bruns)、未公表の結果1
ので、NheI制限部位はアラニンJ、%31に・9人
された。この]1的で、RBSおよびα−アミラーゼシ
グナル配列の大部分をもつ180bpのEcoRI−H
aeIII断片(第6図中の断月)をpALK 1
[M、A 、 コートネイ(C。
urtney)博士、ロチニスター大学、微生物学部、
米国、から得た]から分離した。断片B(アラニン31
]二のNheI1位を産生ずる合成リンカ−)を、p
BR322中でEcoRIおよびNheIの間で断片A
と結合した(PWB 226)、pWB 22Bを
B a m HIで切断し、そして、dNTPとの反応
を充填した後、HindIIIリンカ−(バイオラプス
1002)をこのベクター中に結合し、そしてpWB
2024をこれによって産生した。
米国、から得た]から分離した。断片B(アラニン31
]二のNheI1位を産生ずる合成リンカ−)を、p
BR322中でEcoRIおよびNheIの間で断片A
と結合した(PWB 226)、pWB 22Bを
B a m HIで切断し、そして、dNTPとの反応
を充填した後、HindIIIリンカ−(バイオラプス
1002)をこのベクター中に結合し、そしてpWB
2024をこれによって産生した。
分泌ベクターpCH237は、α−アミラーゼシグナル
配列をIacZプロモーターの制御下にすることによっ
て構成した(第7図)、この構成において、1acZ’
はTAA停止コドンにおいて停止する(α−アミラーゼ
のDNA配列の位置−587−56、第6図)。
配列をIacZプロモーターの制御下にすることによっ
て構成した(第7図)、この構成において、1acZ’
はTAA停止コドンにおいて停止する(α−アミラーゼ
のDNA配列の位置−587−56、第6図)。
次いで、蛋白質合成を1位置−10における1acZ
’の停止トコトンの背後の約50塩基における。α−ア
ミラーゼの可能なRBSにおいて再開する。
’の停止トコトンの背後の約50塩基における。α−ア
ミラーゼの可能なRBSにおいて再開する。
c) Val−15−ヒトアプロチニンをエンコード
する分泌ベクターpCH237 中の配夕曜のクローニング E、 colf中に分泌ベクターpCH237をクロ
ーニングするために、Val−15−ヒトアプロチニン
の遺伝子配列(第4図)を、pUC8(EcoRIとH
i n d I I Iとの間)においてEcoRr−
Hi ndl I I断片としてサブクローニングした
(pWB 2861)、Val−15−ヒトアプロチ
ニンのための遺伝子を含有するpwn 2861(第
8図)をEcoRIで!/J断し、モしてdMPとの反
応を充填した後、Xbaリンカ−(パイロラプス 10
10)を制限部位において結合し、これによってpWB
2862を産生した6次いで、pWB 2862
をX b a IおよびX h o Iで切断し、そし
てベクターを分離し、そして合成リンカ−配列WB 1
4および15と結合し、XbaI部位をアプロチニンの
Arglのためのコドントに産生じた(pW82863
、第8図)。
する分泌ベクターpCH237 中の配夕曜のクローニング E、 colf中に分泌ベクターpCH237をクロ
ーニングするために、Val−15−ヒトアプロチニン
の遺伝子配列(第4図)を、pUC8(EcoRIとH
i n d I I Iとの間)においてEcoRr−
Hi ndl I I断片としてサブクローニングした
(pWB 2861)、Val−15−ヒトアプロチ
ニンのための遺伝子を含有するpwn 2861(第
8図)をEcoRIで!/J断し、モしてdMPとの反
応を充填した後、Xbaリンカ−(パイロラプス 10
10)を制限部位において結合し、これによってpWB
2862を産生した6次いで、pWB 2862
をX b a IおよびX h o Iで切断し、そし
てベクターを分離し、そして合成リンカ−配列WB 1
4および15と結合し、XbaI部位をアプロチニンの
Arglのためのコドントに産生じた(pW82863
、第8図)。
Val−15−ヒトアプロチニンの発現のため、遺伝子
配列おXbaI=HindlII断片としてPWB
2863から分離し、α−アミラーゼシグナル配列の後
にpCH237中に組込み(NheIおよびHi nd
I I Iで切断する)、これにより発現ベクターpC
H286が構成される(第9図)。
配列おXbaI=HindlII断片としてPWB
2863から分離し、α−アミラーゼシグナル配列の後
にpCH237中に組込み(NheIおよびHi nd
I I Iで切断する)、これにより発現ベクターpC
H286が構成される(第9図)。
d) pCH286で形質転換したE、 col
f RR1ΔM15(7)発酵および誘発 pCH286で形質転換したRRIΔM15を、1夜の
培養物として、4%のMES p H6,0および
50用g / m Iのアンピシリン(MES=モルホ
リノエタンスルホン酸)を含む蒸留水中の3%のビーフ
エキス(ギブコ)、1.5%の酵rHエキス(ギブコ)
および0.5%のKH2PO4中で発酵した0通気を良
好にするため、最大100m1の培地を1.000m1
のコニカルフラスコ中で使用し、そしてクーナー(K
h n er)振盪装71(RC−6−U)上で28℃
および190rpmで振盪した。1夜の培養物を新鮮な
培地でl:looに希釈し、そして28℃または37℃
で約20時間続lのOD55(Inmに発酵した0次い
で、lacプロモーターを1ミリモルのイソプロピルチ
オガラクトシダーゼ(シグマ)の添加によって誘発させ
た1発酵を約20時間続け、次いで細l抱を8.00O
rpmの遠心によって収穫した[ローターA 6.1
4をもつコントロンΦセントリコン(Contron
CneL rikon)H−40中で4℃においテI
O分間]。
f RR1ΔM15(7)発酵および誘発 pCH286で形質転換したRRIΔM15を、1夜の
培養物として、4%のMES p H6,0および
50用g / m Iのアンピシリン(MES=モルホ
リノエタンスルホン酸)を含む蒸留水中の3%のビーフ
エキス(ギブコ)、1.5%の酵rHエキス(ギブコ)
および0.5%のKH2PO4中で発酵した0通気を良
好にするため、最大100m1の培地を1.000m1
のコニカルフラスコ中で使用し、そしてクーナー(K
h n er)振盪装71(RC−6−U)上で28℃
および190rpmで振盪した。1夜の培養物を新鮮な
培地でl:looに希釈し、そして28℃または37℃
で約20時間続lのOD55(Inmに発酵した0次い
で、lacプロモーターを1ミリモルのイソプロピルチ
オガラクトシダーゼ(シグマ)の添加によって誘発させ
た1発酵を約20時間続け、次いで細l抱を8.00O
rpmの遠心によって収穫した[ローターA 6.1
4をもつコントロンΦセントリコン(Contron
CneL rikon)H−40中で4℃においテI
O分間]。
細胞を10体積の0.05モルのトリス緩衝液pH7,
5中に懸濁させた。この懸濁液をフレンチプレスに18
,0OOPSIにおいて21i通過させて、細胞を破壊
した。細胞の破片を遠心(30分間、8,000g)に
より除去し、そして遠心物を培養ろ液と一緒にした。
5中に懸濁させた。この懸濁液をフレンチプレスに18
,0OOPSIにおいて21i通過させて、細胞を破壊
した。細胞の破片を遠心(30分間、8,000g)に
より除去し、そして遠心物を培養ろ液と一緒にした。
e) Val−15−ヒトアプロチニンの分離350
m1の70%の過11!素酸を、10リツトルの培養ろ
液および細胞リゼイト上清(株:RR1ΔM15/pC
H286)懸濁液の混合物中に室温においてゆっくり攪
拌しながら入れた。20分間静こした後、形成した沈殿
を遠心(20分間、8.00Orpm、4℃)により分
離した。
m1の70%の過11!素酸を、10リツトルの培養ろ
液および細胞リゼイト上清(株:RR1ΔM15/pC
H286)懸濁液の混合物中に室温においてゆっくり攪
拌しながら入れた。20分間静こした後、形成した沈殿
を遠心(20分間、8.00Orpm、4℃)により分
離した。
次いで、上澄みを8Nの水酸化カリウムで巾IζIした
。この混合物を4℃で1夜放置した後、沈殿した塩化カ
リウムをろ過により除去した。
。この混合物を4℃で1夜放置した後、沈殿した塩化カ
リウムをろ過により除去した。
ろ液をカラム[20X2.5cm、0.02モルのHE
PES緩衝液pH6,5(HEPES=4−(2−ヒド
ロキシエチル)−1−ピペラジン−エタン−スルホン酸
)と平衡化し、そしてS−セファ0−ス、ファスト・フ
ロー(Fast Flow)を充填しである]のクロ
マトグラフィーにかけた。適用後、カラムを250m1
の平衡化緩衝液で溶離し、最後に500m1の平衡化緩
衝液および500m1の塩化ナトリウム中の0.3モル
の平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。
PES緩衝液pH6,5(HEPES=4−(2−ヒド
ロキシエチル)−1−ピペラジン−エタン−スルホン酸
)と平衡化し、そしてS−セファ0−ス、ファスト・フ
ロー(Fast Flow)を充填しである]のクロ
マトグラフィーにかけた。適用後、カラムを250m1
の平衡化緩衝液で溶離し、最後に500m1の平衡化緩
衝液および500m1の塩化ナトリウム中の0.3モル
の平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。
0.13モル〜0.17モルのNaClで溶離された分
画は、エラスターゼ阻害活性を含有し、プールしそして
真空Ie縮して20〜30 m lの体積にした。
画は、エラスターゼ阻害活性を含有し、プールしそして
真空Ie縮して20〜30 m lの体積にした。
それ以りの精製のため、e縮物をハイボア(HiPor
e@)逆相カラムRP−318(250X4.6mm)
(バイオ−ラド、ミュンヘン、カタログNo、125−
0551)のHPLCによってクロマトグラフィーにか
けた。このため、HPLCカラムは、e縮物の適用およ
び水による洗rf1後、まず0.1%のトリフルオロ酢
酸(溶離剤A)で溶離し、10分後、溶離Aおよび0.
1%のトリプルオafd;酸(溶離剤B)の直線の勾配
で溶層した(勾配:0〜lOO%の溶離B、θ〜2時間
、流速1ml/分、検出215nm)。
e@)逆相カラムRP−318(250X4.6mm)
(バイオ−ラド、ミュンヘン、カタログNo、125−
0551)のHPLCによってクロマトグラフィーにか
けた。このため、HPLCカラムは、e縮物の適用およ
び水による洗rf1後、まず0.1%のトリフルオロ酢
酸(溶離剤A)で溶離し、10分後、溶離Aおよび0.
1%のトリプルオafd;酸(溶離剤B)の直線の勾配
で溶層した(勾配:0〜lOO%の溶離B、θ〜2時間
、流速1ml/分、検出215nm)。
エラスターゼ阻害活性をもつUV活性分画を一緒にし、
モしてアセトニトリルの一部を真空蒸発させた。このよ
うにして得られたe縮物の凍結乾仔は、3.8mgの無
色の物質を与え、これは分析用HPLC(モノSカラム
)によるとほとんど均質であった。この混合物を7ミノ
決定上澄み組成を第3図に示し、そしてその阻害スペク
トルを表1に記載する。アミノ酸分析は、この物質が約
78%の精確に処理されたVal−15−ヒトアプロチ
ニンから成り、そして約22%のAla−(−) −V
a I−15−ヒトアプロチニンを含有することを示し
た。
モしてアセトニトリルの一部を真空蒸発させた。このよ
うにして得られたe縮物の凍結乾仔は、3.8mgの無
色の物質を与え、これは分析用HPLC(モノSカラム
)によるとほとんど均質であった。この混合物を7ミノ
決定上澄み組成を第3図に示し、そしてその阻害スペク
トルを表1に記載する。アミノ酸分析は、この物質が約
78%の精確に処理されたVal−15−ヒトアプロチ
ニンから成り、そして約22%のAla−(−) −V
a I−15−ヒトアプロチニンを含有することを示し
た。
実施例2
Val−15−Leu−17−I Ie−18−ヒトア
プロチニ a) Val−15−Leu−17−I Ie−18
−Th r−52−tニドアプロチニンをエンコードす
るベクターPIU 24.4Cの構成 構造遺伝子の合成を、実施例1b)に記載するように、
ブロックα1、δ2.γ1およびδ1から実施した。
Vat−15−Leu−17−I 1e−18−Thr
−52−ヒトアプロチニンをエンコードする配列を、実
施例1b)に記載するように、pUCg中に組込んだ。
プロチニ a) Val−15−Leu−17−I Ie−18
−Th r−52−tニドアプロチニンをエンコードす
るベクターPIU 24.4Cの構成 構造遺伝子の合成を、実施例1b)に記載するように、
ブロックα1、δ2.γ1およびδ1から実施した。
Vat−15−Leu−17−I 1e−18−Thr
−52−ヒトアプロチニンをエンコードする配列を、実
施例1b)に記載するように、pUCg中に組込んだ。
b) α−アミラーゼ分泌ベクターpCH287の構成
α−アミラーゼ分泌ベクターpCH287を、α−アミ
ラーゼ分泌ベクターpCH286と同様に構成する。
ラーゼ分泌ベクターpCH286と同様に構成する。
c) Val−15−Leu−17−11e−18−
ヒトアプロチニンをエンコードする分泌ベクターpCH
287中の配列 のクローニング Val−15−Leu−17−I Ie−18ヒトアプ
ロチニンをエンコードする配列をもつ発現ベクターpC
H287を、pCH286について記載したのと同一の
方法をもちいて構成した。
ヒトアプロチニンをエンコードする分泌ベクターpCH
287中の配列 のクローニング Val−15−Leu−17−I Ie−18ヒトアプ
ロチニンをエンコードする配列をもつ発現ベクターpC
H287を、pCH286について記載したのと同一の
方法をもちいて構成した。
d) pCH287で形質転換したE、 coli
RRIΔM15c7)発酵および誘発 pCH287で形質転換したE、 coliRRIΔ
M15の発酵は、実施例1c)に記載するようにしてて
施した。培養ブロスを、そこに記載するように、遠心に
より清浄にし、そして細胞を同様に破壊した。最後に、
細胞リゼイトおよび培養ろ液を一緒にした。
RRIΔM15c7)発酵および誘発 pCH287で形質転換したE、 coliRRIΔ
M15の発酵は、実施例1c)に記載するようにしてて
施した。培養ブロスを、そこに記載するように、遠心に
より清浄にし、そして細胞を同様に破壊した。最後に、
細胞リゼイトおよび培養ろ液を一緒にした。
e) Val−15−Leu−17−I 1e−18
−ヒトアプロチニンの分離 350 m lの70%の過塩素酸を、実施例2d)か
らの−緒にした上澄み(約10リツトル)に、室温にお
いて攪拌しながら10分以内に添加した。この混合物を
20分間放置した後、形成した沈殿を遠心により分離し
た。遠心物を8N*酸化カリウム溶液で中和した。
−ヒトアプロチニンの分離 350 m lの70%の過塩素酸を、実施例2d)か
らの−緒にした上澄み(約10リツトル)に、室温にお
いて攪拌しながら10分以内に添加した。この混合物を
20分間放置した後、形成した沈殿を遠心により分離し
た。遠心物を8N*酸化カリウム溶液で中和した。
中和した溶液を4℃でカラム(10X2.5em、セフ
ァロース4B上に固定化した抗アプロチニン抗体を適用
しかつ0.1モルのリン酸ナトリウム緩衝液 PH7,
0,塩化ナトリウム中1モル、で前もって平衡化した)
を通してろ過した。
ァロース4B上に固定化した抗アプロチニン抗体を適用
しかつ0.1モルのリン酸ナトリウム緩衝液 PH7,
0,塩化ナトリウム中1モル、で前もって平衡化した)
を通してろ過した。
適用後、カラムを100m1の平衡化緩衝液で溶離し、
そしてアプロチニン誘導体を0.2モルのグリシン−塩
酸緩衝液pH2,4で脱着した。溶離液を飽和トリス溶
液で直ちに中和し、そして真空濃縮して約20m1の体
積にした(浴温度30℃)。
そしてアプロチニン誘導体を0.2モルのグリシン−塩
酸緩衝液pH2,4で脱着した。溶離液を飽和トリス溶
液で直ちに中和し、そして真空濃縮して約20m1の体
積にした(浴温度30℃)。
脱塩しかつ少量の蛋白質を除去するため、 PR318
HPLCを、実施例1e)に記載するようにして、濃縮
物を使用して実施した。阻害活性を右する溶離液をプー
ルし、そしてアセトニトリルを部分的に真空蒸留した。
HPLCを、実施例1e)に記載するようにして、濃縮
物を使用して実施した。阻害活性を右する溶離液をプー
ルし、そしてアセトニトリルを部分的に真空蒸留した。
凍結乾帰すると、3.2mgの無色の物質が残った。H
PLCによる分析に従うと、阻害剤は事実上均質であっ
た。
PLCによる分析に従うと、阻害剤は事実上均質であっ
た。
この物質の阻害スペクトルを表1に示し、そして定量的
アミノ酸分析の結果を表3に記載する。アミノ酸配列を
決定すると、追加のN−末端Ala残基を含有する他の
物質(約15%の量)が存在した。
アミノ酸分析の結果を表3に記載する。アミノ酸配列を
決定すると、追加のN−末端Ala残基を含有する他の
物質(約15%の量)が存在した。
分析用FPLC(溶奴A:0.02モルの酢酸ナトリウ
ム緩衝液pH5,2、溶媒B:0.02モルの酢酸ナト
リウム緩衝液pH5,2、塩化ナトリウム中0.3モル
)において、阻害剤ハ七ノSファーマシアカラムで均質
なピークとして0゜06〜0.08モルの塩化ナトリウ
ムにおいて溶離された。
ム緩衝液pH5,2、溶媒B:0.02モルの酢酸ナト
リウム緩衝液pH5,2、塩化ナトリウム中0.3モル
)において、阻害剤ハ七ノSファーマシアカラムで均質
なピークとして0゜06〜0.08モルの塩化ナトリウ
ムにおいて溶離された。
実施例3
Val−15−Leu−17−I 1e−18−Th
r−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ターpIU26.4G) 表2からのDNAブロックα盲、β2、γ1およびδ2
を、実施例1b)に記載するように、結合し、そしてベ
クターpUC8を組込んだ0組換えベクターをpIU2
6.4Cと表示した。
r−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ターpIU26.4G) 表2からのDNAブロックα盲、β2、γ1およびδ2
を、実施例1b)に記載するように、結合し、そしてベ
クターpUC8を組込んだ0組換えベクターをpIU2
6.4Cと表示した。
b) IacZ遺伝子およびVal−15−Leu
−17−I 1e−18−Thr−52−ヒトアプロチ
ニン遺伝子=発現ベクターpRK 151.1.8の
融合 C−末端をエンコードするI acZ遺伝子末端との遺
伝子の融合をその中で行なうプラスミドベクターpUR
278[U、ルサー(Ruher)およびB、ムラー−
ヒルK(Muller−Hi l la)、EMBOJ
、、2.1791(1983)]を、E、 col
iのガラクトーシダーゼとの融合蛋白質としてヒトアプ
ロチニンの上の変異型の発現のために選択した(I a
cZ遺伝子)、IacZ融合蛋白質の発現は、1acZ
プロモーターの制御下に起こる。
−17−I 1e−18−Thr−52−ヒトアプロチ
ニン遺伝子=発現ベクターpRK 151.1.8の
融合 C−末端をエンコードするI acZ遺伝子末端との遺
伝子の融合をその中で行なうプラスミドベクターpUR
278[U、ルサー(Ruher)およびB、ムラー−
ヒルK(Muller−Hi l la)、EMBOJ
、、2.1791(1983)]を、E、 col
iのガラクトーシダーゼとの融合蛋白質としてヒトアプ
ロチニンの上の変異型の発現のために選択した(I a
cZ遺伝子)、IacZ融合蛋白質の発現は、1acZ
プロモーターの制御下に起こる。
ヒトアプロチニン変異型の遺伝子は、pUR278の1
acZin伝子ノ?li−のBamHIとHindII
Iとの間の切断部位に挿入した。このために、5JI−
gのpUR278−DNAをBamHIおよびHind
IIIで切断し、そして大きいベクター断片を分離した
(第10図)。
acZin伝子ノ?li−のBamHIとHindII
Iとの間の切断部位に挿入した。このために、5JI−
gのpUR278−DNAをBamHIおよびHind
IIIで切断し、そして大きいベクター断片を分離した
(第10図)。
ベクターpIU26.4CのDNAの10#LgをEc
oRIで直線化した。突起するDNA末端に、dATP
およびdTTPの存在下に、DNAポリメラーゼのクレ
ノー断片を酵素的に充填した。充填したDNA末端を1
0倍過剰量のBamHIリンカ−()γ−マシア、デカ
マー)と結合し、そして修飾した遺伝子をクローニング
ベクターからHindIIIおよびBamHIで切出し
、そして、2%の7ガロースゲル中のゲル電気泳動後、
分離した。
oRIで直線化した。突起するDNA末端に、dATP
およびdTTPの存在下に、DNAポリメラーゼのクレ
ノー断片を酵素的に充填した。充填したDNA末端を1
0倍過剰量のBamHIリンカ−()γ−マシア、デカ
マー)と結合し、そして修飾した遺伝子をクローニング
ベクターからHindIIIおよびBamHIで切出し
、そして、2%の7ガロースゲル中のゲル電気泳動後、
分離した。
0.2ルgのベクター−DNA8よび0.1#gの修飾
したpIU26.4C−DNAを、20ルgの結合緩衝
液中で、2単位のT4リガーゼと1夜結合した。
したpIU26.4C−DNAを、20ルgの結合緩衝
液中で、2単位のT4リガーゼと1夜結合した。
E、 coliaRR1ΔM15の形質転換および組
換え発現ベクターの選択は、標準の方法に従って実施し
た。阻害剤とl acZ遺伝子とのリーディングフレー
ムの融合は、このようにして得られた発現ベクターpR
K 151.1.8におけるDNA配列決定によって
確証された。E。
換え発現ベクターの選択は、標準の方法に従って実施し
た。阻害剤とl acZ遺伝子とのリーディングフレー
ムの融合は、このようにして得られた発現ベクターpR
K 151.1.8におけるDNA配列決定によって
確証された。E。
coliaRR1ΔM15/pRK 151゜1.8
を発酵のために選択した。
を発酵のために選択した。
C) 発酵
プラスミドpRK 151.1.8で形質転換したE
、 coli株RRIΔM15の発酵は、37℃にお
いて、実施例1d)に記載した方法に類似する方法で、
振Q (280r pm) LながらLB−アンピシリ
ン栄養溶液中で実施した。
、 coli株RRIΔM15の発酵は、37℃にお
いて、実施例1d)に記載した方法に類似する方法で、
振Q (280r pm) LながらLB−アンピシリ
ン栄養溶液中で実施した。
d) Val−15−Leu−17−I 1e−18
−Th r−52−Lニドアプロチニンの分離 細胞は10リツトルの培養ブロス[株RRIΔM15/
pRK 151.1.8の発酵はIPTGで新しく?
A発した]遠心[15分、a 、 oo。
−Th r−52−Lニドアプロチニンの分離 細胞は10リツトルの培養ブロス[株RRIΔM15/
pRK 151.1.8の発酵はIPTGで新しく?
A発した]遠心[15分、a 、 oo。
rpm]によって分離した。沈殿物(23gの湿潤化+
1′L)を50 m lの0.05モルのトリス緩衝液
、0.1モルの塩化ナトリウム、0.01モルの塩化マ
グネシウムおよび0.01モルのメルカプトエタノール
pH7,0中に懸濁した。細胞をフレンチプレス(1
8,0OOPS1.2回の通過)中で破壊し、そしてリ
ゼイトを20 、000rpmで30分間遠心した。沈
殿物(18gの湿潤化が)を100m1の0.05モル
のトリス緩衝液pH7,7,2モルのグアニジニウム塩
酸t14.o、iモルの塩化ナトリウムおよび0.01
モルのメルカプトエタノール中に再=iし、そして懸濁
液を遠心により20.000gで20分間清浄にした。
1′L)を50 m lの0.05モルのトリス緩衝液
、0.1モルの塩化ナトリウム、0.01モルの塩化マ
グネシウムおよび0.01モルのメルカプトエタノール
pH7,0中に懸濁した。細胞をフレンチプレス(1
8,0OOPS1.2回の通過)中で破壊し、そしてリ
ゼイトを20 、000rpmで30分間遠心した。沈
殿物(18gの湿潤化が)を100m1の0.05モル
のトリス緩衝液pH7,7,2モルのグアニジニウム塩
酸t14.o、iモルの塩化ナトリウムおよび0.01
モルのメルカプトエタノール中に再=iし、そして懸濁
液を遠心により20.000gで20分間清浄にした。
沈殿物(15gの湿潤重量)を、50 m gのジチオ
スレイトールを含有する。50m1の0.05モルのト
リス緩衝液pH7,7,6モルのグアニジニウム塩酸塩
および0.1モルの塩化ナトリウムで抽出した。このた
めに、懸濁液を50℃に1時間攪拌しながら加熱した。
スレイトールを含有する。50m1の0.05モルのト
リス緩衝液pH7,7,6モルのグアニジニウム塩酸塩
および0.1モルの塩化ナトリウムで抽出した。このた
めに、懸濁液を50℃に1時間攪拌しながら加熱した。
懸濁液を遠心(10,000rpm、10分)により清
浄にした。遠心物を0.01モルのメルカプトエタノー
ルを含有するlOリットルの水に対して透析した。これ
により沈殿した融合形質生成物を遠心(20分、20,
000rpm)によって分離した。
浄にした。遠心物を0.01モルのメルカプトエタノー
ルを含有するlOリットルの水に対して透析した。これ
により沈殿した融合形質生成物を遠心(20分、20,
000rpm)によって分離した。
臭化シアンの切断
沈殿を30m1のギ酸中に窒素雰囲気中で溶解した。1
2.5mlの水、次いで4gの臭化シアンをこの溶液に
添加した。この反応混合物を、窒麦下に光を遮断しかつ
攪拌しながら、室温に保持した。溶液を真空濃縮し、残
留物を水中に溶解し、溶液を再び真空濃縮し、残留物を
最後に水中に溶解し、そして溶液を凍結乾燥した。1.
8gの無色の物質が残った。
2.5mlの水、次いで4gの臭化シアンをこの溶液に
添加した。この反応混合物を、窒麦下に光を遮断しかつ
攪拌しながら、室温に保持した。溶液を真空濃縮し、残
留物を水中に溶解し、溶液を再び真空濃縮し、残留物を
最後に水中に溶解し、そして溶液を凍結乾燥した。1.
8gの無色の物質が残った。
復元
600 m gの上の物質を300m1の0.02モル
の酢酸ナトリウム緩衝液pH5,2(尿素中&モルおよ
びメルカプトエタノール中0.01モル)(出発緩衝液
)中に懸濁した。36gの尿素および3mlの懸濁液を
50℃に1時間加熱した。それを遠心により清浄にし、
そして遠心物を25体桔の出発緩衝液に対して1夜透析
した。15m1のS−セファロース(ファスト・フロー
出9:、緩衝液で平衡化した)を保持物中に攪拌しなが
ら入れ、そして、30分後、このスラリーをカラム(1
,5X12cm、5mlの平衡化したSセファロース、
)γスト・フロー、全充填した)中に注いだ、この方ラ
ムを出発緩衝液で、溶離液が光学的にブランクとなるま
で、洗浄した。
の酢酸ナトリウム緩衝液pH5,2(尿素中&モルおよ
びメルカプトエタノール中0.01モル)(出発緩衝液
)中に懸濁した。36gの尿素および3mlの懸濁液を
50℃に1時間加熱した。それを遠心により清浄にし、
そして遠心物を25体桔の出発緩衝液に対して1夜透析
した。15m1のS−セファロース(ファスト・フロー
出9:、緩衝液で平衡化した)を保持物中に攪拌しなが
ら入れ、そして、30分後、このスラリーをカラム(1
,5X12cm、5mlの平衡化したSセファロース、
)γスト・フロー、全充填した)中に注いだ、この方ラ
ムを出発緩衝液で、溶離液が光学的にブランクとなるま
で、洗浄した。
次いで、カラムを180 m lの出発緩衝液および1
80m1の0.02モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5
,2(これはメルカプトエタノール中0.00モルであ
った)の直線の勾配で溶離した0次に、カラムを0.0
2モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5,2(洗浄緩衝液
)で、溶離液が蛋白質を含有しなくなるまで、溶離し、
最後に0.5モル/Iの塩化ナトリウムを含有する上の
洗浄緩衝液で洗浄した。
80m1の0.02モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5
,2(これはメルカプトエタノール中0.00モルであ
った)の直線の勾配で溶離した0次に、カラムを0.0
2モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5,2(洗浄緩衝液
)で、溶離液が蛋白質を含有しなくなるまで、溶離し、
最後に0.5モル/Iの塩化ナトリウムを含有する上の
洗浄緩衝液で洗浄した。
粘製
エラスターゼ−阻害活性を含有する溶離液を一緒にし、
そしてそれらの体請を15m1に真空薄発させた。実施
例1d)に記載するように、濃縮物をハイボア(HiP
ore@’)カラムを通すHPLCにより、0.1%の
トリフルオロ酢酸および50%のア七ト二トリルを含有
する0、1%のトリフルオロ酢酸の直線の勾配を使用し
てクロマトグラフィーにかけた。阻害活性をもつ溶#液
(約10mg)の凍結乾仔後fUられた物質を、モノS
カラムのFPLCにより、0.02モルの酢酸ナトリウ
ム緩衝液pH5,2および0.2モルの酢酸ナトリウム
緩衝液pH5,2(これは0゜3モルの塩化ナトリウム
を含有する)の直線の勾配を使用してクロマトグラフィ
ーにかけた。0゜05モル〜0,07モルの塩化ナトリ
ウムで溶離した物質を、すでに前に述べたように、RP
−318のHPLCによって脱塩し、そして分析用HP
LCにおいて事実上均質であった。収量は0゜5mgで
あった。この阻害剤の阻害スペクトルは1表1において
、アプロチニンのそれと比較して、見ることができる。
そしてそれらの体請を15m1に真空薄発させた。実施
例1d)に記載するように、濃縮物をハイボア(HiP
ore@’)カラムを通すHPLCにより、0.1%の
トリフルオロ酢酸および50%のア七ト二トリルを含有
する0、1%のトリフルオロ酢酸の直線の勾配を使用し
てクロマトグラフィーにかけた。阻害活性をもつ溶#液
(約10mg)の凍結乾仔後fUられた物質を、モノS
カラムのFPLCにより、0.02モルの酢酸ナトリウ
ム緩衝液pH5,2および0.2モルの酢酸ナトリウム
緩衝液pH5,2(これは0゜3モルの塩化ナトリウム
を含有する)の直線の勾配を使用してクロマトグラフィ
ーにかけた。0゜05モル〜0,07モルの塩化ナトリ
ウムで溶離した物質を、すでに前に述べたように、RP
−318のHPLCによって脱塩し、そして分析用HP
LCにおいて事実上均質であった。収量は0゜5mgで
あった。この阻害剤の阻害スペクトルは1表1において
、アプロチニンのそれと比較して、見ることができる。
定量的アミノ酸組成は表5から見ることができる0期待
した配列は配列決定によって確証された。
した配列は配列決定によって確証された。
実施例4
Leu−15−Leu−17−I 1e−18Thr
−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ターpIU 2.6.C)の構成 表2に従うDNAブロックα1.β3、δ!およびδ2
を、実施例1b)に記載するようにして結合した。電気
泳動によって精TA後、pIU2.6.Cが1’Jられ
た。
−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ターpIU 2.6.C)の構成 表2に従うDNAブロックα1.β3、δ!およびδ2
を、実施例1b)に記載するようにして結合した。電気
泳動によって精TA後、pIU2.6.Cが1’Jられ
た。
b) Leu−15−Leu−17−I Ie18−
Thr−52−ヒトアプロチニンとMS2レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成(ベクター
pRK 152.1.1) ベクターpEx 31.b、[ストレベル(Stre
bel)ら、ウィルス字詰(J、 Viro I 、
)、 (1986)、57.983−9911を、M
S2レプリカーゼの配列の一部との融合蛋白質としてL
eu−15−Leu−17−IIe−18−Thr−5
2−ヒトアプロチニンの発現ベクターのための選択した
。このベクター中のMS2融合蛋白質の発現は、ラムダ
ファージのP プロモーターによって冷却される。
Thr−52−ヒトアプロチニンとMS2レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成(ベクター
pRK 152.1.1) ベクターpEx 31.b、[ストレベル(Stre
bel)ら、ウィルス字詰(J、 Viro I 、
)、 (1986)、57.983−9911を、M
S2レプリカーゼの配列の一部との融合蛋白質としてL
eu−15−Leu−17−IIe−18−Thr−5
2−ヒトアプロチニンの発現ベクターのための選択した
。このベクター中のMS2融合蛋白質の発現は、ラムダ
ファージのP プロモーターによって冷却される。
%Jig(7)PIU 2.6.C−DNAをEc。
RIおよびBamHIで切断し、そしてヒトアプロチニ
ン変異型の遺伝子を慣用の方法で分離した。これによっ
て得られたDNAの0.IILgを、pEx 31.
b、ベクターのDNAの0゜411−gと結合した。p
Ex 31.b−DNAをまずEcoRIおよびBa
mHIでつくり、そしてアルカリ性ホスファターゼ(仔
ウシ)で脱リン酸化した。
ン変異型の遺伝子を慣用の方法で分離した。これによっ
て得られたDNAの0.IILgを、pEx 31.
b、ベクターのDNAの0゜411−gと結合した。p
Ex 31.b−DNAをまずEcoRIおよびBa
mHIでつくり、そしてアルカリ性ホスファターゼ(仔
ウシ)で脱リン酸化した。
E、 coli株537と組換えDNAとの形質転換
および引続くクローンの分析は、標準方法によって実施
した。融合したMS2遺伝子とクローニングにした正し
い[インフレーム(inf rame)J融合は、プラ
スミドクローンpRK 152.1.1の配列分析に
よって確証された(第1114)。
および引続くクローンの分析は、標準方法によって実施
した。融合したMS2遺伝子とクローニングにした正し
い[インフレーム(inf rame)J融合は、プラ
スミドクローンpRK 152.1.1の配列分析に
よって確証された(第1114)。
C) 発酵
プラスミドpRK 152.1.lで形質転換したE
、 coli株537の発酵は、脱イオン水1リツト
ルにつき、30gの酵母エキス、30gの肉エキスおよ
び1gのリン酸水十二ナトリウム栄養溶液、pH7、中
で実施した。栄養溶液を減菌した後、lリーフトルの振
盪フラスコ中の100m1の部分を、各場合、同−培地
中で前もって8時間18五増殖したものを接種した。培
養物を。
、 coli株537の発酵は、脱イオン水1リツト
ルにつき、30gの酵母エキス、30gの肉エキスおよ
び1gのリン酸水十二ナトリウム栄養溶液、pH7、中
で実施した。栄養溶液を減菌した後、lリーフトルの振
盪フラスコ中の100m1の部分を、各場合、同−培地
中で前もって8時間18五増殖したものを接種した。培
養物を。
28Orpmにおいて回転振盪機中で振阻しながら、2
8℃に保持した0次いで、それらを42℃に3峙間加熱
し、その間融合蛋白質の収率は細胞の蛋白質含(1にの
15%に上昇した(SDS/PAGE)。
8℃に保持した0次いで、それらを42℃に3峙間加熱
し、その間融合蛋白質の収率は細胞の蛋白質含(1にの
15%に上昇した(SDS/PAGE)。
d) Leu−15−Leu−17−I 1e1
8−Thr−52−ヒトアプロチニンの分離 細胞を遠心(15分、s 、ooo rpm)によって
分離した。沈殿を10体請の0.1モルのトリス塩酸緩
衝液PH7,5,0,01モルのエイレンジアミノ四酢
酸、0.005モルのメルカプトエタノールおよび0.
005モルのベンズアミジン塩酸項中に懸濁させ、リゾ
チーム[フルシカ社(Fluka AG)、 スイス
国ブフスJ(0,2mg/ml)を添加した後、この懸
濁液をよ〈攪拌しながら30℃で30分間インキュベー
ションした0次いで、この反応混合物を4℃に冷却し、
そして細胞をフレンチプレス(アミコ、米国)で18,
0OOPSIにおいて破壊した。このホモジネートを1
0.00Orpmで30分間遠心しくベックマン JA
−10)、そして遠心物を廃棄した。沈殿を上の緩衝液
(これは尿素中2モルであった)中に2回再懸濁し、そ
して各場合において得られた懸濁液を再び遠心によって
透明いにした。
8−Thr−52−ヒトアプロチニンの分離 細胞を遠心(15分、s 、ooo rpm)によって
分離した。沈殿を10体請の0.1モルのトリス塩酸緩
衝液PH7,5,0,01モルのエイレンジアミノ四酢
酸、0.005モルのメルカプトエタノールおよび0.
005モルのベンズアミジン塩酸項中に懸濁させ、リゾ
チーム[フルシカ社(Fluka AG)、 スイス
国ブフスJ(0,2mg/ml)を添加した後、この懸
濁液をよ〈攪拌しながら30℃で30分間インキュベー
ションした0次いで、この反応混合物を4℃に冷却し、
そして細胞をフレンチプレス(アミコ、米国)で18,
0OOPSIにおいて破壊した。このホモジネートを1
0.00Orpmで30分間遠心しくベックマン JA
−10)、そして遠心物を廃棄した。沈殿を上の緩衝液
(これは尿素中2モルであった)中に2回再懸濁し、そ
して各場合において得られた懸濁液を再び遠心によって
透明いにした。
融合蛋白質の分離
次いで、このようにして得られた沈降物を、磁気的に攪
拌しながら、0.05モルのトリス緩衝液pH8,5(
これは塩酸グアニジウム中8モルおよびメルカプトエタ
ノール あった)で抽出し、そして不溶性の部分を遠心(30分
,18,OOOrpm)によッテ除去した.遠心物を各
場合10mlの部分でセファクリル(Sephacry
l)S−300カラム(5X90cm)(これは0.
05モルのトリス−塩酩緩楢液pH8 、5、尿素中6
モルおよびメルカプトエタノール中0.01モルで平衡
化されている)でろ過し、そして平衡化緩衝液で溶離し
た。
拌しながら、0.05モルのトリス緩衝液pH8,5(
これは塩酸グアニジウム中8モルおよびメルカプトエタ
ノール あった)で抽出し、そして不溶性の部分を遠心(30分
,18,OOOrpm)によッテ除去した.遠心物を各
場合10mlの部分でセファクリル(Sephacry
l)S−300カラム(5X90cm)(これは0.
05モルのトリス−塩酩緩楢液pH8 、5、尿素中6
モルおよびメルカプトエタノール中0.01モルで平衡
化されている)でろ過し、そして平衡化緩衝液で溶離し
た。
融合蛋白質全含有する分画(還元性条件下のSDS−P
AGEによる同定)をプールし、そして水に対して広く
透析した.これによって融合蛋白質はほとんど定ら1的
に沈殿し、そして遠心(30分,10.00Orpm)
によって分離し,た。
AGEによる同定)をプールし、そして水に対して広く
透析した.これによって融合蛋白質はほとんど定ら1的
に沈殿し、そして遠心(30分,10.00Orpm)
によって分離し,た。
臭化シアンの切断
500mlの融合蛋白質を21mlのギ酸中に溶解した
,9mlの水および500mgの臭化シアンを添加した
後,この混合物を室温において18時間窒素雰囲気中に
光を遮断して保持した.次いで.300mlの水をこの
溶液に添加し、そして溶媒および過剰の臭化シアンを真
空蒸留した。
,9mlの水および500mgの臭化シアンを添加した
後,この混合物を室温において18時間窒素雰囲気中に
光を遮断して保持した.次いで.300mlの水をこの
溶液に添加し、そして溶媒および過剰の臭化シアンを真
空蒸留した。
残留物を50m1の0905モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、6モルの尿素および0.01モルのメルカプトエタ
ノール、pH5.2,rl−ffに6gの尿素を添加し
て溶解した.この溶液を1夜20体桔の愉快緩衝液に対
して透析した。
液、6モルの尿素および0.01モルのメルカプトエタ
ノール、pH5.2,rl−ffに6gの尿素を添加し
て溶解した.この溶液を1夜20体桔の愉快緩衝液に対
して透析した。
復元
保持物をカラム(2.5X10cm,CM−セファロー
ス、ファスト・フロー、溶解緩衝液と平衡化されている
)に適用し、そしてこの方ラムを、まず、溶解緩衝液で
溶離し,次いで、300mlの溶解緩衝液および0.0
5モルの酢酸ナトリウム緩衝液、0.002モルのメル
カプトエタノール、pH5.2.の直線の勾配で溶離し
、最後に、0,05モルの酢酸ナトリウム緩衝液,PH
5,2,で溶離した。復元した阻害剤を、最後に、カラ
ムから0.05モルの酢酸塩緩衝液、pH5,2、Na
C1中0.5モル、で脱着した。
ス、ファスト・フロー、溶解緩衝液と平衡化されている
)に適用し、そしてこの方ラムを、まず、溶解緩衝液で
溶離し,次いで、300mlの溶解緩衝液および0.0
5モルの酢酸ナトリウム緩衝液、0.002モルのメル
カプトエタノール、pH5.2.の直線の勾配で溶離し
、最後に、0,05モルの酢酸ナトリウム緩衝液,PH
5,2,で溶離した。復元した阻害剤を、最後に、カラ
ムから0.05モルの酢酸塩緩衝液、pH5,2、Na
C1中0.5モル、で脱着した。
精製
エラスターゼ−阻害活性を右する分画をプールし、そし
て0.020モルの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5,2
,に対して広範に透析した。保持されたものをモノ−5
−FPLCカラム(透析緩衝液と羽衡化しである)に適
用し、そしてこのカラムを格100 m lの平衡化緩
衝液および0.3モルの塩化ナトリウムを含有する平行
化緩衝液の直線の勾配で展開した。阻害剤を含有する分
画を、すでに述べた方法で、RP−318カラムの;A
装用HPLCによって脱塩した。ヒトは、蒸発による7
セト二トリルの除去後、溶離液から凍結乾燥によって得
られた。収M:9.5mgの無色の物質、調製物の阻害
スペクトルは表1から見ることができ、そして定量的ア
ミノ酸の組成は表3から見ることができる0期待する配
列は22段階の配列決定によって確証された。
て0.020モルの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5,2
,に対して広範に透析した。保持されたものをモノ−5
−FPLCカラム(透析緩衝液と羽衡化しである)に適
用し、そしてこのカラムを格100 m lの平衡化緩
衝液および0.3モルの塩化ナトリウムを含有する平行
化緩衝液の直線の勾配で展開した。阻害剤を含有する分
画を、すでに述べた方法で、RP−318カラムの;A
装用HPLCによって脱塩した。ヒトは、蒸発による7
セト二トリルの除去後、溶離液から凍結乾燥によって得
られた。収M:9.5mgの無色の物質、調製物の阻害
スペクトルは表1から見ることができ、そして定量的ア
ミノ酸の組成は表3から見ることができる0期待する配
列は22段階の配列決定によって確証された。
実施例5
Arg−15−Arg−17−I Ie−18−Glu
−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ター=pIU 4.6.C)PIU 4.6.Cを
もつpUC8誘導体は、実施例1b)に記載する方法に
よって1表2からの合成遺伝子ブロックα1.β4.γ
2およびδ3の結合によって得た。
−52−ヒトアプロチニン a) 阻害剤をエンコードする構造遺伝子の構成(ベク
ター=pIU 4.6.C)PIU 4.6.Cを
もつpUC8誘導体は、実施例1b)に記載する方法に
よって1表2からの合成遺伝子ブロックα1.β4.γ
2およびδ3の結合によって得た。
b) Arg−15−Arg−17−11e−18−
Glu−52−ヒトアプロチニンとMS2レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成(ベクター
pRK 153.1.l) MS2レプリカーゼおよびArg−15−Arg−17
−I 1e−18−Glu−52−ヒトアプロチニンの
ための遺伝子の融合は、実施例4b)に記載する融合と
同様に実施し、そしてpRK 153.1.1を得た
。
Glu−52−ヒトアプロチニンとMS2レプリカーゼ
との融合蛋白質のための発現ベクターの構成(ベクター
pRK 153.1.l) MS2レプリカーゼおよびArg−15−Arg−17
−I 1e−18−Glu−52−ヒトアプロチニンの
ための遺伝子の融合は、実施例4b)に記載する融合と
同様に実施し、そしてpRK 153.1.1を得た
。
c) pRK 153.1 、t−’c’形質転換
したE、 coli株537の発酵 この発酵は実施例4c)においてE、 coli株5
37/pRK 152.1.1について記載したよう
にして実施した。
したE、 coli株537の発酵 この発酵は実施例4c)においてE、 coli株5
37/pRK 152.1.1について記載したよう
にして実施した。
d) Arg−15−Arg−17−I 1e18−
Glu−52−ヒトアプロチニンの分離 実施例4d)と同様にして、プラスミドpRK153.
1.1で形質転換したllニー coli株537の
発酵後得られたml泡を分離し、そして破壊した。
Glu−52−ヒトアプロチニンの分離 実施例4d)と同様にして、プラスミドpRK153.
1.1で形質転換したllニー coli株537の
発酵後得られたml泡を分離し、そして破壊した。
洗f’ll Lだ細胞封入体を、また、実施例4d)に
記載した方法で臭化シアンで破壊した。阻害剤をCM−
セファロース上でpH5,2において再生した。精製は
モノ−S (FPLC)(7)クロマトグラフィーによ
り、0.02モルのHEPES、pH6,0、および0
.02モルのHEPES、0.3モルの塩化ナトリウム
、pH6,0,の直線の勾配を使用して実施した。阻害
剤はその抗トリプシン活性に基づく分画によって検出し
た。溶離は0.15〜0.18モルの塩化ナトリウムに
おいて起こった。阻害剤の阻害スペクトルは表1から見
ることができ、そして定量的アミ/#の組成は表3から
見ることができる0期待する配列は24段階の配列決定
によって確証された。
記載した方法で臭化シアンで破壊した。阻害剤をCM−
セファロース上でpH5,2において再生した。精製は
モノ−S (FPLC)(7)クロマトグラフィーによ
り、0.02モルのHEPES、pH6,0、および0
.02モルのHEPES、0.3モルの塩化ナトリウム
、pH6,0,の直線の勾配を使用して実施した。阻害
剤はその抗トリプシン活性に基づく分画によって検出し
た。溶離は0.15〜0.18モルの塩化ナトリウムに
おいて起こった。阻害剤の阻害スペクトルは表1から見
ることができ、そして定量的アミ/#の組成は表3から
見ることができる0期待する配列は24段階の配列決定
によって確証された。
理解されるようにこの明細吉および特許請求の範囲は例
示を目的として記載され、限定を意味せず、そして種々
の変更および変化は本発明の精神および範囲を逸脱しな
いでなすことができる。
示を目的として記載され、限定を意味せず、そして種々
の変更および変化は本発明の精神および範囲を逸脱しな
いでなすことができる。
本/AIJ]の主なる特徴及び7S様は以下のとうりで
ある。
ある。
l1位ml 5におけるLys残基が他のプロトゲンア
ミノ酸a基によってご換されたヒトアプロチニン。
ミノ酸a基によってご換されたヒトアプロチニン。
2、lまたは2以上の追加のアミノ酸残基が他のプロト
ゲンアミノ酸残基によって71摸されている上記第1’
/i記伎のヒトアプロチニン。
ゲンアミノ酸残基によって71摸されている上記第1’
/i記伎のヒトアプロチニン。
3、位1x4.16.17.18.19,34.38.
39および52の1または2以上の位置においてアミノ
酸残基が置換されている上記第2項記載のヒトアプロチ
ニン。
39および52の1または2以上の位置においてアミノ
酸残基が置換されている上記第2項記載のヒトアプロチ
ニン。
4、Val、I le、Le、Ala、MetAsn、
Gin、Phe、Tyr、TrpおよびArgからなる
群からのアミノ酸残基によって位置15におけるLys
残基が置換されているヒトアプロチニン。
Gin、Phe、Tyr、TrpおよびArgからなる
群からのアミノ酸残基によって位置15におけるLys
残基が置換されているヒトアプロチニン。
5、夕4応する位tにおける;!2換の場合において、
次のアミノ酸残基が、各場合において、存在することが
できる二位置16: GIy、SetまたはThr 位置17: Leu、Vat、I Ie、Ser、Thr、Asn、
Gin、Phe、TyrまたはArg位置18: Ala、Vat、Leu、I le、Ser、Thr、
Asn、Gln、Asp、GluまたtまPh位置19
: Val Ile、Leu、Ala、Thr、Asnま
たはGin 位置34: I Ie、Leu、Ala、Thr、Met、Asn、
Gin、Asp、Glu、PheまたはAr位2239
: Val、I le、Leu、Met、Asn、Gln、
Asp、Glu、Phe、Ser、ThrまたはArg 位fi52: Val、I le、Leu、Gin、Glu、Thr、
Asp、Phe、LysまたはArg、および 位置14および38において、これらの2つの位とにお
けるアミノ酸残ノ、(が同一であるかあるいは異なるこ
とができる場合、Gly、Ala、Val、Leu、P
ro、Ser、Thr、Asn、Gin、Glu、Ly
s、ArgまたはPhe。
次のアミノ酸残基が、各場合において、存在することが
できる二位置16: GIy、SetまたはThr 位置17: Leu、Vat、I Ie、Ser、Thr、Asn、
Gin、Phe、TyrまたはArg位置18: Ala、Vat、Leu、I le、Ser、Thr、
Asn、Gln、Asp、GluまたtまPh位置19
: Val Ile、Leu、Ala、Thr、Asnま
たはGin 位置34: I Ie、Leu、Ala、Thr、Met、Asn、
Gin、Asp、Glu、PheまたはAr位2239
: Val、I le、Leu、Met、Asn、Gln、
Asp、Glu、Phe、Ser、ThrまたはArg 位fi52: Val、I le、Leu、Gin、Glu、Thr、
Asp、Phe、LysまたはArg、および 位置14および38において、これらの2つの位とにお
けるアミノ酸残ノ、(が同一であるかあるいは異なるこ
とができる場合、Gly、Ala、Val、Leu、P
ro、Ser、Thr、Asn、Gin、Glu、Ly
s、ArgまたはPhe。
上記第1〜4項のいずれかに記載のヒトアプロチニン
6、J−2第1〜5項のいずれかに記載のヒトアプロチ
ニンをエンコードする核酸。
ニンをエンコードする核酸。
7、上記第6項記・戒のDNAを含有する発現系。
8、ヒトアプロチニンをエンコードする核酸を、ヒトア
プロチニンを発現する宿主有機体の中に組込み1次いで
発現産生物を分離することを特徴とする」二記第1〜5
項のいずれかに記載のヒトアプロチニンを調製する方法
。
プロチニンを発現する宿主有機体の中に組込み1次いで
発現産生物を分離することを特徴とする」二記第1〜5
項のいずれかに記載のヒトアプロチニンを調製する方法
。
9、 1−2第1〜5項のいずれかに記載のヒトアプロ
チニンを含有する薬物。
チニンを含有する薬物。
10、薬物を調製するための北記第1〜5項のいずれか
に記載のヒトアプロチニンの使用。
に記載のヒトアプロチニンの使用。
第1図は、ヒトアプロチニンの配列の略図である。
第2図は、ヒトイソアプロチニンの配列の略図である。
第3図は、ヒトアプロチニンの変異型をエンコードする
遺伝子の調製において使用するデオキシリポ核酸(DN
A配列ブロック)の配列である。 第4図は、制限酵素のための切断部位をもっMet −
(−1)−Val−15−ヒトアプロチニン遺伝子の配
列を示す。 :55図は、プラスミドクローンprtr 16゜4
、Cの略図である。 fJ、6図はPALK 1のα−アミラーゼシグナル
配列である。 第7図は、ベクターpCH237の構成の略図である。 第8図は、ベクターpW8 2863の構成の略図であ
る。 第9図は、ベクターpCH286の構成の略図である。 第10図は、ベクターpRK 1511.1の構成の
略図である。 第11図は、ベクターpRK 152.1.1の構成
の略図である。 5\ 手続補正書彷幻 平成1年1月24日 特許庁長官 吉 1)文 毅 殿 1、事件の表示 昭和63年特許願第159055号 2、発明の名称 3゜ らの使用 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 バイエル・アクチェンゲゼルシャフト 5゜ 補正命令の日付 昭和63年9月27日(発送臼) 補正の対象 図面(第3図、第4図、第7図〜第9図)補正の内容
遺伝子の調製において使用するデオキシリポ核酸(DN
A配列ブロック)の配列である。 第4図は、制限酵素のための切断部位をもっMet −
(−1)−Val−15−ヒトアプロチニン遺伝子の配
列を示す。 :55図は、プラスミドクローンprtr 16゜4
、Cの略図である。 fJ、6図はPALK 1のα−アミラーゼシグナル
配列である。 第7図は、ベクターpCH237の構成の略図である。 第8図は、ベクターpW8 2863の構成の略図であ
る。 第9図は、ベクターpCH286の構成の略図である。 第10図は、ベクターpRK 1511.1の構成の
略図である。 第11図は、ベクターpRK 152.1.1の構成
の略図である。 5\ 手続補正書彷幻 平成1年1月24日 特許庁長官 吉 1)文 毅 殿 1、事件の表示 昭和63年特許願第159055号 2、発明の名称 3゜ らの使用 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 バイエル・アクチェンゲゼルシャフト 5゜ 補正命令の日付 昭和63年9月27日(発送臼) 補正の対象 図面(第3図、第4図、第7図〜第9図)補正の内容
Claims (1)
- 1、位置15におけるLys残基が他のプロトゲンアミ
ノ酸残基によって置換されたヒトアプロチニン。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3721240 | 1987-06-27 | ||
DE3721240.0 | 1987-06-27 | ||
DE3724570.8 | 1987-07-24 | ||
DE19873724570 DE3724570A1 (de) | 1987-06-27 | 1987-07-24 | Human-aprotinin, dessen lys-rest in position 15 gegen einen anderen protogenen aminosaeurerest ausgetauscht ist |
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ID=25857006
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JP (1) | JPH02439A (ja) |
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DK (1) | DK349688A (ja) |
IL (1) | IL86852A0 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103930579A (zh) * | 2011-11-14 | 2014-07-16 | Lg电子株式会社 | 合金铸铁和采用该合金铸铁的叶片的制造方法 |
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US7413537B2 (en) | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
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AU1545692A (en) | 1991-03-01 | 1992-10-06 | Protein Engineering Corporation | Process for the development of binding mini-proteins |
IL104314A0 (en) * | 1992-01-07 | 1993-05-13 | Novo Nordisk As | Human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof,their production and pharmaceutical compositions containing them |
US10744179B2 (en) | 2014-09-18 | 2020-08-18 | The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the Other Members of Board, of The College of the Holy | Method for treatment of inflammatory skin disorders with inhibitors of IL-36 proteolytic processing |
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GB2188933A (en) * | 1986-04-10 | 1987-10-14 | Bayer Ag | Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby |
-
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- 1987-07-24 DE DE19873724570 patent/DE3724570A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-06-16 EP EP88109617A patent/EP0297362A3/de not_active Withdrawn
- 1988-06-24 IL IL86852A patent/IL86852A0/xx unknown
- 1988-06-24 DK DK349688A patent/DK349688A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-06-27 JP JP63159055A patent/JPH02439A/ja active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103930579A (zh) * | 2011-11-14 | 2014-07-16 | Lg电子株式会社 | 合金铸铁和采用该合金铸铁的叶片的制造方法 |
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---|---|
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DK349688A (da) | 1988-12-28 |
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EP0297362A2 (de) | 1989-01-04 |
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