JPH09512422A

JPH09512422A - カイメース阻害活性を有するα−１−抗キモトリプシン類似体

Info

Publication number: JPH09512422A
Application number: JP7525636A
Authority: JP
Inventors: エス．クーパマン，バリー; ルービン，ハービー; ノーマンシェクター; メイワン，ジ
Original assignee: ザトラスティーズオブザユニバーシティオブペンシルベニア
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1997-12-16
Also published as: EP0757719A1; US5723316A; AU6715694A; WO1995027053A1; AU696945B2; CA2186635A1; EP0757719A4

Abstract

(57)【要約】発明は、３５８位にアミノ酸置換を有するａ−１−抗キモトリプシンの類似体を提供する。３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有するａ−１−抗キモトリプシン類似体及び３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有し、３５８位のアミノ酸が置換された類似体もまた発明の範囲内である。これらの類似体はカイメース阻害活性を有する。メチオニン−アラニン−セリン或はアラニン−セリンのＮ−末端延長を有する新規なα−１−抗キモトリプシンもまた提供する。α−１−抗キモトリプシンを生成するための発現ベクターもまた提供する。本発明は、またα−１−抗キモトリプシンの類似体を発現することができる宿主細胞及び細胞培養、並びに宿主細胞からのたんぱく質製剤もまた提供する。α−１−抗キモトリプシンの類似体の製造方法及びα−１−抗キモトリプシンの類似体を使用してカイメース活性を阻害する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】カイメース阻害活性を有するα−１− 抗キモトリプシン類似体発明の分野本発明は組み換えＤＮＡ技術によって製造される物質の分野、一層特には組み換えＤＮＡ技術によって製造されるたんぱく質の分野に関する。発明の背景セリンプロテアーゼインヒビターであるセルピン［ｓｅｒｐｉｎ−ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（セリンプロテイナーゼインヒビター）］と内生のかつ微生物のプロテアーゼとが相互作用して、広範囲の分子種であって、各々は宿主生存において中枢の完全な、活性なセルピンの濃度を保つ作用をする極めて進化的に保存された生体恒常性機構の成分であるものを産生する。これらの種の内、セルピン−酵素複合体及び完全なセルピンの加水分解された不活性形態はＩＬ−６の産生を刺激し、たんぱく質のセルピン上科の細区分を含む急性期たんぱく質の合成を増大させる。セルピン−酵素複合体は循環から速やかに除かれるが、それらは開裂された及び完全な形態と共に局部炎症域に蓄積し得る。これは化学走性の化学誘引剤及びインヒビター、並びに好中球脱顆粒、ロイコトリエン、血小板活性因子（ＰＡＦ）及びスーパーオキシド産生の活性剤及びインヒビターの複雑な微環境を確立する。Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ等は、天然の抗キモトリプシン（ＡＣＴ）及び組み換え抗キモトリプシン（γＡＣＴ）が懸濁液中のヒト好中球によるスーパーオキシド産生を抑制することを示した。Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４６、２３８８。この系では、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）で複合化された完全なＡＣＴ及びγＡＣＴは、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）或はフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で刺激された好中球によるフリーラジカル生成を抑制するのに同等に有効であった。種々の動物モデルは、ランナウエイセリンプロテアーゼ活性が肺損傷の主たる機構でありかつ適当なセルピン応答が損傷の度合いを制御するという仮説を確証する。例えば、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）は、アルファ−１−プロテアーゼインヒビター（ａｌＰＩ）と組み合わさって、羊をエンドトキシン誘発肺損傷から防いだが、個々のセルピンは組合せ程には有効でなかった。Ｒｅｄｅｎｓ等、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、１９８８、２６、１５。Ｒｅｄｅｎｓ等は、またＡＴＩＩＩが内毒血症ラッツにおいて血管内凝固症候群の発生を防ぐのを示した。Ｅｍｅｒｓｏｎ等、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、１９８７、２１、１。Ｈ₂Ｏ₂及びエラスターゼのクロロメチルケトンのスカベンジャーはラッツにおいて好中球エラスターゼ媒介急性浮腫性肺損傷の反応性酸素強化作用をブロックしかつα１ＰＩはブレオマイシン媒介肺炎症並びに続く線維症を減少させた。Ｂａｉｒｄ等、Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９８６、６１、１２２４及びナガイ等、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．、１９９２、１４５、６５１。しかし、別の系では、好中球エラスターゼインヒビター、ＥｇｌｉｎＣ及び低分子化合物Ｌ６５８，７５８はロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）誘発好中球媒介粘着、血管外遊出或は脈管漏出を抑制することができなかった。Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９０、２５９、Ｈ１２８８。発明の要約よって、治療上投与するたんぱく質分解酵素のインヒビターは炎症の分子及び細胞機構を制限しかつ組織損傷を減小させ得る。従って、動物に臨床適用するためのα−１−抗キモトリプシンのような安全かつ有効なインヒビターの要求が依然ある。多機能的プロテアーゼインヒビターをベースにした治療剤は、フリーラジカル並びにプロテアーゼが成人吸収症候群、膵炎、炎症性皮膚外傷及び再潅流損傷のような損傷の機構に関係させられた疾患の治療を臨床的に進歩させるものと思う。本発明は抗キモトリプシン活性及び／又はカイメース（ｃｈｙｍａｓｅ）抑制活性を有するヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を提供する。本発明は、野生型３５８位、ロイシンがトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリシン及びバリンから選ばれるアミノ酸に変換されるような３５８位にアミノ酸置換を有するα−１−抗キモトリプシン類似体を含む。また、野生型α −１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）に対応するアミノ酸がアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）で置換されたヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体も本発明の範囲に含まれる。ＳＥＱＩＤＮＯ：８は、また３５８位が上述した群から選ぶアミノ酸で置換されてもよい。上述した新規なポリペプチド、並びにヒト野生型α−１−抗キモトリプシン、図１は、メチオニン−アラニン−セリン或はアラニン−セリンのＮ−末端延長配列を有してもよい。Ｎ−末端延長を有する新規なポリペプチドは、メチオニン− アラニン−セリン或はアラニン−セリンのＮ−末端延長配列を有する、必要に応じて上述した置換基の内の一つを有する成熟ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンのアミノ酸配列全体をコード化するヌクレオチド配列から作られる。これらの新規なα−１−抗キモトリプシン類似体は安定なα−１−抗キモトリプシンモノマーを生じ、たんぱく質二量体及び見掛け上の不均一性を生じさせた γＡＣＴ記載のプリカーサーα−１−抗キモトリプシンポリペプチド中に存在するＮ−末端システインを除く。これらのα−１−抗キモトリプシンポリペプチドは抗キモトリプシン活性を有し、α−１−抗キモトリプシンそれ自体と同じようにして有用である。本発明の類似体は、またカイメース抑制にも有用である。本発明は、また発明のα−１−抗キモトリプシン類似体の遺伝情報を指定する核酸を含む発現ベクター、発明の類似体を発現することができる形質転換宿主細胞及び細胞培養も提供する。本発明は、更にα−１−抗キモトリプシン類似体を発現することができる宿主細胞を培養することを含むα−１−抗キモトリプシン類似体の製造方法を提供する。本発明は、またカイメースに少なくとも一種のα−１−抗キモトリプシン類似体を抑制量接触させることを含むカイメースの抑制方法を提供する。また、発明のα−１−抗キモトリプシン類似体を有効量カイメース活性を示すサンプルに加えることを含むα−１−抗キモトリプシン類似体を使用してカイメース活性を抑制する方法も提供する。発明の範囲は、肺炎症、再潅流損傷を治療するのに、並びに血餅を治療及び予防するのに有用なヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を提供する。ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を製薬的に許容し得る量でキャリヤーと共に含む薬剤及び組成物もまた本発明の主題であり、それらの上述した症状の治療への用法も本発明の主題である。本発明は一層特には請求の範囲に指摘しかつ下記の記述に好適な実施態様でおいて説明する。図面の簡単な説明図１は、ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの完全なヌクレオチド配列及び予測されるアミノ酸配列を示す。全長遺伝子はヌクレオチド残基１〜１２０９によってコード化される。図２は、ヒトカイメースのα−１−抗キモトリプシン類似体による滴定のグラフである。発明の詳細な記述本発明は、野生型ヒトα−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位におけるロイシンに対応するアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリシン及びバリンから選ばれるアミノ酸で置換されたヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を提供する。発明の好適な実施態様では、３５８位におけるロイシンをトリプトファンで置換する。３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ −Ｌｅｕ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）をＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）で置換したα−１−抗キモトリプシンの類似体もまた本発明によって提供する。３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有する類似体は、３５８位がメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリシン及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換されてもよい。３５８位においてアミノ酸ロイシンに代るものを有する野生型抗キモトリプシンはγＡＣＴ−Ｌ３５８と呼ばれる類似体を生じ、特定の類似体では、置換される一文字のアミノ酸記号がその後に続く。例えば、γＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗは３５８アミノ酸位にトリプトファンを有する組み換えα−１−抗キモトリプシンを表わす。発明の別の態様は、Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＳｅｒのＮ−末端延長を有する野生型及び類似体形態のヒトα−１−抗キモトリプシンを提供する。発明のこの実施態様では、成熟ヒトα−１−抗キモトリプシンはＮ−末端に更に３つのアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含有する。別の実施態様は、Ｍｅｔが開裂しかつ２つのアミノ酸Ａｌａ−ＳｅｒがＮ−末端に残る野生型及び類似体形態の成熟ヒトα−１−抗キモトリプシンを含む。α−１−抗キモトリプシンの野生型及び類似体形態は、本明細書中に開示するＮ−末端延長を有してよい。 α−１−抗キモトリプシンはセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）である。それは、その天然の循環形態では、５５，０００〜６６，０００ダルトンの糖たんぱく質であり、変動は糖鎖形成の微不均一性に起因される。それは主に肝臓で合成され、また肥満細胞、血脈洞組織球、内皮細胞中に及び組織／単核細胞ラインの細胞中に報告されてきた。炎症性刺激に応答して、プラズマレベルの α−１−抗キモトリプシンが数時間内で４倍より多く増大する。キモトリプシン様酵素及びそれらのインヒビターは細胞機能の変調、ＤＮＡ結合、所定の寄生菌機能の抑制及び血管収縮神経たんぱく質のプロセシングを含む広範囲の正常の及び異常の生物学的プロセスにおいて確認されてきた。加えて、 α−１−抗キモトリプシンはアルツハイマーのプラークにおけるアミロイド付着物の成分であるようでありかつ種々のカルシノーマ中に及び生殖系のいくつかの組織中に存在する。ヒトα−１−抗キモトリプシンはその標的酵素とナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）安定な複合体を形成する、これはセルピン／セリンプロテアーゼ相互作用の一般的な性質である。これらの複合体の性質についてはほとんど知られていない。キモトリプシン及びキモトリプシン／小さい分子インヒビター複合体の高分解能結晶構造は解明されかつ酵素のＮＭＲ分析が報告されたが、ヒトα−１−抗キモトリプシン単独或はセリンプロテアーゼとの複合体としての直接の構造研究は報告されていない。プロテアーゼ及びオキシダントはショック生理学を確立しかつ維持する際に中心的な役割を果たしかつプロテアーセインヒビターはショックの結果を好都合に改変することができるという証拠がある。小さい分子プロテアーゼインヒビターはヒトの膵臓において効力を有するのが示されてきた。同様に、抗キモトリプシンは肝臓疾患の場合のように凝固障害の治療において関係させることができる。プロテアーゼは、また炎症性疾患の重要な媒介物質となる。これらの酵素をそれらのインヒビターによって調節することは、これらの疾患において組織破壊を制御するために重要である。野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位にアミノ酸置換を有する発明の類似体、３５６〜３６１アミノ酸位にアミノ酸置換を有し、３５８位が上述したアミノ酸から選ばれるアミノ酸を有する類似体は、野生型或は天然の抗キモトリプシンに比べて、驚くべきことにかつ予期し得ない程にずっと良好なカイメースインヒビターであり、プロテイナーゼがヒト肥満細胞内に高い濃度で貯蔵される。ヒトカイメースは二種のヒトセルピンプラズマインヒビター、すなわちα−１−抗キモトリプシン及びα−１ −プロテイナーゼインヒビターによって阻害される。これらのインヒビターは両方共セルピンたんぱく質科のメンバーである。α−１−抗キモトリプシン及びα −１−プロテイナーゼインヒビターによるカイメースの阻害は不可逆と思われ、ＳＤＳにおける変性に対して典型的な密着結合複合体耐性を示したが、両方のインヒビターによる反応は極めて効率的とは言えなかった。擬一次条件下で求めると、α−１−抗キモトリプシン及びα−１−プロテイナーゼインヒビターについて、二次速度定数２５，０００Ｍ^-1Ｓ^-1及び８，０００Ｍ^-1Ｓ^-1がそれぞれ得られた。これらの値は、α−１−抗キモトリプシンによる好中球カテプシンＧの阻害、或はα−１−プロテイナーゼインヒビターによる好中球エラスターゼの阻害について観測される値に比べておよそ１００−１，０００倍小さかった。反応の効果の無いことは、滴定において、終点が化学量論の阻害（ＳＩ）４．５モルインヒビター／カイメース１モル（α−１−抗キモトリプシン）及び５．０モルインヒビター／カイメース１モル（α−１−プロテイナーゼインヒビター）を生− たことで、更に一層明らかであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び生成物のＮ−末端配列分析による分析は、高い化学量論の阻害が、競争反応がインヒビターの反応性ループ内で加水分解によって分解されたインヒビターを生成することによることを示した。野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８位のロイシンがトリプトファンで置換されたα−１−抗キモトリプシン類似体は、天然のインヒビターに比べてずっと効率的なカイメースのインヒビターである。化学量論の阻害はおよそ１モルインヒビター／カイメース１モルである。すなわち、競争分割反応はほとんど排除され、発明の類似体は、カイメースの阻害について、野生型α−１−抗キモトリプシンに比べて４倍効率的であることを示す。阻害についての見掛けの二次速度定数は、野生型α−１−抗キモトリプシンγＡＣＴによるカイメースの阻害についての見掛けの二次速度定数に比べて５倍より大きく、一層速い相互作用を立証する。本発明の別の態様は、α−１−抗キモトリプシン及び類似体の遺伝情報を指定する核酸配列、発明の核酸配列を発現するために形質転換された発現ベクター及び宿主細胞、たんぱく質をコード化するＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞において合成される本発明のたんぱく質を含むたんぱく質調製並びに発明の核酸配列発現することができる細胞培養を提供する。野生型α−１−抗キモトリプシンにおいて３５８アミノ酸位にアミノ酸置換を有するα−１−抗キモトリプシン類似体或は３５６〜３６１アミノ酸位にアミノ酸置換を有し、３５８位が上述したアミノ酸から選ばれるアミノ酸を有するα−１−抗キモトリプシン類似体は、特定のたんぱく質の遺伝情報を指定する核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞において産生されるのが普通である。宿主細胞は、特定のたんぱく質の遺伝情報を指定する核酸配列を発現させる条件下で培養する。たんぱく質が蓄積する適当な量の時間の後に、たんぱく質を宿主細胞或は細胞を囲む培地から精製する。 α−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定するヒト遺伝子は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。適したライブラリーは、カリフォルニア、パロアルト在Ｃｌｏｎｔｅｃｈのような商業的出所から得ることができる。次いで、陽性クローンにＤＮＡ配列を施してα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列の存在を求める。ＤＮＡ配列は、Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９７７、７４、５４６３の連鎖停止法を使用して容易に行われる。 α−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を、次いでポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを使用して操作してもよく、或は別法として米国特許第５，０７９，３３６号（同特許の開示を本明細書中に援用する）に開示されている通りにしてカセットベクターの中に装入してもよい。発明において用いるのに適した発現ベクター、宿主細胞及び細胞培養は、α−１−抗キモトリプシン類似体生成物を合成することができる発現システムから選ぶ。発明において用いるのに適した宿主細胞は本明細書中に援用する米国特許第５，０７９，３３６号に開示されている通りにして形質転換してα−１−抗キモトリプシンをしっかり含有しかつ発現することができる原核細胞及び真核細胞を含む。本発明を実施するのに適したタイプの細胞は細菌、酵母及び哺乳動物細胞を含む。組み換えα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸は、組み換えたんぱく質を生成するために最も一般的に用いられる細菌宿主細胞Ｅ．ｃｏｌｉを含む原核性或は真核性宿主細胞において発現してよい。その他の微生物菌種、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ及びその他の腸内細菌科、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ或はＳｅｒｒａｔｉａＭｅｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ或はその他の細菌種の種々の種もまた用いてよい。一般的に用いられる真核性システムは酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、チキン細胞、例えばＥ３Ｃ／Ｏ及びＳＬ−２９、哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ−７或はＭＤＣＫ細胞、等を含む。前述したリストは単に例示するものであり、発明の核酸配列を発現するのに適した宿主細胞のタイプを何ら制限することを意図しない。本発明で用いる通りの発現ベクターとは、組み換えα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸配列を含有するように処理することができる任意のタイプのベクター、例えばプラスミド発現ベクター及びウイルスベクターを言う。発現ベクターの選定は、組み換えα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸の発現が生じるように、所望の宿主細胞との適合性に基づく。プラスミド発現ベクターは発明の核酸配列をプロモーターのような少なくとも一種の発現コントロールエレメントと操作可能に結合させてなる。プラスミドベクターは、宿主細胞と適合し得る種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含有するのが普通である。発明の核酸配列を含有するプラスミドの選定を容易にするために、プラスミドベクターは、また抗生物質抵抗性の遺伝情報を指定する遺伝子のような選定可能なマーカーを含有してもよい。適した例はアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール或はカイナマイシン抵抗性の遺伝情報を指定する遺伝子を含み、これらに限定されない。適した発現ベクター、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現コントロールエレメントは当分野で知られており、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー在、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）に見出すことができる。下記に挙げるプラスミド及びベクターは単に例であり、何ら制限することを意味しない。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＺＭＳ、及びｐＺＭのようなプラスミドはＥ．ｃｏｌｉにおいて発現せるために用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおいて発現せるために用いることができる。ｐＭＴ２及びｐＭＳＧのようなプラスミドは哺乳動物において発現せるために用いることができる。適したウイルスベクターはバキュロウイルス、Ｖａｃｃｉｎａｖｉｒｕｓ及びアデノウイルスを含む。所望の宿主について適した発現システムを構築するための詳細の事項は当業者に知られている。たんぱく質を組み換え生産するためには、それをコード化するＤＮＡを適当に選定の発現システムの中に結合させ、次いでシステムを形質転換させて適合し得る宿主細胞にし、これを次いで、外来の遺伝子の発現が行なわれる条件下で培養しかつ維持する。次いで、本発明のペプチドを培養から、細胞を溶解させることによるか或は培地から適しかつ当業者に知られている通りにしてのいずれかで回収する。特には、ヒトα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸配列を含む発現ベクターは、更に転写及び翻訳コントロールエレメントをヒトα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸配列に作動的に結合させてなるのが好ましい。例えば、上流位置に、プロモーターが存在し、それにリボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始シグナルが存在してよく、かつ下流位置に、転写終結シグナルが存在してよい。転写及び翻訳コントロールエレメントは任意の機能的組合せ或は順序で結合させてよい。発明の任意の特定の実施態様で用いる転写及び翻訳コントロールエレメントは、発現システムを作り出すように、発現ベクターを導入する細胞のタイプに関連して選定することになる。たんぱく質生成物の高レベルの発現を確実にするために、Ｅ．ｃｏｌｉｔｒｐ−ｌａｃプロモーター或はＴ７ｐＬプロモーターのような強いプロモーターを使用するのが好ましい。ｐｌＮｏｍｐ及びβ−ラクタマーゼプロモーターは、 α−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定するＤＮＡに作動的に結合させる場合に、α−１−抗キモトリプシンを低い収量で或は収量無くもたらすのが分かった。また、生成物を蓄積する間、宿主細胞の可能な毒性を回避するために、プロモーターをＰ_Lプロモーターのような誘導性プロモーターにするのが好ましい。別法として、Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８６、１８９、１１３（あたかも本明細書中に完全に記載されているかのように詳細に援用する）に開示されている通りのバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーセをベースにした遺伝子発現システムを使用してもよい。このシステムでは、バクテリオファージＴ７プロモーターを選定した生成物の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列に作動的に結合させて含有するプラスミドで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについての発現可能な遺伝子を有するλファージを感染させる。プラスミドの十分なコピーが宿主細胞中に存在しかつ感染後直ぐにタンパク質合成が開始した後に、細胞にファージを感染させる。ヒトα−１−抗キモトリプシン類似体の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有する形質転換された宿主細胞を、次いで宿主について適した培地中で成長させることができる。誘導性プロモーターを用いる場合、宿主細胞を成長させて高密度にしかつ融合たんぱく質及びプロテアーゼを発現するためにプロモーターを作動させてもよい。プロモーターが誘導性でない場合、たんぱく質生成物の構成性産生が行われることになる。α−１−抗キモトリプシン類似体の構成性産生は、それが実質的に宿主細胞に対して毒性でない発現システムにおいて好ましい。細胞は、類似体形成のそれ以上の増大が無くなる或は栄養消費対類似体形成の比が所定のレベルより下に低下するまで成長させ、その時点で細胞を収穫し、溶解させ、慣用の技術に従ってたんぱく質生成物を得て実質的に精製することができる。そのような技術はクロマトグラフィー、電気泳動、抽出及び密度勾配遠心分離を含む。本発明で用いる通りの適した発現ベクターで形質転換させた宿主細胞、及びかかる宿主細胞の培養を使用して本発明のα−１−抗キモトリプシンを合成することができる。α−１−抗キモトリプシンの組み換え類似体のたんぱく質製剤もまた宿主細胞及び細胞培養から調製することができる。宿主細胞を、細胞を維持しかつ細胞と組み換えα−１−抗キモトリプシン類似体を含有する培地との混合物を生成するのに適した培地で培養する。別法として、混合物を、それから組み換えα−１−抗キモトリプシンを精製するように精製してもよい。本発明において有用な精製法は下記を含み、それらに制限されない：イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、透析及び当分野で知られているその他のたんぱく質精製法。宿主細胞によって産生される精製された或は未精製の組み換えα−１−抗キモトリプシン類似体のたんぱく質製剤は、たんぱく質の精製度に応じて、α−１−抗キモトリプシン及びおそらく細胞と培地との混合物からのその他の物質を含んで生産される。すなわち、本発明はヒトα−１−抗ホモトリプシン或は類似体を発現することができる宿主細胞を培養してヒトα−１−抗ホモトリプシン或は類似体を含有する細胞を生産し、必要に応じて混合物を精製してヒトα−１−抗ホモトリプシン或は類似体を精製された形態で生産することを含むヒトα−１−抗ホモトリプシン或は類似体の生産方法を提供する。宿主細胞によって産生される精製された或は未精製の組み換えα−１−抗キモトリプシン類似体のたんぱく質製剤は、よってたんぱく質の精製度に応じて、α −１−抗キモトリプシン並びに宿主細胞成分及び／又は細胞培地のようなその他の物質を含んで生成される。「精製された」なる用語は、発明の核酸配列の状態を説明するのに使用する場合、ヒトα−１−抗キモトリプシン或は非組み換え細胞における、すなわちその「天然状態」における核酸に通常付随するその他の物質の遺伝情報を指定しない核酸が実質的に存在しない核酸配列を言う。「精製された」或は「精製された形態の」なる用語は、α−１−抗キモトリプシンたんぱく質或は類似体たんぱく質の状態を説明するのに使用する場合、それの天然状態で通常それに付随する細胞物質或はその他の物質が少なくともある程度に存在しないα−１−抗キモトリプシン或は類似体を言う。α−１−抗キモトリプシン或は類似体は純度（等質性）少なくとも約２５％〜約１００％を有するのが好ましい。純度は少なくとも約５０％であるのが一層好ましい。本発明のα−１−抗キモトリプシンの類似体は抗キモトリプシン活性を示し、天然或は野生型α−１−抗キモトリプシンと同じように有用である。類似体はカイメースインヒビターとして、並びに血餅、再潅流損傷、肺の炎症を治療及び予防するのに有用である。肺炎症の場合、炎症は胃内容物、煙のような酸性物質、グラム陰性細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からの感染を含む病原体感染のような感染を吸引することによって引き起こされ得、これらに限定されない。発明の類似体は、製薬的に許容し得るキャリヤー或は希釈剤、例えば塩水或はその他の緩衝剤と共に投与することができる。適した製薬上のキャリヤーは当分野で良く知られており、例えばこの分野における標準の参考テキストであるペンシルバニア、イーストン在ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａｌｆｏｎｓｏ編集、Ｒｅｍｉｎｇ−ｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）第１８版、１９９０年に記載されている。キャリヤーは意図する投与のルート及び標準の製薬的実施に関連して選定するのがよい。投与量は患者の体重及び臨床症状に関連して設定されることになる。有効成分対キャリヤーの割合比は類似体の化学的性質、溶解度及び安定性、並びに意図する投与量に依存することになるのは当然である。発明の類似体は、発明の方法において単独で或は発明のその他の類似体を含みこれらに限定されないその他の化合物と組み合わせて用いることができる。発明の方法は、また抗体、毒素及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みこれらに限定されないその他の治療に関連して用いてもよい。インビホ適用について、投与すべき量は、また患者の年令、体重及び臨床症状にも依存することになる。本発明の類似体は、接種及び注入を含む任意の適したルート、例えば静脈内、経口、腹腔内、筋肉内、皮下ルートにより局所に、並びに上皮の或は皮膚粘膜のライニング、例えば鼻、口、膣、直腸及び胃腸ライニングを通して吸収することによって投与することができる。本発明の類似体、薬剤及び組成物の投与方式は、類似体を送達する生物における部位を決めるのがよい。例えば、局所適用はクリーム、軟膏、ゲル、油、エマルション、ペースト、ローション、等で投与することができる。非経口投与について、類似体は、その他の溶質、例えば溶液を等張性にさせるのに十分な塩、グルコース、デキストロースを含有することができる無菌水溶液の形態で用いてよい。経口投与方式について、本発明は錠剤、カプセル、ドロップ、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル、水溶液、懸濁液、等の形態で用いてよい。種々の崩壊剤、例えばデンプン及び潤滑剤を用いてよい。カプセル形態での経口投与について、有用な希釈剤はラクトース及び高分子ポリエチレングリコールである。水性懸濁液を経口用に必要とする場合、所定の甘味剤及び／又はフレーバリング剤を加えてもよい。また、３５８位、或は３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有し、３５８位が上述したアミノ酸から選ばれるα−１−抗キモトリプシン類似体；もしくは３５６〜３６１位に対応するヒト野生型α−１−抗キモトリプシンのアミノ酸Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ＬｅｕがＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ− Ｉｌｅ−Ｐｒｏで置換されたα−１−抗キモトリプシン類似体を治療すべき症状を示すサンプルに加えることにより、カイメースを阻害する、皮膚炎症を治療する、血餅を治療及び予防する、肺炎症を治療する、並びに再潅流損傷を治療する方法も提供する。現行の発明の目的から、動物は下記を含みこれらに限定されない：ＯｒｄｅｒＲｏｄｅｎｔｉａ、例えばマウス及びＯｒｄｅｒＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ、例えばうさぎ；一層特にはＦｅｌｉｎｅｓ（猫）及びＣａｎｉｎｅｓ（犬）を含むＯｒｄｅｒＣａｒｎｉｖｏｒａ；更に一層特にはＯｒｄｅｒＡｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ、Ｂｏｖｉｎｅｓ（牛）及びＳｕｉｎｅｓ（豚）並びにＥｑｕｉｎｅｓ（馬）を含むＯｒｄｅｒＰｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ；一層特にはＯｒｄｅｒＰｒｉｍａｔｅｓ、Ｃｅｂｏｉｄｓ及びＳｉｍｏｉｄｓ（モンキー）並びにＡｎｔｈｒｏ− ｐｏｉｄｓ（ヒト及びエイプ）。最も好適な実施態様の動物はヒトである。例組み換えα−１−抗キモトリプシン類似体の生産及び精製材料キモトリプシンはＳｉｇｍａ或はＢｏｅｈｒｉｎ−ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから得た。発色性プロテアーゼ物質はすべてＢａｃｈｅｍから得、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）もＢａｃｈｅｍから得た。ヒト血清α−１−抗キモトリプシンは、ツダ等、Ｔｏｋａｉ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１９８２、７、２０１の研究を基にした手順を用いて生産した。この方法は、ＤＮＡセルロースからの回分式溶離、Ｇ−１５０クロマトグラフィー及びＤＮＡセルロースからのＫＣ１勾配溶離の３工程で純α−１−抗キモトリプシンをもたらす。プラスミド構築及びＤＮＡ操作は、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー在、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）に従って行なった。ヒト抗キモトリプシンからの遺伝子の同定及び配列決定ＭｉｔｃｈｅｌｌＷｅｉｓｓ，Ｄｅｐａｒｔ− ｍｅｎｔｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより提供されるファージ発現ベクターλ−ｇｔ１１におけるヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをＹｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'l．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９７７、７４、５４６３の方法に従ってスクリーンし、ポリクローナル抗血清を関連するセリンプロテアーゼインヒビターであるＣ１エステラーゼインヒビター（カリフォルニア、サンタバーバラ在ＤＡＫＯ）に対して生じさせた。陽性クローンを選び、再スクリーンしかつプラーク精製した。ＤＮＡ配列決定を、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＣｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅＷｉｓｔａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ペンシルバニア、フィラデルフィア）から得られるオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、Ｓａｎｇｅｒ等．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'l．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９７７、７４、５４６３の連鎖停止法によって行なった。 λ−ｇｔ１１ｃＤＮＡクローンの内の一つからのＥｃｏＲｌ断片のＤＮＡ配列及び誘導アミノ酸配列は、図１に表わす通りの成熟ヒトα−１−抗キモトリプシンの全解読領域を含有するものであった。構築は、また５’−Ｍｅｔ−Ａｌａ −Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）を含む５’−末端コード化７アミノ酸の２１ヌクレオチド伸長を含むのであった。成熟たんぱく質はアミノ酸末端に１アミノ酸位、Ａｓｎから出発する３９８アミノ酸（Ｍ_r４５，０３１）を含有しかつ２３６位に単一のシステイン残基を含有する。３５８アミノ酸位にトリプトファンを有する組み換えα−１−抗キモトリプシン及び類似体の生産ヒトα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する核酸配列を上記の通りにして得かつ米国特許第５，０７９，３３６号（同米国特許を本明細書中に援用する）に記載されている通りにしてサブクローン化してｐＵＣ１９（ウイスコンシン、マジソン在、Ｐｒｏｍｅｇａ）にしてもよい。しかし、本例では、３５８位にロイシンに代えてトリプトファンの置換を有するα−１−抗キモトリプシンの類似体、γＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗを下記の通りにしてＰＣＲに従って生産した。市販されているプラスミドｐＫＣ３０をＢａｍＨＩにより切断し、一本鎖は付着端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｅｎｄ）を生じ、これらをＫｌｅｎｏｗ反応によって満たした。両端がブラント端にされた線状化されたプラスミドは自己結合され、Ｅ．ｃｏｌｉＮ４８３０−１は結さく反応混合物によって軽質転換された。軽質転換株から精製されたプラスミドはｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）であり、ＢａｍＨＩ部位だけが取り除かれたｐＫＣ３０を示した。このｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）をＨｐａＩによって消化させ、次の結合工程のために２つのブラントエンドを生じた。リボソーム結合部位を含有する０．２ｋｂ断片を下記の一連のプラスミド：ｐＡＲ３０３８、ｐＡＲ３０３９及びｐＡＲ３０４０からＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶによって切断した。切断したＥｃｏＲＶはブラントエンドを生じた。ＸｂａＩにより作り出された付着端をＫｌｅｎｏｗ反応によって満たした。両端をブラント端にすることにより、３つの０．２ｋｂ断片を別々にＨｐａＩ消化されたｐＫＣ３０（−ＢａｍＨＩ）に結合させた。３つの結さく混合物を用いてＮ４８３０− １を別々に軽質転換させた。これらの軽質転換株から３つのベクターが得られ、それらを３つのリーディングフレームに対応してｐＺＭ３０３８、ｐＺＭ３０３９及びｐＺＭ３０４０と命名した。これらのｐＺＭベクターはｐＫＣ３０からのｐＬプロモーターを含有し、かつｐＡＲベクターからＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を受けた。これらのベクターの特有のクローニング部位は、ｐＡＲからの断片中に配置されるＢａｍＨＩである。ｐＺＭ３０３８、ｐＺＭ３０３９、或はｐＺＭ３０４０の内の一つをＮｈｅＩによって切断して２つの断片、約５．９ｋｂ及び約０．７５ｋｂを生成した。５．９ｋｂ断片をゲル精製しかつ結さくさせて再循環させる。Ｎ４８３０−１をこの結さく反応によって軽質転換させた。軽質転換株から分離されたプラスミドをｐＺＭｓと命名した。ｐＺＭｓはｐＬプロモーターの下流の特有のクローニング部位−ＮｈｅＩ、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及び出発コドンを有する。表１に示す通りのプライマー１、２、３及び４をニューヨーク、コールドスプリングハーバー在、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）に記載されている技術によって調製し、トリプトファンの遺伝情報を指定する塩基をα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する配列の中に導入するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルにおいて使用した。標準のＰＣＲプロトコルは当業者に知られている。全長ヌクレオチド配列を２つの部分、フラグメントＡ及びＢで造り、これらを組み合わせて全長ヌクレオチド配列を生成した。フラグメントＡを構築するために、２つのプライマーを使用した。プライマ−１は、表１に下線を施して示すＮｈｅＩクローニング部位を含有する伸長された５’テールを有するα−１−抗キモトリプシンについての解読鎖或はセンス鎖の５’配列を含有する。プライマー２は、３５８位のロイシンの遺伝情報を指定する塩基に取って代えるためにトリプトファンの遺伝情報を指定する塩基を有する３’テールを含む（トリプトファンコドンを表１に太い文字で示す）。次いで、プライマー１及び２をポリメラーゼ連鎖反応と共に使用し、α−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する配列をｐＵＣ１９においてサブクローン化して３５８位を通してＮ末端の遺伝情報を指定するフラグメントＡを生成した。フラグメントＡの生成については、標準のＰＣＲ法に従った。１００ｎｇ／μ ｌのプライマー１１μｌ、１００ｎｇ／μｌのプライマー２１μｌ、１０ｘＰＣＲ緩衝液１０μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ１０μｌ及びＴａｑ酵素０．５μ ｌを１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、すなわちα−１−抗キモトリプシン遺伝子を含有するｐＵＣ１９に加え、蒸留水で反応容積を１００μｌにもたらした。９４℃１５秒間、５２℃１５秒間、及び７２℃１秒間の３工程のＰＣＲを行なった。３工程は１サイクルに等しく、３０サイクルをランした。フラグメントＢを構築するために、２つのプライマーを使用した。プライマー３は、３５８位のロイシンの遺伝情報を指定する塩基に取って代えるためにトリプトファンの遺伝情報を指定する塩基を有する３’テールを含む解読鎖或はセンス鎖のヌクレオチドを含有する（トリプトファンコドンを表１に太い文字で示す）。プライマ−４は表１に下線を施して示すＮｈｅＩクローニング部位を含有する伸長された５’テールを有する。次いで、プライマー４及び５をポリメラーゼ連鎖反応と共に使用し、α−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する配列をｐＵＣ１９においてサブクローン化してＣ−末端を通して３５８位の遺伝情報を指定するフラグメントＢを生成した。フラグメントＢの生成について、フラグメントＡの生成について上述したプロトコルに従った。次いで、全長配列を、フラグメントＡ及びＢの各々５〜１０ｎｇを用いて、フラグメントＡの生成について上述したプロトコルによって生成した。フラグメントを変性させかつ再アニールさせた。フラグメントを再アニールさせて、プライマー２及び３を経て作り出されるトリプトファンの遺伝情報を指定する配列において重複するフラグメントＡ及びＢのヘテロ二本鎖を生成した。フラグメントＡ及びＢのヘテロ二本鎖を、ＴａｇＤＮＡポリメラーセを使用して伸長させ、フラグメントＡ及びＢの重複する部分はプライマーとして働いて野生型の３５８位においてロイシンに代えてトリプトファンを有するα−１−抗キモトリプシンの遺伝情報を指定する全長配列を生成する。全長配列を、次いでプライマー１及び４を使用して拡大させた。拡大された全長配列を、次いでＮｈｅＩで消化させかつ発現ベクターｐＺＭｓの中に装入し、これをＮｈｅＩで消化させた。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、全長遺伝子を含有するｐＺＭｓで軽質変換させた。それ故、反応性部位の３５８アミノ酸位が変更されたα−１−抗キモトリプシンの類似体が発現された。すなわち、３５８アミノ酸位におけるロイシンはトリプトファンに変更された。この類似体を本明細書中νＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗとして表わす。本発明のヒト野生型α−１− 抗キモトリプシンのその他の類似体を同様にして調製することができる。Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ或はＡｌａ−ＳｅｒＮ末端伸長を有する組み換えα− １−抗キモトリプシンの調製野生型α−１−抗キモトリプシンのヌクレオチド配列内でコード化されたＮ末端配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）内のＬｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）配列をコード化するヌクレオチドを欠失することによりＮ末端システイン残基を除くことによって安定なモノマーを直接発現させてνＭＡＳ−ＡＣＴをコード化するヌクレオチド配列を生成した。それ故に、野生型α−１−抗キモトリプシンのアミノ酸位−４〜−１におけるアミノ酸ロイシン、システイン、ヒスチジン及びプロリンが欠失された。Ｎ末端伸長はアミノ酸位−３〜−１においてメチオニン−アラニン−セリンになる。このような伸長は、Ｎ末端プライマー５’−ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を用いた全コード化配列の上述したＰＣＲ拡大によって行なった。Ｃ末端プライマーは５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴＡＧＧＣＴＴＧＣ −３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）であり、ここで下線を施した配列ＧＣＴＡＧＣは装入部位として働いた。下線を施したＣＴＡ配列はベクターのセンス鎖においてＴＡＧ終結コドンを生じる。配列をクローン化してｐＺＭｓにした。拡大された全長配列をＮｈｅＩで消化させかつ発現ベクターｐＺＭｓの中に装入し、これをＮｈｅＩで消化させた。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｎ末端伸長が変更された遺伝子を含有するｐＺＭｓで軽質変換させた。それ故に、アミノ酸位−４〜−１を、アミノ酸ロイシン、システイン、ヒスチジン及びプロリンが欠失されるように変えることによってα−１−抗キモトリプシンの類似体が生成された。この類似体を本明細書中νＭＡＳ−ＡＣＴとして表わす。 νＡＣＴ類似体の発現Ｅ．ｃｏｌｉＮ４８３０−１を、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー在、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）が記載する通りの標準塩化カルシウム法により、発現ベクターｐＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗ、ｐＭＡＳ−ＡＣＴ、ｐＡＳ−ＡＣＴ、ｐＭＡＳ−ＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗ或はｐＡＳ−ＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗによって軽質変換させた。小規模増殖条件及び抽出前述した発現ベクターによって形質変換されたＥ．ｃｏｌｉ菌種Ｎ４８３０− １のフレッシュな一晩培養を、アムピシリン（Ｎａ⁺塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ肉汁に１．５％に希釈し、振盪インキュベーターにおいて３０℃で増殖させてＡ_600nm０．１８にし、温度を４２℃に上げることによって誘発させ、更に５〜８時間増殖させた。細胞を遠心分離し、フレンチプレスで粉砕した。組み換えα−１−抗キモトリプシン類似体の精製及び特性表示Ｅ．ｃｏｌｉの大規模増殖前述した発現ベクターによって形質変換されたＥ．ｃｏｌｉ菌種Ｎ４８３０− １を、酸素バブラーを装着した１５Ｌカーボイ中の３０℃のアムピシリン（Ｎａ⁺ 塩、０．１ｍ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地で増殖させた。細胞を、温度を４２ ℃に上げることによって誘発させ、更に６時間増殖させて最終のＡ_600nmおよそ０．９〜１．０にした。抽出及びカラムクロマトグラフィーすべての精製工程を４℃で行なった。α−１−抗キモトリプシン類似体の典型的な調製では、細胞ペーストを１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液、ｐＨ６．９（２５ｍｌ）に分散させ、フレンチプレスを１０，０００ｐｓｉ（７００kg/cm²）及び４℃で３回通すことによって溶解させた。細胞残骸を、３０，０００×ｇで３０分間４℃において遠心分離することによって、取り除いた。上澄み液（２５ｍｌ）を、５０ｍＭＫＣｌを含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５に平衡にしておいたＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（４．９ｃｍ²×３７ｃｍ）に装填した。たんぱく質が５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５中のＫＣｌの線状勾配（２Ｌ中５０〜５００ｍＭ）で溶離した。分画（１５ｍｌ）を、本明細書中に記載する通りにして、Ａ_280nmによりたんぱく質についてモニターしかつ抗キモトリプシン活性についてアセイした。類似体がおよそ２００ｍＭＫＣｌで溶離した。類似体を含有する分画を一緒にしかつ１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液、ｐＨ６．９の２容積（各々２．５Ｌ）に対して４８時間にわたり透析させた。透析された溶液を、次いで１０ｍＭＫＣｌを含有する１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液、ｐＨ６．９で予備平衡化しておいたＤＮＡ−セルロースカラム（１．７ｃｍ²×２０ｃｍ）にかけた。装填した後に、カラムを初めに同じ緩衝液（２０ｍｌ）で洗浄した。カラムを同じ緩衝液中のＫＣｌの線状勾配（１０〜５００ｍＭ、３００ｍｌ）で溶離させた。分画（８ｍｌ）を、本明細書中に記載する通りにしてたんぱく質及び抗キモトリプシン活性についてアセイした。類似体がおよそ３５０ｍＭＫＣｌで溶離した。抗キモトリプシン活性を含有する分画を、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）１９７０、２２７、６８０に従って行うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度についてアセイした。各々の部分を、ＡｍｉｃｏｎＹＭ−１０膜を使用して限外ろ過によって濃縮しかつ５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５（５００ｍｌ）に対して一晩透析させた。いくつかの場合において、組み換えたんぱく質を、更にＦＰＬＣＭｏｎｏＱアニオン交換カラムで、上記の条件を使用して精製した。抗キモトリプシン活性アセイ抗キモトリプシン活性は粗製細菌リゼイト中で、リゼイトそれ自体におけるバックグラウンド阻害活性が大きいために、直接測定することができなかった。バックグラウンド活性を、ポンプ（ＬＫＢ２１５０ポンプ）の中に嵌込んだＭｏｎｏＱＨＲ５／５アニオンＦＰＬＣ交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２１５２勾配コントローラー及び延長波長モジュールを有するＵＶ吸光度ディテクター（Ｗａｔｅｒ４４０ＵＶ吸光度ディテクター）を使用してアニオン交換クロマトグラフィーによって抗キモトリプシンから分離した。クロマトグラフィーは、細胞２００ｍｇからのエキストラクトに関して行うのが典型的であった。分離は５０ｍＭＫＣｌを含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．５によるイソクラティック洗浄（５分）、次いで流量１．０ｍｌ／分でのＫＣＩの線状勾配（３０分で５０〜３５０ｍＭ）を伴うものであった。たんぱく質吸光度を２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの両方でモニターした。分画（１．０ｍｌ）を捕集しかつ抗キモトリプシン或は抗トリプシン活性についてアセイした。抗キモトリプシン或は抗トリプシン活性は、物質Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（９０％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液０．１ｍｌ）、ＤｅｌＭａｒ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７９、９９，３１６のキモトリプシン触媒される加水分解或は物質Ｎ−Ｂｚｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（９０％ＤＭＳＯ中の１４．６ｍＭ溶液０．０２ｍｌ）のトリプシン触媒される加水分解の阻害として測定した。典型的なキモトリプシンアセイは、（１．０ｍｌ）中に下記を含有するものであった：１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．３、０．００５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、牛膵臓キモトリプシン（１８ｍモル）及びカラム溶離液（０．００５〜０．５ｍｌ）。アセイ混合物を室温で５分間プリインキュベートし、物質（９０％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液０．０１ｍｌ）を加え、残留するキモトリプシン活性をｐ−ニトロアニリンの遊離によって引き起こされるＡ_410nmの変化速度によって求めた。典型的なトリプシンアセイは、（１．０ｍｌ）中に下記を含有するものであった：１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．３、０．００５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、牛トリプシン（８．６ｐモル）及びサンプル（０．００５〜０．５ｍｌ）。アセイ混合物を室温で１０分間プリインキュベートした後に、物質（９０％ＤＭＳＯ中の１５ｍＭ溶液０．０２ｍｌ）を加え、残留するトリプシン活性を上記の通りにして求めた。光学的吸光度の測定を、温度調節されるサンプルコンパートメントを装備した分光計（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ８４５２Ａ）を使用して２５℃で行なった。組み換えα−１−抗キモトリプシン及び類似体とヒトカイメースとの相互作用材料ペプチド−ニトロアニリド物質はＳｉｇｍａ或はＢａｃｈｅｍから購入した。ＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ−５ＰＷＨＰＬカラムはＳｕｐｅｌｃｏから購入した。Ｈｅｐａｒｉｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅはＰｈａｒｍａｃｉａから購入した。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ−Ｐ（ＰＶＤＦ膜）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。野生型の３５８位のロイシンがトリプトファン（Ｗ）で置換された抗キモトリプシンの類似体を本明細書中に記載する通りにして生産した。ヒトカイメースの精製肥満細胞プロテイナーゼをヒトの皮膚から抽出し、５００ｍｌのｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで分画化した。ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから２ＭＮａＣｌ、０．１ＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）により一工程で溶離されたカイメースを、更に大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合するカイメースの分画は可変であった。３０〜７０％の酵素ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合を生じるエキストラクトでは、別の精製法を使用した。フロー−スルー中のカイメースを、塩化カリウムを加えることによって沈殿させた。沈殿を高い塩緩衝液中に可溶化させた後に、カイメースをフェニルブチルアミン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２０ｍｌ樹脂）に吸収させ、カイメースは、０．４ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍ［３−（Ｎ− モルホリノ）−プロパン−スルホン酸］、ＭＯＰＳ、（ｐＨ６．８）、０．２ＭＤトリプトファンメチルエステル、Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ溶液を加えることによって一工程で溶離された。次いで、プロテイナーゼをｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけ、カラムに吸収させ、塩勾配を用いて溶離させた。両方の手順によって精製したカイメースは同じ触媒特性を有し、ＳＤＳで同等に泳動し、血清ＡＣＴに対して滴定した際に、同じ化学量論の阻害を有していた。両方の手順によって精製した酵素をこれらの研究で使用した。インヒビター及びプロテイナーゼ濃度の定量 α−１−組み換え抗キモトリプシンの濃度をキモトリプシンで滴定することによって定量した。滴定は、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１５０〜３００ｐＭプロテイナーゼを含有する５０μｌ（２５℃）で行なった。残留活性は、サンプルを、物質ＳｕｃＡＡＰＦ−ｐＮＡ或はＣＢＺ−ＧＰＡ−ｐＮＡ（カルボベンゾキシ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇｐ−ニトロアニリド）を１ｍＭで含有する１ｍｌアセイ緩衝液で希釈することによって１０〜１５分インキュベートした後に定量した。ストックキモトリプシン溶液を、活性部位滴定液Ｎ−トランス−シンナモイルイミダゾールで標準化した。カイメース濃度を、物質ＳｕｃＡＡＰＦ− ｐＮＡを１ｍｌ含有する標準アセイ条件下で測定したその比活性２．７μモルの生成物ｍｉｎ−１／カイメース１ｎモルを使用して定量した；ε₄₁₀＝８８００（ｐ−ニトロアニリンの消衰係数）を使用して遊離されたｐ−ニトロアニリンを定量した。カイメースアセイカイメースと組み換えα−１−抗キモトリプシン及び類似体との反応を、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣｌ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１５０〜４００ｎＭカイメースを含有する溶液５０〜１５０μｌ中で２５℃において行なった。独立に前述した類似体を含むインヒビターで適当な時間インキュベートした後に、残留活性を、サンプルアリコートを上記した通りの物質１ｍＭを含有する１ｍｌアセイ緩衝液に希釈することによって、測定した。カイメースとインヒビターとの反応を通常のセリンプロテイナーゼインヒビター（ＰＭＳＦ）を加えることによって停止させ、反応混合物のサンプルを電気泳動にかけて反応生成物を求めた。カイメースと変異型γＡＣＴｓとの反応化学量論の阻害（ＳＩ）値及び二次速度定数を類似体について求めた。各々の組み換えα−１−抗キモトリプシンについてＳＩを得るための滴定（ｐＨ８．０、１ＭＮａＣｌ、２５℃）を図２に提示する。これらの研究における残留活性は数分内で達成され、少なくとも２４時間の間一定のままであった。二次速度定数（ｋ_ob _s/I ）をすべてのγＡＣＴＳについて（γＡＣＴＳ）₀／（カイメース）₀＞＞１において評価した。カイメースと血清α−１−抗キモトリプシンとの反応は、（Ｉ）₀／（Ｅ）₀比がＳＩに比べておよそ１０倍大きい場合に、擬一次であると思われる。速度研究における反応条件は滴定と同様であり、測定はＮａＣｌ濃度１Ｍ及び２Ｍで行なった。阻害速度定数プログレスカーブを物質の存在において擬一次条件（（Ｉ）₀＞＞（Ｅ）₀）下で求めた。反応は０．２５〜１．０ｍＭのＳｕｃＡＡＰＦ−ｐＮＡ、２〜２．５ｎＭのカイメース及びインヒビターを含有した。吸光度を１５分間連続してモニターし、瞬間速度を１分間隔にわたって回帰分析によって求めた。瞬間速度対時間（ｔ）のプロットを非線状法により表現Ａｅ^-k'に適合させて見掛けの一次速度定数ｋ’を求めた。（Ａ）は初期活性である。ｋ_obs/Iを下記の関係から計算した：ｋ_obs/I＝ｋ’（（Ｓ／Ｋｍ）＋１）／Ｉ（式中、Ｓは初期物質濃度であり、Ｋｍは実験条件下での物質のカイメース加水分解についてのＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数であり、Ｉは初期インヒビター濃度である。反応を少なくとも３／２代の間モニターした。Ｋｍは１．０ＭＮａＣｌ中０．８０ｍＭ及び２．０ＭＮａＣｌ中０．４９であった。すべての変異型についての速度定数及びＳＩを表２に集める。値の最小の変化だけが２つの異なるＮａＣｌ濃度で観測された。結果は、ＳＩ及び阻害速度を変調させる際に、Ｐｌ残基、ＬｅｕのＴｒｐへの変化の重要性を例示する。カイメースと血清ＡＣＴとの反応は、カイメース阻害と競争する反応において分解されたインヒビターが発生する（分解されたインヒビター３．５モル／カイメース１モル）ことにより、化学量論の阻害（ＳＩ）４．０を有する。ａ−速度定数を測定するための実験条件は、物質及び９％Ｍｅ₂ＳＯ₄を存在させる他は、滴定の条件と同様であった。ほとんどのｋ_obs／［Ｉ］値は２つの実験の平均であり、平均からの偏差は典型的には１５％より小さかった。２ＭＮａＣｌ中のνＡＣＴ−Ｌ３５８Ｗ及び１ＭＮａＣｌ中のνＡＣＴ−Ｌ２５８Ｗについてのｋ_obs／［Ｉ］値は、それぞれ４及び５の測定値に基づき、ＳＤは報告された値のそれぞれ８％及び１５％であった。Ｌｅｕ３５８（Ｃａｓ）とは米国特許第５，０７９，３３６号に記載されている方法に従って調製される類似体のカセット変種を言う。本明細書中に示しかつ記載したものに加えて発明の種々の変更は前記の記載から当業者に明らかであると思う。そのような変更は、また特許請求の範囲内に入ることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/81 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 ＡＢＮ 9/99 ＡＢＥＣ１２Ｐ 21/02 ＡＤＺ // Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ特許法第30条第１項適用申請有り 1993年11月１日米国生化学及び分子生物学会発行の「ザ・ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー第268巻31号」に発表 (72)発明者ルービン，ハービーアメリカ合衆国 19103 ペンシルベニア, フィラデルフィア，マニングストリート 1925 (72)発明者シェクターノーマンアメリカ合衆国 19131 ペンシルベニア, フィラデルフィア，シティーアベニュー 6100，アパートメント 708 (72)発明者ワン，ジメイアメリカ合衆国 19104 ペンシルベニア, フィラデルフィア，サウスフォーティエスストリート 316

Claims

【特許請求の範囲】１．野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位におけるロイシンに対応するアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換されたヒト野生型 α−１−抗キモトリプシンの類似体。２．野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸がアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）で置換されたヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体。３．Ｘｘｘにおけるアミノ酸がメチオニンである請求項２の類似体。４．カイメース阻害活性を有する請求項１、２又は３の類似体。５．図１に示すアミノ酸配列を含み、配列において３５８アミノ酸位がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換された請求項１の類似体。６．図１に示すアミノ酸配列を含み、３５８アミノ酸位におけるロイシンがトリプトファンで置換された請求項１の類似体。７．図１に示す配列を含み、配列において３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕがアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ− Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）で置換された請求項２の類似体。８．随意にメチオニン−アラニン−セリン及びアラニン−セリンからなる群より選ばれるＮ−末端伸長を含む請求項１、２又は３の類似体。９．図１に示すヌクレオチド配列を含み、配列において３５６〜３６１アミノ酸位がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ −Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏでありかつアミノ酸位がメチオニンである請求項３の類似体。１０．図１に示すヌクレオチド配列を含み、配列において３５８アミノ酸位におけるロイシンの遺伝情報を指定するヌクレオチドがトリプトファンの遺伝情報を指定するヌクレオチドで置換された請求項１の類似体。１１．図１に示すヌクレオチド配列を含み、配列において３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕの遺伝情報を指定するヌクレオチドがアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）の遺伝情報を指定するヌクレオチドで置換された請求項２の類似体。１２．アミノ酸Ｘｘｘがメチオニンである請求項１１の類似体。１３．ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンのアミノ酸３５８位におけるロイシンに対応するアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換されたヒト野生型α− １−抗キモトリプシンの類似体の遺伝情報を指定する精製された核酸配列。１４．野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸の遺伝情報を指定する核酸がアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはメチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンからなる群より選ばれる）の遺伝情報を指定する核酸で置換されたヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体の精製された核酸配列。１５．アミノ酸Ｘｘｘがメチオニンである請求項１４の精製された核酸配列。１６．随意にメチオニン−セリン−アラニン及びアラニン−セリンからなる群より選ばれるＮ−末端伸長を有する請求項１３、１４又は１５の精製された核酸配列。１７．前記ヒト野生型α−１−抗キモトリプシン核酸配列が図１に示す配列を含む請求項１の核酸配列。１８．実質的にヒト野生型α−１−抗キモトリプシンに等しい配列並びにメチオニン、アラニン及びセリン；並びにアラニン及びセリンからなる群より選ばれるＮ− 末端伸長を有するヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体。１９．ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンが図１に示すアミノ酸配列を有する請求項１５のヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体。２０．実質的に野生型α−１−抗キモトリプシンに等しい配列並びにメチオニン、アラニン及びセリン；並びにアラニン及びセリンからなる群より選ばれるＮ −末端伸長を有するヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体の遺伝情報を指定する精製された核酸配列。２１．前記ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの核酸配列が図１に示す配列を含む請求項２０の核酸配列。２２．請求項１の類似体の核酸配列を含む発現ベクター。２３．請求項２の類似体の核酸配列を含む発現ベクター。２４．請求項３の類似体の核酸配列を含む発現ベクター。２５．請求項５の類似体の核酸配列を含む発現ベクター。２６．請求項１の類似体の核酸配列を発現することができる宿主細胞。２７．請求項２の類似体の核酸配列を発現することができる宿主細胞。２８．請求項３の類似体の核酸配列を発現することができる宿主細胞。２９．請求項５の類似体の核酸配列を発現することができる宿主細胞。３０．細胞を、図１に示す核酸配列を含み、更に３５８アミノ酸位にトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸の遺伝情報を指定する核酸を含む発現ベクターで形質転換させることによって得られる、野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位におけるロイシンに対応するアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換されたα−１−抗キモトリプシンを発現することができる細胞培養。３１．野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるＴｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸がアミノ酸Ｉｌｅ −Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏで置換されたα−１−抗キモトリプシンを発現することができる細胞培養であって、該α−１−抗キモトリプシンは、細胞を、図１に示す配列を含み、更に３５６〜３６１アミノ酸位におけるＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）の遺伝情報を指定する核酸を含む発現ベクターで形質転換させることによって得られる細胞培養。３２．アミノ酸Ｘｘｘがメチオニンである請求項３１の細胞培養。３３．請求項１のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を含むたんぱく質製剤。３４．請求項２のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を含むたんぱく質製剤。３５．請求項３のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を含むたんぱく質製剤。３６．請求項５のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を含むたんぱく質製剤。３７．カイメースに請求項１、２又は３のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を有効量接触させることを含むカイメースの阻害方法。３８．カイメースに請求項５のヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を有効量接触させることを含むカイメースの阻害方法。３９．ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を使用してカイメース活性を阻害する方法であって、前記カイメースに前記類似体を有効量接触させる工程を含み、該類似体は野生型α−１−抗キモトリプシンのアミノ酸３５８位におけるロイシンに対応するアミノ酸をトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換させた前記方法。４０．ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を使用してカイメース活性を阻害する方法であって、前記カイメースに前記類似体を有効量接触させる工程を含み、該類似体は野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸をアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）で置換させた前記方法。４１．アミノ酸Ｘｘｘがメチオニンである請求項４０の方法。４２．ヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を使用してカイメース活性を阻害する方法であって、前記カイメースに前記類似体を有効量接触させる工程を含み、該類似体は野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位におけるロイシンに対応するアミノ酸をトリプトファンで置換させた前記方法。４３．有効量のヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を製薬的に許容し得るキャリヤー中に含む組成物であって、該類似体は野生型α−１−抗キモトリプシンの３５８アミノ酸位におけるロイシンに対応するアミノ酸をトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれるアミノ酸で置換させた組成物。４４．有効量のヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体及び製薬的に許容し得るキャリヤーを含む組成物であって、該類似体は野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ −Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸をアミノ酸Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｘｘはトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、及びバリンからなる群より選ばれる）で置換させた組成物。４５．アミノ酸Ｘｘｘがメチオニンである請求項４４の組成物。４６．野生型α−１−抗キモトリプシンの３５６〜３６１位におけるＴｈｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕに対応するアミノ酸がＩｌｅ−Ｐｒｏ −Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏで置換されたヒト野生型α−１−抗キモトリプシンの類似体を肺の炎症を治療するための薬剤の調製において使用する方法。４７．前記炎症が酸性物質を吸引することから生じる請求項４６の方法。４８．酸性物質が胃内容物である請求項４７の方法。４９．酸性物質が煙である請求項４７の方法。５０．前記炎症が病原体による感染から生じる請求項４６の方法。５１．前記病原体がグラム陰性細菌である請求項５０の方法。５２．３５８位におけるアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、及びアルギニンからなる群より選ばれるヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を再潅流損傷を治療するための薬剤の調製において使用する方法。５３．３５８位におけるアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、及びアルギニンからなる群より選ばれるヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を血餅を治療或は予防するための薬剤の調製において使用する方法。５４．３５８位におけるアミノ酸がトリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、及びアルギニンからなる群より選ばれるヒトα−１−抗キモトリプシンの類似体を肺の炎症を治療するための薬剤の調製において使用する方法。５５．前記３５８アミノ酸位がアルギニンである請求項５２、５３、又は５４のいずれか一の方法。５６．前記３５８アミノ酸位がトリプトファンである請求項５２、５３、又は５４のいずれか一の方法。５７．前記３５８アミノ酸位がフェニルアラニンである請求項５２、５３、又は５４のいずれか一の方法。