JPH02302669A - B型肝炎ウイルス抗体検出システム - Google Patents
B型肝炎ウイルス抗体検出システムInfo
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- JPH02302669A JPH02302669A JP12157789A JP12157789A JPH02302669A JP H02302669 A JPH02302669 A JP H02302669A JP 12157789 A JP12157789 A JP 12157789A JP 12157789 A JP12157789 A JP 12157789A JP H02302669 A JPH02302669 A JP H02302669A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はB型肝炎ウィルス表面抗原(以下HBs抗原と
記す)に対する抗体(以下HBg抗体と記す)を検出す
る方法及びそのための試薬に関する。詳しくは88g抗
原をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている天然
の細胞株、及び/又は、遺伝子工学技術を用いてHBs
抗原をコードする遺伝子が人為的に細胞内に組み込まれ
た細胞株を培養することにより培養物中に産生されたH
Bs抗原を含んでなる、免疫学的反応によるHBs抗体
検出用試薬及びそれを用いる検出方法に関するものであ
る。
記す)に対する抗体(以下HBg抗体と記す)を検出す
る方法及びそのための試薬に関する。詳しくは88g抗
原をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている天然
の細胞株、及び/又は、遺伝子工学技術を用いてHBs
抗原をコードする遺伝子が人為的に細胞内に組み込まれ
た細胞株を培養することにより培養物中に産生されたH
Bs抗原を含んでなる、免疫学的反応によるHBs抗体
検出用試薬及びそれを用いる検出方法に関するものであ
る。
したがって本発明は、B型肝炎の診断、検査、ひいては
その治療にも広く利用できるものである。
その治療にも広く利用できるものである。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕B型肝
炎を引き起こすB型肝炎ウィルスは感染性が橿めて強く
、そのキャリアーは全世界で厖大な数に上ると言われて
いる。感染しても自覚症状のない場合もあるが、劇症肝
炎で死に至ることもあり、更にキャリアーの一部は慢性
肝炎から肝硬変、肝癌へと進行することから社会的に大
きな問題となっている。このようなり型肝炎の感染を未
然に予防し、かつ患者の治療を全うすることが現代臨床
医学上の大きな課題の一つとなっているのである。B型
肝炎に感染すると血清中にか出現する。このHas抗体
を高感度に検出することは、B型肝炎に関するほぼ全て
のステージ、即ち初期感染の有無、ワクチン接種の可・
不可、ワクチン接種後の有効性の判定、或いはB型肝炎
患者の病状経過の診断などにおいて必須のこととなって
いる。
炎を引き起こすB型肝炎ウィルスは感染性が橿めて強く
、そのキャリアーは全世界で厖大な数に上ると言われて
いる。感染しても自覚症状のない場合もあるが、劇症肝
炎で死に至ることもあり、更にキャリアーの一部は慢性
肝炎から肝硬変、肝癌へと進行することから社会的に大
きな問題となっている。このようなり型肝炎の感染を未
然に予防し、かつ患者の治療を全うすることが現代臨床
医学上の大きな課題の一つとなっているのである。B型
肝炎に感染すると血清中にか出現する。このHas抗体
を高感度に検出することは、B型肝炎に関するほぼ全て
のステージ、即ち初期感染の有無、ワクチン接種の可・
不可、ワクチン接種後の有効性の判定、或いはB型肝炎
患者の病状経過の診断などにおいて必須のこととなって
いる。
一般に、Has抗体の検出法としてはオフタロニー法、
交差免疫電気泳動法、エンザイムイムノアッセイ、受身
赤血球凝集反応法、ラジオイムノアッセイ等が知られて
いる。そしてこれらの検出法においては、特異性と検出
感度の点から、高度に精製された。 88g抗原の使用
が不可欠となっている。
交差免疫電気泳動法、エンザイムイムノアッセイ、受身
赤血球凝集反応法、ラジオイムノアッセイ等が知られて
いる。そしてこれらの検出法においては、特異性と検出
感度の点から、高度に精製された。 88g抗原の使用
が不可欠となっている。
従来は、HBs抗原陽性のヒト血漿若しくはヒト血清か
ら硫安分画、エタノール分画、超遠心分画、密度勾配遠
心分画、アフィニティークロマトグラフィー等公知の精
製法により精製したB型肝炎ウィルスが88g抗原の原
料として用いられて来ている。
ら硫安分画、エタノール分画、超遠心分画、密度勾配遠
心分画、アフィニティークロマトグラフィー等公知の精
製法により精製したB型肝炎ウィルスが88g抗原の原
料として用いられて来ている。
しかしながら、B型肝炎ウィルスを何ら処理することな
くこれをそのまま使用した場合、感染の危険性が非常に
高い、従って、感染を防ぐ目的で、HBs抗原ワクチン
の製法の分野で行われている技術、即ち精製B型肝炎ウ
ィルスに対して加熱処理やホルマリン処理などの不活化
処理を行ったHBs抗原をllBs抗体検出用試薬に用
いているのが現状である。
くこれをそのまま使用した場合、感染の危険性が非常に
高い、従って、感染を防ぐ目的で、HBs抗原ワクチン
の製法の分野で行われている技術、即ち精製B型肝炎ウ
ィルスに対して加熱処理やホルマリン処理などの不活化
処理を行ったHBs抗原をllBs抗体検出用試薬に用
いているのが現状である。
この場合でも、不活化処理の際には生のB型肝炎ウィル
スを取り扱う必要があり、やはり危険性がつきまとう。
スを取り扱う必要があり、やはり危険性がつきまとう。
以上のようなヒト血液を原料としているHBs抗原は、
感染の危険性が高いだけでなく、血液成分中の非特異的
凝集を呈する混在因子の影響を受は易く、又HBs抗原
、の精製に複雑な工程を必要とし、しかも大量供給が難
しくなど、多々の問題を有している。
感染の危険性が高いだけでなく、血液成分中の非特異的
凝集を呈する混在因子の影響を受は易く、又HBs抗原
、の精製に複雑な工程を必要とし、しかも大量供給が難
しくなど、多々の問題を有している。
近年、88g抗原をコードする遺伝子が組み込まれてい
る天然のヒト細胞株、或いは遺伝子工学技術を用いて該
遺伝子が人為的に組み込まれたヒト或いはマウス等の動
物細胞株を培養することによりHBs抗原を得て、これ
を診断剤に応用する報告が幾つか開示されている゛(特
開昭59−74991号、特開閉61−268177号
、特開昭61−158798号、特開昭61−2319
97号、特開昭62−55088号、特開昭63−45
227号、特開昭63−22098号など)。しかしな
がら、これらの報告は何れも製造されたHBs抗原が診
断剤として利用できる可能性を記載しているに留まって
おり、診断剤として実用化できるほど具体的に完成され
るまでには至っていないのである。
る天然のヒト細胞株、或いは遺伝子工学技術を用いて該
遺伝子が人為的に組み込まれたヒト或いはマウス等の動
物細胞株を培養することによりHBs抗原を得て、これ
を診断剤に応用する報告が幾つか開示されている゛(特
開昭59−74991号、特開閉61−268177号
、特開昭61−158798号、特開昭61−2319
97号、特開昭62−55088号、特開昭63−45
227号、特開昭63−22098号など)。しかしな
がら、これらの報告は何れも製造されたHBs抗原が診
断剤として利用できる可能性を記載しているに留まって
おり、診断剤として実用化できるほど具体的に完成され
るまでには至っていないのである。
かかる現状に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を行った結
果、遺伝子工学技術或いは細胞工学技術によって得られ
たHBs抗原が、全く予期せざることに、B型肝炎ウィ
ルスの感染による生体の免疫応答で成立したHBs抗体
と特異的に反応することを新たに見い出し、この有用な
新知見に基づき本発明を完成させるに至った。即ち、本
発明はB型肝炎ウィルスゲノムのプレーS1領域、プレ
ー32領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも一種以
上を保持している細胞から産生されたHBs抗原を含有
してなることを特徴とする、HBs抗体検出システムに
関するものである。
果、遺伝子工学技術或いは細胞工学技術によって得られ
たHBs抗原が、全く予期せざることに、B型肝炎ウィ
ルスの感染による生体の免疫応答で成立したHBs抗体
と特異的に反応することを新たに見い出し、この有用な
新知見に基づき本発明を完成させるに至った。即ち、本
発明はB型肝炎ウィルスゲノムのプレーS1領域、プレ
ー32領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも一種以
上を保持している細胞から産生されたHBs抗原を含有
してなることを特徴とする、HBs抗体検出システムに
関するものである。
本発明でいうB型肝炎ウィルスゲノムのプレーSl領域
、プレーS2領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞とは、まず、遺伝子工学技
術によりB型肝炎ウィルスゲノムのプレーSl領域、プ
レー32fiI域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を人為的に組み込んだ細胞が挙げられる。この
ように人為的に創製した細胞株においては、該遺伝子が
挿入されたプラスミドが細胞核外にエピゾームとして存
在している場合と、該遺伝子が細胞のゲノムに組み込ま
れている場合とがあるが、本発明ではこれらの両方のタ
イプの細胞株が利用され得る。次に、B型肝炎ウィルス
に自然感染した結果、該ウィルスのプレー5lffJl
域、プレー32 iff域、並びにS遺伝子のうちの少
なくとも一種以上の遺伝子がゲノムに組み込まれたヒト
細胞株、例えばヒト肝癌細胞を挙げられる。以上のよう
な条件を満たす細胞株で公知のものとして、遺伝子工学
技術により創製された細胞株ではクローン^123(特
開昭63−132845号)やMS128 (第61同
日本生化学会大会抄録、印、Na8、p、699及び特
願昭63−65070号)が挙げられ、又B型肝炎ウィ
ルスに自然感染した結果該ウィルスの遺伝子がゲノムに
組み込まれたヒト細胞株では、huSP (特開昭60
−45535号)、huGに−14(特開昭61−15
8798号)等を挙げることが出来る。
、プレーS2領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞とは、まず、遺伝子工学技
術によりB型肝炎ウィルスゲノムのプレーSl領域、プ
レー32fiI域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を人為的に組み込んだ細胞が挙げられる。この
ように人為的に創製した細胞株においては、該遺伝子が
挿入されたプラスミドが細胞核外にエピゾームとして存
在している場合と、該遺伝子が細胞のゲノムに組み込ま
れている場合とがあるが、本発明ではこれらの両方のタ
イプの細胞株が利用され得る。次に、B型肝炎ウィルス
に自然感染した結果、該ウィルスのプレー5lffJl
域、プレー32 iff域、並びにS遺伝子のうちの少
なくとも一種以上の遺伝子がゲノムに組み込まれたヒト
細胞株、例えばヒト肝癌細胞を挙げられる。以上のよう
な条件を満たす細胞株で公知のものとして、遺伝子工学
技術により創製された細胞株ではクローン^123(特
開昭63−132845号)やMS128 (第61同
日本生化学会大会抄録、印、Na8、p、699及び特
願昭63−65070号)が挙げられ、又B型肝炎ウィ
ルスに自然感染した結果該ウィルスの遺伝子がゲノムに
組み込まれたヒト細胞株では、huSP (特開昭60
−45535号)、huGに−14(特開昭61−15
8798号)等を挙げることが出来る。
これらの細胞株は何れも本発明に係るHBs抗原を取得
するのに使用され得るが、特にhuGK−14或いはM
S128の産生ずるHBs抗原を利用することが好まし
い。
するのに使用され得るが、特にhuGK−14或いはM
S128の産生ずるHBs抗原を利用することが好まし
い。
そして酵母若しくはバクテリアなどの動物細胞以外の細
胞にB型肝炎ウィルスゲノムのプレーSl fiI域、
プレー32 eff域、並びにS遺伝子のうちの少なく
とも一種以上を組み込んだ細胞は本発明では使用されな
い。
胞にB型肝炎ウィルスゲノムのプレーSl fiI域、
プレー32 eff域、並びにS遺伝子のうちの少なく
とも一種以上を組み込んだ細胞は本発明では使用されな
い。
本発明で用いられるHBs抗原は、上で述べた細胞株が
産生ずるプレSl蛋白質、プレS2蛋白質、S抗原のう
ちの少なくとも一種以上を含むものである。しかして本
発明の88g抗原は、B型肝炎ウィルス粒子に非常に類
似したウィルス外被を有しておりHBs抗体と特異的に
結合するが非感染性のものであり・また一部がグリコジ
ル化されている場合もある。
産生ずるプレSl蛋白質、プレS2蛋白質、S抗原のう
ちの少なくとも一種以上を含むものである。しかして本
発明の88g抗原は、B型肝炎ウィルス粒子に非常に類
似したウィルス外被を有しておりHBs抗体と特異的に
結合するが非感染性のものであり・また一部がグリコジ
ル化されている場合もある。
上述の細胞株を培養することにより培養液、培養上清、
培養濾液、培養細胞体といった培養物中に得られたHB
s抗原は、任意の公知方法を用いて精製を行えばよい。
培養濾液、培養細胞体といった培養物中に得られたHB
s抗原は、任意の公知方法を用いて精製を行えばよい。
−例として、限外濾過膜により培養上清を適当に濃縮後
、硫安塩析或いは超遠心分離を行い、その後塩化セシウ
ムによる平衡遠心法、庶II濃度勾配遠心法を組み合わ
せて精製する方法(特開昭61−158798号)が挙
げられる。
、硫安塩析或いは超遠心分離を行い、その後塩化セシウ
ムによる平衡遠心法、庶II濃度勾配遠心法を組み合わ
せて精製する方法(特開昭61−158798号)が挙
げられる。
以上のようにして得られたl1ls抗原は、当分野で通
常用いられている免疫学的反応に基づく抗体の検出方法
、例えばオフタロニー法、交差免疫電気泳動法、エンザ
イムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫
分析法、受身赤血球凝集反応法、並びに血球、ラテック
ス或いはその他の人工粒子を担体として用いた間接凝集
反応等によってHas抗体を検出するための試薬の主成
分として使用され・る。
常用いられている免疫学的反応に基づく抗体の検出方法
、例えばオフタロニー法、交差免疫電気泳動法、エンザ
イムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫
分析法、受身赤血球凝集反応法、並びに血球、ラテック
ス或いはその他の人工粒子を担体として用いた間接凝集
反応等によってHas抗体を検出するための試薬の主成
分として使用され・る。
本発明においては、後記するように、ヒト肝癌細胞由来
の細胞株、肝炎ウィルスDNAの形質転換細胞株といっ
た既知の細胞株を使用できるが、特にこのような場合に
は危険なり型肝炎ウィルスを直接取扱う必要がないため
、感染することもなくきわめて安全である。
の細胞株、肝炎ウィルスDNAの形質転換細胞株といっ
た既知の細胞株を使用できるが、特にこのような場合に
は危険なり型肝炎ウィルスを直接取扱う必要がないため
、感染することもなくきわめて安全である。
本発明のHBs抗体検出用試薬を、HBs抗原陽性のヒ
ト血漿若しくはヒト血清を原料として製造されたHBs
抗原を主成分として含有する従来のHBs抗体検出用試
薬と比較すると、以下に記す有利な点を有している。
ト血漿若しくはヒト血清を原料として製造されたHBs
抗原を主成分として含有する従来のHBs抗体検出用試
薬と比較すると、以下に記す有利な点を有している。
まずHas抗体検出用試薬の主成分であるHBs抗原の
製造に当たっては、 l)従来、感染予防の目的で精製された)IBs抗原に
対して行われてきたホルマリン処理或いは加熱処理など
の不活化処理が不要である。
製造に当たっては、 l)従来、感染予防の目的で精製された)IBs抗原に
対して行われてきたホルマリン処理或いは加熱処理など
の不活化処理が不要である。
そして、HBs抗体の検出に関しては、2)従来のHB
s抗原陽性ヒト血漿由来のHBs抗原を主成分とする試
薬につきものの、血液成分に起因する非特異的反応が起
こらない。
s抗原陽性ヒト血漿由来のHBs抗原を主成分とする試
薬につきものの、血液成分に起因する非特異的反応が起
こらない。
3)従来のllBs抗原陽性ヒト血漿由来のHBs抗原
を主成分とするllBs抗体検出用試薬を用いては全く
検出出来ないか、或いは極く僅かの検出感度しか得るこ
との出来なかったHas抗体を、特異性よく、しかも高
感度に検出できる。
を主成分とするllBs抗体検出用試薬を用いては全く
検出出来ないか、或いは極く僅かの検出感度しか得るこ
との出来なかったHas抗体を、特異性よく、しかも高
感度に検出できる。
等の優れた特性を有しているのである。
次に本発明に係るHBs抗原の製造例を示す。
(1)培養細胞由来のHBs抗原の製造ヒト肝癌細胞由
来の細胞株huGK−14(微生物工業技術研究所に寄
託番号FERM P−10665として寄託されている
)についてはその培養上清より、特許協力条約に基づい
て公開された国際特許出願国際公開番号−086103
975に記載の方法に従ってHas抗原を精製した。簡
単に述べると、(a)培養上清を限外濾過膜により10
〜30倍に?!4縮、(b)得られた濃縮液を抗HBs
抗原モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムに負荷、(C)カラムに吸着し
ている蛋白質を溶出、@溶出液を塩化セシウムを用いた
平衡密度勾配超遠心にかける、(e)抗原画分を取り出
して緩衝液で透析、(f)メンブレンフィルターに通す
ことにより濾過滅菌、というステップを踏んで精製HB
s抗原を得た。
来の細胞株huGK−14(微生物工業技術研究所に寄
託番号FERM P−10665として寄託されている
)についてはその培養上清より、特許協力条約に基づい
て公開された国際特許出願国際公開番号−086103
975に記載の方法に従ってHas抗原を精製した。簡
単に述べると、(a)培養上清を限外濾過膜により10
〜30倍に?!4縮、(b)得られた濃縮液を抗HBs
抗原モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムに負荷、(C)カラムに吸着し
ている蛋白質を溶出、@溶出液を塩化セシウムを用いた
平衡密度勾配超遠心にかける、(e)抗原画分を取り出
して緩衝液で透析、(f)メンブレンフィルターに通す
ことにより濾過滅菌、というステップを踏んで精製HB
s抗原を得た。
R−I11マウス由来の培養細胞Cl27(ATCCC
RL1616)にB型肝炎ウィルスのDNAをトランス
フェクトして得られた形質転換細胞株MS128(微生
物工業技術研究所に寄託番号FERM P−9773と
して寄託されている)についてもhuGK−14の場合
と同じ方法で培養上清より精製HBs抗原を得た。
RL1616)にB型肝炎ウィルスのDNAをトランス
フェクトして得られた形質転換細胞株MS128(微生
物工業技術研究所に寄託番号FERM P−9773と
して寄託されている)についてもhuGK−14の場合
と同じ方法で培養上清より精製HBs抗原を得た。
(2)血清由来のHBs抗原の製造
HBs抗原陽性プール血清より常法により精製した。具
体的に用いた方法は以下の通りである。
体的に用いた方法は以下の通りである。
HBs抗原陽性血清201をpH7,0において飽和硫
安50〜55%で沈澱分画後生理食塩水で溶解し、同溶
液で塩析した。塩析内液をセファロース6B(ファルマ
シア社製)カラム(φ5X100CIl)に負荷して分
画しつつゲル濾過した。2B0ns+における吸光度の
最初のピークの画分を取り、これを粗HBs抗原とした
。この粗HBs抗原を抗HBsモノクローナル抗体(ジ
ノテスト社製)結合セファロース4B(ファルマシア社
製)カラム(φ5×3C層)に負荷し、pH7,6のP
BS (本明細書の比較例及び実施例で用いられたPB
SのpH1以下全て7.6であった)で洗浄後、3Mの
にSCNを含むPBSによりカラムに吸着された物質を
溶出した。これをPBSで透析後、透析内液を塩化セシ
ウムによる平衡遠心法を用いて、超遠心機(日立製作所
型5CP85)1 )にて130,0OOX g 、
50時間遠心し、HBs抗原画分を得た。この両分をP
BSで透析した後、透析内液を取って60″Cで10時
間の不活化処理を行って精製HBs抗原を得た。
安50〜55%で沈澱分画後生理食塩水で溶解し、同溶
液で塩析した。塩析内液をセファロース6B(ファルマ
シア社製)カラム(φ5X100CIl)に負荷して分
画しつつゲル濾過した。2B0ns+における吸光度の
最初のピークの画分を取り、これを粗HBs抗原とした
。この粗HBs抗原を抗HBsモノクローナル抗体(ジ
ノテスト社製)結合セファロース4B(ファルマシア社
製)カラム(φ5×3C層)に負荷し、pH7,6のP
BS (本明細書の比較例及び実施例で用いられたPB
SのpH1以下全て7.6であった)で洗浄後、3Mの
にSCNを含むPBSによりカラムに吸着された物質を
溶出した。これをPBSで透析後、透析内液を塩化セシ
ウムによる平衡遠心法を用いて、超遠心機(日立製作所
型5CP85)1 )にて130,0OOX g 、
50時間遠心し、HBs抗原画分を得た。この両分をP
BSで透析した後、透析内液を取って60″Cで10時
間の不活化処理を行って精製HBs抗原を得た。
本発明に係るHBs抗原と従来のHBs抗原とのHBs
抗体に対する検出感度を受身赤血球凝集法によって比較
した。
抗体に対する検出感度を受身赤血球凝集法によって比較
した。
(1) HBs抗原感作赤血球の調製
市販のヒツジ赤血球を生理食塩水で洗浄した後、PBS
で5%(v/v)に浮遊させたちの4容に対し、2.5
%(W/V)のグルタルアルデヒドのPBS溶液1容を
加え、室温で2時間反応させた。反応終了後PBSで遠
心洗浄し、グルタルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球を得
た。該固定化ヒツジ赤血球の5%PBS浮遊液1容に、
0.005%(w/v)タンニン酸を含むP B S
?9液1容を加え室温で30分間反応させた後PBSで
遠心洗浄して、タンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球を得
た。このタンニン酸処理固定化赤血球の5%PBS浮遊
液1容に対し、製造例に従って調製されたhuGK−1
4細胞由来のHBs抗原のPBS懸濁液(1mg/d)
、若しくは血清由来のHBs抗原のPBS懸濁液(1■
/d)1容を加え、室温で3時間反応させた。これらの
反応液をそれぞれPBSで遠心洗浄し、赤血球濃度が0
.5%(w/v)となるように1%(v/v)正常ウサ
ギ血清を含むPBSに浮遊させた。
で5%(v/v)に浮遊させたちの4容に対し、2.5
%(W/V)のグルタルアルデヒドのPBS溶液1容を
加え、室温で2時間反応させた。反応終了後PBSで遠
心洗浄し、グルタルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球を得
た。該固定化ヒツジ赤血球の5%PBS浮遊液1容に、
0.005%(w/v)タンニン酸を含むP B S
?9液1容を加え室温で30分間反応させた後PBSで
遠心洗浄して、タンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球を得
た。このタンニン酸処理固定化赤血球の5%PBS浮遊
液1容に対し、製造例に従って調製されたhuGK−1
4細胞由来のHBs抗原のPBS懸濁液(1mg/d)
、若しくは血清由来のHBs抗原のPBS懸濁液(1■
/d)1容を加え、室温で3時間反応させた。これらの
反応液をそれぞれPBSで遠心洗浄し、赤血球濃度が0
.5%(w/v)となるように1%(v/v)正常ウサ
ギ血清を含むPBSに浮遊させた。
以上のようにして得られたhuGK−14細胞由来のH
Bs抗原若しくは血清由来の88g抗原を結合させたタ
ンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球(以下Has抗原感作
固定化ヒツジ赤血球という)を以下の試験に供した。
Bs抗原若しくは血清由来の88g抗原を結合させたタ
ンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球(以下Has抗原感作
固定化ヒツジ赤血球という)を以下の試験に供した。
(2)検出方法
市販のラジオイムノアッセイ用試薬でHBs抗体陽性と
された血清22検体について、上記(1)に従って調製
されたhuGK−14細胞由来HBs抗原惑作固定化ヒ
ツジ赤血球若しくは血清由来HBg抗原感作固定化ヒツ
ジ赤血球を用いて、受身赤血球凝集法によりHBs抗体
を下記の要領にて検出を試みた。
された血清22検体について、上記(1)に従って調製
されたhuGK−14細胞由来HBs抗原惑作固定化ヒ
ツジ赤血球若しくは血清由来HBg抗原感作固定化ヒツ
ジ赤血球を用いて、受身赤血球凝集法によりHBs抗体
を下記の要領にて検出を試みた。
まず上記検体をPBSで10倍に希釈した後、これらの
各希釈検体25μ!をU型96六マイクロプレート(住
人ベークライト社製)の各ウェルに入れ、1%(v/v
)正常ウサギ血清を含むPBS 25μ!を加えて検体
を希釈した(20倍希釈)。この20倍希釈液から25
μ!を取って別のウェルに入れ、1%(v/v)正常ウ
サギ血清を含むPBS 25μlを加えて検体を希釈し
た(40倍希釈)。このような希釈操作を繰り返すこと
により、希釈倍数、/)420〜2,560倍(2’
〜211X10) ノ検体を得た0次に各ウェルに前記
(1)で得られたIBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球(
huGK−14細胞由来HBs抗原若しくは血清由来H
Bs抗原)のPBS浮遊液(0,5%(w/v) )2
5μβづつを加え、プレート全体をマイクロミキサーで
1分間振擾し、室温にて2時間静置した後、赤血球凝集
の有無にょるHBg抗体の検出を行って、各HBs抗原
感作固定化ヒツジ赤血球の検出感度を凝集価で評価した
。
各希釈検体25μ!をU型96六マイクロプレート(住
人ベークライト社製)の各ウェルに入れ、1%(v/v
)正常ウサギ血清を含むPBS 25μ!を加えて検体
を希釈した(20倍希釈)。この20倍希釈液から25
μ!を取って別のウェルに入れ、1%(v/v)正常ウ
サギ血清を含むPBS 25μlを加えて検体を希釈し
た(40倍希釈)。このような希釈操作を繰り返すこと
により、希釈倍数、/)420〜2,560倍(2’
〜211X10) ノ検体を得た0次に各ウェルに前記
(1)で得られたIBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球(
huGK−14細胞由来HBs抗原若しくは血清由来H
Bs抗原)のPBS浮遊液(0,5%(w/v) )2
5μβづつを加え、プレート全体をマイクロミキサーで
1分間振擾し、室温にて2時間静置した後、赤血球凝集
の有無にょるHBg抗体の検出を行って、各HBs抗原
感作固定化ヒツジ赤血球の検出感度を凝集価で評価した
。
凝集価は各検体において赤血球の凝集が認められた終末
点(end paint)における希釈倍数値で表わし
た。
点(end paint)における希釈倍数値で表わし
た。
11Bs抗原を感作していない固定化ヒツジ赤血球のP
BS浮遊溶液を用いた他は上記と同じ方法及び試薬によ
る実験を対照実験として行った。
BS浮遊溶液を用いた他は上記と同じ方法及び試薬によ
る実験を対照実験として行った。
凝集価の測定結果を第1図に示す、第1図においては横
軸にhuGK−14細胞由来HBs抗原惑作赤血球の凝
集価を、縦軸に血清由来HBs抗原感作赤血球の凝集価
を取り、各々の検体の両HBs抗原感作赤血球による凝
集価を座標としてグラフ上に・又はOでポイントした。
軸にhuGK−14細胞由来HBs抗原惑作赤血球の凝
集価を、縦軸に血清由来HBs抗原感作赤血球の凝集価
を取り、各々の検体の両HBs抗原感作赤血球による凝
集価を座標としてグラフ上に・又はOでポイントした。
この図の座標のN、D、は全での検出濃度に亙って検出
されなかったこと(no t de tec Led)
を意味する。
されなかったこと(no t de tec Led)
を意味する。
この図に示されているように、HBs抗原として血清由
来のllBs抗原を用いた場合に比べて、huGK−1
4細胞由来のHBs抗原を用いた場合の方が、一部の例
外を除き、同一検体に対して2倍以上高い検出感度を有
することが判明した。これら22検体の内、特に2検体
(第1図中の○で示した検体NTII及び阻2)に関し
ては、血清由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用いた
場合には、殆ど凝集しなかったのに対し、huGK−1
4細胞由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用いた場合
には高い凝集価を示した。
来のllBs抗原を用いた場合に比べて、huGK−1
4細胞由来のHBs抗原を用いた場合の方が、一部の例
外を除き、同一検体に対して2倍以上高い検出感度を有
することが判明した。これら22検体の内、特に2検体
(第1図中の○で示した検体NTII及び阻2)に関し
ては、血清由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用いた
場合には、殆ど凝集しなかったのに対し、huGK−1
4細胞由来のHBs抗原感作固定化赤血球を用いた場合
には高い凝集価を示した。
すなわち、検体Na2においては、従来法(血清由来H
Bs抗原を用いた試薬)によれば凝集が生じなかった(
N、D、)のに対して、本発明によれば640倍もの高
稀釈でも抗体が検出された。また検体Nalにおいて、
従来法によれば20倍の希釈でやっと抗体が検出された
めに対して、本発明によれば320倍希釈でも抗体が検
出され、160倍もの高い検出感度を有することが実証
された。
Bs抗原を用いた試薬)によれば凝集が生じなかった(
N、D、)のに対して、本発明によれば640倍もの高
稀釈でも抗体が検出された。また検体Nalにおいて、
従来法によれば20倍の希釈でやっと抗体が検出された
めに対して、本発明によれば320倍希釈でも抗体が検
出され、160倍もの高い検出感度を有することが実証
された。
一方対照実験においては、何れの検体の場合でも固定化
ヒツジ赤血球の凝集は認められなかった。
ヒツジ赤血球の凝集は認められなかった。
上記の血清由来のHBg抗原感作固定化赤血球を用いた
場合とhuGK−14細胞由来のRag抗原感作固定化
赤血球を用いた場合とで著しい検出感度の差が見られた
2検体(N11.l及びNa2)について、これがHB
a抗体に対する特異的な反応によるものであることを確
認するために、HBs抗原による吸収試験を以下の(3
)に記載の方法により行った。
場合とhuGK−14細胞由来のRag抗原感作固定化
赤血球を用いた場合とで著しい検出感度の差が見られた
2検体(N11.l及びNa2)について、これがHB
a抗体に対する特異的な反応によるものであることを確
認するために、HBs抗原による吸収試験を以下の(3
)に記載の方法により行った。
(3) HBs抗原による吸収試験
上記(2)においてhuGK−14細胞由来のHBs抗
原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した血清2検
体(第1図のOで示した検体−1及び隘2)と、市販の
抗HBgモノクローナル抗体(英国ケンブリッジラボ社
製)を1μg/alの割合で添加されたヒト正常血清(
ポジティブコントロールとして使用)を用意し、これら
の計3検体をPBSで10倍に希釈した。この10倍希
釈された各検体25μlをU型96六マイクロプレート
(住友ヘークライト社製)のウェルに入れ、1%(v/
v)正常ウサギ血清を含むPB525μ2を用いて上記
(2)と同じ様にして各検体を倍々希釈した系列(20
〜2560倍)を作った0次いでhulJ−14細胞由
来の精製HBs抗原(2μs/me)の1%(v/v)
正常ウサギ血清−PBS懸濁液10u1.を前記の各ウ
ェルに添加し、プレート全体をマイクロミキサーで1分
間振盪した後、室温で2時間反応させた。
原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した血清2検
体(第1図のOで示した検体−1及び隘2)と、市販の
抗HBgモノクローナル抗体(英国ケンブリッジラボ社
製)を1μg/alの割合で添加されたヒト正常血清(
ポジティブコントロールとして使用)を用意し、これら
の計3検体をPBSで10倍に希釈した。この10倍希
釈された各検体25μlをU型96六マイクロプレート
(住友ヘークライト社製)のウェルに入れ、1%(v/
v)正常ウサギ血清を含むPB525μ2を用いて上記
(2)と同じ様にして各検体を倍々希釈した系列(20
〜2560倍)を作った0次いでhulJ−14細胞由
来の精製HBs抗原(2μs/me)の1%(v/v)
正常ウサギ血清−PBS懸濁液10u1.を前記の各ウ
ェルに添加し、プレート全体をマイクロミキサーで1分
間振盪した後、室温で2時間反応させた。
huGK−14細胞由来の精製88g抗原の代わりに1
%(v/v)正常ウサギ血清−PBS 10μlを用い
た他は上と同じ条件の実験を対照実験として行った。
%(v/v)正常ウサギ血清−PBS 10μlを用い
た他は上と同じ条件の実験を対照実験として行った。
反応終了後、各ウェルに0.5%(w/v) huGK
−14細胞由来のHBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球の
浮遊液25μlづつを加え、プレートをマイクロミキサ
ーで1分間振盪して、室温にて2時間静置後の赤血球凝
集反応の有無から上記(2)と同様にして凝集価を決定
した。
−14細胞由来のHBs抗原感作固定化ヒツジ赤血球の
浮遊液25μlづつを加え、プレートをマイクロミキサ
ーで1分間振盪して、室温にて2時間静置後の赤血球凝
集反応の有無から上記(2)と同様にして凝集価を決定
した。
この結果を表1に示す。
表1
1)抗HBgモノクローナル抗体
2)−は全ての希釈倍率に亙って赤血球の凝集が起こら
なかったことを示す。
なかったことを示す。
対照実験を基準とすると、3つの検体の何れにおいても
huGに一14細胞由来のHBs抗原を添加することに
より大幅に赤血球凝集が阻止されることが表1から示さ
れた。このことから上記(2)において2つの検体N1
1l及びNa2について血清由来のHBs抗原感作固定
化赤血球を用いた場合とhu(J−14細胞由来のHB
s抗原感作固定化赤血球を用いた場合とで著しい検出感
度の差が見られたのは、HBs抗体に対する特異的な反
応によるためであ企ことを確認された。
huGに一14細胞由来のHBs抗原を添加することに
より大幅に赤血球凝集が阻止されることが表1から示さ
れた。このことから上記(2)において2つの検体N1
1l及びNa2について血清由来のHBs抗原感作固定
化赤血球を用いた場合とhu(J−14細胞由来のHB
s抗原感作固定化赤血球を用いた場合とで著しい検出感
度の差が見られたのは、HBs抗体に対する特異的な反
応によるためであ企ことを確認された。
(4)結論
以上の比較例における実験結果から、本発明でHas抗
体検出用試薬として使用されるhuGK−14細胞由来
のHas抗原は当業者の予想を越えた検出感度を有し、
しかもその検出感度の高さはHBs抗体に対する特異的
な反応によるものであって、非特異的な反応によるもの
ではないことが示された。
体検出用試薬として使用されるhuGK−14細胞由来
のHas抗原は当業者の予想を越えた検出感度を有し、
しかもその検出感度の高さはHBs抗体に対する特異的
な反応によるものであって、非特異的な反応によるもの
ではないことが示された。
以上の比較例において、B型肝炎ウィルスゲノムのプレ
ーsHI域、プレー32領域、並びにS遺伝子のうちの
少なくとも一種以上を保持している細胞としてhuGK
−14を一例として用い、その培養上清から得られたH
as抗原について、血清由来のHas抗原との検出感度
の比較及び、HBs抗体に対する反応特異性を述べた。
ーsHI域、プレー32領域、並びにS遺伝子のうちの
少なくとも一種以上を保持している細胞としてhuGK
−14を一例として用い、その培養上清から得られたH
as抗原について、血清由来のHas抗原との検出感度
の比較及び、HBs抗体に対する反応特異性を述べた。
本発明に係るhuGK−14細胞或いはMS128細胞
の培養上清より得られた精製HBs抗原をHBs抗体検
出用試薬の主成分として用いて、HBs抗体を免疫学的
反応により検出した例を以下に実施例として記載する。
の培養上清より得られた精製HBs抗原をHBs抗体検
出用試薬の主成分として用いて、HBs抗体を免疫学的
反応により検出した例を以下に実施例として記載する。
実施例1
エンザイムイムノアッセイによるHBg抗体の検出(1
) HBs抗原結合マイクロプレートの調製huGK−
14細胞の培養上清より得られた精製HBs抗原をPB
Sで1μg/mlに希釈し、これをエンザイムイムノア
ッセイ用96六マイクロプレート(住人ベークライト社
製)の各ウェルに50plずつ分注した。このプレート
を4℃で10時間放置して08g抗原をウェルに吸着さ
せた後PBSで洗浄し、1%(v/v)BSA−PBS
溶液を200uj!加えて4℃で5時間放置することに
よりウェルの抗原未吸着部分を覆い、HBs抗原結合マ
イクロプレートを調製した。
) HBs抗原結合マイクロプレートの調製huGK−
14細胞の培養上清より得られた精製HBs抗原をPB
Sで1μg/mlに希釈し、これをエンザイムイムノア
ッセイ用96六マイクロプレート(住人ベークライト社
製)の各ウェルに50plずつ分注した。このプレート
を4℃で10時間放置して08g抗原をウェルに吸着さ
せた後PBSで洗浄し、1%(v/v)BSA−PBS
溶液を200uj!加えて4℃で5時間放置することに
よりウェルの抗原未吸着部分を覆い、HBs抗原結合マ
イクロプレートを調製した。
以上のようにして得られたHBg抗原結合マイクロプレ
ートを以下の実験に供した。
ートを以下の実験に供した。
(2)パーオキシダーゼで標識された抗ヒトIgG抗体
の調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ(ベーリンガー社製、グレ
ードり5■を0.3M炭酸緩衝液(pH8,1)1mに
溶解し、これに2.4−ジニトロフルオロベンゼン(D
NFB)の1%溶液0.2−を加え、室温で1時間撹拌
した。得られたDNFB結合パーオキシダーゼを0.0
1?l炭酸緩衝液(pH9,5)に対して透析した。透
析内液を取り、これに精製抗ヒトIgGウサギ抗体(カ
ッペル社製)5■を含むo、otn炭酸緩衝液1jdを
添加して、室温で2時間撹拌した。この反応液を予めP
BSで平衡化しておいたセファロース6B(ファルマシ
ア社製)カラム(φ2.5X100cm)に負荷して5
dづつ分画しつつゲル濾過した。得られた各両分につい
て2B0nmにおける吸光度(蛋白質、濃度)及び40
3n−における吸光度(西洋ワサビパーオキシダーゼ)
を測定して、両吸光度の最初のピークに溶出されてきた
両分を取って、これをパーオキシダーゼで標識化された
抗ヒトIgG抗体とした。
の調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ(ベーリンガー社製、グレ
ードり5■を0.3M炭酸緩衝液(pH8,1)1mに
溶解し、これに2.4−ジニトロフルオロベンゼン(D
NFB)の1%溶液0.2−を加え、室温で1時間撹拌
した。得られたDNFB結合パーオキシダーゼを0.0
1?l炭酸緩衝液(pH9,5)に対して透析した。透
析内液を取り、これに精製抗ヒトIgGウサギ抗体(カ
ッペル社製)5■を含むo、otn炭酸緩衝液1jdを
添加して、室温で2時間撹拌した。この反応液を予めP
BSで平衡化しておいたセファロース6B(ファルマシ
ア社製)カラム(φ2.5X100cm)に負荷して5
dづつ分画しつつゲル濾過した。得られた各両分につい
て2B0nmにおける吸光度(蛋白質、濃度)及び40
3n−における吸光度(西洋ワサビパーオキシダーゼ)
を測定して、両吸光度の最初のピークに溶出されてきた
両分を取って、これをパーオキシダーゼで標識化された
抗ヒトIgG抗体とした。
(3) Hag抗体の検出
比較例の(2)のllBs抗体の検出で用いたHas抗
体陽性ヒト血清のうちのhuGK−14細胞由来のHB
s抗原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した2検
体及びHBs抗体陰性ヒト血清l検体の計3検体を[%
BSA (w/v)−PBS溶液によりそれぞれ50倍
希釈した。これらの50倍希釈液を1倍として試験管内
で1%BSA (w/v)−PBS溶液により倍々希釈
(100〜12.800倍)した、これらの各希釈血清
50μlを上記lll5抗原結合マイクロプレートの各
ウェルに添加して、ウェットチェンバー内で37℃3時
間反応させた0反応終了稜線マイクロプレートの各ウェ
ルを0.05%ツイーン2〇−PBS溶液で十分に洗浄
し、上記(2)で得られた西洋ワサビパーオキシダーゼ
標識化抗ヒ)IgGウサギ抗体の1%BSA (w/v
)−PBS希釈液50ulを添加して、ウェットチェン
バー内で37℃3時間反応させた。その後各ウェルを0
.05%ツイーン2O−PBS溶液を用いて十分に洗浄
し、OPD溶液(Method in I!nzymo
logy+ lJl+ p、432)を100μiずつ
添加して、37℃で30分間反応させた。
体陽性ヒト血清のうちのhuGK−14細胞由来のHB
s抗原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した2検
体及びHBs抗体陰性ヒト血清l検体の計3検体を[%
BSA (w/v)−PBS溶液によりそれぞれ50倍
希釈した。これらの50倍希釈液を1倍として試験管内
で1%BSA (w/v)−PBS溶液により倍々希釈
(100〜12.800倍)した、これらの各希釈血清
50μlを上記lll5抗原結合マイクロプレートの各
ウェルに添加して、ウェットチェンバー内で37℃3時
間反応させた0反応終了稜線マイクロプレートの各ウェ
ルを0.05%ツイーン2〇−PBS溶液で十分に洗浄
し、上記(2)で得られた西洋ワサビパーオキシダーゼ
標識化抗ヒ)IgGウサギ抗体の1%BSA (w/v
)−PBS希釈液50ulを添加して、ウェットチェン
バー内で37℃3時間反応させた。その後各ウェルを0
.05%ツイーン2O−PBS溶液を用いて十分に洗浄
し、OPD溶液(Method in I!nzymo
logy+ lJl+ p、432)を100μiずつ
添加して、37℃で30分間反応させた。
次いで4N硫酸を1’OO,crj!づつ各ウェルに添
加して反応を停止させ、各ウェルの吸光度をマイクロプ
レートリーダー(コロナ電気社製)によって計測した。
加して反応を停止させ、各ウェルの吸光度をマイクロプ
レートリーダー(コロナ電気社製)によって計測した。
対照実験として、08g抗原を結合していないマイクロ
プレートを用いて以上と同様の実験を行った。
プレートを用いて以上と同様の実験を行った。
結果を第2図に示す。
この図が示すように、本発明に係るHag抗体検出用試
薬を結合せしめたマイクロプレートによりHBs抗体を
特異的に検出することが出来た。
薬を結合せしめたマイクロプレートによりHBs抗体を
特異的に検出することが出来た。
実施例2
マイクロプレートを用いた間接凝集法によるHBs抗体
の検出; llBs抗原としてhuGK−14細胞由来
の精製18g抗原を使用 (1) HBg抗原結合担体粒子の調製PBSに対して
2%(w/v)となるように浮遊させた高比重粒子(徳
山曹達社製)l容に対し、huGK−14細胞より得ら
れた精製Has抗原(20μg/d)1容を加え、4℃
で1時間保持して、粒子にHBs抗原を結合させた。そ
して該粒子をPBSで洗浄し、非特異的吸着を抑えるた
めにl (w/ν)BSA −PBS中に更に4℃lO
時間該粒子を浸漬した。
の検出; llBs抗原としてhuGK−14細胞由来
の精製18g抗原を使用 (1) HBg抗原結合担体粒子の調製PBSに対して
2%(w/v)となるように浮遊させた高比重粒子(徳
山曹達社製)l容に対し、huGK−14細胞より得ら
れた精製Has抗原(20μg/d)1容を加え、4℃
で1時間保持して、粒子にHBs抗原を結合させた。そ
して該粒子をPBSで洗浄し、非特異的吸着を抑えるた
めにl (w/ν)BSA −PBS中に更に4℃lO
時間該粒子を浸漬した。
その後この粒子を1%(v/v)正常ウサギ血清−pa
sで1回遠心洗浄し、゛最終的に0.3%(w/ν)と
なるように1%(v/v)正常ウサギ血清−PBSに浮
遊させたHBs抗原結合粒子を得た。
sで1回遠心洗浄し、゛最終的に0.3%(w/ν)と
なるように1%(v/v)正常ウサギ血清−PBSに浮
遊させたHBs抗原結合粒子を得た。
以上のようにして得られたHBs抗原結合粒子を以下の
実験に供した。
実験に供した。
(2) HBs抗原結合測定マイクロプレートの調製P
BSで1ug/−に希釈した精製11Bs抗原をU型9
6六マイクロプレート(住人ベークライト社製)の各ウ
ェルに50μ2ずつ分注し、4 ’Cで一晩放置して該
HBs抗原を該マイクロプレートに吸着させた。その後
各ウェルをPBSで洗浄し、1%(&4/v)BSA−
PBS 200μj!を加え、最後に4°Cで3時間放
置してウェルの抗原未吸着部分を覆うことによりHBs
抗原の結合したマイクロプレートを調製した。
BSで1ug/−に希釈した精製11Bs抗原をU型9
6六マイクロプレート(住人ベークライト社製)の各ウ
ェルに50μ2ずつ分注し、4 ’Cで一晩放置して該
HBs抗原を該マイクロプレートに吸着させた。その後
各ウェルをPBSで洗浄し、1%(&4/v)BSA−
PBS 200μj!を加え、最後に4°Cで3時間放
置してウェルの抗原未吸着部分を覆うことによりHBs
抗原の結合したマイクロプレートを調製した。
(3) HBs抗体の検出
比較例の(2)のHBs抗体の検出で用いたヒト血清検
体のうちからhuGに一14細胞由来HBs抗原感作固
定化赤血球のみに高い凝集性を示した2検体(Nal及
びNa2) 、抗Hasモノクローナル抗体(英国ケン
ブリッジラボ社製)を1μg/dとなるように添加した
ヒト正常血清HBs抗体(ポジティブコントロールとし
て使用)、及びHBs抗体陰性ヒト血清(ネガティブコ
ントロールとして使用)、の計4検体をPBSでそれぞ
れ10倍に希釈した。これらの希釈血清25μ!を0.
2%(w/v)ツイーン20及び2%(w/v) BS
Aを含むPBS 25ulを用いて、前記(2)で調製
したHBs抗原結合マイクロプレートの各ウェル中にて
倍々希釈(20〜2.560倍)した0次に各ウェルに
前記(1)で調製されたHBs抗原結合粒子の浮遊液を
25μβづつ加え、マイクロプレートをマイクロミキサ
ーで1分間振盪後、室温で1時間静置して凝集像を肉眼
で判定した。
体のうちからhuGに一14細胞由来HBs抗原感作固
定化赤血球のみに高い凝集性を示した2検体(Nal及
びNa2) 、抗Hasモノクローナル抗体(英国ケン
ブリッジラボ社製)を1μg/dとなるように添加した
ヒト正常血清HBs抗体(ポジティブコントロールとし
て使用)、及びHBs抗体陰性ヒト血清(ネガティブコ
ントロールとして使用)、の計4検体をPBSでそれぞ
れ10倍に希釈した。これらの希釈血清25μ!を0.
2%(w/v)ツイーン20及び2%(w/v) BS
Aを含むPBS 25ulを用いて、前記(2)で調製
したHBs抗原結合マイクロプレートの各ウェル中にて
倍々希釈(20〜2.560倍)した0次に各ウェルに
前記(1)で調製されたHBs抗原結合粒子の浮遊液を
25μβづつ加え、マイクロプレートをマイクロミキサ
ーで1分間振盪後、室温で1時間静置して凝集像を肉眼
で判定した。
一方これとは別に、)IBs抗原を結合していない高比
重粒子の浮遊液を用い、他の方法と試薬は同一とした実
験を対照実験として行った。
重粒子の浮遊液を用い、他の方法と試薬は同一とした実
験を対照実験として行った。
凝集価は各検体において凝集像が認められた終末点にお
ける希釈倍数値で表わした。
ける希釈倍数値で表わした。
結果を表2に示す。
表2
1)抗HBsモノクローナル抗体
2)−は全ての希釈倍率に亙って粒子の凝集が起こらな
かったことを示す。
かったことを示す。
この表2が示すように、本発明に係るhuGK14細胞
由来のHBg抗体検出用試薬を結合せしめた粒子の凝集
反応により、HBg抗体を特異的に検出することが出来
た。
由来のHBg抗体検出用試薬を結合せしめた粒子の凝集
反応により、HBg抗体を特異的に検出することが出来
た。
実施例3
マイクロプレートを用いた間接凝集法によるHBs抗体
の検出: HBs抗原としてl’ls 128細胞由来
の精製HBs抗原を使用 (1) HBs抗原結合担体粒子の調製HBs抗原とし
てMS128細胞の培養上清より得られた精製Has抗
原を用いた以外は実施例2(1)と同じ方法でHas抗
原結合担体粒子を調製した。
の検出: HBs抗原としてl’ls 128細胞由来
の精製HBs抗原を使用 (1) HBs抗原結合担体粒子の調製HBs抗原とし
てMS128細胞の培養上清より得られた精製Has抗
原を用いた以外は実施例2(1)と同じ方法でHas抗
原結合担体粒子を調製した。
(2) 1(Bs抗原結合測定マイクロプレートの調製
88g抗原としてMS128細胞の培養上清より得られ
た精製HBs抗原を用いた以外は実施例2(2)と同じ
方法でHas抗原結合測定マイクロプレートを調製した
。
88g抗原としてMS128細胞の培養上清より得られ
た精製HBs抗原を用いた以外は実施例2(2)と同じ
方法でHas抗原結合測定マイクロプレートを調製した
。
(3) Has抗体の検出
市販のラジオイムノアッセイ用試薬でHBs抗体陽性と
された血清80検体をpusで20倍に希釈した。これ
らの希釈血清25μlを0.2%(in/v)ツイーン
20及び2%(w/v) BSAを含むPBS 25u
iを用いて、前記(2)で調製したHas抗原結合マイ
クロプレートの各ウェル中にて倍々希釈(40〜10.
240倍)した0次に各ウェルに前記(1)で調製され
たHBs抗原結合粒子の浮遊液を25μ!づつ加え、マ
イクロプレートをマイクロミキサーで1分間振盪後、室
温で1時間静置して凝集像を肉眼で判定した。各検体の
凝集価の決定は実施例2と同じである。
された血清80検体をpusで20倍に希釈した。これ
らの希釈血清25μlを0.2%(in/v)ツイーン
20及び2%(w/v) BSAを含むPBS 25u
iを用いて、前記(2)で調製したHas抗原結合マイ
クロプレートの各ウェル中にて倍々希釈(40〜10.
240倍)した0次に各ウェルに前記(1)で調製され
たHBs抗原結合粒子の浮遊液を25μ!づつ加え、マ
イクロプレートをマイクロミキサーで1分間振盪後、室
温で1時間静置して凝集像を肉眼で判定した。各検体の
凝集価の決定は実施例2と同じである。
対照として、huGK−14細胞由来の精製HBs抗原
を用いて上と全く同じ方法で調製したHBs抗原結合マ
イクロプレート及びHBs抗原結合粒子により、上記8
0検体に対して凝集価を求めた。
を用いて上と全く同じ方法で調製したHBs抗原結合マ
イクロプレート及びHBs抗原結合粒子により、上記8
0検体に対して凝集価を求めた。
結果については、MS128細胞由来の精製llBs抗
原を用いた試薬による凝集価と、対照のhuGK−14
細胞由来の精製11Bs抗原を用いた試薬による凝集価
との相関を示す形で第3図に表示した。
原を用いた試薬による凝集価と、対照のhuGK−14
細胞由来の精製11Bs抗原を用いた試薬による凝集価
との相関を示す形で第3図に表示した。
この図から明らかなように、MS 128細胞由来の精
製tlBs抗原を用いた試薬による凝集価と、対照のh
uGK−14細胞由来の精製HBs抗原を用いた試薬に
よる凝集価とはよく相関しており、MS 128細胞よ
り得られた精製HBs抗原もまたHBs抗体検出用試薬
として有用である。
製tlBs抗原を用いた試薬による凝集価と、対照のh
uGK−14細胞由来の精製HBs抗原を用いた試薬に
よる凝集価とはよく相関しており、MS 128細胞よ
り得られた精製HBs抗原もまたHBs抗体検出用試薬
として有用である。
以上、B型肝炎ウィルスゲノムのプレーS l ml域
、プレー32領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞として、細胞株huGK−
14及びMS128を用いた実施例を記載してきたが、
これ以外の細胞株を培養して得られた培養物から調製さ
れたHBs抗原を利用しても同様な効果を有するHBs
抗体検出用試薬を得ることが出来ることは当業者には明
白であろう。
、プレー32領域、並びにS遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞として、細胞株huGK−
14及びMS128を用いた実施例を記載してきたが、
これ以外の細胞株を培養して得られた培養物から調製さ
れたHBs抗原を利用しても同様な効果を有するHBs
抗体検出用試薬を得ることが出来ることは当業者には明
白であろう。
本発明のHas抗体検出用試薬をエンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集法などの)I
Bs抗体検出法に利用することによって、HBs抗原陽
性のヒト血漿若しくはヒト血清を原料として製造された
HBs抗原を主成分として含有する従来のB型肝炎ウィ
ルス抗原に対するllBs抗体検出用試薬では検出出来
ないか、或いは掻く僅かの感度しか得ることの出来なか
ったHBs抗体を高感度に検出できるようになった。し
かも本発明のB型肝炎ウィルス抗原に対するHBs抗体
検出用試薬はその製造に当たってB型肝炎の感染の危険
が全(無いものである。
セイ、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集法などの)I
Bs抗体検出法に利用することによって、HBs抗原陽
性のヒト血漿若しくはヒト血清を原料として製造された
HBs抗原を主成分として含有する従来のB型肝炎ウィ
ルス抗原に対するllBs抗体検出用試薬では検出出来
ないか、或いは掻く僅かの感度しか得ることの出来なか
ったHBs抗体を高感度に検出できるようになった。し
かも本発明のB型肝炎ウィルス抗原に対するHBs抗体
検出用試薬はその製造に当たってB型肝炎の感染の危険
が全(無いものである。
そのうえ本発明によれば、遺伝子工学ないし細胞工学の
技術によりHas抗体検出用試薬が大量に且つ低コスト
で工業生産することができる。しかも本発明においては
樹立された細胞株も使用することができるので、B型肝
炎感染の危険性はなく安全にHBs抗体検出用試薬を得
ることもできる。
技術によりHas抗体検出用試薬が大量に且つ低コスト
で工業生産することができる。しかも本発明においては
樹立された細胞株も使用することができるので、B型肝
炎感染の危険性はなく安全にHBs抗体検出用試薬を得
ることもできる。
第1図は受身赤血球凝集法でHBs抗体を検出するに際
し、血清由来のHBs抗原を用いた従来のHBs抗体検
出用試薬を使用した場合とhuGK−14細胞由来のH
Bs抗原を用いた本発明に係るHBg抗体検出用試薬を
使用した場合との検出感度の違いを凝集価で比較したも
のである。 第2図は本発明のHag抗体検出用試薬を結合させたマ
イクロプレートを用いたエンザイムイムノアッセイによ
るHag抗体の検出を示すものである。 この図中でローロはHBs抗体陽性ヒト血清N11l、
Q−Oはfing抗体陽性ヒト血清NO,2、・−・は
flBs抗体陰性ヒト血清を示す。 第3図は間接凝集反応法においてMS128細胞由来の
HBs抗原を用いたHas抗体検出用試薬を使用した場
合と、huGK−14細胞のHas抗原を用いたHBs
抗体検出用試薬を使用した場合との検出感度の相関を凝
集価で表わしたものである。。 第1図 11.0. 20 40 1!IQ
160 320 64G +280 256
0huGK−14m胞由来HBi抗原を用い?−試!血
清希釈倍数 第3図
し、血清由来のHBs抗原を用いた従来のHBs抗体検
出用試薬を使用した場合とhuGK−14細胞由来のH
Bs抗原を用いた本発明に係るHBg抗体検出用試薬を
使用した場合との検出感度の違いを凝集価で比較したも
のである。 第2図は本発明のHag抗体検出用試薬を結合させたマ
イクロプレートを用いたエンザイムイムノアッセイによ
るHag抗体の検出を示すものである。 この図中でローロはHBs抗体陽性ヒト血清N11l、
Q−Oはfing抗体陽性ヒト血清NO,2、・−・は
flBs抗体陰性ヒト血清を示す。 第3図は間接凝集反応法においてMS128細胞由来の
HBs抗原を用いたHas抗体検出用試薬を使用した場
合と、huGK−14細胞のHas抗原を用いたHBs
抗体検出用試薬を使用した場合との検出感度の相関を凝
集価で表わしたものである。。 第1図 11.0. 20 40 1!IQ
160 320 64G +280 256
0huGK−14m胞由来HBi抗原を用い?−試!血
清希釈倍数 第3図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、B型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレー
S2領域、並びにS遺伝子のうち、少なくとも一種以上
を保持している細胞から産生されたB型肝炎ウィルス表
面抗原を含有することを特徴とするB型肝炎ウィルス表
面抗原に対する抗体検出用試薬。 2、B型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレー
S2領域、並びにS遺伝子のうち、少なくとも一種以上
を保持している細胞が、ゲノムにB型肝炎ウィルス遺伝
子が組み込まれている天然の細胞株、及び/又は、B型
肝炎ウィルス表面抗原をコードする遺伝子が人為的に細
胞内に組み込まれた細胞株であることを特徴とする、請
求項1記載のB型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体検
出用試薬。 3、該天然の細胞株がヒト肝癌細胞であることを特徴と
する、請求項2記載のB型肝炎ウィルス表面抗原に対す
る抗体検出用試薬。 4、該ヒト肝癌細胞が細胞株huGK−14であること
を特徴とする、請求項3記載のB型肝炎ウィルス表面抗
原に対する抗体検出用試薬。 5、該人為的細胞株が細胞株MS128であることを特
徴とする、請求項2記載のB型肝炎ウィルス表面抗原に
対する抗体検出用試薬。 6、B型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体を検出する
方法において、抗原として、B型肝炎ウイルスゲノムの
プレーS1領域、プレーS2領域、並びにS遺伝子のう
ち、少なくとも一種以上を保持している細胞から産生さ
れるB型肝炎ウィルス表面抗原を用いることを特徴とす
る、B型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体の検出方法
。 7、B型肝炎ウイルスゲノムのプレーS1領域、プレー
S2領域、並びにS遺伝子のうち、少なくとも一種以上
を保持している細胞が、ゲノムにB型肝炎ウィルス遺伝
子が組み込まれている天然の細胞株、及び/又は、B型
肝炎ウィルス表面抗原をコードする遺伝子が人為的に細
胞内に組み込まれた細胞株であることを特徴とする、請
求項6記載の検出方法。 8、該天然の細胞株がヒト肝癌細胞であることを特徴と
する、請求項7記載の検出方法。9、該天然ヒト肝癌細
胞が細胞株huGK−14であることを特徴とする、請
求項8記載の検出方法。 10、該人為的細胞株が細胞株MS128であることを
特徴とする、請求項7記載の検出方法。 11、B型肝炎ウィルス抗体の検出が免疫学的反応に基
づくものであることを特徴とする、請求項6記載のB型
肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体の検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1121577A JP2957195B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | B型肝炎ウイルス抗体検出システム |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1121577A JP2957195B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | B型肝炎ウイルス抗体検出システム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02302669A true JPH02302669A (ja) | 1990-12-14 |
JP2957195B2 JP2957195B2 (ja) | 1999-10-04 |
Family
ID=14814685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1121577A Expired - Lifetime JP2957195B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | B型肝炎ウイルス抗体検出システム |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2957195B2 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61158798A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Japan Found Cancer Res | B型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
JPS61268177A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-11-27 | Japan Found Cancer Res | ヒト肝癌由来の変異細胞株huGK−14 |
JPS6255088A (ja) * | 1985-04-15 | 1987-03-10 | エンドトロニツクス・インコ−ポレイテツド | 組換えdna技術によるb型肝炎表面抗原 |
-
1989
- 1989-05-17 JP JP1121577A patent/JP2957195B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61158798A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Japan Found Cancer Res | B型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
JPS61268177A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-11-27 | Japan Found Cancer Res | ヒト肝癌由来の変異細胞株huGK−14 |
JPS6255088A (ja) * | 1985-04-15 | 1987-03-10 | エンドトロニツクス・インコ−ポレイテツド | 組換えdna技術によるb型肝炎表面抗原 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2957195B2 (ja) | 1999-10-04 |
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