JP4292670B2 - 抗ＨＢｃ抗体の免疫測定法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明が属する技術の分野】
本願発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下ＨＢＶと略す）の感染により生体内で産生される、ＨＢＶの芯（コア；以下ＨＢｃと略する）に対する抗体（以下抗ＨＢｃ抗体と略す）の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＢＶは直径４２ｎｍの二重構造をもつ球形粒子で、外皮（エンベロープ）と芯（コア）から成ることが知られている。ＨＢｃ抗原は、このＨＢｃを形成する抗原のことであり、抗ＨＢｃ抗体は、ＨＢｃ抗原に対する抗体である。
【０００３】
ヒト等にＨＢＶが感染すると抗ＨＢｃ抗体が産生されるが、ＨＢｃ抗体はＨＢＶ感染初期から感染後長期間にわたり血中に存在することが知られている。ＨＢｃ抗体にはＩｇＭ型とＩｇＧ型の２タイプがあり、急性Ｂ型肝炎では発症後１２週までＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の陽性が認められる。一方ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体は、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体が陰性となった後も、長期に渡って低力価から中力価の陽性を呈すると報告されている（西岡幹夫、Ｂ型肝炎ウイルス感染症における血中抗原抗体系とその解釈、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ，２４（２），１０６−１０８，１９８６年）。また抗ＨＢｃ抗体は、Ｂ型肝炎表面抗原（以下ＨＢｓ抗原と略する）が出現した後、血清中に出現するが、急性Ｂ型肝炎においてはＨＢｓ抗原が消失した後からＨＢｓ抗原に対する抗体（以下抗ＨＢｓ抗体）が出現するころまで持続する。
【０００４】
これらの事実から、抗ＨＢｃ抗体は、ＨＢｓ抗原や抗ＨＢｓ抗体血清中に見出されない時期にＨＢＶ感染を知見するうえで重要なマーカーということができる（Ｈ．Ｉｉｓｕｋａら、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｔｉ−ＨＢｃ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ＨＢＶ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｕｎｉｔｓｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ＨＢｓＡｇ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，６３，１０７−１１１，１９９２年）。また更には、急性Ｂ型肝炎時には抗ＨＢｃ抗体の抗体価が高くなることから、Ｂ型慢性肝炎の急性発症と急性Ｂ型肝炎を識別するうえでも重要なマーカーである（三宅和彦・山中正己、慢性肝炎の診断の実際・血清生化学、免疫学的検査でどの程度まで診断できるか、ＭｅｄｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ，４（７），１０８０−１０８３，１９８７年）。
【０００５】
こののように抗ＨＢｃ抗体の検出は、Ｂ型肝炎の病態把握・感染予防に重要であり、輸血後の感染防止を目的とする輸血用血液のスクリーニング検査にも利用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
抗ＨＢｃ抗体の検出は、従来、主として競合イムノアッセイにより行われている。この方法は、ＨＢｃ抗原中の抗ＨＢｃ抗体との結合部位に対して試料中の抗ＨＢｃ抗体と検出可能な標識物で標識した一定量の抗ＨＢｃ抗体（以下標識抗ＨＢｃ抗体と略す）とを競合させるものであり、ＨＢｃ抗原と結合した標識抗ＨＢｃ抗体の割合は、試料中の抗ＨＢｃ抗体の濃度に反比例し、阻害率（陰性コントロールと試料の測定値の差から算出）として現わされる。
【０００７】
競合イムノアッセイでは、試料中に標識抗ＨＢｃ抗体とＨＢｃ抗原との免疫反応を妨害する物質（妨害物質が存在すると測定値が低くなり、見かけ上、試料中に抗ＨＢｃ抗体が存在するか、或いは実際の存在量以上に存在するかのような結果、つまり偽陽性を生じてしまう。
【０００８】
これまでに血液中のγ−グロブリン、アルブミン、α１−アンタイトリプシン等の種々の血清蛋白質がＨＢｃ抗原と複合体を形成し、抗ＨＢｃ抗体との反応部分をブロックしてしまうことが報告されており（今井光信、ＨＢｅ抗原の本態、肝胆膵、９（４），４８７−４８９，１９８４年）、従来の抗ＨＢｃ抗体測定においても前記擬陽性を防止するために種々の工夫がされている。
【０００９】
本願発明は、抗ＨＢｃ抗体を免疫学的に検出するにあたり、前記妨害物質による擬陽性の発生を防止するための簡便な方法を新たに提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本願請求項１の発明は、生物学的試料中の抗ＨＢc抗体を免疫学的に検出するための方法に係り、免疫反応を生じさせる際にグアニジル基を有する物質を共存させる方法である。そして本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記グアニジル基を有する物質はアルギニン、プロタミン類、尿素、グアニジン塩酸塩から選ばれる１種以上であることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本願発明は、グアニジル基を有する物質の共存下で免疫反応、即ちＨＢｃ抗原と抗ＨＢｃ抗体（標識抗ＨＢｃ抗体）を反応させるものである。グアニジル基を有する物質としては、例えばアルギニン、プロタミン類、尿素、グアニジン塩酸塩等を例示することができる。これら物質を単独で、或いは２種以上混合して使用することにより本願発明の効果を達成できるが、中でもアルギニンを使用することは、試薬コストや試薬の取扱が容易である等の面で好ましい。
【００１２】
グアニジル基を有する物質の共存量は、使用する物質を用いた予備的実験により任意に設定し得るが、一例を示せば、アルギニンの共存量について述べれば重量／容量％で５％から１０％程度とすることが例示できる。
【００１３】
グアニジル基を有する物質は免疫反応を行う容器に予め凍結乾燥状態或いは液体状態で投入しておいても良いし、ＨＢｃ抗原又は抗ＨＢｃ抗体（標識抗ＨＢｃ抗体）を容器に添加するのと同時に投入すれば良い。
【００１４】
グアニジル基を有する物質を共存させることにより達成される効果は、抗ＨＢｃ抗体（標識抗ＨＢｃ抗体を含む）とＨＢｃ抗原との間で免疫反応を生じさせる操作を含む免疫測定であれば、いわゆる競合イムノアッセイであってもサンドイッチイムノアッセイであっても同様である。従って本願発明は、競合イムノアッセイの形態及びサンドイッチイムノアッセイの形態のいずれの形態で実施しても良い。いずれの場合にも、２つのタイプがあり、競合イムノアッセイを例に説明すれば、一つは試料と標識抗ＨＢｃ抗体を一緒に混合して担体に結合したＨＢｃ抗原に対して競合させる方法（いわゆる１ステップアッセイ）であり、もう一つはまず担体に結合したＨＢｃ抗原と試料を反応させ、次いで標識抗ＨＢｃ抗体を反応させる方法（２ステップアッセイ）である。
【００１５】
また本願発明を実施する際には、最終的に形成される免疫複合体の検出のため標識を使用するが、標識としてはアルカリ性ホスファターゼ等の酵素、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープ等に代表される種々の標識を用いることができる。またこれら標識は、免疫反応を生じさせるための試薬成分と化学的に直接結合されていても、ビオチン−アビジン等の親和結合を形成する物質を利用して間接的に結合されていても良い。特に後者の場合は、当初から結合されていることを要せず、免疫反応の過程等で両者を結合させるようにしても良い。
【００１６】
本願発明の実施に当たっては、最終的に形成される免疫複合体に含まれる標識と該複合体に含まれずに遊離状態で存在する標識を分離するため、水不溶性担体を用いることが好ましい。水不溶性担体としてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン等を材料とするビーズ、チューブ、プレート等、従来から使用されている担体や容器内壁を利用することが可能である。
【００１７】
本願発明を実施するための試薬は、例えば水不溶性担体と結合したＨＢｃ抗原、標識抗ＨＢｃ抗体そしてグアニジル基を有する物質とから構成することができる。ここで、ＨＢｃ抗原を例えば抗ＨＢｃ抗体を用いて担体と間接的に結合する構成を選択したり、前記したように標識と抗ＨＢｃ抗体をビオチン−アビジン等で間接的に結合させる構成を選択しても良い。
【００１８】
ＨＢｃ抗原は、ＨＢＶから変性剤（ＳＤＳ等）及び還元剤（ジオスレイトールやメルカプトエタノール等）を用いて調製しても良いし、大腸菌や酵母等を用いて遺伝子組換えの手法により調製しても良い。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下実施例により本願発明を更に詳細に説明するが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお以下の実施例は、市販の自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名；ＡＩＡ−２１）を用いて実施したものである。実施例で用いた抗ＨＢｃ抗体検出用試薬は、まず容量１．２ｍｌの容器に、アルカリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した５０μｌのマウス抗ヒトＨＢｃ抗体（モノクローナル抗体）溶液（抗体量で５０ｍｇ）を加えて凍結乾燥し、続いて５０μｌのヒトＨＢｃ抗原溶液（抗原量で５ｎｇ）と、０．０６μｌのマウス抗ヒトＨＢｃ抗体（前記モノクローナル抗体とは異なるモノクローナル抗体）溶液（抗体量で６０ｎｇ）を固定化した直径約１．４ｍｍの球状担体（内部にフェライトを練り込んだもの）を加え、同様に凍結乾燥して調製したものである。
【００２０】
実施例では、３０μｌのヒト血清を試料として用い、免疫反応は３７℃で１０分間行った。なお免疫反応に際しては、磁石により容器中の担体を運動させて反応液を攪拌した状態で生じさせた。
【００２１】
免疫反応終了後、前記装置にていわゆるＢ／Ｆ分離操作を行い、前記担体と結合していない遊離成分を分離・除去し、ＡＬＰの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加してその添加した瞬間から３００秒までの３００秒間に渡って基質分解物である４メチルウンベリフェロンの蛍光強度の増大から、その生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。
【００２２】
また下記実施例では、陰性コントロール（抗ＨＢｃ抗体を含まないヒト血清試料；抗ＨＢｃ抗体以外のＨＢＶマーカーが検出されず、かつ、Ｂ型肝炎の病歴がない者であって、インフォームドコンセントの得られた者から得た血清）についての測定値と、陽性コントロール（市販の競合法によるＥＩＡ測定キット（コアザイム、商品名、ダイナボット（株）製）を用いて計算した値（該値＝（陰性コントロールの測定値−該コントロールを２００倍希釈時の測定値）／（陰性コントロールの測定値×１００）が１００％程度となるほど高濃度のＨＢｃ抗体を含む、インフォームドコンセントの得られた者から得た血清）とを基準として、抗ＨＢｃ抗体が存在したことにより抑制された割合（ＩＮＨ％）により試料中の抗ＨＢｃ抗体量を示した。即ち、ＩＮＨ％＝は下記式により表される。そしてこの計算式により５０％以上の値を示した場合は陽性とした。
【００２３】
【化１】

【００２４】
実施例１
上記のようにして調製した反応容器（以下試薬（Ａ）と略する）と、上記においてヒトＨＢｃ抗原溶液及び固定化抗ヒトＨＢｃ抗体を凍結乾燥する際に以下の操作において免疫反応時の濃度（重量／容量）が５％となるようにアルギニンをも添加した反応容器（以下試薬（Ｂ）と略する）を用いて、陰性コントロール１試料と抗ＨＢｃ抗体が陰性である２２試料について抗ＨＢｃ抗体の検出を行った。なお結果は、陰性及び陽性コントロールについては５重測定、試料については２重測定した。
【００２５】
結果を表１に示す。また表１の結果をヒストグラム化した図を図１に示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】
表１、図１から分かるように、試薬（Ａ）によって５０％以上のＩＮＨ％を示していた検体（Ｔ５及びＴ１９）が、試薬（Ｂ）を用いた場合には３０程度のＩＮＨ％を示すようになり、全体的にばらついていた結果が３０％以下に収束する。この結果から、免疫反応をアルギニン共存下で生じさせることにより偽陽性を抑制し得ることが分かる。
【００２８】
実施例２
実施例１で用いた陽性コントロールを陰性コントロールで１０倍、５０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍に希釈した希釈列を調製し、実施例１と同様に試薬（Ａ）及び試薬（Ｂ）を用いて抗ＨＢｃ抗体の検出を行った。結果を表２に示す。また表２の結果から得られる阻害曲線を図２に示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
表２、図２から分かるように、両試薬の阻害曲線は同等のものであり、試薬の感度や検出能はアルギニンの共存によって影響を受けない。
【００３１】
実施例３
陽性コントロール、陰性コントロール及び１４試料を実施例１のように試薬（Ａ）及び試薬（Ｂ）を用いて測定し、その結果から試薬（Ａ）及び試薬（Ｂ）の測定値分布を求めた。結果を表３、図３及び図４に示す。
【００３２】
【表３】

【００３３】
表３、図３及び図４から分かるように、試薬（Ａ）は陰性・陽性試料の測定値分布に重複があるが、試薬（Ｂ）では両者の分布が明確に分離している。このことから、アルギニンを共存させることにより陰性試料の測定値分布が収束し、陰性と陽性の判別が明確になることが分かる。
【００３４】
実施例４
実施例１と同様に、免疫反応時の濃度（重量／容量）が０、１、２、５、１０又は１５％となるようにアルギニンを添加した反応容器を用いて、陰性コントロール１試料と抗ＨＢｃ抗体が陽性である１５試料について抗ＨＢｃ抗体の検出を行った。結果を表４、図５に示す。
【００３５】
【表４】

【００３６】
表４及び図５から分かるように、アルギニン濃度を上げることで全体的にばらついていた検出結果が３０％以下に収束すること、かかる効果を得るためには５％以上のアルギニンを添加することが好適であること、が分かる。
【００３７】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本願発明によりＨＢｃ抗原と抗ＨＢｃ抗体（標識抗ＨＢｃ抗体を含む）間の免疫反応の妨害を抑制し、最終的には検出結果が偽陽性と判別される恐れを減少することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の結果をヒストグラム化した図である。
【図２】図２は、実施例２の結果（阻害曲線）を示した図である。
【図３】図３は、実施例３において試薬Ａを用いたときのＨＢｃ抗体陰性検体および陽性検体の分布図である。
【図４】図４は、実施例３において試薬Ｂを用いたときのＨＢｃ抗体陰性検体および陽性検体の分布図である。
【図５】図５は、実施例４におけるＨＢｃ抗体陰性検体についての分布図である。

Claims (1)

1. 生物学的試料中の抗ＨＢｃ抗体を競合法により免疫学的に検出するための方法において、免疫反応を生じさせる際にアルギニンまたはアルギニン塩を共存させることで妨害物質による擬陽性の発生を防止する方法。

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