JP3237923B2 - 人工標準及び対照血清およびその製法 - Google Patents
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Description
て使用するための標準及び対照試薬及びこれらの試薬の
製法に関する。
ゲン、自己抗原又はある種の医薬品に対する特異性抗体
の産生を伴なう疾病の常用の免疫診断法は、これらの抗
体が原因作用物上の抗原性構造と複合体(conjugate)
を形成することができることを基にしている。これらの
方法のいくつかでは、試験されるべきものが特定抗体の
含量である試料を、病原体の抗原性構造(これらの抗原
性構造は、適当な担体材料に担持されている)と接触さ
れられる。試料中に存在する特定抗体は、担体材料上固
定されている病原体の抗原性構造と結合し、それとの免
疫複合体として検出される。試料中の特定の抗体と複合
体を形成することができる抗体その他のレセプター、例
えばプロテインAを使用することが可能である。一般
に、検出試薬は、測定技術によって結合された特定の抗
体の量を確かめることを可能にする標識を持つ。普通使
用される標識としては、放射性同位元素、酵素、蛍光
性、燐光性又はルミネセンス性物質、安定不対電子を持
つ物質、赤血球、ラテックス粒子、金属ゾルがある。
べき抗体の一定量を含有する対照及び標準血清が必要で
ある。この型のポジティブ対照血清により検定において
使用される試薬が利用できるか否か試験することができ
る。標準化、即ち異なった日又は異なった試験室におい
て得られた検定結果を比較することができることが標準
血清によって更に可能となる。
にしばしば実施された技術は、その疾病が一定の原因作
用物によって起こされている患者から血液を取り、血清
を得、異なった患者からの血清を混合することによって
対照又は標準血清を病原体に向けられた特異的抗体の特
定の含量に調節することによりなる。
の抗体を含有する充分な数のヒトが用意されなければな
らないことである。更に、例えば子供の場合や、また患
者の血液が感染性で、この病原体を殺す適当な方法が知
られていないというリスクがある場合のようなヒトから
血液を取れない医学上の理由があることもしばしばあ
る。
利な点を持たない人工標準及び対照血清ならびにその製
法ならびにその使用を記載している。使用される標準及
び対照試薬は、2つの成分A及びBの化学的に結合した
複合体であり、複合体中成分Aは、病原体中の抗原性構
造とコンプレックスを形成する能力を与え、そして成分
Bは、免疫化学検定法において測定されるべきクラスの
ヒト免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントを
表わす。即ち、DE−A−31 12 334においてク
レームされている複合体を製造するためには、ヒト血清
から大量かつきわめて高純度で成分B、即ちクラスG、
M、A、D又はEのヒト免疫グロブリンを単離すること
が必要である。人工標準及び対照試薬を調製するための
同一の方法が1988年DE−A−38 00 048に
記載されている。
ンを得るのに複雑な精製法が必要であることであり、こ
の精製操作によって免疫グロブリンの損失又はその抗原
性構造の変化を来たす。即ち、例えば、ヒト免疫グロブ
リンMはすべての既知の精製法において凝集体形成の傾
向があり、これは上述した型の複合体の調製の利用性を
減じる。他の免疫グロブリン、例えばIgEクラスの場
合には、ヒト血清中普通存在する濃度は100μg/リ
ットル未満である。したがってヒトIgEを精製するた
めには骨髄腫IgE患者によって寄贈される血液に頼る
ことが必要であり、それに対応してその血液試料はまれ
なものでありかつコストがかかる。
で対照血清は標準血清も含む。したがってこの発明の目
的は、上述した複合体の不利な点を持たない人工標準及
び対照血清を見出すことであった。
する結合部分、例えば、この構造的特徴に対して向けら
れた抗体を表わす成分A、及びその免疫反応性を制限す
ることなしに向けられた、検出されるべき病原体に結合
する因子に結合することができる成分Bの複合体を調製
することによって適当な人工標準及び対照血清を得るこ
とができることが見出された。この複合体を、適当な濃
度で健常人からの血液、血液成分又は試料液に添加す
る。次に得られた生成物を標準又は対照の目的で用い
る。
ことができ、又健常人からの血液中、血液成分その他の
試料液中チェック用機能又は標準化にすぐれて適してい
る試薬を免疫グロブリンの自然の含量と関連して得るこ
とができることが明らかになった。
定の抗体クラスの抗体に対する免疫化学検出法において
使用するための標準及び対照血清(これらの抗体は、特
定の病原体に特異的に向けられている)であって、哺乳
類中検出されるべき特定の抗体クラスの存在下に被分析
物特異性の部分と抗体に特異的に結合する部分との複合
体を含有することを特徴とし、複合体はそれだけでは検
出されるべき抗体と免疫化学的均等物であるとは認識さ
れないものである標準及び対照血清に関する。
は、検出されるべき抗体がヒト由来のものである血清で
ある。
析物特異性及び抗体クラス特異性結合部分がモノクロー
ナル抗体又は抗体フラグメントであるものである。
ク、糖タンパクである。複合体の成分Aがポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体又はそのフラグメント(それ
らは当業者に既知の方法によって病原体の構造的特徴に
対して調製することができる)、ならびにレクチンその
他のレセプターによって形成されることが可能でありか
つ好ましい。成分Aは好ましくは非ヒト(non-human)
由来のものである。
ようなものと確認された分子が、被分析物抗体を検出す
るために用いられる特異性結合パートナーによってその
ようなものとして認識されないことを意味する。モノク
ローナル抗体が特に好ましい。
き抗体に対して向けられているポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体か、又は検出されるべき抗体の構造
的特徴と特異的に反応することができる結合因子、例え
ばレクチンもしくはプロテインAから構成される。
がきわめて特に好ましい。成分Bも好ましくはヒト由来
でないものである。
及びBがその免疫機能を保持しながら結合しているいず
れかの構成物を意味する。当業者に周知のこのような複
合体の製法は、例えば、化学試薬によるか又は生物親和
性相互作用による結合である。しかし、化学合成、ハイ
ブリドーマ技術又は遺伝子工学の方法によってハイブリ
ッド分子を得ることも可能である。
合関連しており、そしてそれ自身当業者に知られている
抗体フラグメントも包含する。
おりである。被分析物抗原に対するモノクローナル抗体
を当業者に知られている方法によって調製する。
記載されている方法によって検出されるべき抗体クラス
に対して特異的に向けられているモノクローナル抗体に
結合される。
フィーによって精製する。その後複合体を、例えば透析
により、好ましくは1〜10mg/mlに濃縮すること、そ
して当業者に知られている方法によって安定化すること
が有利である。この複合体の一定量を、例えば被分析物
抗体を含まない正常ヒト血清の特定量に添加する。この
ようにして得られたこの標準又は対照血清は、当業者に
知られている方式で安定化して貯蔵可能とすることがで
きる。
使用するために用いられる。本発明による方法は、普遍
的な適用性を特徴とする。実施例中使用された方法の他
の複合体への適用をそこなうことになる制限は知られて
いない。
にも適用することができ、用いられる複合体は、関係の
ある検定法において標識用レセプターとして用いられる
分子によってそれとして認識されないが、特定の動物種
及び抗体クラスに特異的な分子に結合した後にのみ認識
されることが必須のことである。
ヒト及び動物診断法において使用することができる。挙
げられる例は、ウイルス、例えば肝炎A、B、C、種々
のHIVタイプのウイルスの構造的特徴に対する種々の
免疫グロブリンクラスの抗体、風疹、サイトメガリー、
麻疹、おたふくかぜ、水痘、単純ヘルペス及びエプスタ
イン−バールウイルス、細菌及び寄生虫病原体、例えば
梅毒、ボレリア症、トキソプラスマ症、ならびにアレル
ギー疾患、例えばアレルギー特異性IgE抗体の決定、
自己免疫病の検出、ならびに診断又は治療の目的で免疫
原性作用物の投与を受けた可能性がある患者における体
液性防御因子の検出である。それらの例は、腫瘍随伴構
造物に対するモノクローナル抗体及びサイトカイン様又
は血液凝固特性を持つ組換え体タンパク質である。
1ml中)に0.2MのLiBO3/20%ジオキサン1m
lを添加し、15倍モル過剰のN−γ−マレイミドブチ
リルオキシサクシンイミド(GMBS)を添加し、そし
て混合物を室温において1時間インキュベートする。
0.1モルの燐酸ナトリウム緩衝液+5mMのニトリロト
リ酢酸(NTA)pH6.0を用いゲルクロマトグラフィ
ー(セファデックスG−25)によって未反応のヘテロ
二官能性試薬を除去する。
0mMの燐酸ナトリウム,100mMのNaCl,pH7.4
中)を、24倍モル過剰の3−(2−ピリジルジチオ)
プロピオン酸N−サクシンイミジル(SPDP)と共に
室温において30分間インキュベートし、次に100倍
モル過剰(SPDPに比べて)のジチオスレイトール
(DTT)を用いて室温において15分間還元する。還
元が起こって後、0.1Mの燐酸ナトリウム/5mMのN
TA pH6.0を用いゲルクロマトグラフィー(セファデ
ックスG−25)によって過剰の試薬を除去する。
BcAgと共に室温において2時間インキュベートして
後、その容量の1/10の0.1MのN−エチルマレイミド
によって停止させる。この複合体を、50mMのトリス/
HCl pH7.4を用いゲルクロマトグラフィー(ACA
34,LKB)によって精製して後、濃縮して3mlと
し、そしてHBAによって安定化する。この複合体(濃
度=2mg/ml)50μl、25μl、12.5μl及び
6.25μlを正常ヒト血清(抗HBc IgM陰性)1
ml中にピペットで取り、0.2μmのSartorius膜フィル
ターを通して濾過し、そして+2〜+8℃において貯蔵
する。
(Behringwerke AG, Marburg, FRGのEnzygnost(登録商
標)抗HBcAg/IgM検定キット)において、予め
1:100希釈した血清、又は実施例1のとおり調製さ
れた人工ポジティブ対照10μlおよび試料緩衝液90
μlを、抗ヒトIgMでコーティングしたマイクロタイ
タープレート中37℃において1時間インキュベート
し、包装説明書に従って洗浄し、HBcAg−POD複
合体100μlと共に37℃において1時間インキュベ
ートし、再び洗浄し、包装説明書に従ってテトラメチル
ベンジジン(TMB)基質溶液と共に室温において30
分間インキュベートし、0.5MのH2SO4溶液100
μlによって停止させ、そして光度計中450nmにおい
て測定する。
TMBの色素への変換の触媒となる。30分後に生じる
色が、試料中HBcAgに対して向けられた抗体の含量
に比例する。実施例1に記載された順次希釈状態の人工
ポジティブ対照について得られる吸光度と表1中ネガテ
ィブ対照についての吸光度と比較する。
(ab′)フラグメントの複合体の調製 HSVに対するモノクローナル抗体10mg(50mMの酢
酸ナトリウム緩衝液pH4.3 2ml中)をペプシン1mgと
共に37℃において24時間インキュベートし、反応混
合物を2N NaOH約0.2mlでpH7.2に調節する。
このF(ab′)2フラグメントを、50mMのトリス/H
Cl pH7.4を用いゲルクロマトグラフィー(LKBに
より供給されるACA−44)によって精製して後、濃
縮して1ml(F(ab′)2フラグメント約5mg)とし、
そして0.1MシステアミンHCl溶液0.1mlにより室
温において60分間還元してF(ab′)として後セファ
デックスG−25(カラム1cm容量10ml)上でクロマ
トグラフ処理する。還元された抗HSV F(ab′)フ
ラグメントを活性化された抗ヒトIgM−マレイミド
(上を参照)5mgと37℃において1時間反応させる。
未反応の抗体F(ab′)フラグメントを、50mMのトリ
ス/HCl pH7.4を用いゲルクロマトグフィー(AC
A−34 LKB)によって実複合体から分離して後、
濃縮して5mlとし、そしてHSAによって安定化させ
る。
ス抗ヒトIgM抗体と複合させた。
Claims (3)
- 【請求項1】 哺乳類体液中の特定の抗体クラスの抗体
で、特定の病原体に対して特異的な抗体に対する免疫化
学検出法において使用するための標準及び対照血清であ
って、哺乳類中にて検出されるべき特定の抗体クラスの
存在下に、被分析物である特定の病原体に特異的に結合
する部分と検出されるべき抗体に特異的に結合する部分
との複合体を含有し、複合体はそれだけでは検出される
べき抗体と免疫化学的に等価なものと認識されないもの
であることを特徴とする標準及び対照血清。 - 【請求項2】 検出されるべき抗体がヒト由来のもので
ある請求項1記載の標準又は対照血清。 - 【請求項3】 被分析物に特異的に結合する部分及び抗
体クラスに特異的に結合する部分がモノクローナル抗体
または抗体フラグメントである請求項1記載の標準又は
対照血清。
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