JPH02113886A - 新規なα−アミラーゼ、その製造法及びそれを用いた糖類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マルトース生成型の新規なα−アミラーゼ並
びにそれを用いた糖類の製造法に関する。

更）ご詳しくは、サーモモノスポラ属に属する好熱性放
線菌を培養して得ちれる、耐熱性で、デンプンもしくは
、その部分加水分解物からマルトースを主成分とする糖
質を生成する新規なα−アミラーゼ、並びにそれを用い
た糖質の製造法に関する。

〔従来の技術〕

α−アミラーゼはデンプン、アミロース、アミロペクチ
ン、グリコーゲン及びそれらの部分加水分解物中α−１
，４−グルコピラノシド結合を任意に加水分解し、グル
コース、マルトースおよび種々のマルトオリゴ糖を生成
する酵素である。該α−アミラーゼは微生１勿、動物あ
るいはｈＨ勿中に広く分布している。

α−アミラーゼのうち、微生物由来のα−アミラーゼは
例えばデンプンの液化や繊維の糊抜きなどに大量に用い
られている。例えば、バチルス（８ａｃ＋　ｌ　Ｉｕｓ
）　　寓：Ｂ、アミロリクエファシェンス（Ｂ、　ａｍ
ｙｌｏｌ’１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ、リシエニホ
ルミス（Ｂ、　　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など〕
を生産するα−アミラーゼは、耐熱性に優れていること
かうデンプン糖の製造用原料として用いられる液化デン
プンの製造等に用いられている。これらの目的に用いら
れるα−アミラーゼはデンプンに作用させたときに液化
型に作用し、糊液粘度を急激に低下せしめる優れた作用
を有しているが、デンプンからの生成物はグルコース、
マルトース、及びマルト）ＩＪオースなどの一連のマル
トオリゴ糖であり本発明の目的とするマルトース生産の
ための糖化酵素としては使用できない。

一方、これろのα−アミラーゼ以外にいくつかの微生物
由来のα−アミラーゼをマルトースの生産に用いる試み
がなされている。例えば、ストレプトマイセス・バイグ
ロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐ＋ｃｕｓ）　（Ｄｉｅ　５ｔａｒｋｅ、　　２６
＠、４１３項、１９７３年）、ストレプトマイセス・プ
レコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｒｅｃｏｘ
）　（特開昭５０−５２２７７号）、サーモアクチノマ
イセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｖｕｌｕｇａｒｉｓ）　　ｃ、へｇｒｉｃ、　
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、４２巻、１６８１項、１９７８年）、バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｖｓ）　　（Ｓｔａｒ
ｃｈ／５ｔａｒｋｅ、　　３５巻、４０５項、１９８４
年）などが報告されている。

しかしながらこれらのα−アミラーゼについては耐熱性
及び酵素の生産性の点で必ずしも有利なものではなかっ
た。

一方、一般にデンプン糖の生産は、５０℃以上の高温で
かつｐＨ４，５〜６．０の弱酸性条件下で行なわれてい
る。ところが、６０℃以下の反応温度では反応槽中の微
生物汚染により反応ｐＨが低下する。

そこで該汚染によるｐＨ低下を補償するために、水酸化
カルシウムなどのアルカリ試薬をｐＨ調整の目的で反応
液に多量に添加しなければならなかった。

このため、生産物の脱塩、精製等の後処理には多大の費
用が必要となる。従って、このような微生物汚染を防止
するためには６０℃以上に酵素反応の最適温度を有し、
同時にｐＨ低下を調整するため■アルカリ剤の添加量を
低減するために反応の至適ｐＨを中性〜弱酸性に有する
酵素が求められている。

一方、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ。

５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｎｏｐｈｉｌｕｓ）や、サーモ
アクチノマイセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕｌｕｇａｒｉｓ）のα−アミラー
ゼは、６５〜７０℃に至適温度を有しており、工業的意
味において優れた特性を有していると考えられるが、酵
素の生産性や培養の因難さのために実用的とは言えなか
った。

このような状況下で高い（６０℃以上）酵素反応の至適
作用温度を有し、しかも弱酸性〜弱アルカリ性領域に安
定ｐＨ範囲を有するα−アミラーゼの開発が強く要求さ
れる。また、このような酵素を開発することによって、
デンプンからのマルトースの製造を安価かつ高い生産性
で実施することが可能となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の第１の目的は上記要件を満足する新規
なα−アミラーゼを提供することである。

本発明の第２の目的は、上記新規α−アミラーゼを簡単
且つ高収率で製造する方法を提供することである。

本発明の第３の目的は上記要件を満足する新規なα−ア
ミラーゼを使用し、デンプンもしくはその分解生成物か
ら収率よく糖類を得る方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは培養が容易であり、酵素反応の至
適温度が６０℃以上にあり、かつ弱酸性側に至適ｐＨを
有する、温度安定性に曖れたα−アミラーゼを生産する
微生物を得るべく鋭意検索した結果、山梨県身延山中の
土壌中から採取された好熱性放線菌が上記目的を達成す
る上で極めて有用であり、これを好気的に培養すること
により、培養物中に上記要件を満足する新規α−アミラ
ーゼＴＦ−３５を高収率で生成蓄積することを見いだし
、本発明を完成したものである。

本発明の方法において使用する新規耐熱性α−アミラー
ゼ生産菌株は、本発明者等により新たに自然界から検索
、単離されたものであるっこの微生物の菌学的性質は下
記に示す通りである。

（１）形態的特徴 栄養寒天上での形態を以下に示す。

■胞子形成菌糸の分肢法　　単純分肢 ■抱子形成菌糸の形態　　　屈曲状（ｆｌｅｘｏｕｓ）
■胞子の数　　　　　　　　１　個 ■砲子の平面構造　　　　　平　滑 ■胞子の大きさ　　　　　　０．８〜０．９　Ｘｏ、　
９〜１．０μ■鞭毛胞子の有無　　　　　認められない
■胞子のうの有ｍ　　　　　　６１２められない■胞子
網の着生位買　　　　気菌糸上 （２）各種培地上の性状 ■栄養寒天培地 旺盛な発育で、表面は白色、裏面は淡い褐色、可溶性色
素は生成しない。又、３０℃の培養で胞子の着生がない
場合気菌糸は、暗緑色である。

■ペプトン・イースト・鉄寒天培地 旺盛な発育で、表面は白色、裏面は褐色、可溶性色票は
生成し：′；−・）： ■イースト・麦芽寒天培地 旺盛な発育で表面：ま薄い褐色、裏面は褐色、可溶性色
素は生成しない。

■オートミール寒天培地 発育は旺盛ではなく、表面は白色、裏面は淡い褐色、可
溶性色素は生成しないニ ゲルコース・アスパラギン寒天、スターチ無機塩寒天、
グリセリン・アスパラギン寒天、シュークロース・硝酸
塩寒天、チロシン寒天、ブリドハム・ボッ）ＩＪ−ブ寒
天培地上では生育しない。

（３）生理的性質 ■生育温度範囲　　　　　　２８〜６０℃生育最適温度
範囲　　　　４５〜５０℃■ゼラチンの液化　　　　　
陽　性 ■デンプンの加水分解　　　陽　性 （スターチ・イースト寒天培地上） ■脱脂牛乳の凝固　　　　　陽　性 〃　　ペプトン化　　　陽　性 ■メラニン色素の生成　　　陰　性 以上の菌学的（！Ｘ質についてバージエイス・マニュア
ル・オン・デタミネーティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　！、４ａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＞の第８版
を参照し本園をサーモモノスポラ・ヒ゛リゾイス（丁ｈ
ｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｖｉｒｉｃｌｉｓ）の一
種と同定した。しかしながら、バージエイス・マニュア
ル・オン・システマテインク・バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１巻ではサーモモ
ノスポラ・ビリディスの記載はなくサーモモノスポラ・
ビリディス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｖ
ｉｒｉｄｉｓ）と興名が変更されていだが、その菌学的
諸性質に関する詳細な記載がなされていないことからバ
ージェイス・マニュアル・オン・デタミ木−テイブ・バ
タテリオロジーの第８版に従シ）本図をサーモモノスポ
ラ・ビリディスと同定した。

なお、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に昭和
６３年ＩＯ月１４日に寄託され、その受託番号は微工研
菌寄１０３３９号（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｐ−１０３３９）
である。

本発明の新規な耐熱性α−アミラーゼＴＦ−３５の製造
法につきさらに詳しく説明するっ上記のようなサーモモ
ノスポラ、属に属するα−アミラーゼＴＦ−３５生産菌
を適当な培地に接種し、その生育温度の観点から２８〜
６０℃、好ましくは４０〜５０℃にて、２４〜４８時間
好気的に培養することにより培養液中に菌体外分泌型酵
素として該α−アミラーゼＴＦ−３５が生成蓄積される
。

本発明に用いられる培地には安価に入手し得る公知の各
種材料を使用することができる。例えば、窒素源として
は、コーン・ステイープ・リカーポリペプトン、大豆粕
、フスマ、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸液などであ
り、炭素源としては、水飴、マルトース、各種デンプン
、可溶性デンプン、デンプン液化液、デキストリン、サ
イクロデキストリンなどである。

また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩等のｇｆ４塩や
各種ビタミン類を必要により添加する。

本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えば、１％可溶性デンプン、０．５％ポリペプトン、
０．５％酵母エキス、０．１％に２１（ＰＯ，。

００２％Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０、を含有する液体培地で
ある。

本発明において有用な前記α−アミラーゼＴＦ−３５生
産菌は菌体外分泌型の酵素を産生ずる。

培養後培養上清中に蓄積される菌体外分泌型酵素は、粗
酵素液として遠心分離により図体を除去することにより
得られる。粗酵素液をそのまま用いることが経済的で有
利である。しかしこれをさらに精製して使用することも
できる。精製のために、例えば硫安等による塩析、エタ
ノール、アセトン、イソプロパツール等による溶媒沈澱
法、限外濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵素
精製法を用′ｖ）ることができる。

以下に、本発明のα−アミラーゼの好ましい製造法の一
例を挙げて更に詳しく説明する。

好熱性放線菌サーモモノスポラ・ビリディスＴＦ−３５
株（微工研菌寄１０３３９号）を、１％可溶性デンプン
、１％ポリペプトン、０．１％ＫｘＨＰＯ＜、　　０．
０２％Ｉ（ｇ　Ｓ　０４・７Ｈ２０を含む培地に植菌し
、４５℃にて４８時間好気的に培養して得ちれる培養液
を１０，０００Ｘｇ、４℃にて連続遠心して菌体を除き
、約Ｌ　ＩＪットルの上澄液（粗酵素液）を得るっつい
で、該上澄液に固形硫酸アンモニウムを添加し、８０％
飽和とし、４℃で一夜放置するっ生じた沈殿を１０，０
００ｘｇ、４℃にて遠心して集め、５　ｍＭ　ＣａＣｌ
　２を含む２ＱｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
に溶解させた後、回復（ｋ液に対して一夜４℃で透析す
る。透析により生じる沈澱は遠心分離により除き、得ら
れる上澄液を５ｒｎｋｉｃａｃβ２を含む１０ｍＭトリ
ス・塩酸援（封液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ
−セルロースカラムに吸着させ、０．０５ＭのＮａＣｉ
を含む上記と同様な緩衝液によって酵素を溶出させる。

溶出した活性画分を集め平均分画分子ｉ５．０００の限
外濾過膜を用いてａ縮した後、０．２　Ｍ　Ｎａｃβを
含む上記同様のトリス・塩酸緩衝液を用いて−ｐｉ透析
する。次いで、該透析酵素を同様にＱ、２ＭＮａＣｆを
含む上記トリス・塩酸緩衝液で平衡化したセファクリル
Ｓ−２００カラムを用いてゲル濾過に付し、活性画分を
集める。かくして得られるＲ製酵素はポリアクリルアミ
ドゲルディスク電気泳動的に単一であり、活性収率は約
１８％であった。

このようにして得られる本発明の新規アミラーゼＴＦ−
３５は下記の理化学的性質を有する。

（イ）作用 アミロペクチン、アミロース、デンプン、グリコーゲン
及びそれらの部分加水分解物中のα−１，４−グルコピ
ラノシド結合からなる直鎖状構造を特異的に加水分解し
、主成分としてマルトースを生成する。

（ワ）基質特異性 マルトトリオース以上の重合度を有するα−１，４グル
コピラノシド結合からなる直鎮状マルトオリゴ糖及びサ
イクロデキストリンを加水分解し、プルラン及びパノー
スを加水分解しない。

（ハ）　至　適　ｐＨ５，５〜６，０ （功安定ｐＨ ４０℃、３時間の条件下でｐｆ１５．５〜９，０で安定
である。

（ネ）作用適温　　約６０℃ （へ）失活温度 ６０℃、１０分間の条件下ではｐＨ４及びｐＨ９で完全
に失活し、ｐＨ６，３０分間の条件下で７０℃で完全に
失活する。

（ト）温度安定性 ｐＨ６，３０分間の条件下では、５５℃まで安定である
。

（チ）阻害、活性化及び安定化 本酵素は、銅、水銀、カドミウム、亜鉛、３価の鉄、Ｎ
−ブロモサクシニイミドで阻害され、カルシウムで安定
化されろう （１月分子量〈ゲル濾過法） １３．０００±２．０００ （ヌ）等電点（クロマトフオーカシング法）５．２ 更に、α−アミラーゼＴＦ−３５の活性測定法並びに活
性表示法は以下の通りである。

０．１Ｍの酢酸援衝液（ｐＨ６，０）に溶解させた１％
（’ｖＶ／Ｖ）のアミｏ−ス溶液０．３　ｍｌに酵素液
０．０５−を混合し、５５℃で１０分間反応させた後、
ＤＮＳ試薬〔ジェイ・アール・サムナー・ジー・イー・
ソマーズ、“ラボラトリ−イクスベリメンツ　イン　バ
イオロジカル　ケミストリーアカデミツク　プレス、ニ
ューヨーク　（ホＲ。

Ｓｕｍｎｅｒ、　Ｇ、　巳、　Ｓｏｍｅｒｓ、“Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙεｘｐｅｒ　ｉｍｅｎｔｓ＋ｎ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　３４５５項、１９４４年］　ｌ
−を加えて反応を止める。次いで、沸騰水中で１０分間
加熱した後急冷し、５ｄの水を加えて充分に撹拌する。

同時に処理した０、３５ｍｆの０．５ｍｇ／ｍ！グルコ
ース溶液を標準とし、その着色度分光光度計を用いて５
００ｎｒｒｌで測定する５酵素活性の単位は前述の条件
下で１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位とした。

本発明の方法によって得られる耐熱性α−アミラーゼＴ
Ｆ−３５の理化学的、酵禦化学的諸件賃と従来公知の放
線菌由来のマルトース生成型α−アミラーゼとの比較を
第１表に示す。

作用 本発明のα−アミラーゼは、アミロース、アミロペクチ
ン、デンプン、グリコーゲン中のα−１゜４−グルコピ
ラノシド結合を加水分解し、マルトースを主成分とする
糖質を生成する。このマルトースはデンプン糖の一種で
麦芽糖ともよばれ、般に甘味剤、栄養剤などとして有用
なものである。

このデンプン糖の生成反応は、低温かつ弱酸性条件下で
実施された場合、既に述べたような微生物汚染に起因す
る様々な悪影響を受けることが知られている。そこで、
このデンプンの酵素加水分解反応をできるだけ高温条件
下で行ない、また、中性〜弱アルカリ側のｐＨ条件下で
実施することが望ましいとされている。

しかしながら、これまでに単離されたマルトースを主に
生成するα−アミラーゼは熱安定性に劣り、殆どが５０
℃前後の至適温度を示すにすぎなかった。更に、一部高
温領域に至適温度を有するものも知られているが、酵素
の生産性が悪い、該酵素産生微生物の培養が困難である
等の欠点を有しており、高価であり、大規模使用ができ
ないなど工業的観点から十分満足できるものでなかった
。

しかしながら、このようなデンプンの酵素分解反応に係
わる諸問題点は、本発明によるα−アミラーゼ並びにそ
の製法によってほぼ解決される。

即ち、まず本発明のα−アミラーゼは約６０℃に酉￥素
反応の至適温度を有しており、至適ｐＨも弱酸性〜中性
領域にある。従って、デンプンの加水分解を高温でしか
も弱酸性領域近傍で実施することが可能となる。この事
実は、微生物汚染を確実に防止することを保証し、また
汚染に基づ＜ｐＨ低下を補償する目的でアルカリ試薬を
添加する必要もなくなり、コストパフォーマンスにおけ
る大巾な改善が期待できる。更に、高温での反応が可能
なことから、反応速度の改善が期待でき、これは分解生
成物の量産性を保証する。

かくして、本発明の方法によればデンプンの酵素生産の
ために有用α−アミラーゼを安価かつ大量に供給でき、
またかくして得られる酵素によりマルトースを高度に含
有するデンプン塘の工業的に大規模な生成を有利に実施
できる。

実施例 以下、実施例に従って本発明の新規耐熱性マルトース生
成型のα−アミラーゼＴＦ−３５の製造法及びそれを用
いたデンプンまたはその分解生成物からのを用な糖類の
製造法につき更に具体的に説明する。

しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって回
答制限されるものはない。

実施例１ 好熱性放線菌サーモモノスポラ・ビリディスＴ　Ｆ　−
３５（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｖｉｒｉｄｉ
ｓＴ　Ｆ　−３５）菌株を５００ｍ！容の三角フラスコ
中に可溶性デンプン２％、ゼラチン加水分解物２％、Ｋ
、ＨＰＯ，０，１％、Ｍｇ５ＣＬ　０．０２％を含む培
地（ｐＨ７，０）　　５０ｍ１：の２０本に植菌し、４
５℃で４８時間２００ｐｐｍで回転振盪培養した後、集
菌しついで１２．　ＯＯＯ×ｇ、４℃で３０分間遠心分
離して菌体を除き、１１０車位／ｒｎｌの酵素液８４０
ａｌｌ！得た。

得られた粗酵素液に固形硫酸アンモニウムを添加し、８
０％飽和とし、４℃で一夜放置するユ生じた沈殿を１０
，０００ｘｇ、４℃にて遠心して集め、５　ｍＭ　Ｃａ
Ｃｆｌ　２を含む２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（、ｐｌ
（８，０）に溶解させた後、同緩衝液に対して一夜４℃
で透析する。透析により生じる沈澱は遠心分離により除
き、得られる上澄液を５ｍＭＣａＣ１２を含む１０ｍＭ
）リス・塩酸緩衝液（ｐｌ（８，０）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムに吸着させ、０．０５ＭのＮａ
Ｃ１を含む上記と同様な緩衝液によって酵素を溶出させ
る。溶出した活性画分を集め平均分画分子ｆｆ１５．０
００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．２ＭＮａＣ
ｊ７を含め上記同様のトリス・塩酸緩衝液を用いて一夜
透析する。

次いで、該透析酵素を同様に０．２ＭＮａＣβを含む上
記トリス・塩酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２
００カラムを用いてゲル濾過に付し、活性画分を集める
。かくして得られる精製α−アミラーゼＴＦ−３５はポ
リアクリルアミドゲルディスク電気泳動的に単一であり
、活性収率は約１８％であった。

実施例２ （イ）１０ｍ〜□ｒ　ＣａＣ１’ｚ　　・２Ｈ２０を含
む５ｍｆ！の５％（Ｗ／Ｖ）の可溶性デンプン（メルク
社製）にデンプンＩｇ当り２００単位の実施例１で得た
本発明の精製α−アミラーゼＴＦ−３５を添加し、　５
５℃、ｐ）ｔ５．５で反応させた。２４時間後の反応液
中の糖組成をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｌａｂ）
社製ＨＰＸ−４２Ａカラムを用いる高速液体クロマトグ
ラフ法（ＨＰＬＣ）で測定した。

その結果、グルコース１２．５％、フルドース７３．４
％、マルトトリオース８．２％、オリゴ糖５．９％であ
った。

（ロ）特異性 マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、パノース、
プルラン、及びα、β、Ｔ−サイクロデキストリンの１
０　ｍＭ　ＣａＣρ２・２Ｈ２０を含む５％溶液５ｍｌ
に基質１ｇにつき２００単位の本発明の精製α−アミラ
ーゼＴＦ−３５を添加し、５５℃で２４時間反応させた
。反応生成物をＩＩＰＬｃ法で測定した結果を第２表に
示す。

（ハ）至適ｐＨ Ｏ４ＩＭ酢酸護衝液（ｐＨ４，０，５，０，５，５゜６
．０）、０．ＩＭリン酸謹衝液（ｐＨ６．０　、　６．
５７．０，８．０＞または、０．１Ｍグリシン援衝液（
ｐＨ９，０）に溶解させた１　％（Ｗ／Ｖ）　可ｉ？ｌ
Ｅヂンブンイ容液１．０ｄに本発明の精製酵素を予め１
ｍ〜Ｉ　ＥＤＴＡを含む水で一夜透析したα−アミラー
ゼ含有溶液０．０５ｍを混合し先に述べた方法でα−ア
ミラーゼ活性を測定した。α−アミラーゼＴＦ−３５の
至適ｐ）ＩはｐＨ６，０における酵素活性を１００とす
る相対活性で示した（第１図）。

（ニ）安定ｐＨ ｐＨ４〜９の範囲で（ハ）で用いた酵素と同様に処理し
た本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５を４５℃で３時間
及び６０℃で１０分間処理し、ｐＨ６，０で処理した時
の残存酵素活性を１００とする相対活性を第２図に示す
。なお、使用した暖衡液は酢酸（ｐＨ４〜６）、リン酸
（ｐＨ６〜８）及びグリシ：／−ＮａＯＨ−ＮａＣ；！
　（ｐｉ（９）である。

ｐＨ６，３０分、７０℃、 〈ネ）作用適温 くハ）で用いた酵素と同様に処理した本発明のα−アミ
ラーゼＴＦ−３５含有溶液の活性を各温度で測定した。

６０℃で測定した時の酵素活性を１００とした時の相対
活性を第３図に示す。

（へ）失活条件及び、温度安定性 精製した本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５を（ハ）で
用いた酵素と同様に処理した後、１０ｍＭｃａｃ　ｊｉ
！　２　・２Ｈ２０存在下及び、不存在下で５０℃及び
、６０℃で３０．６０，１４０，２１．０分間処理し、
残存する活性を測定した。その結果を第４図に示す。

（チ）阻害化 （ハ）で用いた酵素と同様に処理した本発明のα−アミ
ラーゼＴＦ−３５含有溶液に總濃度１ｍＭ（水銀は０，
１ｍＭ）となるように各種金属の塩酸塩を添加し活性を
測定した。無添加時の活性を１００とした時の相対活性
を測定した結果を第３表に示す。

第３表　金属及び化学試葵の影響 くり〉　　分　子　１１ セファクリルＳ−２００を用いたゲル濾過法により求め
た本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５の分子量は、１３
．０００±２．０００であった（第５図）Ｃ （ヌ）等電点 ファルマシア社１１ＰＢＥ９４ゲル及び、ポリバッファ
ー７４を用いるクロマトフオーカシング法により求めた
本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５の等電点は、５．２
であった（第６図）Ｃ実施例３ 好熱性放線菌サーモモノスポラ・ビリディスＴ　Ｆ　−
３５＜Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｖｉｒｉｄｉ
ｓ　Ｔ　Ｆ　−３５）菌株を５００社容０三角フラスコ
中の可溶性デンプン２％、ゼラチン加水分解物２％、Ｋ
、ＨＰＯ４０，１％、：、４ｇ５Ｏ，０，０２％を含む
培地（ｐＨ７．０）　　５０ｒｎｌの１０本に植菌し、
４５℃で４８時間、２００ｒ、　ｐｌｍ、で回転振盪培
養した後、集菌しついで１２．０００ｇ、４℃で３０分
間遠心分離して菌体を除き、８７．５単位／−の粗酵素
液４５０−を得た。ついで平均分画分子量５．０００の
限外濾過膜を用いてこれを’４１　Ｒし、３．２００単
位／蔵のａ１粗酵素液を約１０ｍ１得た。なお、酵素の
活性単位は上記方法によって測定した。

ついで、５ｍｆの２０％（Ｗ／Ｖ）とうもろこしデンプ
ン懸濁液を細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（大和化成
側型、タライスターゼＴ−５）を用いて１０５℃で液化
した後、直に１２５℃で３０分間オートクレーブし、Ｄ
、　　Ｅ　（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ　
：直接還元糖に対する全固定物の割合）８のデンプン液
化液を得た。該デンプン液化液に対しデンプン１ｇ当り
２００単位のＴＦ’−３５菌の前述の方法で調製した濃
縮粗酵素液を添加し、ｐＨ５，５，５５℃で４８時間反
応させた。

ついで、反応柊了後の糖液に対して、０．２％（Ｗ／Ｖ
）の活性炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、
０．４５μｍポアサイズのメンブランフィルタ−で濾別
して得られる糖液中のマルトース含量をアミネックス（
Ａｍ１ｎｅｘ　）ＨＰ　Ｘ　−４２Ａ　（Ｂｉｏ　−Ｒ
ａｄ　−Ｌａｂ社製）カラムを用いる高速液体クロマド
グガフ法で測定した結果、７２．５％であった。

実施例４ ５ｍ１の２０％（Ｗ／Ｖ）馬鈴薯デンプン懸濁液を細菌
液化型α−アミラーゼ（大和化成■製りライスターゼし
−１）を用いて９０℃で液化した後、直ちに１２５℃で
３０分間オートクレーブし、Ｄ。

Ｅ９のデンプン液化液を得た。

該デンプン液化液の固形物に対し、０．２％の大豆由来
のβ−アミラーゼ（長潮生化学社製１０．０００Ｕ／ｇ
）　　及び実施例３で調整した濃縮粗酵素液をデンプン
Ｉｇ当り２００単位添加し、ｐＨ５，５，５５℃で４８
時間反応させた。

ついで得られる糖液を実施例３と同様の方法で脱色、濾
過し、糖液中のマルトースの含有量を高速液体クロマト
グラフ法で測定した結果、８２．３％であった。

実施例５ １０ｍ１の２５％（Ｗ／Ｖ）とうもろこしデンプン懸濁
液を細菌液化型α−アミラーゼ（大和化成Ｇａ製クりイ
スターゼし−５）を用し）で９０℃で液化した後、直ち
に１２５℃でオートクレーブし、Ｄ、Ｅ５のデンプン液
化液を得た。

該デンプン液化液の固形物に対し、０．０５％プルラナ
ーゼ（大野製菓製３．８３０　Ｕ／ｇ）及び実施例３で
調整した濃縮粗酵素液をデンプン１ｇ当り３００単位添
加し、ｐＨ５．５．５５℃で４８時間反応させた。

つ５１で得られる糖液を実施例３と同様の方法で脱色、
濾過し、糖液中のマルトースの含有量を高速液体クロマ
トグラフ法で測定した結果、７８．２％であった。

実施例６ 実施例５で調製したデンプン液化液に固形物に対し、０
．０１％イソアミラーゼ（材厚製１２５０．０００ｔＪ
／ｇ＞及び実施例３で調製した濃縮粗酵素液をデンプン
１ｇ当り２００亘位添加し、ｐＨ５，５，５５℃で反応
させた。

ついで得られる糖液を実施例３と同様の方法で脱色、濾
過し、糖液中のマルトースの含有量を高速液体クロマト
グラフ法で測定した結果、７６．５％であった。

実施例７ 約４５βの２８％（Ｗ／Ｖ）とうもろこしデンプン懸濁
液を細菌糖化型α−アミラーゼ（大和化成潤製クライス
ターゼし−５）を用いて９０℃で液化した後、直ちに１
２５℃でオートクレーブし、Ｄ、Ｅ５のデンプン液化液
を得た。

該デンプン液化液の固形物に対し、０．１大豆由来のβ
−アミラーゼ（長潮生化学社製Ｌ０，０００Ｕ／ｇ）、
０．１％のプルラナーゼ（大野製薬製３、８３０　Ｕ／
ｇ）及び実施例３で調製したａ１粗酵素液をデンプン１
ｇ当り１００単位添加し、ｐＨ５，５，５５℃で４８時
間反応させた。

ついで得られる糖液を実施例３と同様の方法で脱色、濾
過し、糖液中のマルトースの含有量を高速液体クロマト
グラフ法で測定した結果、８８．０％であった。

〔発明の効果〕

以上詳しく述べたように、本発明によれば高温度域（６
０℃）に酵素反応の至適温度を有し、しかも弱酸性〜弱
塩基性領域に安定ｐＨ範囲を有するマ）レトース生成型
α−アミラーゼが提供され、このものはその前記緒特性
に基づき、デンプンの酵素分解反応の収率、効率を大幅
に改善することを可能とする。しかも余分な試薬の必要
性を排除し、脱塩などの後処理工程が短縮でき経済性も
著しく向上する。

かくして、本発明は安価かつ大規模でのデンプン糖の製
造を可能とするもので工業的に極めて大きな意義を有す
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図には、それぞれ本発明のα−アミラー
ゼＴＦ−３５の相対活性のｐＨ依存性及び温度依存性を
示す。第２図及び第４図には、それぞれ本発明のα−ア
ミラーゼＴＦ−３５の残存活性とｐＨ及び温度との関係
を示す。第５図は、本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５
を含むタンパク賃の分子量とフラクションとの関係を示
す図である。 第６図は、本発明のα−アミラーゼＴＦ−３５０等電点
が５．２であることを示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の理化学的性質を有するα−アミラーゼＴＦ
   −３５。 （イ）作用 アミロペクチン、アミロース、デンプン、 グリコーゲン及びそれらの部分加水分解物中のα−１，
   ４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状構造を特異的
   に加水分解し、主成分としてマルトースを生成する。 （ロ）基質特異性 マルトトリオース以上の重合度を有するα −１，４グルコピラノシド結合からなる直鎖状マルトオ
   リゴ糖及びサイクロデキストリンを加水分解し、プルラ
   ン及びパノースを加水分解しない。 （ハ）至適ｐＨ５．５〜６．０ （ニ）安定ｐＨ ４０℃、３時間の条件下でｐＨ５．５〜９．０で安定で
   ある。 （ホ）作用適温約６０℃ （ヘ）失活温度 ６０℃、１０分間の条件下でｐＨ４及びｐＨ９で完全に
   失活し、ｐＨ６、３０分間の条件下で７０℃で完全に失
   活する。 （ト）温度安定性 ｐＨ６、３０分間の条件下では、５５℃まで安定である
   。 （チ）阻害、活性化及び安定化 本酵素は、銅、水銀、カドミウム、亜鉛、 ３価の鉄、Ｎ−ブロモサクシニイミドで阻害され、カル
   シウムで安定化される。 （リ）分子量（ゲル濾過法） １３，０００±２，０００ （ヌ）等電点（クロマトフォーカシング法）５．２
2. （２）菌体外分泌型酵素である請求項（１）記載のα−
   アミラーゼＴＦ−３５。
3. （３）サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏ
   ｒａ）属に属するα−アミラーゼＴＦ−３５生産菌を培
   養し、培養物からα−アミラーゼＴＦ−３５を採取する
   ことを特徴とするα−アミラーゼＴＦ−３５の製造法。
4. （４）サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏ
   ｒａ）属に属するα−アミラーゼＴＦ−３５生産菌が微
   工研菌寄第１０３３９号である請求項（３）記載の製造
   法。
5. （５）請求項（１）記載のα−アミラーゼＴＦ−３５を
   単独もしくはβ−アミラーゼ及び／又は枝切り酵素と併
   用して、デンプンもしくはその加水分解物に作用させる
   ことを特徴とする糖類の製造法。