JPS62126993A - マルト−スの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、新規なアミラーゼＧ４とβ−アミラーゼを組
み合せ、澱粉から収量よくフル１〜−スを製造する方法
に関するものである。

〔従来技術〕

β−アミラーゼはアミロース及びアミロペクチンの非還
元性末端からマルトースを生成するが、β−アミラーゼ
はアミロペクチン中の分岐結合（α−１，６−グルコシ
ド結合）を加水分解することができないため、アミロペ
クチンやこれを含む澱粉からのマルトースの収量は５０
〜６０％である。

そして、これ以上に収量よくマルトースを得るためには
、α−１，６−グルコシド結合を加水分解する、プルラ
ナーゼ、イソアミラーゼなどのα−１，６−グルコシダ
ーゼをβ−アミラーゼと併用して使用する必要がある。

〔目　　的〕

本発明は、澱粉からマルトースを７０％以上の高い収量
で収得する新規なマルトースの製造方法を提供するもの
である。

本発明者は数年来、澱粉からマルトース以上の各種オリ
ゴ糖の製法を確立することを目的として、広く自然界よ
り、新規なアミラーゼ生産菌の検索を行ってきた結果、
アミロース、アミロペクチン、澱粉などのα−グルカン
を特異的にマルトテトラオース（Ｇ４）に加水分解する
新規なアミラーゼがバシルス・サーキュランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）と同定した細菌によ
り生産されることを認めた。

澱粉からマルトテトラオースを生成するアミラーゼとし
て、シュードモナス・スッッツェリ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏ
ｎａｓｓｔｕｚｅｒｉ）の生産するアミラーゼが、アミ
ロースやアミロペクチンの非還元性末端からマルトテト
ラオース単位で加水分解することが知られている。しか
し、この酵素はアミロペクチンやグリコーゲンからは高
分子量のリミットデキストリンを残すと報告されている
〔アーカイブバイオケミストリーアンドバイオフィジク
ッス（Ａｒｃｈｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｊｒｙ　ａ
ｎｄｔｌｌｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）　１４５巻１０５頁（
１９７１））　、そして、この酵素による澱粉からのマ
ルトテトラオースの収量は約５５％、アミロペクチンか
らの収量は５２％である。〔アメリカ合衆国特許ＵＳＰ
３，６５４，０８２（１９７２）　、アミラーゼシンポ
ジウム、６巻、３１頁（１９７１））　。

しかるに、バシルス属細菌の生産するアミラーゼは、′
Ｉ！Ｑ粉から約６５％〜７５％の極めて高い収量でマル
トテトラオースを生成することが認められた。

マルトテトラオースの収量は、使用する澱粉の種類、液
化塵（ＤＥ）、酵素量などにより影響されるが、通常、
グルコース１〜５％、マルトース５〜１５％、フル１−
トリオース５〜１５％、マルトテトラオース６５〜７５
％、マルトペンタオース１〜５％、その他の糖類１〜１
５％である。

たとえば、ＤＥ４．２のポテトスターチを使用したとき
の糖組成は第１表に示す通りである。表から明らかなよ
うに、この酵素は、澱粉に作用させたとき高分子のリミ
ットデキストリンを殆んど残すことなく、ｇ１８）から
マルトテトラオースを極めて高い収量で生成する。

第１表 しかるに、本酵素はアミロペクチンやプルランのα−１
，６−グルコシド結合を分解することができないことか
ら、ｅｎｄｏ型の分解機作をもった酵素であると考えら
れ、シュードモナス・スッッツェリの酵素とは基質特異
性において著しく異なった酵素ということができる。こ
の他、本発明の酵素はシュードモナス・スッツエリの酵
素に比べ、最適作用ＰＨ範囲が広いこと、分子盆が小さ
い、などの差も認めちれる〔アーカイブバイオケミスト
リー　アンド　バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉ
ｃｓ）１４５巻、１０５頁（１９７１））ことから新規
な酵素と認められるものである。本発明者は、この酵素
をアミラーゼＧ４と命名した。

〔効　　果〕

以上の通り、アミラーゼＧ４はα−１，６−グルコシド
結合を分解することはできないが、アミロースやアミロ
ペクチンをマルトテトラオース単位で規則的に分解し、
且つアミロペクチンの分岐内鎖も切断する能力をもって
いるため、リミットデキストリンを殆んど残すことなく
、アミロペクチンや澱粉を分解することができる。この
ため、本酵素はβ−アミラーゼのようなマルトース生成
酵素を併用して用いるとき、アミロペクチンやこれを含
む澱粉からも７０〜８０％の高い収量でマルトースを得
ることができる。本発明は、この知見に基づいてなされ
たものである。

〔構　　成〕

すなわち１本発明は、澱粉、又はその派生物である液化
澱粉に、バシルス属アミラーゼＧ４とマルトース生成酵
素を作用させることを特徴とするマルトースの製造方法
に関するものである。以下に、本発明の内容を更に具体
的に説明する。

本発明において使用するアミラーゼＧ４は、土壌中より
分離し、バシルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）と同定された細菌の生産する菌体
外酵素であり、下記の酵素的性質を有する。

（１）作用：　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−グルカンを、マルトテトラオースを主成
分とする分解物に分解する。

本酵素はエンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約６５〜７５％
の収量でマルトテトラオースが得られる。

（２）作用温度範囲及び最適温度；　１％可溶性澱粉、
０．０５Ｍリン酸緩衝液の下で作用させたとき、約７５
℃まで作用し、最適作用温度は約５０°Ｃである〔第１
図（ａ）〕。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適ＰＨ；　　約４〜約１２の
広い範囲シ；作用する。最適作用ｐｌ＋は６〜８．５で
ある（０．０５Ｍ酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶性
澱粉下で作用、第１図（ｂ））。

（４）熱安定性；　　０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，
０）の下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱で約
４０％失活し、５５℃、１０分間の加熱で約８５％失活
した。〔第１図（Ｃ）〕。

（５）ｐＨ安定性；　　０．１Ｍ緩衝液の下で、室温（
２５℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、ｐｌ＋６〜９の範囲で安定であった。

〔第１図（ｄ）〕 （６）安定化；　カルシウムイオンが存在するとき。

熱安定性の増加が認められた。

〔第１図（Ｃ）の破線〕 （７）阻害剤；　本酵素は、５Ｘ１０−　’　ＭのＨｇ
Ｃ１ｚ、Ｃｕ５Ｏ４、Ｚｎ５Ｏ４、ＡｇＮ０３により、
それぞれ約１００％、約９５％、約５０％、約３０％阻
害された。

（８）精製方法；　本酵素は、液体培養物の遠心上澄液
から、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｃｐｈｉ
↑ｏ４１ｃ）カラム　クロマトグラフィーとバイオゲル
（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａｏ、　５ｍカラム、クロマトグラフ
ィー及び同ゲルによる再クルマドグラフィーにより電気
泳動的に均一まで精製することができる。

（９）分子量；　バイオゲル（Ｂｉｏｇｃｌ）Ａｏ、５
ｍを用いたゲル濾過法により測定した分子量は約１万で
あった。

（１０）力価測定法；　　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解させた２％可溶性澱粉０．５腸Ωに、適
量の酵素を加え、水で全ｉ１＋ｅＱとし、４０℃で反応
させる。この条件で、１分間に１μモルのグルコースに
相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について１本発明以前に知られている
シュードモナススッッツェリのマルトテトラオース生成
アミラーゼと比較すると（１）最適作用ｐＨは本発明の
酵素はｐＨ６〜８．５の広いｐＨ範囲にあるのに対し、
シュードモナススッッツェリの酵素はｐＨ８付近にある
こと、（２）本発明の酵素を澱粉に作用させたとき、約
６５〜７５％の収量でマルトテトラオースが得られるに
対し、シュードモナススツッツェリの酵素の場合は約５
５％であること、（３）本発明の酵素の分子量は１万前
後にあるのに対し、シュードモナススツッツェリの酵素
は、　４８，０００と５８，０００にある〔バイオケミ
ストリーアンドバイオフィジクスアクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ａｃｔａ
）５６６巻、８８頁（１９７９）　）など、本発明の酵
素とシュードモナススツッツェリの酵素とは、澱粉から
のマルトテトラオースの収量。

最適作用ｐＨ，分子量などの性質において顕著な違いの
あるものであり、新規な酵素ということがきる。

本発明の酵素を生産するバシルスサーキュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｇ−４の菌学的性
質は下記に示す通りであり、微工研条寄第８２０号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

（１）形態；　桿菌、巾０．５〜１×５〜６μ、運動性
なし。

ダラム陰性。

（２）胞子；　通常、末端近くに１個、胞子嚢のふくら
みは認められない。

（３）肉汁；　混濁、沈降する。

（４）肉汁寒天；　生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及び
表面凹凸あり。

（５）グルコース肉汁寒天；　生育良好、淡黄〜淡褐色
。

（６）グルコース硝酸寒天；　生育悪い。

（７）ポテト；　生育良好、乳白色に生育。

（８）グルコース・アスパラギン寒天；　生育あまり良
くない。淡黄〜黄褐色。

（９）チロシン寒天；　良く生育する。わずかに褐色。

（１０）ミルク；　ゆっくり凝固、ペプトン化。

（１１）インドール；　生成しない。

（１２）カタラーゼ；　生成する。

（１３）アセチルメチルカルビノール；　生成しない。

（１４）硫化水素；　生成しない。

（１５）クエン酸；　利用する。

（１６）硝酸塩の還元；　陰性。

（１７）クエン酸；　利用する。

（１８）食塩肉汁；　８％食塩含有培地までよく生育し
１０％食塩でも少し生育する。

（１９）炭水化物の利用；　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リ
ボース、マルトース、シュークロス、澱粉などから酸を
生成するが、ガスの生成はない。Ｄ−キシロース、し−
ラムノース、Ｌ−ソルボースの利用性は良くない。

（２０）最適生育温度；２６℃前後。

（２１）最高生育温度；　約６０℃。

（２２）死滅温度；　　１００℃、で３０分間加熱して
も死滅しない。

以上の菌学的性質について、バージェイスマニュアルオ
ブデタミネーティブバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’
Ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔａｒｍｉｎａｔ
、ｉｖｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の第７版及び第８
版（ザウィリアムスアンドゥイルキンスカンパニー（Ｔ
ｈｅ　Ｖｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）、（１９５７年及び１９７４年）を参照し
、本菌をバシルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）の一種と同定し、バシルスサーキュ
ランスＧ−４と命名した。

本発明によるアミラーゼＧ４を生産するための培養は、
窒素源として、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、カゼ
イン、コーン・ステイープ・リカー、大豆粕など、通常
、微生物の培養に対しよく用いられる有機窒素源が使用
され、炭素源としては、澱粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シュークロスなどが使用される。そし
て、これに補足する栄養源として、無機窒素源、リン酸
塩、マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が使用され
る。培養はｐＨ５〜９、温度２０〜６０℃で好気的に行
われる。

アミラーゼＧ４は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。必要により濃縮し。

硫安、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、または、ア
セトン、イソプロパツール、エタノール、メタノールな
どの有機溶媒を加えて、酵素を沈澱物として収得し、乾
燥、保存する。

本発明において、アミラーゼＧ４と併用されるマルトー
ス生成酵〜素としては１通常、大豆、小麦、大麦など、
植物起源のβ−アミラーゼや、バシルス属など細菌の生
産するβ−アミラーゼ〔アグリカルチャ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　４０巻、１５１５
頁（１９７６）など〕が使用されるが、この他、バシル
ス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属などの
微生物の生産するマルトース生成α−アミラーゼも使用
することができる。

アミラーゼＧ４とマルトース生成酵素と組み合せて行う
澱粉の糖化反応は、次のようにして行う。

澱粉は、通常、あらかじめ酸または液化型α−アミラー
ゼにより液化される。液化度はマルトースの収量に影響
し、なるべく低ＤＥであることが望ましい。通常、ＤＥ
５以下の液化澱粉が使用される。

反応は、基質濃度、通常５〜４０％において通常ＰＨ５
〜８．温度は４０℃〜６０℃で行われる。アミラーゼＧ
４はカルシウムイオンの存在により熱安定化されるので
、糖化に際し、通常５ｘｉｏ−’〜２Ｘ１０−　”　Ｍ
程度のカルシウム塩が添加される。

アミラニセＧ４とβ−アミラーゼなどマルトース生成酵
素は、同時に澱粉に作用させるのが望ましいが、あらか
じめ、マルトース生成酵素で糖化し、反応途中でアミラ
ーゼＧ４を添加して反応を継続するか、あるいは、最初
、アミラーゼＧ４で反応を開始し１次いでマルトース生
成酵素を添加して反応を行なう。

次に、実施例により、本発明の詳細な説明する。

実施例１ ポリペプトン１％、リン酸２カリ０．３％、硫酸マグネ
シウム（７水塩）０．１％、可溶性澱粉１％からなる培
地３０ｍ２を２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、１２
０℃で１０分間殺菌したのち、バチルスサーキュランス
Ｇ４（微工研条寄第８２０号）を接種し、３０℃で４日
間振盪培養した。

培養後、遠心分離して得た上澄液について、生産された
アミラーゼＧ４を測定した結果、培地１ｍＱ当り、６．
１単位であった。

該上澄液に、冷アセトンを２倍容量加え、生成した沈澱
物を水に溶解し、アミラーゼＧ４の酵素液とした。

バシルス・ズブチルスの液化型α−アミラーゼを用い、
常法により液化した、ＤＥ４．２のポテト液化澱粉１ｇ
（固形分として）に、アミラーゼＧ４を４単位又は／及
び大麦β−アミラーゼ５００単位（ベーリンガー・マン
ハイム製、活性の測定及び定義はアグリカルチャー・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、）第４０巻、　１５１５頁（１９７６）
に記載の方法によった）、ＣａＣｕ　２５Ｘ１０−３Ｍ
量を加え、全景１０ｍ１２とし、ρト１７付近、５０℃
で２０時間反応を行った。反応後、糖化糖中の糖組成を
液体クロマトグラフ法により定量した。結果は第２表に
示す通りである。

第２表 （Ｇ１．　Ｇ２、Ｇ３及びＧ４は、それぞれグルコース
の１．２゜３及び４量体を示している。） 実施例２ 実施例１と同様にして調製した液化塵（ＤＥ）の異なる
液化ポテト澱粉各１ｇ（固形分として）に、アミラーゼ
Ｇ４をＩＯ単位、大麦製β−アミラーゼ１０００単位と
ＣａＣｌ２２５Ｘ１０−３Ｍｆｆ１加え、全量１０ｍ　
Ｑとして、５０℃で３日間反応を行った。反応後、糖化
液中の糖組成を液体クロマトグラフ法により定量した。

結果は第３表に示す通りである。

第３表 実施例３ 実施例１において、マルトース生成酵素として大豆β−
アミラーゼの代りに、バシルス・セレウス・バリエータ
ス・ミコイデスのβ−アミラーゼ（北海道糖業（株）よ
り入手することができる）を５００単位／ｇを加え、５
０℃で２日間反応を行った。得られた糖化液の糖組成を
分析した結果は第４表に示す通すであった。

第４表

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）と（ｄ）は、それぞれア
ミラーゼＧ４の最適ρ■、最適温度、熱安定性とｐＨ安
定性を示している。 大１回 張Ａ（ＯＣ）　　　　　　　　　　　　ｐＨ瓜潅（１Ｃ
）　　　　　　　　　　　　ｐＨ手続主甫正書（自発） 昭和６１年８月２２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 澱粉又は液化澱粉に、バシルス属アミラーゼＧ４とマル
   トース生成酵素を作用させることを特徴とするマルトー
   スの製造方法。