JPH02107186A - Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤＨと略す）を酸化して過酸化水素又は水
を生成する酵素反応に関与するＮＡＤＨオキシダーゼを
微生物を用いて製造する方法に関するものであり、本発
明の方法によれば、活性の安定なＮＡＤＨオキシダーゼ
を効率よく製造する二とができる。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
と略す）は、生体内で行われる種々の脱水素酵素反応の
補酵素であり、それらの酵素の中には工業的に有用な光
学活性化合物、反応中間体等の製造に好適に用いうるち
のが少なくない。目的とする酵素を反応素子として酵素
リアクターに用いる場合、反応当量のＮＡＤを使用する
ことは高価なＮＡＤを使い捨てにすることになり実用的
方法とはなりえない。従って、反応系に投入するＮＡＤ
量を反応当量より減少し、生成したＮＡＩ）Ｈを系内で
再生する必要がある。再生方法としては酵素的方法及び
化学的方法が知られているが、種々の欠点を有している
［ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー（Ｊ　ｏｕｒｎａＬ　　６ｆＡ　ｍｅｒｉｃａｎ　
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓ　ｏｃｉｅｔｙ）、１０７巻
、第６９９９−７００８ページ、■９８５年等参照１゜
例えば、再生反応速度の低さ、再生応用に用いた基質−
生成物と目的反応の生成物の分離、再生反応基質の価格
等の問題がある。これらの問題のいくつかは分子状酸素
を直接の電子受容体としてＮＡＤＨを酸化することによ
り解決することができる。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼ
はＮＡＤＨを分子状酸素を用いて酸化しＮ’ＡＤを再生
するのに有用な酵素である。

従来の技術 従来より分子状酵素を電子受容体としてＮＡＤＨを酸化
するＮＡＤＨオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・
プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ）由来のもの［アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒ
ａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）　２５巻、第８７６ページ、１９６１年
１、ストレプトコッカス・７アエカリス（Ｓ　ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のもの［
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミメトリー（Ｊ
　ｏｕｒａｎｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２３７巻、第２６４７ペー
ジ、１９６２年１、アコレプラズマ・ライドラライ（Ａ
　ｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ　　Ｉａｉｄｌａｗｉ　ｉ）
由来のもの［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ　ｏｕｒａｎ
ｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１２０
巻、第３２９ページ、１９８１年］、バチルス・メガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａＬｅｒｉｕｍ）
由来のもの［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　、９８巻、第１４３３ページ、１９８５年１、ロイ
コノストック會メセンテロイデス（Ｌ　ｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のもの［
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　ｏｕｒａ
ｎｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９７
巻、第１２７９ページ、１９８５年］等が報告されてい
る。

しかしながら、これらの技術知られいるＮＡＤ１４オキ
シダーゼは、該微生物の培養がむずかしく大量調製が困
難である（アコレプラズマ・ライドラライ等）、菌体内
膜画分に存在するため大量調製がむずかしく、さらに菌
体内含量の向上に困難である（バチルス・メガテリウム
等）、熱安定性が弱く、長期にわたる活性の保持を期待
しえない（ロイコノストック・メセンテロイデス等）等
の欠点を有している。

本発明者らは、工業的生産に適したＮＡＤＨオキシダー
ゼについて広く検索した結果、アルカリ性領域に至適生
育ｐＨををする通性嫌気性細菌が、温度安定性にすぐれ
たＮＡＤＨオキシダーゼを生産することを見出し本発明
を完成するに到った。

なお、本発明において１通性嫌気性菌」とは、嫌気性菌
のうち酸素の存在下でも非存在下でも生育しうるものを
いう。

発明の要旨 本発明によれば、アルカリ性領域に至適生育ｐＨを有す
る通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌を嫌気的又
は好気的に培地で培養し、該培養物よりＮＡＤＨオキシ
ダーゼを採取することを特徴とするＮＡＤＨオキシダー
ゼの製造法が提供される。

発明の詳細な説明 本発明に使用する、ＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌株は、
好アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、ＮＡＤＨオキシダ
ーゼ生産能を有するものであればいかなる菌株でもよく
、またこれらの変異株であってもよい。そして、これら
の性質を有する菌株の好適具体例としては、例えば、ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ａ　ｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第５１巻
、第２２７１〜２２７５ページ（１９８７）に記載され
ているＥｐＯ１株があげられる。

本菌株はアルカリ性にｐＨを調節した堆肥に集積、分離
されたものであり、同文献によれば次のような菌学的性
質を有するものである。

（１）　　形態 （ａ）　　細胞の形及び大きさ：桿菌、（０，３〜０゜
６）Ｘ　（１，５〜２．５）ｐｍ （ｂ）　　多形性の有無：無 （ｃ）　　運動性：なし くｄ）　　胞子：耐熱性胞子あり （ｅ）　　ダラム染色：培養のごく初期には陽性（ｆ）
　　抗酸性：陰性 （２）各培地における生育 （ａ）　　肉汁寒天培地：生育せず （ｂ）ゼラチン：液化せず （３）生理学的性質 （ａ）　　生育の範囲：ｐＨ７，０で生育せず、ｐＨ８
。

５〜１Ｏ００を至適とする。

４０℃付近を至適とする。

（ｂ）　　オキシダーゼ：陰性 （ｃ）　　カタラーゼ：陰性 （ｄ）　　発酵可能な糖＝Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビ
ノース、Ｄ−リポース、Ｄ−グリコース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−フルクトース、アミフタリン、エスクリン、サ
リシン、マルトース、サッカロース、セロビオース、ト
レハロース、可溶性でン粉、ペクチン、キシラン （ｅ）３％食塩存在下で生育 （４）その他の性質 （ａ）　　細胞壁成分：メソジアミノピメリン酸含有 （ｂ）　　チトクローム：チトクロームａ、　ｂ、　ｃ
、　ｄを含有せず。

（Ｃ）　　キノン：メナキノン、ユビキノン含有せず。

（ｄ）ＤＮＡ中グアニン、シトシン含有（ＧＣ含量）　
　　　　　　　　　　３５．９％（ｅ）　　細胞脂肪酸
組成：アンティン　　２３．７％（嫌気培養時）　　イ
ソブランチ１３５．４％直鎖　　　　　３７．２％ （ｇ）　　嫌気及び好気培養時にキシラナーゼを生成。

以上の諸性質を「バーシーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティク・バクテリオロジー（Ｂ　ｅｒｇｅｙ　ｓ　
　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｒ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）Ｊ第２巻（１９８６年）より
検索した。好アルカリ性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）とは、ダラム染色陽性、胞子形成、好気での生育、多
様な炭水化物への生育等、性質を同じくするものが多い
が、カタラーゼ陰性、運動性陰性、肉汁寒天での生育を
示さない等の性質を異にする。チトクロム、キノンを含
まないこともバチルス属への帰属を示さない。

クロスリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）とも菌体
脂肪酸組成、好気での生育等合致しない点かあり、これ
ら既存の属には帰属されない新菌株の可能性がある。従
って、本発明においては未同定菌ＥｐＯ１株とのみ称呼
することとする。なお、本菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所に微生物受託番号　微工研菌寄＠１００９６
号（ＦＥＲＭＰ−１００９６）として寄託されている。

本発明に使用する微生物菌体の培養に使用しうる培地の
栄養源である窒素源としては、例えは、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いるこ
とができる。また、無機塩金属塩としては、例えばリン
酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等が
用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーンス
テイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源
を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、グルコ
ース、キシロース、マンノース、フルクトース、アルド
ース、シュークロース、セロビオース、キシラン等を培
地に添加することができる。

前述したＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼ生産菌を上記の如
き組成の培地で培養するにあたり、培養温度は通常約２
０〜約５０°Ｃ１好ましくは約３５〜約４５°Ｃの範囲
内で適当である。また、培養中のｐＨは約ｐＨ７，５以
上のアルカリ性領域であれば厳密に限定されるものでは
ないが、一般には８〜１０゜５、好ましくは８．５〜１
０．０の範囲内とするものが有利である。培養中のｐＨ
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸すトリウム等のアルカリを培地に添加することにより
至適範囲内となるよう調整するのが好都合である。培養
時間は通常３〜２４時間、好ましくは５〜２０時間程度
とすることができる。培養は通気撹拌、振盪等の好気的
条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条件下
で行ってもよい。

嫌気的条件下での培養を行う場合には、還元銅カラムで
酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス
、又はそれらの混合物等の酸素不含ガス雰囲気や、培地
の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育を容易にす
るチタニウム（ＩＩＩ）クエン酸、ジチオナイト等の還
元剤の添加等、偏性嫌気性菌の培養に際し通常用いられ
る手法［例えば山里、宇田用、児玉、森地編、［微生物
の分離法Ｊ　Ｒ＆Ｄプランニング（１９８６年刊）２４
６〜２７４頁、等参照１の中から、本菌の生育至適とす
るアルカリ性領域において効力を有し、かつ本菌の生育
に悪影響を及ぼさない条件であれば、それを適用するこ
とができる。

さらに、菌体取得にいたるまでの培養はその全段階を嫌
気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ行う必要はな
く、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あるいは好気
条件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件を
組み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。

かくして培養される菌体は、ＮＡＤＨオキシダーゼをそ
の菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過等のそれ自体公知の分離
、精製方法［例えば日本生化学会場　生化学実験講座第
１巻「タンパク質の化学■分離精製」東京化学同人刊、
１〜３３４頁；掘尾武−１山下仁平編「蛋白質・酵素の
基礎実験法」南江堂刊１〜３７９頁等参照］（１）作用
：本酵素は以下の反応式で示される如＜ＮＡＤＨを酸化
してＮＡＤと過酸化水素を生成する。

ＮＡＤＨ＋Ｈ”＋Ｏ，−シＮ　Ａ　Ｄ　”＋　Ｈ２０２
（２）至適ｐＨニリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸
緩衝液を用いて測定したところ、本酵素は７゜０付近に
至適ｐＨを有していた（添付の第１図参照）。

（３）至適温度及び熱安定性ニリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を用いて測定したところ、本酵素は約３７°Ｃに至
適温度を有していた（添付の第２図参照）。

（４）温度安定性二本酵素を上記（３）にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し３７°Ｃにて保存し活性の温度安定性
を調べたところ、１００時間経過後も０時間におけると
略々間等の活性を有していた。

一方、既に知られているロイコノストック・メセンテロ
イデス（Ｌｏｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　Ｍｅｓｅｒｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）第９７巻、１２８５頁（＋９８５）の第７Ｂ
図に記載されているごとく、３０°Ｃでは６０分後も活
性を保つものの、４０°Ｃでは約６０％、５０°Ｃでは
０％に活性が低下し、安定性が劣ることがわかる。

（５）−両隣イオンの要求：無細胞菌体抽出液を５Ｑｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ緩衝液にて透析して得た酵素液のＮＡＤ
Ｈオキシダーゼ活性を１００とした場合、該酵素液に２
０ｍＭ濃度となるようにに＋、Ｎａ”、Ｎ　Ｈ、＋を添
加したときの活性はそれぞれ、３１０．１８０．３１０
であった。

（６）ＮＡＤＨオキンダーゼは無細胞抽出液を１００．
０００Ｘｇで１時間超遠心処理した上溝画分に存在する
。

なお、本酵素の定性的分析は、Ｎ　Ａ　Ｄ　）Ｉの３４
０ｎｍの吸光の減少もしくはＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ共存時の酸
素の吸収を酸素電極又はマノメーターにより観測するこ
とにより行なった。また、本酵素の活性測定は次のよう
に行うことができる。すなわち、５０ｍＭ緩衝液１．９
ｍ（２，酵素液Ｑ、Ｑ５ｍｆ２からなる反応液を指定す
る温度にて予め保持した後、５ｍＭＮＡＤＨ０，０５ｍ
Ｑを加え反応を開始し、３４０ｎｍにおける吸光の減少
を測定する。酵素活性は１分間に１μｍｏｂのＮＡＤＨ
を酸化する酵素量を１単位とした。

発明の効果 以上に述べた本発明によれば、アルカリ性領域に至適生
育ｐＨを有するＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌を使用する
ため、培養時に雑菌汚染の恐れの少ないＮＡＤＨオキシ
ダーゼ生産菌から、温度安定性等の優れたＮ　Ａ　Ｄ　
Ｈオキシダーゼを容易に生産することができる。

実施例 次に実施例をあげて本発明のＮＡＤＨオキシダーゼの製
造法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施
例に何ら限定されるものではない。

実施例１ Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、Ｍｇ５Ｑ、
・７Ｈ２０２００ｍｇ１Ｍｎ５Ｏ，・７Ｈ７Ｈ２Ｏ５，
Ｆｅ５０．・７Ｈｚ０　５ｍｇ、ＣａＣｕ５・２Ｈｚ０
　７００ｍｇ、酵母エキス３ｇｓポリペプトン３００ｍ
ｇ、キシランｌＯｇ及びレサズリン１ｍｇを蒸留水９Ｑ
Ｑｍ（２に溶解し、９０ｍ４ずつｌｏｏｍＱ容血清ビン
に分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して調製
した無酸素窒素ガスを通気後ブチルゴム栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ１２０℃１５分殺菌を行なった。

この培地に１２０°Ｃ１１５分減菌済みの１０％炭酸ナ
トリウム水溶液（ｐＨ１０，６）をｌｏｍＱ添加し、培
地のｐＨ１！１−１０とした。さらに、還元剤としてサ
イエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）第１９４巻１１６５−１
１６６頁記載のＡ。

Ｊ　、　Ｂ　、　Ｚ　ｅｈｎｄｅｒ　　＆　　Ｋ　、Ｗ
ｕｈｒｍａｎｎらの方法に準じて調製したチタニウム（
ＩＩＩ）クエン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるよ
うに添加した。本培地に好アルカリ性菌ＥｐＯ１株（微
工研菌寄第１００９６号）を接種し、４０°Ｃｌ２Ｏ時
間静置培養を行なったものを種培養液とした。

キシランｌＯｇをグルコース］Ｏｇに変えた他は同組成
の培地４５０ｍ４を５００ｍＱ容血清ビンに分注し、同
様の操作を行ない１２０°Ｃ１１５分殺菌後、ｌＯ％炭
酸ナトリウム水溶液５０ｍＬチタニウム（Ｉｎ）クエン
酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるように添加した。

前記種培養液１０ｍ１２を接種し、４０°Ｃ１２４時間
静置培養した。培養終了後培養液１００ｍＱを、１．０
００ｘｇ、２０分遠心し得られた菌体を５０　ｍＭ　　
Ｔ　ｒｉｓ塩酸緩衝液に懸濁後、遠伸集菌し洗浄菌体を
得た。この菌体を同上緩衝液５ｍＱに懸濁後、超音波処
理により菌体を破壊し、遠心分離して得られた上澄を粗
酵素液とし、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を測定したとこ
ろ、０゜２５単位１ｍ（２であった（１単位は１分間に
１μｍ。

ｌｅのＮ　Ａ　Ｄ　ｌ−１を酸化する酵素量を示す）。

実施例２ キンランｌｏｇの代わりにグルコースｌｏｇを、さらに
レサズリン奈含有しない他は実施例１に記述したと同じ
培地９０ｍＱを５００ｍ４容三角フラスコに分注し１２
０°Ｃ１１５分殺菌する。別途加熱滅菌した１０％炭酸
ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを１０に調製したのち
、実施例１記載の種培養液５ｍＣを接種し、３０℃、２
０時間振盪培養を行なった。培養終了後、培養液１００
ｍ１２より遠心分離して得られた菌体を５ｍ１２の５Ｑ
ｍＭ）リス塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕し、遠心分
離して得られた上澄を粗酵素液とした。その活性は０１
１８単位１ｍＱであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるＮＡＤＨオキンダーゼの
至適ｐＨを示すグラフであり、第２図は本発明により得
られるｌ’Ｊ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼの至適温度を示
すグラフである。 Ｈ 差戻 （０Ｃ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルカリ性領域に至適生育ｐＨを有する通性嫌気性のＮ
   ＡＤＨオキシダーゼ生産菌を培地で培養し、培養物より
   ＮＡＤＨオキシダーゼを採取することを特徴とするＮＡ
   ＤＨオキシダーゼの製造法。