JP2008092832A - 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の理化学的性質を有するBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ:
(1)酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する;
(2)至適pHは8〜10付近である;
(3)70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上の残存活性を有する;
(4)至適温度は50〜70℃である;
(5)アンモニウム塩により活性化される;及び
(6)分子量はSDS-PAGEで測定した場合50〜60kDaである。
【選択図】なし
Description
[1] 下記の酵素学的性質を有するBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ:
(1)酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する;
(2)至適pHは8〜10付近である;
(3)70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上の残存活性を有する;
(4)至適温度は50〜70℃である;
(5)アンモニウム塩により活性化される;及び
(6)分子量はSDS-PAGEで測定した場合50〜60kDaである。
[2] さらに、以下の酵素学的性質を有する[1]の酵素:
(7)NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない;及び
(8)Kmは約0.022mMである。
[3] Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)由来である[1]又は[2]のNADHオキシダーゼ。
[4] Brevibacterium属微生物を培養し、培養物からNADHオキシダーゼを回収することを含む、[1]〜[3]のいずれかのNADHオキシダーゼの製造法。
[5] Brevibacterium属微生物が、Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)である[4]のNADHオキシダーゼの製造法。
[6] [1]〜[3]のいずれかのNADHオキシダーゼを用いて、光学活性マンデル酸又はD-フェニルアラニンを製造する方法。
(a)形態
(1)細胞の大きさ:0.8×1.0〜1.5μm(24h)、0.8×0.8〜1.0μm(72h)の桿菌。Rod-coccus cycleあり。
(2)グラム染色性:陽性。
(3)胞子の有無:なし。
(4)運動性:なし。
(5)コロニー形態(培地;Nutrient Agar、培養時間24時間):
円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色。
(6)生育温度:37℃で+、45℃で−。
(7)カタラーゼ:陽性。
(8)オキシダーゼ:陰性。
(9)酸/ガス産生(グルコース):-/-。
(10)O/Fテスト(グルコース):-/-。
上記の菌学的性質により、本発明のBrevibacterium sp.KU1309は新種微生物であると同定された。
(1)本発明の酵素は以下の反応式で酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する
NADH + H+ + O2 → NAD+ + H2O2;
(2)本発明の酵素の至適pHは8〜10付近であり、酸化還元酵素と共にアルコールの酸化反応を行う際に、好適である;
(3)本発明の酵素は温度安定性に優れており、70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上、好ましくは90%以上、さらにほぼ100%の残存活性を有する。この性質は、物質生産プロセスに於いて好適である;
(4)本発明の酵素の至適温度は50〜70℃、好ましくは約60℃である;
(5)本発明の酵素はアンモニウム塩により活性化される。反応系を弱アルカリ性に保つ際にアンモニア水を用いると、酵素も活性化されるので好適である;
(6)本発明の酵素はZn2+(39%)、Cu2+(42%)、Ag+(37%)などの柔らかい酸に阻害される;
(7)本発明の酵素は、NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない。NADPHを酸化できないという本酵素の特性は、NADHとNADPHが混在する生体試料中のNADH量を選択的に測定できるという利点がある;
(8)本発明の酵素のKmは0.1mM以下、好ましくは約0.02mM例えば0.022mMである;
(9)本発明の酵素を用いてNADHを1mol酸化すると、1molの過酸化水素が生成する;及び
(10)本発明の酵素の分子量はSDS-PAGEで測定した場合、50kDa〜60kDaである。本発明の酵素はホモダイマーを形成し、ゲルろ過で想定した分子量は約100kDaである。
実施例1 酵素の精製
Brevibacterium属微生物Brevibacterium sp.KU1309を土壌から単離し、以下の方法で培養した。単離したBrevibacterium sp.KU1309は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター(日本、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に2006年8月29日付けで寄託した(受託番号:FERM P-21008)。
無細胞抽出液の調製
湿潤した細胞(20g)を100mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)5mM 2-メルカプトエタノールに懸濁し、Dyno-mill(Willy A. Bachofen Co.)で破砕した。この混合物を遠心分離し、上澄みを回収し、これを無細胞抽出液とした。
酵素活性は、NADHがNAD+へ酸化されると減少する340nmの吸光度を吸光光度計で測定して評価した。反応は0.1mM NADH、100mMトリス塩酸(pH8.8)、500mM硫酸アンモニウムに酵素溶液を加えて行った。1ユニットはNADH1μモルを1分間あたりに酸化する酵素量として定義した。
無細胞抽出液を0℃で攪拌しながら、硫酸アンモニウムを35%飽和の濃度となるまで15分間かけて少しずつ添加した。その後さらに1時間攪拌した。遠心分離により沈殿を除去し、上澄みに65%飽和となるまで硫酸アンモニウムを15分間かけて加えた。加え終わってから1時間攪拌した後、遠心分離により沈殿を回収した。この沈殿を10mMリン酸緩衝溶液、5mM 2-メルカプトエタノール、30%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解した。
5mM 2-メルカプトエタノール、飽和30%硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(=緩衝溶液A)で平衡化したPhenyl toyopearlカラム(東ソー、カラム体積150ml)に試料をのせた。Econo Gradient Pump(Bio Rad)を用いてクロマトグラフィーを行った(流速1.5ml/min)。450mlの緩衝溶液Aで洗浄したのち、450mlの緩衝溶液Aと450mlの5mM 2-メルカプトエタノール、20%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液B(pH7.0)の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出させた。各フラクションの酵素活性を調べ、活性フラクションを集めて、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に透析した。このフラクションプールを5mM 2-メルカプトエタノール、200mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(緩衝溶液C)で平衡化されたDEAE toyopearlカラム(東ソー、カラム体積50ml)にのせた。150mlの緩衝溶液Cで洗浄後、150mlの緩衝溶液Cと150mlの5mM 2-メルカプトエタノール、300mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液D)による、NaCl直線勾配でタンパク質を溶出した(流速1ml/min)。これらの中から活性のあるフラクションを回収し、30%飽和となるまで硫酸アンモニウムを加えた。この溶液を、5mM 2-メルカプトエタノール、30%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液E)で平衡化したButyl toyopearlカラム(東ソー、カラム体積10ml)にのせた。30mlの緩衝溶液Eで洗浄後、30mlの緩衝溶液Eと30mlの5mM 2-メルカプトエタノール、15%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液F)の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出した(流速1ml/min)。活性なフラクションを回収し、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に透析した。Butyl toyopearlカラムによる各クラクションの酵素活性を図1Aに示す。図1Aに示すように単一ピークが認められた。さらに、精製後にSDS-PAGEを行った。CBBによる染色では50kDa付近(56.8kDa)に均一なバンドを確認することができた(図1B)。
精製過程における酵素活性、収率を次の表1にまとめた。
(1)pH依存性
pH5.5〜11.5の範囲で酸化反応の最適pHを測定した。緩衝溶液は各pH範囲に適した緩衝溶液、すなわちMES(pH5.5〜6.5)、MOPS(pH6.5〜7.4)、HEPES(pH7.0〜8.0)、Tris(pH7.5〜8.8)、グリシン(pH8.8〜10.4)、CAPS(pH9.4〜10.8)、リン酸ナトリウム(pH10.54〜11.52)を用いた。各pHでの相対反応速度を図2にまとめた。
本酵素は、アルカリ側pH8.5〜10)に至適pHを有することが判明した。
酵素をpH4.5〜11.5の各pHで70℃、1時間インキュベートし、その後の残存活性を測定した。緩衝溶液はクエン酸(pH4.7)、MES(pH5.5、6.3)、MOPS(pH6.6、7.4)、Tris(pH7.4、8.5)、TAPS(pH8.4、9.2)、CAPS(pH9.4、10.2)、リン酸ナトリウム(pH10.5、11.5)を用いた。
70℃の加熱を行っていない状態を100%として残存活性をプロットしたのが図3である。
図に示すようにpH6〜10の広いpH範囲で安定であった。
MOPS緩衝溶液(pH6.6)中での熱に対する安定性の検討を行った。各温度で1時間インキュベートし、その後の活性を室温で測定した。これを図4のグラフの(◆)で示した。また各温度(30℃〜70℃)で酵素活性を測定し、これを図4のグラフに(□)で示した。
図に示すように70℃、1時間のインキュベートに対してほぼ100%安定であった。
各種塩を加えて反応を行い、340nmの吸光度を測定し反応速度を決定した。図5Aに各種塩の酵素活性に対する効果を示す。このようにアンモニウム塩を加えることに酵素活性は上昇することがわかった。そこで、アンモニウム塩濃度の酵素活性に対する影響を調べた。方法は、硫酸アンモニウムを0Mから4.35Mの各濃度存在下で反応を行い、反応速度の相対値を算出した。図5Bにアンモニウム塩の酵素活性に対する効果を示す。
図に示すように、活性にはアンモニウム塩が必要であり、活性が最大となるアンモニウム塩濃度([NH4 +])は、3.0Mであった。
酵素溶液を100mM Tris-HCl(pH8.8)に加え、さらに阻害剤を終濃度1mMとなるように加え、3分間室温でインキュベートした。その後、NADHを10μM、(NH4)2SO4を500mMとなるように加え、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
図6に相対活性値を示す。図6に示すように、Zn2+(39%)、Cu2+(42%)、Ag+(37%)などの柔らかい酸に阻害された。
速度論的解析はNADH濃度を10μMから100μMの間で反応速度を測定し、この値からLineweaver-Burkプロットを作成した。反応は次のように行った。反応液{NOX;0.28ug/ml、NADH;10μM-100μM、(NH4)2SO4; 500mM、Tris-HCl;100mM (pH8.8)}を吸光光度計用セルに入れ、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
表2にNADHに対するKineticsを示す。
NOXはH2O副生型とH2O2副生型に分類される。図8Aに示すアッセイ法を用いてH2O2の生成確認と定量を行った。
(i)マンデル酸デヒドロゲナーゼとの併用による光学活性マンデル酸の調製
Enterococcus faecalis IAM 10071からのマンデル酸デヒドロゲナーゼ(Tamura, Y., et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:957-957)とBrevibacteriumsp.からのNADHオキシダーゼを組み合わせることで、マンデル酸の酸化を行った。
MRS培地10mlの入った試験管にEnterococcus faecalis IAM 10071を固体培地から白金耳を用いて植菌し、30℃で24時間振とう培養した。この培養液をMRS培地1.2リットルの入った5リットルの三角フラスコ(バッフルつき)に全量移し、30℃で48時間、旋回培養した。培養液から遠心分離によって細胞を回収し、湿潤細胞9.2gを得た。これを100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、5mM 2-メルカプトエタノールに懸濁し、ミルによって細胞を破砕した。遠心分離によって未破砕菌体を除去し、無細胞抽出液を得た。マンデル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性はマンデル酸の酸化に伴い生成するNADHの340nmの吸光度を吸光光度計により測定した。反応は50mMラセミ体マンデル酸、1mM NAD+、100mMトリス塩酸(pH8.8)に酵素溶液を加えて行った。25%〜60%飽和の硫酸アンモニウムで沈殿したタンパクを遠心分離によって回収し、10mMトリス塩酸緩衝溶液(pH7.5)に溶解し、同緩衝液で透析した。この酵素溶液を5mM 2-メルカプトエタノール、100mM NaClを含む10mMトリス塩酸(pH7.5)で平衡化したDEAE toyopearlカラム(カラム体積50ml、流速1ml/min)にのせた。平衡化した緩衝溶液で洗浄後、150mlの平衡化した緩衝溶液と150mlの5mM 2-メルカプトエタノール、200mM NaClを含む10mMトリス塩酸(pH7.5)、を用いて直線勾配によりタンパク質を溶出した。このフラクションから活性画分を集め、Amicon Ultra(MILLI PORE)により濃縮してマンデル酸デヒドロゲナーゼの部分精製酵素を得た。
この結果、48時間後にはR体のマンデル酸は全て酸化され、光学活性(S)-マンデル酸が得られた。
L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは和光純薬より購入したものを用いた。
反応は次の組成で行った。2.5mM DLフェニルアラニン、0.1mM NAD+、10mM硫酸アンモニウム、100mM CAPS(pH 10.2)、NADHオキシダーゼ0.2U/ml、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ0.2U/mlの混合物を30℃でインキュベートし、HPLCによって系中のフェニルアラニンの光学純度を調べた。[HPLC条件:Crownpak CR(+)展開相5.7%過塩素酸、流速0.5ml/min、検出UV200nm、保持時間D-フェニルアラニン18.5min、L-フェニルアラニン25.1min]
この結果、48時間後にはL体のフェニルアラニンは全て酸化され、光学活性D-フェニルアラニンが得られた。
Claims (6)
- 下記の酵素学的性質を有するBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ:
(1)酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する;
(2)至適pHは8〜10付近である;
(3)70℃、1時間の熱処理でも失活せず、80%以上の残存活性を有する;
(4)至適温度は50〜70℃である;
(5)アンモニウム塩により活性化される;及び
(6)分子量はSDS-PAGEで測定した場合50〜60kDaである。 - さらに、以下の酵素学的性質を有する請求項1記載の酵素:
(7)NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない;及び
(8)Kmは約0.022mMである。 - Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)由来である請求項1又は2に記載のNADHオキシダーゼ。
- Brevibacterium属微生物を培養し、培養物からNADHオキシダーゼを回収することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のNADHオキシダーゼの製造法。
- Brevibacterium属微生物が、Brevibacterium sp.KU1309(受託番号:FERM P-21008)である請求項4記載のNADHオキシダーゼの製造法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のNADHオキシダーゼを用いて、光学活性マンデル酸又はD−フェニルアラニンを製造する方法。
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