JPH01304886A

JPH01304886A - Ｄｎａの精製方法

Info

Publication number: JPH01304886A
Application number: JP13531488A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Kikyoya; 正桔梗谷; Tatsuo Yamamoto; 達夫山本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1988-05-31
Publication date: 1989-12-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、　ＤＮＡの精製方法に関し、さらに詳しくは
、　ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、　　タンパク、多糖類、脂
質などの各種菌体成分を含む菌体溶菌液から、プラスミ
ドＤＮＡ　、　　ファージＤＮＡなどのＤＮＡを高純度
で単離・精製する方法に関する。

（従来の技術）バイオテクノロジーの発展に伴い、遺伝子ＤＮＡの単離
、精製および塩基配列決定が頻繁に行われている。しか
し、各種技術の進歩にもかかわらず。

その操作は繁雑な手作業を必要とし、長時間と多大の労
力とを要する。そのため、このような作業は基礎および
応用開発において、研究者にとって大きな負担となって
いる。バイオテクノロジーの特に応用技術の展開のため
には、これらの作業を短時間で完了できるような技術が
望まれる。特に。

ＤＮＡの配列分析、　ＤＮＡの構築、構築されたＤＮＡ
配列に所望の遺伝子が正しく入っているかのチエ’７り
などを行う目的のためには、これに使用するための所望
のＤＮＡを短時間で単離し、精製することが必要である
。各種研究のためには、特に菌体からＤＮＡ　（特に、
プラスミド、ファージなどのＤＮＡ）を迅速に分離して
精製することが望まれる。

菌体からＤＮＡを比較的迅速に単離・精製する方法とし
ては、ボイリング法、アルカリ法、クリャ−ドライゼー
ト法などが採用されている。これらのうち、アルカリ法
でＤＮＡを単離するにはまず。

菌体をアルカリと界面活性剤（ＳＤＳ、　　）リドンＸ
−１００など）とで溶菌させ、溶菌後に該アルカリを中
和する。クリヤードライゼート法では、アルカリの代わ
りにリゾチームが用いられる。このような操作により菌
体に含まれるタンパクなどが溶解すると同時にＤＮＡ　
　（宿主ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡな
ど）が変性され、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ　ＤＮＡ）から−
本ｔｉＤＮＡ（ｓｓ　ＤＮＡ）　となる。次いで、これ
をｐＨ５程度の酸性条件にすると、溶解していたタンパ
クなどが析出すると同時にｓｓ　ＤＮＡがもとのｄｓ　
ＤＮＡに戻ろうとする。しかし９分子量の大きな宿主Ｄ
ＮＡは容易に戻ることが出来ず、　ｓｓ　ＤＮＡの状態
のまま残存し、タンパクなどが析出される際に共沈する
（凝集沈澱）。他方１分子量が比較的小さいうえに２本
鎖がよじれあった状態で安定に存在するプラスミドＤＮ
Ａでは、この中和処理により直ちにもとの２本鎖ＤＮＡ
に戻ることができ、析出することはない。従って、この
中和後の溶菌液を遠心分離すると、大部分の宿主ＤＮＡ
は沈澱として除去され。

プラスミドＤＮＡ　、ファージＤＮＡなどを含有する溶
液が得られる。同様に、上記ボイリング法では。

アルカリ処理工程の代わりに加熱工程が設けられ。

加熱によりＤＮＡおよびタンパクは変性を受ける。

ＤＮＡは、上記アルカリ法の場合と同様にｓｓ　ＤＮＡ
となり、その後、徐冷によりｄｓ　ＤＮＡに戻るが、こ
のとき、アルカリ法の場合と同様に分子量の差により宿
主ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとに分離される。

このようにして宿主ＤＮＡの大部分が除去され。

主として目的とするプラスミドＤＮＡやファージＤＮＡ
を含む溶液が得られるが、該溶液中には、さらに。

ＲＮＡ　、各種タンパク、多糖類・宿主ＤＮＡの一部お
よびその断片などが混入している。例えば、プラスミド
口Ｎ＾を単離して配列決定を行う際には、特にＲＮＡに
よる妨害が大きいため９通常、このＲＮＡはリボヌクレ
アーゼ処理により低分子化され、ポリエチレングリコー
ル沈澱により除去される。しかし、リボヌクレアーゼは
安定性が高いため、使用後に完全に除去することが難し
い。リボヌクレアーゼは高活性であるため、場合によっ
てはその後の反応に使用される必要なＲＮＡが分解され
るという欠点がある。さらにこのような方法は、上記の
ように、いずれも遠心操作やピペッティング操作などの
多数の複雑な手作業による操作工程を必要とするため、
自動化がなされにくい、そして。

これらの操作は手作業であるためＤＮへの回収率や純度
などにもバラツキが生じ、技術差による個人間の格差も
大きい。

リボヌクレアーゼを用いず、菌体や細胞からＤＮＡを１
段階で単離・精製する方法として、ヒドロキシアパタイ
トカラムを使用する方法が提案されている。（ｊ、Ａ、
Ｂｅ１ａｎｄら、　Ｊ、Ｃｈｒｏａａｔｏｇｒａｐｈｙ
＋　１７４＋１７７−１８６（１９７９）　）。この方
法によれば、まず、菌体をあらかじめ溶菌し、これに、
尿素８Ｍ（８モル／２）リン酸緩衝液（リン酸０．２４
Ｍ）、　　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；　　０．
１％）およびエチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴ＾；１０
＋ｓＭ）を含む緩衝液を加える。

これを、上記と同様の緩衝液であらかじめ処理したヒド
ロキシアバ多イトカラムに通液すると、溶菌液中のＤＮ
Ａのみが選択的にヒドロキシアパタイト（吸着剤）に吸
着される。上記吸着条件下においてはｄｓ　ＤＮＡのみ
が吸着され、　ｓｓ　ＤＮＡなどは吸着されない（リン
酸塩濃度が０．１５Ｍ以下であれば。

ある程度は吸着される）。尿素濃度が８Ｍと高いた、め
、非特異的なタンパクの吸着もほとんど起こらない。ｄ
ｓ　ＤＮＡを吸着したヒドロキシアパタイトカラムに２
次に＋　１０５Ｍリン酸緩衝液を流して上記吸着に用い
た緩衝液中の尿素、　ＳＯ５などを除去する。

さらに０．３Ｍリン酸緩衝液を通液することにより吸着
したｄｓ　ＤＮＡを溶離させ、これを回収する。

しかし、上記ヒドロキシアパタイトカラムを使用する方
法においても、目的とするプラスミドＤＮＡ。

ファージＤＮＡなどのＤＮＡに加えて宿主（ホスト）菌
体または細胞由来のｄｓ　ＤＮＡの混入が避けられない
。これは、宿主由来のＤＮＡの分子量が大きいため、た
とえ１本鎖であってもヒドロキシアパタイトとの親和性
を有するためである。この宿主由来のＤＮＡを除去する
には、上記アルカリ法、クリヤードライゼート法または
ボイリング法における遠心分離後の上清をカラムにかけ
る方法が有効である。しかし、このような前処理を行・
うと操作工程が増すため、自動化が困難となる。さらに
アルカリ法を用いた場合には、宿主ＤＮへの一部が切断
されて低分子化し、これらが混入するという欠点もある
。

さらに上記ヒドロキシアパタイトカラムを使用する方法
には別の欠点もある。つまり、この方法で回収されたｄ
ｓ　ＤＮＡは、上記０．３Ｍリン酸緩衝液の溶液として
得られるため、そのまま使用することができない。なぜ
なら、リン酸塩はエタノールなどのアルコールに対する
溶解度が低いため１次工程においてエタノール沈澱によ
りｄｓ　ＤＮＡを回収しようとするとｄｓ　ＤＮＡと同
時にリン酸塩が多量に析出し、この析出したリン酸塩を
除去することが困難であるからである。そのため、透析
などの方法によりリン酸塩を除去する必要がある。この
ように、透析という煩雑な操作を必要とし、そのためｄ
ｓ　ＤＮＡの回収率が悪いという欠点がある。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、菌体溶菌液からプラスミドＤ
ＮＡ　、ファージＤＮＡなどのＯＮ八を、短時間のうち
に高純度で、かつ煩雑な操作を必要とすることなく、単
離・精製する方法を提供することにある。本発明の他の
目的は、上記菌体溶液に含有される宿主菌体または細胞
由来のＤＮＡ　（宿主ＤＮＡ）やＲＮＡを効果的に除去
し、Ｊ：記プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡを自動的
に単離・精製し得る方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段）発明者らは上記Ｂｅ１ａｎｄらのヒドロキシアパタイト
カラムを使用する方法において１例えば、クリヤーライ
ゼート法による溶菌液を遠心分離することなくそのまま
カラムにかければ、操作工程が簡略化され得ると考えた
。しかし、宿主ＤＮＡが遠心分離によって系内から除去
されていないため、これらの一部がヒドロキシアパタイ
トに吸着する。

そのためこれら宿主ＤＮＡが混入し、高純度のプラスミ
ド（ファージ）　　ＤＮＡは得られなかった。

発明者らはさらに、プラスミドＤＮＡ　、　　ファージ
ＤＮＡなどのＤＮＡを、宿主ＤＮＡが混入することな（
単離・精製する方法を検討した。その結果、吸着クロマ
トグラフィーを用いた単離・精製方法において水溶性ポ
リマーを存在させることが効果的であることを見い出し
１本発明を完成するに至った。

本発明のＤＮＡの精製方法は、溶菌菌体と分子量ｉ　、
　ｏｏｏ〜５００　、０００の水溶性ポリマーとを、水
溶性ポリマーの終濃度が０．０１〜２０重量％となるよ
うに含む水溶性ポリマー含有溶菌液を調製する工程；該
溶菌液を吸着剤と接触させて、該溶菌液中のＤＮＡを該
吸着剤に吸着・担持させる工程；および該ＤＮＡを吸着
・担持する吸着剤に該吸着剤と強い相互作用を有する溶
離液を接触させて、該ＤＮＡを溶出させる工程を包含し
、そのことにより上記目的が達成される。

本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては。

電荷を持たない中性の水溶性ポリマーが好ましく。

このような水溶性ポリマーとしては、デキストラン、ポ
リエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドンなどが用いられる。これら
の水溶性ポリマーの分子量はｔ　、　ｏｏｏ　〜５００
　、０００が好ましく、特ニ３，０００−１００，００
０の分子量のポリマーが好適に用いられる。水溶性ポリ
マーの分子量が、　５００，０００を越えると溶液の粘
度が高くなるため取り扱いが困難になり、また。

分子量が１，０００未満では本発明の効果を奏さない。

水溶性ポリマーは、終濃度が０．０１〜２０重世％、好
ましくは１〜１０重量％となるように溶菌液に添加され
る。なお、終濃度とは、吸着剤と接触される直前の水溶
性ポリマー含有溶菌液の中の水溶性ポリマーの濃度を意
味する。菌体を含む液に水溶性ポリマーを添加し、これ
を溶菌させてもよい。水溶性ポリマーの終濃度が高すぎ
ると溶液の粘度が高くなるため取り扱いが困難になり、
また、　ｏ、ｏｉ重量％未満の終濃度では本発明の効果
を奏さない。

本発明に用いられる吸着剤としては１例えば。

ｄｓ　ＤＮＡのみを選択的に吸着しうるヒドロキシアパ
タイト、逆相系吸着剤、またはイオン交換体が用いられ
る。特にヒドロキシアパタイトを用いると。

宿主ＤＮＡに加えてＲＮＡが効果的に除去される。上記
吸着剤のうち逆相系吸着剤としては、　Ｃ−１８，Ｃ−
８゜Ｃ−３系などの疎水性相互作用による吸着能を有す
る吸着剤が挙げられる。イオン交換体としては。

−級アミン系、二級アミン系（例えば、アミノエチル基
を側鎖に有するイオン交換体）、三級アミン系（例えば
、ジエチルアミノエチル基を側鎖に有するイオン交換体
）、および四級アミン系のカチオン交換体が好ましい。

溶離液は、使用する吸着剤の種類により異なるが１例え
ば吸着剤としてヒドロキシアパタイトを用いる場合には
、該吸着剤を構成する成分（アニオンおよびカチオン）
の少な（とも一方、好ましくは両方と強い相互作用を有
する溶媒、ことに。

難溶性の塩を形成しうる塩溶液が使用され得る。

そのような塩溶液のなかでは、解離定数が小さいアニオ
ンとカチオンとの組合せでなる塩の溶液であり、かつＤ
ＮＡなどの核酸との親和性が高いものが好適である。さ
らに水やアルコール系溶媒に可溶であり、エタノール沈
澱により析出することのない塩が選択される。例えば、
使用される塩のアニオン成分としては炭酸；および蟻酸
、酢酸、プロピオン酸などの有機酸が好適である。カチ
オン成分としては、アンモニア；ジエチルアミン、トリ
エチルアミンなどのアルキルアミン類；エタノールアミ
ン、プロパツールアミンなどのアルカノールアミン類；
およびピリジン、アニソノなどの芳香族アミン類が好適
である。このような成分でなる塩を含む溶離液としては
、特にトリエチルアミン炭酸緩衝液が好適である。トリ
エチルアミン炭酸緩衝液は揮発性であるため、　　ＤＮ
Ａを含む溶出液の溶媒を留去したり凍結乾燥することに
よりＤＮＡのみを高純度で回収することが可能となる。

上記溶離液の濃度は２例えば、トリエチルアミン炭酸緩
衝液を使用する場合には、該緩衝液の濃度は１０ＩＩＩ
Ｍ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２Ｍ、　さらに好ましく
は１００ｍＭ〜１Ｍの範囲である。このように、　５０
ｍＭ以下の低濃度であってもＤＮＡを溶出することが可
能である。

逆相系吸着剤またはイオン交換体を用いる場合には、溶
離液は特に限定されず、それぞれＤＮＡを吸着させ、そ
して溶出させ得る２通常の逆相クロマトグラフィーまた
はイオン交換クロマトグラフィーに使用される溶離液が
用いられる。これらの溶離液の種類、濃度、　ｐｎなと
の条件は、　ＤＮＡの吸着および溶出について最適であ
るように、前もって調べておくことが望ましい。

本発明方法によりプラスミドＤＮＡ　、　ファージＤＮ
ＡなどのＤＮＡの精製を行うには、まずアルカリ法。

ボイリング法などの常法により調製した溶菌液に。

水溶性ポリマーを添加する。溶菌前の菌体に水溶性ポリ
マーを添加しておき、これに溶菌剤を添加して水溶性ポ
リマー含有溶菌液を得ることもできる。このようにして
得られた水溶性ポリマーを含む溶菌液中には、所望のプ
ラスミドＤＮＡやファージＤＮＡの他、宿主ＤＮＡ由来
のｓｓ　ＤＮＡ、　ＲＮＡ　、タンパク、多糖類、脂質
などが含まれる。次いで、この溶菌液を、吸着剤９例え
ばヒドロキシアパタイトと接触させる。ヒドロキシアパ
タイトを充填したカラムなどが好適に利用され１例えば
、　０．０５Ｍ〜０．２５Ｍのリン酸緩衝液を溶離液と
して通液することにより、溶菌液中のｄｓ　ＤＮＡが選
択的に吸着される。溶菌液中のｓｓ　ＤＮＡ、　　ＲＮ
Ａ、蛋白質、多糖類。

脂質などは吸着されない。次に、　ｄｓ　ＤＮＡを吸着
・担持する吸着剤に、前記溶離液を接触させる。例えば
、　ｄｓ　ＤＮＡを吸着・担持するヒドロキシアパタイ
トにトリエチルアミン炭酸緩衝液を接触させると、炭酸
イオンがヒドロキシアパタイトのカルシ　　　″ラムと
結合して難溶性の炭酸カルシウムを生成し。

ｄｓ　ＤＮＡはヒドロキシアパタイトから脱着する。例
えば、ヒドロキシアパタイトカラムのベツド容量の２倍
量のトリエチルアミン炭酸緩衝液を通液することにより
、吸着されているｄｓ　ＤＮＡのほぼ全量を回収するこ
とができる。このようにして回収される溶出液を通常の
エタノール沈澱処理に付すことにより精製ｄｓ　ＤＮＡ
が得られる。溶出液中のトリエチルアミン炭酸塩はエタ
ノールに相溶するため。

ｄｓ　ＤＮＡに混入してその純度を低下させることがな
い。エタノール沈澱処理の代わりに溶媒の減圧留去や凍
結乾燥を行うことによってもトリエチルアミン炭酸塩が
揮発・除去され（脱塩が達成され）で高純度のｄｓ　Ｄ
ＮＡが得られる。

本発明の方法においては、水溶性ポリマーが溶菌液中に
含有されるため、上記吸着剤を用いた処理により得られ
る目的とするプラスミドＤＮＡやファージＤ　Ｎ　Ａに
宿主ＤＮＡが混入することがない。その理由は明らかで
はないが１例えば９次の理由が考えられる：１）水溶性
ポリマーの添加により溶菌液の粘度が若干上昇し、その
結果カラム充填剤粒子間における該溶菌液の流れが良好
になり、　ｄｓ　ＤＮＡの吸着時に宿主ＤＮＡが吸着さ
れずに通過する；２）水溶性ポリマーにより高い分子量
を有する宿主ＤＮＡが凝集し、これが強固に吸着剤に結
合し、溶離液により容易に溶出されない；および３）宿
主ＤＮＡと水溶性ポリマーとが結合することにより、吸
着剤との親和性の低い複合体を形成し、吸着剤に吸着さ
れない。

このように２本発明方法によりプラスミドＤＮＡおよび
／またはファージＤＮ＾が、宿主ＤＮＡの混入を受ける
ことな（高純度で単離・精製される。

（実施例）以下に本発明を実施例つき説明する。

実１瀾土（ＰＥＧ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）（Ａ）菌体の培養および溶菌ニブラスミドｐＵｃ１８を
含有する大腸菌ＪＭ１０９株を５　ｍｌのＬＢ培地中で
１晩培養した。この培養液１゜５戚を５．００Ｏｒｐｍ
にて５分間遠心分離し、菌体を沈澱させた。

得られた菌体を、２ＸＴＥ緩衝液（２０ｍＭ　）リス・
塩酸−２ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ８，０））
ｔｏ。

ｇ　Ｑに懸濁させ、これに０．２Ｍ水酸化ナトリウム−
０，１％ドデシル硫酸ナトリウムを２００　μ！加え。

室温で１０分間放置し、菌体を完全に溶菌させた。

これに回収率の算出を目的として　Ｊでインビトロ（ｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏ　）標識されたプラスミドＤＮＡ　（
’ＩＩ−ｐＵＣ１８）を約０．１μＣｉ　（約５μｌ）
添加した。この溶菌液に、３０％ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）６０００を６０μ２添加し、約５％の濃度
とした。次いで。

この強アルカリ性溶液に３Ｍの酢酸カリウムを１５０μ
！加えて中和した。この操作により、溶液中のＰＥＧ終
濃度は３．５％となった。

（Ｂ）ＤＮへの精製：（Ｂ）−１力ラム操作（吸着）（Ａ）項で得られた溶菌菌体とＰＥＧとを含む水溶液（
ＰＥＧ含有溶菌液）を、１ｍｌのヒドロキシアパタイト
（吸着剤）を充填したカラムに流速５ｄ／時間でチャー
ジし、菌体成分を吸着させた。ＰＥＧの添加により溶液
の粘度が若干上昇したが、カラム操作に問題はなかった
。

（Ｂ）−２力ラム操作（洗浄１）上記カラムに約２０ｍ２の８Ｍ尿素−０，２４Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）を流速２０Ｉｎ１／時間で１時間
、溶出液の２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤｚ、。）が
Ｏになるまで通液した。

（Ｂ）−３カラム操作（洗浄２）次に、　　ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　ｌ−リス・塩酸−１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ７，５））約１０ｍ
１を流速２０ｄ／時間の割合で３０分間通液し、　（Ｂ
）−２項に記載された洗浄液の成分である尿素およびリ
ン酸緩衝液を洗い流した。

（Ｂ）−４カラム操作（溶離）このカラムに０．１Ｍトリエチルアミン炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を流速５ｍｌ／時間で流した。カラムの出口
に紫外線吸収モニター（ＵＶモニター）を接続して２６
０ｎｍの吸光度をモニターしたところ、第１図に曲線で
示す結果が得られた。第１図から溶離液の通液開始後０
．２〜１．２ｍｌの範囲で大部分のプラスミドＤＮＡが
溶出されているのがわかる。カラムからの溶出液の各フ
ラクションの放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、各フラクションに含まれる３Ｈ標識化プラ
スミドの回収率を調べた。その結果を第１図に棒グラフ
で示す。

第１図から、はぼ９５％以上のプラスミドｐＵＣ１８が
回収されていることがわかる。

（Ｂ）−５ＤＮＡの単離および純度の評価得られた溶出
液的１　ｍｌに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．１　ｄ加えて
エタノール沈澱を行った。プラスミドＤＮＡ　（ｐＵｃ
１８）が４μｇ回収された。このプラスミド０．２μｇ
を電気泳動にかけ、核酸染色し、その後バンドをデンシ
トメーターにて読み取ったところ、第２図１に示す泳動
パターンが得られた。第２図において、■は宿主ＤＮＡ
　、■はｏｃ　ＤＮ＾（ニック（切れ目）の入ったｐＨ
ｃ１８プラスミドＤＮ＾）、■はｃｃＤＮＡにツクの入
らないｐＵｃ１ＢプラスミドＤＮＡ）　。

そして■はＲＮＡを示す。得られた全核酸量（■＋■＋
■＋■）に対する宿主ＤＮＡ（■）、プラスミドＤＮＡ
　（■＋■）、またはＲＮＡ　（■）の割合を求め、収
量とあわせて純度（％）として表１に示す。表１から明
らかなように、プラスミドＤＮＡは９９．５％の純度で
得られ、宿主ＤＮＡはわずか０．５％であり。

かつＲＮＡは全く検出されなかった。

ル較桝土（水溶性ポリマー無添加溶菌液からの、ヒドロキシアパ
タイトを用いたプラスミドＤＮＡの精製）ＰＥＧを添加
しないで、実施例１と同様の操作を行った。プラスミド
ＤＮＡ　ｐｕｃｉａが３．９　μｇ回収された。このプ
ラスミドＤＮＡの電気泳動パターンを第２図６に、そし
て純度を表１に示す。表１から明らかなように、水溶性
ポリマーが存在しないと宿主ＤＮＡの混入が１５％と高
値であり、さらに精製を必要とした。

２施１（口ＥＸ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）３０％ＰＥＧ　６０００水溶液の代わりに１０％デキス
トラン＋１５００　（ファルマシア製１分子量約４５０
．０００　、以下ＤＥＸとする）水溶液を用いて、実施
例１と同様の操作を行った。（Ａ）項の操作により溶液
中のＤＥＸ終濃度は１．２％となり、これをヒドロキシ
アパタイトカラムにチャージした。プラスミドＤＮＡ　
ｐｕｃｉａが３．５μｇ回収された。このプラスミドＤ
ＮＡの電気泳動パターンを第２図２に、そして純度を表
１に示す。表１から明らかであるように、プラスミドＤ
ＮＡは純度９８％で得られ、宿主ＤＮＡは２．０％であ
り、かつＲＮＡは全く検出されなかった。

裏施糎主（ＰＶＡ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）３０％ＰＥＧ　６０００水溶液の代わりに１０％ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ、分子１１００．０００）水溶
液を用いて。

実施例１と同様の操作を行った。（＾）項の操作により
溶液中のＰＶＡ終濃度は１．２％となり、これをヒドロ
キシアパタイトカラムにチャージした。プラスミドＤＮ
Ａ　ｐｕｃｉａが３．６μｇ回収された。このプラスミ
ドＤＮＡの電気泳動パターンを第２図３に。

そして純度を表１に示す。表１から明らかであるように
、プラスミドＤＮＡは純度９８．５％で得られ。

宿主ＤＮ＾は１．５％であり、かつＲＮＡは全く検出さ
れなかった。

遺：ＪｔＬＬ（ＰＥＧ添加溶菌液からの、　ＤＥ５２を用いたプラス
ミドＤＮＡの精製）吸着剤としてヒドロキシアパタイトの代わりにイオン交
換セルロースであるＤＢＳ２　（ワットマン製）を用い
たこと、および（Ｂ）−４項におけるカラム溶離液とし
て０．１Ｍトリエチルアミン炭酸緩衝液（ｐＨ８，０）
の代わりにＩＭ　ＮａＣ１を用いたこと以外は、実施例
１と同様の操作を行った。プラスミドＤＮＡ　ｐ［Ｉｃ
１８を含む核酸が１３．７μｇ回収された。このプラス
ミドＤＮへの電気泳動パターンを第２図４に、そして純
度を表１に示す。表１から明らかであるように。

宿主ＤＮＡの混入は２．０％と低い値であったがＲＮＡ
の混入が６８％と高値であったため、さらにＲＮａｓｅ
処理を行って該ＲＮＡを除去した。この操作により。

ＲＮ＾が混入していないプラスミドＤＮＡが４．１μｇ
回収された。

１隻貫工（ＰＥＧ添加添加ラプラスミド溶液の、　５ｅｐＰａｋ
−Ｃ１８を用いたプラスミドＤＮＡの精製）比較例１で得られた。宿主ＤＮＡの混入の多いプラスミ
ドＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス・塩酸−１ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ７，５））に溶解させ
て粗プラスミド溶液とし、この溶液に３０％ＰＥＧ　６
０６０を加えてＰＥＧの終濃度を３％とした。この溶液
の２００μ２をＣ−１８逆相シリカゲル充填カラムであ
る５ｅｐＰａｋ−Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）にチャー
ジし、プラスミドＤＮＡを吸着させた。次いで、上記と
同様のＴＥ緩衝液を用いて十分にカラムを洗浄した後、
３０％エタノールにてプラスミドＤＮＡを溶出させた。

このエタノ−ル溶出液を回収し、エタノールを揮発除去
した後、エタノール沈澱によりプラスミドＤＮＡを精製
した。

この操作によりプラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１８が３．２
μｇ得られた。このプラスミドＤＮＡの電気泳動パター
ンを第２図５に、そして純度を表１に示す。表１から明
らかであるように、プラスミドＤＮＡは純度９８％で得
られ、宿主ＤＮＡは２，０％であり、　ＰＥＧを用いた
この操作により、プラスミドＤＮＡが比較例１よりも精
製されたことが示された。

上較拠Ｉ（冑分子量ＰＶＡ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタ
イトを用いたプラスミドＤＮＡの精製）分子量ｉｏｏ、
ｏｏｏのＰνへの代わりに分子量６００．０００のＰＶ
Ａを用いて、実施例３と同様の操作を行った。

使用濃度は実施例３と同じであったが、高分子量のポリ
マーを用いると溶液の粘度が上昇し、カラム操作中にカ
ラム充填剤が目詰まりして圧力が上昇した。そのため、
カラム処理時間が長くかかり。

取り扱いが非常に難しかった。プラスミドＤＮＡ　ｐｕ
ｃｉｓの収量は１．８μｇであり、実施例３に比べて約
半分の量しか回収されなかった。このプラスミドＤＮＡ
の電気泳動パターンを第２図７に、そして純度を表１に
示す。表１から明らかなように、高分子量の水溶性ポリ
マーを用いるとプラスミドＤＮＡの収率がよくないうえ
、宿主ＤＮＡが８％混入していた。

ル較拠主（高濃度ＰＥＧ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイ
トを用いたプラスミドＤＮＡの精製）３０％ＰＩＥＧ　
６０００水溶液６０μｌを用いる代わりに。

５０％ＰＥ６６０００水溶液４５０μ！を用いて実施例
１と同様の操作を行った。（八）項の操作により溶液中
のＰＥＧ終濃度は２５％となり、これをヒドロキシアパ
タイトカラムにチャージした。高濃度のＰＥＧを用いる
と、比較例２の場合と同様に溶液の粘度が上昇したため
、カラム処理時間が長くかかり、取り扱いが非常に難し
かった。プラスミドＤＮＡ　ｐＬｌｃ１８の収量は２．
１　μｇであった。このプラスミドＤＮＡの電気泳動パ
ターンを第２図８に、そして純度を表１に示す。表１か
ら明らかなように、高濃度の水溶性ポリマーを用いると
ＲＮＡの混入はなかったが、宿主ＤＮＡが７％混入して
いた。

表１（発明の効果）本発明方法によれば、このように、菌体溶菌液からプラ
スミドＤＮＡ　、　　ファージＤＮＡなどのＤＮＡを短
時間のうちに高純度・高収率で、かつ煩雑な操作を必要
とすることなく単離・精製することができる。本法を用
いてプラスミドＤＮＡ　、　ファージＤＮＡなどのＤＮ
Ａの単離・精製の自動化が可能となる。

このような方法は、　ＤＮＡの配列決定、　　［ｌＮＡ
の構築など遺伝子工学の各分野で広く利用され得る。

土−区皿図証単星脱班第１図は１本発明方法によりヒドロキシアパタイトカラ
ムを用いてＰＥＧ添加溶菌液からのプラスミドＤＮＡの
単離・精製を行ったときの溶出液の紫外線吸収をモニタ
ーした結果、およびＤＮＡの指標として加えられた３Ｈ
放射活性をモニターした結果を示すグラフ；そして第２
図は２本発明方法および他の方法により得られる精製Ｄ
ＮＡの電気泳動パターンである。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、溶菌菌体と分子量１，０００〜５００，０００の水
溶性ポリマーとを、水溶性ポリマーの終濃度が０．０１
〜２０重量％となるように含む水溶性ポリマー含有溶菌
液を調製する工程；該溶菌液を吸着剤と接触させて、該溶菌液中のＤＮＡを
該吸着剤に吸着・担持させる工程；および該ＤＮＡを吸
着・担持する吸着剤に該吸着剤と強い相互作用を有する
溶離液を接触させて、該ＤＮＡを溶出させる工程；を包含するＤＮＡの精製方法。