JPH01304886A - Method for purifying dna - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、 ＤＮＡの精製方法に関し、さらに詳しくは
、 ＤＮＡ 、 ＲＮＡ 、 タンパク、多糖類、脂
質などの各種菌体成分を含む菌体溶菌液から、プラスミ
ドＤＮＡ 、 ファージＤＮＡなどのＤＮＡを高純度
で単離・精製する方法に関する。[Detailed Description of the Invention] (Industrial Application Field) The present invention relates to a method for purifying DNA, and more specifically, to a method for purifying DNA, and more specifically to a bacterial cell lysate containing various bacterial cell components such as DNA, RNA, proteins, polysaccharides, and lipids. This invention relates to a method for isolating and purifying DNA such as plasmid DNA and phage DNA with high purity.
（従来の技術）
バイオテクノロジーの発展に伴い、遺伝子ＤＮＡの単離
、精製および塩基配列決定が頻繁に行われている。しか
し、各種技術の進歩にもかかわらず。(Prior Art) With the development of biotechnology, isolation, purification, and base sequencing of genetic DNA are frequently performed. However, despite advances in various technologies.
その操作は繁雑な手作業を必要とし、長時間と多大の労
力とを要する。そのため、このような作業は基礎および
応用開発において、研究者にとって大きな負担となって
いる。バイオテクノロジーの特に応用技術の展開のため
には、これらの作業を短時間で完了できるような技術が
望まれる。特に。The operation requires complicated manual labor, and requires a long time and a great deal of effort. Therefore, such work places a heavy burden on researchers in both basic and applied development. For the development of biotechnology, especially applied technology, a technology that can complete these tasks in a short time is desired. especially.
ＤＮＡの配列分析、 ＤＮＡの構築、構築されたＤＮＡ
配列に所望の遺伝子が正しく入っているかのチエ’７り
などを行う目的のためには、これに使用するための所望
のＤＮＡを短時間で単離し、精製することが必要である
。各種研究のためには、特に菌体からＤＮＡ （特に、
プラスミド、ファージなどのＤＮＡ）を迅速に分離して
精製することが望まれる。DNA sequence analysis, DNA construction, constructed DNA
In order to check whether a desired gene is correctly included in a sequence, it is necessary to isolate and purify the desired DNA for use in a short period of time. For various researches, it is especially important to extract DNA from bacterial cells (especially
It is desirable to rapidly separate and purify DNA such as plasmids and phages.
菌体からＤＮＡを比較的迅速に単離・精製する方法とし
ては、ボイリング法、アルカリ法、クリャ−ドライゼー
ト法などが採用されている。これらのうち、アルカリ法
でＤＮＡを単離するにはまず。As methods for relatively quickly isolating and purifying DNA from bacterial cells, the boiling method, the alkaline method, the claridolyzate method, etc. are employed. Of these, the first step is to isolate DNA using the alkaline method.
菌体をアルカリと界面活性剤（ＳＤＳ、 ）リドンＸ
−１００など）とで溶菌させ、溶菌後に該アルカリを中
和する。クリヤードライゼート法では、アルカリの代わ
りにリゾチームが用いられる。このような操作により菌
体に含まれるタンパクなどが溶解すると同時にＤＮＡ
（宿主ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡな
ど）が変性され、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡ）から−
本ｔｉＤＮＡ（ｓｓ ＤＮＡ） となる。次いで、これ
をｐＨ５程度の酸性条件にすると、溶解していたタンパ
クなどが析出すると同時にｓｓ ＤＮＡがもとのｄｓ
ＤＮＡに戻ろうとする。しかし９分子量の大きな宿主Ｄ
ＮＡは容易に戻ることが出来ず、 ｓｓ ＤＮＡの状態
のまま残存し、タンパクなどが析出される際に共沈する
（凝集沈澱）。他方１分子量が比較的小さいうえに２本
鎖がよじれあった状態で安定に存在するプラスミドＤＮ
Ａでは、この中和処理により直ちにもとの２本鎖ＤＮＡ
に戻ることができ、析出することはない。従って、この
中和後の溶菌液を遠心分離すると、大部分の宿主ＤＮＡ
は沈澱として除去され。Treat bacterial cells with alkali and surfactant (SDS, ) Ridone X
-100, etc.), and after lysis, the alkali is neutralized. In the clear dryzate method, lysozyme is used instead of alkali. This operation dissolves the proteins contained in the bacterial cells and at the same time dissolves the DNA.
(host DNA, plasmid DNA, phage DNA, etc.) is denatured and double-stranded DNA (ds DNA) is
This will be the real tiDNA (ss DNA). Next, when this is made into acidic conditions with a pH of about 5, dissolved proteins etc. precipitate out, and at the same time the ss DNA is converted to the original ds
Trying to get back to DNA. However, the large molecular weight host D
NA cannot easily return, remains as ss DNA, and co-precipitates when proteins and the like are precipitated (coagulation and precipitation). On the other hand, plasmid DNA has a relatively small molecular weight and stably exists with two strands twisted together.
In A, this neutralization treatment immediately restores the original double-stranded DNA.
can be returned to, and will not precipitate. Therefore, when this neutralized lysate is centrifuged, most of the host DNA is
is removed as a precipitate.
プラスミドＤＮＡ 、ファージＤＮＡなどを含有する溶
液が得られる。同様に、上記ボイリング法では。A solution containing plasmid DNA, phage DNA, etc. is obtained. Similarly, in the boiling method mentioned above.
アルカリ処理工程の代わりに加熱工程が設けられ。A heating process is provided instead of the alkali treatment process.
加熱によりＤＮＡおよびタンパクは変性を受ける。DNA and proteins are denatured by heating.
ＤＮＡは、上記アルカリ法の場合と同様にｓｓ ＤＮＡ
となり、その後、徐冷によりｄｓ ＤＮＡに戻るが、こ
のとき、アルカリ法の場合と同様に分子量の差により宿
主ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとに分離される。DNA is ss DNA as in the case of the alkaline method above.
Then, it returns to ds DNA by slow cooling, but at this time, as in the case of the alkaline method, it is separated into host DNA and plasmid DNA due to the difference in molecular weight.
このようにして宿主ＤＮＡの大部分が除去され。In this way, most of the host DNA is removed.
主として目的とするプラスミドＤＮＡやファージＤＮＡ
を含む溶液が得られるが、該溶液中には、さらに。Mainly target plasmid DNA or phage DNA
A solution is obtained which further contains:
ＲＮＡ 、各種タンパク、多糖類・宿主ＤＮＡの一部お
よびその断片などが混入している。例えば、プラスミド
口Ｎ＾を単離して配列決定を行う際には、特にＲＮＡに
よる妨害が大きいため９通常、このＲＮＡはリボヌクレ
アーゼ処理により低分子化され、ポリエチレングリコー
ル沈澱により除去される。しかし、リボヌクレアーゼは
安定性が高いため、使用後に完全に除去することが難し
い。リボヌクレアーゼは高活性であるため、場合によっ
てはその後の反応に使用される必要なＲＮＡが分解され
るという欠点がある。さらにこのような方法は、上記の
ように、いずれも遠心操作やピペッティング操作などの
多数の複雑な手作業による操作工程を必要とするため、
自動化がなされにくい、そして。Contaminants include RNA, various proteins, polysaccharides, and parts of host DNA and fragments thereof. For example, when plasmid mouth N^ is isolated and sequenced, interference by RNA is particularly large, so this RNA is usually reduced in molecular weight by ribonuclease treatment and removed by polyethylene glycol precipitation. However, due to the high stability of ribonucleases, it is difficult to completely remove them after use. Due to the high activity of ribonucleases, the disadvantage is that in some cases the necessary RNA used in subsequent reactions is degraded. Furthermore, as mentioned above, all of these methods require a large number of complicated manual manipulation steps such as centrifugation and pipetting.
It is difficult to automate, and.
これらの操作は手作業であるためＤＮへの回収率や純度
などにもバラツキが生じ、技術差による個人間の格差も
大きい。Since these operations are done manually, there are variations in the recovery rate and purity of DN, and there are also large disparities between individuals due to differences in technique.
リボヌクレアーゼを用いず、菌体や細胞からＤＮＡを１
段階で単離・精製する方法として、ヒドロキシアパタイ
トカラムを使用する方法が提案されている。（ｊ、Ａ、
Ｂｅ１ａｎｄら、 Ｊ、Ｃｈｒｏａａｔｏｇｒａｐｈｙ
＋ １７４＋１７７−１８６（１９７９） ）。この方
法によれば、まず、菌体をあらかじめ溶菌し、これに、
尿素８Ｍ（８モル／２）リン酸緩衝液（リン酸０．２４
Ｍ）、 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ； ０．
１％）およびエチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴ＾；１０
＋ｓＭ）を含む緩衝液を加える。DNA is extracted from bacterial bodies and cells without using ribonuclease.
As a step-by-step isolation and purification method, a method using a hydroxyapatite column has been proposed. (j, A,
Be1and et al., J. Chroaatography
+174+177-186 (1979)). According to this method, first, the bacterial cells are lysed in advance, and then
Urea 8M (8 mol/2) phosphate buffer (phosphoric acid 0.24
M), sodium dodecyl sulfate (SDS; 0.
1%) and ethylenediaminetetraacetic acid (HDT^; 10
+sM).
これを、上記と同様の緩衝液であらかじめ処理したヒド
ロキシアバ多イトカラムに通液すると、溶菌液中のＤＮ
Ａのみが選択的にヒドロキシアパタイト（吸着剤）に吸
着される。上記吸着条件下においてはｄｓ ＤＮＡのみ
が吸着され、 ｓｓ ＤＮＡなどは吸着されない（リン
酸塩濃度が０．１５Ｍ以下であれば。When this solution is passed through a hydroxyaba-rich column that has been treated with the same buffer solution as above, the DN in the lysate is
Only A is selectively adsorbed to hydroxyapatite (adsorbent). Under the above adsorption conditions, only ds DNA is adsorbed, and ss DNA etc. are not adsorbed (if the phosphate concentration is 0.15M or less).
ある程度は吸着される）。尿素濃度が８Ｍと高いた、め
、非特異的なタンパクの吸着もほとんど起こらない。ｄ
ｓ ＤＮＡを吸着したヒドロキシアパタイトカラムに２
次に＋ １０５Ｍリン酸緩衝液を流して上記吸着に用い
た緩衝液中の尿素、 ＳＯ５などを除去する。adsorbed to some extent). Since the urea concentration is as high as 8M, non-specific protein adsorption hardly occurs. d
s on the hydroxyapatite column adsorbed with DNA.
Next, urea, SO5, etc. in the buffer used for the adsorption are removed by flowing +105M phosphate buffer.
さらに０．３Ｍリン酸緩衝液を通液することにより吸着
したｄｓ ＤＮＡを溶離させ、これを回収する。Furthermore, the adsorbed ds DNA is eluted by passing a 0.3M phosphate buffer through it, and then recovered.
しかし、上記ヒドロキシアパタイトカラムを使用する方
法においても、目的とするプラスミドＤＮＡ。However, even in the method using the above-mentioned hydroxyapatite column, the target plasmid DNA.
ファージＤＮＡなどのＤＮＡに加えて宿主（ホスト）菌
体または細胞由来のｄｓ ＤＮＡの混入が避けられない
。これは、宿主由来のＤＮＡの分子量が大きいため、た
とえ１本鎖であってもヒドロキシアパタイトとの親和性
を有するためである。この宿主由来のＤＮＡを除去する
には、上記アルカリ法、クリヤードライゼート法または
ボイリング法における遠心分離後の上清をカラムにかけ
る方法が有効である。しかし、このような前処理を行・
うと操作工程が増すため、自動化が困難となる。さらに
アルカリ法を用いた場合には、宿主ＤＮへの一部が切断
されて低分子化し、これらが混入するという欠点もある
。In addition to DNA such as phage DNA, contamination with ds DNA derived from host bacterial cells or cells is unavoidable. This is because host-derived DNA has a large molecular weight and has an affinity for hydroxyapatite even if it is single-stranded. To remove this host-derived DNA, it is effective to apply the supernatant after centrifugation in the alkaline method, clear drisate method, or boiling method to a column. However, if such preprocessing is not performed,
This increases the number of operating steps, making automation difficult. Furthermore, when the alkaline method is used, there is also the drawback that a portion of the host DNA is cleaved and becomes low molecular weight, which causes contamination.
さらに上記ヒドロキシアパタイトカラムを使用する方法
には別の欠点もある。つまり、この方法で回収されたｄ
ｓ ＤＮＡは、上記０．３Ｍリン酸緩衝液の溶液として
得られるため、そのまま使用することができない。なぜ
なら、リン酸塩はエタノールなどのアルコールに対する
溶解度が低いため１次工程においてエタノール沈澱によ
りｄｓ ＤＮＡを回収しようとするとｄｓ ＤＮＡと同
時にリン酸塩が多量に析出し、この析出したリン酸塩を
除去することが困難であるからである。そのため、透析
などの方法によりリン酸塩を除去する必要がある。この
ように、透析という煩雑な操作を必要とし、そのためｄ
ｓ ＤＮＡの回収率が悪いという欠点がある。Furthermore, the method using the hydroxyapatite column described above has other drawbacks. In other words, the d recovered using this method
s DNA is obtained as a solution in the above 0.3M phosphate buffer and cannot be used as is. This is because phosphate has low solubility in alcohols such as ethanol, so when attempting to recover ds DNA by ethanol precipitation in the first step, a large amount of phosphate precipitates at the same time as ds DNA, and the precipitated phosphate is removed. This is because it is difficult to do so. Therefore, it is necessary to remove phosphate by a method such as dialysis. In this way, it requires a complicated operation called dialysis, and therefore d
s The disadvantage is that the recovery rate of DNA is poor.
（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。(Problem to be solved by the invention) The present invention solves the above-mentioned conventional problems.
その目的とするところは、菌体溶菌液からプラスミドＤ
ＮＡ 、ファージＤＮＡなどのＯＮ八を、短時間のうち
に高純度で、かつ煩雑な操作を必要とすることなく、単
離・精製する方法を提供することにある。本発明の他の
目的は、上記菌体溶液に含有される宿主菌体または細胞
由来のＤＮＡ （宿主ＤＮＡ）やＲＮＡを効果的に除去
し、Ｊ：記プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡを自動的
に単離・精製し得る方法を提供することにある。The purpose is to extract plasmid D from the bacterial cell lysate.
The object of the present invention is to provide a method for isolating and purifying ON8 such as NA and phage DNA in a short time with high purity and without requiring complicated operations. Another object of the present invention is to effectively remove DNA (host DNA) and RNA derived from host cells or cells contained in the above-mentioned cell solution, and automatically isolate plasmid DNA and phage DNA. The objective is to provide a method that allows separation and purification.
（課題を解決するための手段）
発明者らは上記Ｂｅ１ａｎｄらのヒドロキシアパタイト
カラムを使用する方法において１例えば、クリヤーライ
ゼート法による溶菌液を遠心分離することなくそのまま
カラムにかければ、操作工程が簡略化され得ると考えた
。しかし、宿主ＤＮＡが遠心分離によって系内から除去
されていないため、これらの一部がヒドロキシアパタイ
トに吸着する。(Means for Solving the Problems) In the above-mentioned method using a hydroxyapatite column of Be1 and et al., the inventors found that, for example, if a lysate obtained by the clear lysate method is directly applied to the column without centrifugation, the operating steps can be reduced. I thought that it could be simplified. However, since the host DNA is not removed from the system by centrifugation, some of it is adsorbed to hydroxyapatite.
そのためこれら宿主ＤＮＡが混入し、高純度のプラスミ
ド（ファージ） ＤＮＡは得られなかった。Therefore, these host DNAs were contaminated and highly pure plasmid (phage) DNA could not be obtained.
発明者らはさらに、プラスミドＤＮＡ 、 ファージ
ＤＮＡなどのＤＮＡを、宿主ＤＮＡが混入することな（
単離・精製する方法を検討した。その結果、吸着クロマ
トグラフィーを用いた単離・精製方法において水溶性ポ
リマーを存在させることが効果的であることを見い出し
１本発明を完成するに至った。The inventors further discovered that DNA such as plasmid DNA and phage DNA can be used without contamination with host DNA (
We investigated isolation and purification methods. As a result, they discovered that it is effective to include a water-soluble polymer in an isolation and purification method using adsorption chromatography, and have completed the present invention.
本発明のＤＮＡの精製方法は、溶菌菌体と分子量ｉ 、
ｏｏｏ〜５００ 、０００の水溶性ポリマーとを、水
溶性ポリマーの終濃度が０．０１〜２０重量％となるよ
うに含む水溶性ポリマー含有溶菌液を調製する工程；該
溶菌液を吸着剤と接触させて、該溶菌液中のＤＮＡを該
吸着剤に吸着・担持させる工程；および該ＤＮＡを吸着
・担持する吸着剤に該吸着剤と強い相互作用を有する溶
離液を接触させて、該ＤＮＡを溶出させる工程を包含し
、そのことにより上記目的が達成される。The DNA purification method of the present invention includes lytic bacterial cells and molecular weight i,
A step of preparing a water-soluble polymer-containing lysate containing a water-soluble polymer of ooo ~ 500,000 so that the final concentration of the water-soluble polymer is 0.01 to 20% by weight; contacting the lysate with an adsorbent. and adsorbing and supporting the DNA in the lysate on the adsorbent; and contacting the adsorbent that adsorbs and supports the DNA with an eluent that has a strong interaction with the adsorbent, so as to remove the DNA. The method includes a step of eluting, thereby achieving the above object.
本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては。The water-soluble polymer used in the present invention includes:
電荷を持たない中性の水溶性ポリマーが好ましく。A neutral water-soluble polymer with no charge is preferred.
このような水溶性ポリマーとしては、デキストラン、ポ
リエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドンなどが用いられる。これら
の水溶性ポリマーの分子量はｔ 、 ｏｏｏ 〜５００
、０００が好ましく、特ニ３，０００−１００，００
０の分子量のポリマーが好適に用いられる。水溶性ポリ
マーの分子量が、 ５００，０００を越えると溶液の粘
度が高くなるため取り扱いが困難になり、また。Examples of such water-soluble polymers include dextran, polyethylene glycol, Ficoll, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone. The molecular weight of these water-soluble polymers is t,ooo~500
,000 is preferable, especially D3,000-100,00
Polymers with a molecular weight of 0 are preferably used. When the molecular weight of the water-soluble polymer exceeds 500,000, the viscosity of the solution increases, making it difficult to handle.
分子量が１，０００未満では本発明の効果を奏さない。If the molecular weight is less than 1,000, the effects of the present invention will not be achieved.
水溶性ポリマーは、終濃度が０．０１〜２０重世％、好
ましくは１〜１０重量％となるように溶菌液に添加され
る。なお、終濃度とは、吸着剤と接触される直前の水溶
性ポリマー含有溶菌液の中の水溶性ポリマーの濃度を意
味する。菌体を含む液に水溶性ポリマーを添加し、これ
を溶菌させてもよい。水溶性ポリマーの終濃度が高すぎ
ると溶液の粘度が高くなるため取り扱いが困難になり、
また、 ｏ、ｏｉ重量％未満の終濃度では本発明の効果
を奏さない。The water-soluble polymer is added to the lysate at a final concentration of 0.01 to 20% by weight, preferably 1 to 10% by weight. Note that the final concentration means the concentration of the water-soluble polymer in the water-soluble polymer-containing lysate immediately before contacting with the adsorbent. A water-soluble polymer may be added to a liquid containing bacterial cells to lyse the bacteria. If the final concentration of the water-soluble polymer is too high, the viscosity of the solution will increase, making it difficult to handle.
Furthermore, the effects of the present invention cannot be achieved at a final concentration of less than o, oi% by weight.
本発明に用いられる吸着剤としては１例えば。Examples of adsorbents used in the present invention include:
ｄｓ ＤＮＡのみを選択的に吸着しうるヒドロキシアパ
タイト、逆相系吸着剤、またはイオン交換体が用いられ
る。特にヒドロキシアパタイトを用いると。Hydroxyapatite, a reverse phase adsorbent, or an ion exchanger that can selectively adsorb only ds DNA is used. Especially with hydroxyapatite.
宿主ＤＮＡに加えてＲＮＡが効果的に除去される。上記
吸着剤のうち逆相系吸着剤としては、 Ｃ−１８，Ｃ−
８゜Ｃ−３系などの疎水性相互作用による吸着能を有す
る吸着剤が挙げられる。イオン交換体としては。RNA in addition to host DNA is effectively removed. Among the above adsorbents, the reverse phase adsorbents include C-18, C-
Examples include adsorbents having adsorption ability based on hydrophobic interactions such as 8°C-3 type adsorbents. As an ion exchanger.
−級アミン系、二級アミン系（例えば、アミノエチル基
を側鎖に有するイオン交換体）、三級アミン系（例えば
、ジエチルアミノエチル基を側鎖に有するイオン交換体
）、および四級アミン系のカチオン交換体が好ましい。-class amine type, secondary amine type (for example, ion exchanger having aminoethyl group in the side chain), tertiary amine type (for example, ion exchanger having diethylaminoethyl group in the side chain), and quaternary amine type cation exchangers are preferred.
溶離液は、使用する吸着剤の種類により異なるが１例え
ば吸着剤としてヒドロキシアパタイトを用いる場合には
、該吸着剤を構成する成分（アニオンおよびカチオン）
の少な（とも一方、好ましくは両方と強い相互作用を有
する溶媒、ことに。The eluent varies depending on the type of adsorbent used; for example, when hydroxyapatite is used as an adsorbent, the eluent contains the components (anions and cations) that make up the adsorbent.
(with a solvent that has a strong interaction with one or the other, preferably with both).
難溶性の塩を形成しうる塩溶液が使用され得る。Salt solutions capable of forming sparingly soluble salts may be used.
そのような塩溶液のなかでは、解離定数が小さいアニオ
ンとカチオンとの組合せでなる塩の溶液であり、かつＤ
ＮＡなどの核酸との親和性が高いものが好適である。さ
らに水やアルコール系溶媒に可溶であり、エタノール沈
澱により析出することのない塩が選択される。例えば、
使用される塩のアニオン成分としては炭酸；および蟻酸
、酢酸、プロピオン酸などの有機酸が好適である。カチ
オン成分としては、アンモニア；ジエチルアミン、トリ
エチルアミンなどのアルキルアミン類；エタノールアミ
ン、プロパツールアミンなどのアルカノールアミン類；
およびピリジン、アニソノなどの芳香族アミン類が好適
である。このような成分でなる塩を含む溶離液としては
、特にトリエチルアミン炭酸緩衝液が好適である。トリ
エチルアミン炭酸緩衝液は揮発性であるため、 ＤＮ
Ａを含む溶出液の溶媒を留去したり凍結乾燥することに
よりＤＮＡのみを高純度で回収することが可能となる。Among such salt solutions, it is a salt solution consisting of a combination of an anion and a cation with a small dissociation constant, and D
Those having high affinity with nucleic acids such as NA are preferred. Furthermore, a salt is selected that is soluble in water or alcoholic solvents and does not precipitate out by ethanol precipitation. for example,
Suitable anionic components of the salts used are carbonic acid; and organic acids such as formic acid, acetic acid and propionic acid. Cationic components include ammonia; alkylamines such as diethylamine and triethylamine; alkanolamines such as ethanolamine and propatoolamine;
and aromatic amines such as pyridine and anisono. A triethylamine carbonate buffer is particularly suitable as an eluent containing a salt made of such components. Since triethylamine carbonate buffer is volatile, DN
By distilling off the solvent of the eluate containing A or freeze-drying it, it becomes possible to recover only DNA with high purity.
上記溶離液の濃度は２例えば、トリエチルアミン炭酸緩
衝液を使用する場合には、該緩衝液の濃度は１０ＩＩＩ
Ｍ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２Ｍ、 さらに好ましく
は１００ｍＭ〜１Ｍの範囲である。このように、 ５０
ｍＭ以下の低濃度であってもＤＮＡを溶出することが可
能である。The concentration of the eluent is 2. For example, when using a triethylamine carbonate buffer, the concentration of the buffer is 10III.
M or more, preferably in the range of 50mM to 2M, more preferably in the range of 100mM to 1M. In this way, 50
It is possible to elute DNA even at low concentrations below mM.
逆相系吸着剤またはイオン交換体を用いる場合には、溶
離液は特に限定されず、それぞれＤＮＡを吸着させ、そ
して溶出させ得る２通常の逆相クロマトグラフィーまた
はイオン交換クロマトグラフィーに使用される溶離液が
用いられる。これらの溶離液の種類、濃度、 ｐｎなと
の条件は、 ＤＮＡの吸着および溶出について最適であ
るように、前もって調べておくことが望ましい。When using a reversed phase adsorbent or an ion exchanger, the eluent is not particularly limited, and can adsorb and elute DNA, respectively.2 Eluents used in ordinary reversed phase chromatography or ion exchange chromatography can be used. liquid is used. It is desirable to investigate in advance the type, concentration, and pn conditions of these eluents so that they are optimal for DNA adsorption and elution.
本発明方法によりプラスミドＤＮＡ 、 ファージＤＮ
ＡなどのＤＮＡの精製を行うには、まずアルカリ法。Plasmid DNA, phage DNA by the method of the present invention
To purify DNA such as A, first use the alkaline method.
ボイリング法などの常法により調製した溶菌液に。For lysis solution prepared by conventional methods such as boiling method.
水溶性ポリマーを添加する。溶菌前の菌体に水溶性ポリ
マーを添加しておき、これに溶菌剤を添加して水溶性ポ
リマー含有溶菌液を得ることもできる。このようにして
得られた水溶性ポリマーを含む溶菌液中には、所望のプ
ラスミドＤＮＡやファージＤＮＡの他、宿主ＤＮＡ由来
のｓｓ ＤＮＡ、 ＲＮＡ 、タンパク、多糖類、脂質
などが含まれる。次いで、この溶菌液を、吸着剤９例え
ばヒドロキシアパタイトと接触させる。ヒドロキシアパ
タイトを充填したカラムなどが好適に利用され１例えば
、 ０．０５Ｍ〜０．２５Ｍのリン酸緩衝液を溶離液と
して通液することにより、溶菌液中のｄｓ ＤＮＡが選
択的に吸着される。溶菌液中のｓｓ ＤＮＡ、 ＲＮ
Ａ、蛋白質、多糖類。Add water-soluble polymer. It is also possible to obtain a lysis solution containing a water-soluble polymer by adding a water-soluble polymer to the bacterial cells before lysis and adding a lytic agent thereto. The lysate containing the water-soluble polymer thus obtained contains not only the desired plasmid DNA and phage DNA, but also ss DNA, RNA, protein, polysaccharide, lipid, etc. derived from the host DNA. This lysate is then brought into contact with an adsorbent 9 such as hydroxyapatite. A column filled with hydroxyapatite is preferably used. For example, by passing a 0.05M to 0.25M phosphate buffer as an eluent, ds DNA in the lysate can be selectively adsorbed. . ss DNA, RN in lysate
A. Protein, polysaccharide.
脂質などは吸着されない。次に、 ｄｓ ＤＮＡを吸着
・担持する吸着剤に、前記溶離液を接触させる。例えば
、 ｄｓ ＤＮＡを吸着・担持するヒドロキシアパタイ
トにトリエチルアミン炭酸緩衝液を接触させると、炭酸
イオンがヒドロキシアパタイトのカルシ ″ラムと
結合して難溶性の炭酸カルシウムを生成し。Lipids etc. are not adsorbed. Next, the eluent is brought into contact with an adsorbent that adsorbs and supports ds DNA. For example, when triethylamine carbonate buffer is brought into contact with hydroxyapatite, which adsorbs and supports ds DNA, carbonate ions combine with the calcilum of hydroxyapatite to produce poorly soluble calcium carbonate.
ｄｓ ＤＮＡはヒドロキシアパタイトから脱着する。例
えば、ヒドロキシアパタイトカラムのベツド容量の２倍
量のトリエチルアミン炭酸緩衝液を通液することにより
、吸着されているｄｓ ＤＮＡのほぼ全量を回収するこ
とができる。このようにして回収される溶出液を通常の
エタノール沈澱処理に付すことにより精製ｄｓ ＤＮＡ
が得られる。溶出液中のトリエチルアミン炭酸塩はエタ
ノールに相溶するため。ds DNA is desorbed from hydroxyapatite. For example, by passing a triethylamine carbonate buffer in an amount twice the bed volume of the hydroxyapatite column, almost the entire amount of adsorbed ds DNA can be recovered. The eluate thus collected is subjected to a conventional ethanol precipitation treatment to obtain purified ds DNA.
is obtained. Because triethylamine carbonate in the eluate is compatible with ethanol.
ｄｓ ＤＮＡに混入してその純度を低下させることがな
い。エタノール沈澱処理の代わりに溶媒の減圧留去や凍
結乾燥を行うことによってもトリエチルアミン炭酸塩が
揮発・除去され（脱塩が達成され）で高純度のｄｓ Ｄ
ＮＡが得られる。It does not contaminate ds DNA and reduce its purity. Triethylamine carbonate can be volatilized and removed (desalination is achieved) by distilling off the solvent under reduced pressure or freeze-drying instead of ethanol precipitation, resulting in highly pure dsD.
NA is obtained.
本発明の方法においては、水溶性ポリマーが溶菌液中に
含有されるため、上記吸着剤を用いた処理により得られ
る目的とするプラスミドＤＮＡやファージＤ Ｎ Ａに
宿主ＤＮＡが混入することがない。その理由は明らかで
はないが１例えば９次の理由が考えられる：１）水溶性
ポリマーの添加により溶菌液の粘度が若干上昇し、その
結果カラム充填剤粒子間における該溶菌液の流れが良好
になり、 ｄｓ ＤＮＡの吸着時に宿主ＤＮＡが吸着さ
れずに通過する；２）水溶性ポリマーにより高い分子量
を有する宿主ＤＮＡが凝集し、これが強固に吸着剤に結
合し、溶離液により容易に溶出されない；および３）宿
主ＤＮＡと水溶性ポリマーとが結合することにより、吸
着剤との親和性の低い複合体を形成し、吸着剤に吸着さ
れない。In the method of the present invention, since the water-soluble polymer is contained in the lysate, host DNA does not contaminate the target plasmid DNA or phage DNA obtained by treatment with the above-mentioned adsorbent. The reasons for this are not clear, but the following reasons may be considered: 1) Addition of the water-soluble polymer slightly increases the viscosity of the lysing solution, resulting in better flow of the lysing solution between the column packing particles. 2) host DNA with a high molecular weight is aggregated by the water-soluble polymer, and this is tightly bound to the adsorbent and is not easily eluted by the eluent; and 3) the binding of host DNA and water-soluble polymer forms a complex with low affinity for the adsorbent and is not adsorbed by the adsorbent.
このように２本発明方法によりプラスミドＤＮＡおよび
／またはファージＤＮ＾が、宿主ＤＮＡの混入を受ける
ことな（高純度で単離・精製される。In this way, by the method of the present invention, plasmid DNA and/or phage DNA can be isolated and purified with high purity without being contaminated by host DNA.
（実施例） 以下に本発明を実施例つき説明する。(Example) The present invention will be explained below with reference to examples.
実１瀾土
（ＰＥＧ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）
（Ａ）菌体の培養および溶菌ニブラスミドｐＵｃ１８を
含有する大腸菌ＪＭ１０９株を５ ｍｌのＬＢ培地中で
１晩培養した。この培養液１゜５戚を５．００Ｏｒｐｍ
にて５分間遠心分離し、菌体を沈澱させた。Fruit 1 soil (Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from PEG-added bacteriolytic solution) (A) Culture of bacterial cells and culturing of Escherichia coli strain JM109 containing lytic niblasmid pUc18 in 5 ml of LB medium overnight. did. 5.00 Orpm of this culture solution 1°5
The cells were centrifuged for 5 minutes to precipitate the bacterial cells.
得られた菌体を、２ＸＴＥ緩衝液（２０ｍＭ ）リス・
塩酸−２ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ８，０））
ｔｏ。The obtained bacterial cells were soaked in 2XTE buffer (20mM)
Hydrochloric acid - 2mM ethylenediaminetetraacetic acid H8,0))
to.
ｇ Ｑに懸濁させ、これに０．２Ｍ水酸化ナトリウム−
０，１％ドデシル硫酸ナトリウムを２００ μ！加え。g suspended in Q and added with 0.2M sodium hydroxide.
200μ of 0.1% sodium dodecyl sulfate! Addition.
室温で１０分間放置し、菌体を完全に溶菌させた。The cells were left to stand at room temperature for 10 minutes to completely lyse the bacterial cells.
これに回収率の算出を目的として Ｊでインビトロ（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ）標識されたプラスミドＤＮＡ （
’ＩＩ−ｐＵＣ１８）を約０．１μＣｉ （約５μｌ）
添加した。この溶菌液に、３０％ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）６０００を６０μ２添加し、約５％の濃度
とした。次いで。For the purpose of calculating the recovery rate, this was in vitro (i.
n vitro) labeled plasmid DNA (
'II-pUC18) about 0.1 μCi (about 5 μl)
Added. To this lysate, 60μ2 of 30% polyethylene glycol (PEG) 6000 was added to give a concentration of about 5%. Next.
この強アルカリ性溶液に３Ｍの酢酸カリウムを１５０μ
！加えて中和した。この操作により、溶液中のＰＥＧ終
濃度は３．５％となった。Add 150μ of 3M potassium acetate to this strong alkaline solution.
! In addition, it was neutralized. Through this operation, the final concentration of PEG in the solution was 3.5%.
（Ｂ）ＤＮへの精製：
（Ｂ）−１力ラム操作（吸着）
（Ａ）項で得られた溶菌菌体とＰＥＧとを含む水溶液（
ＰＥＧ含有溶菌液）を、１ｍｌのヒドロキシアパタイト
（吸着剤）を充填したカラムに流速５ｄ／時間でチャー
ジし、菌体成分を吸着させた。ＰＥＧの添加により溶液
の粘度が若干上昇したが、カラム操作に問題はなかった
。(B) Purification to DN: (B)-1 force ram operation (adsorption) Aqueous solution containing lytic bacterial cells obtained in section (A) and PEG (
The PEG-containing bacteriolysis solution) was charged into a column packed with 1 ml of hydroxyapatite (adsorbent) at a flow rate of 5 d/hour to adsorb bacterial components. Although the viscosity of the solution increased slightly due to the addition of PEG, there were no problems with column operation.
（Ｂ）−２力ラム操作（洗浄１）
上記カラムに約２０ｍ２の８Ｍ尿素−０，２４Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）を流速２０Ｉｎ１／時間で１時間
、溶出液の２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤｚ、。）が
Ｏになるまで通液した。(B) - Double force ram operation (washing 1) Approximately 20 m2 of 8M urea-0.24M phosphate buffer (pH 7.0) was added to the above column at a flow rate of 20 l/hour for 1 hour, and the absorbance of the eluate at 260 nm (ODz ,.) was passed until it became O.
（Ｂ）−３カラム操作（洗浄２）
次に、 ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｌ−リス・塩酸−１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ７，５））約１０ｍ
１を流速２０ｄ／時間の割合で３０分間通液し、 （Ｂ
）−２項に記載された洗浄液の成分である尿素およびリ
ン酸緩衝液を洗い流した。(B)-3 column operation (washing 2) Next, TE buffer (10mM l-Lis.HCl-1
mM ethylenediaminetetraacetic acid acetic acid H7,5)) approx. 10m
1 at a flow rate of 20 d/hour for 30 minutes, (B
) The components of the washing solution described in Section 2, urea and phosphate buffer, were washed away.
（Ｂ）−４カラム操作（溶離）
このカラムに０．１Ｍトリエチルアミン炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を流速５ｍｌ／時間で流した。カラムの出口
に紫外線吸収モニター（ＵＶモニター）を接続して２６
０ｎｍの吸光度をモニターしたところ、第１図に曲線で
示す結果が得られた。第１図から溶離液の通液開始後０
．２〜１．２ｍｌの範囲で大部分のプラスミドＤＮＡが
溶出されているのがわかる。カラムからの溶出液の各フ
ラクションの放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、各フラクションに含まれる３Ｈ標識化プラ
スミドの回収率を調べた。その結果を第１図に棒グラフ
で示す。(B)-4 column operation (elution) 0.1M triethylamine carbonate buffer (p
H8,0) was flowed at a flow rate of 5 ml/hour. Connect an ultraviolet absorption monitor (UV monitor) to the outlet of the column.
When the absorbance at 0 nm was monitored, the results shown by the curve in FIG. 1 were obtained. From Figure 1, 0 after the start of eluent flow.
．． It can be seen that most of the plasmid DNA was eluted in the range of 2 to 1.2 ml. The radioactivity of each fraction of the eluate from the column was measured using a liquid scintillation counter, and the recovery rate of the 3H-labeled plasmid contained in each fraction was examined. The results are shown in a bar graph in FIG.
第１図から、はぼ９５％以上のプラスミドｐＵＣ１８が
回収されていることがわかる。From FIG. 1, it can be seen that more than 95% of plasmid pUC18 was recovered.
（Ｂ）−５ＤＮＡの単離および純度の評価得られた溶出
液的１ ｍｌに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．１ ｄ加えて
エタノール沈澱を行った。プラスミドＤＮＡ （ｐＵｃ
１８）が４μｇ回収された。このプラスミド０．２μｇ
を電気泳動にかけ、核酸染色し、その後バンドをデンシ
トメーターにて読み取ったところ、第２図１に示す泳動
パターンが得られた。第２図において、■は宿主ＤＮＡ
、■はｏｃ ＤＮ＾（ニック（切れ目）の入ったｐＨ
ｃ１８プラスミドＤＮ＾）、■はｃｃＤＮＡにツクの入
らないｐＵｃ１ＢプラスミドＤＮＡ） 。(B) Isolation of -5 DNA and Evaluation of Purity Ethanol precipitation was performed by adding 0.1 d of 3M sodium acetate to 1 ml of the obtained eluate. Plasmid DNA (pUc
18) was recovered in an amount of 4 μg. 0.2 μg of this plasmid
When subjected to electrophoresis, stained with nucleic acid, and then read the bands with a densitometer, the migration pattern shown in FIG. 2 was obtained. In Figure 2, ■ indicates host DNA.
, ■ is oc DN^ (pH with a nick)
c18 plasmid DNA^), ■ is pUc1B plasmid DNA that does not contain ccDNA).
そして■はＲＮＡを示す。得られた全核酸量（■＋■＋
■＋■）に対する宿主ＤＮＡ（■）、プラスミドＤＮＡ
（■＋■）、またはＲＮＡ （■）の割合を求め、収
量とあわせて純度（％）として表１に示す。表１から明
らかなように、プラスミドＤＮＡは９９．５％の純度で
得られ、宿主ＤＮＡはわずか０．５％であり。And ■ indicates RNA. Total amount of nucleic acid obtained (■＋■＋
■+■) host DNA (■), plasmid DNA
The ratio of (■+■) or RNA (■) was determined and shown in Table 1 as purity (%) along with the yield. As is clear from Table 1, the plasmid DNA was obtained with a purity of 99.5%, and the host DNA was only 0.5%.
かつＲＮＡは全く検出されなかった。And no RNA was detected.
ル較桝土
（水溶性ポリマー無添加溶菌液からの、ヒドロキシアパ
タイトを用いたプラスミドＤＮＡの精製）ＰＥＧを添加
しないで、実施例１と同様の操作を行った。プラスミド
ＤＮＡ ｐｕｃｉａが３．９ μｇ回収された。このプ
ラスミドＤＮＡの電気泳動パターンを第２図６に、そし
て純度を表１に示す。表１から明らかなように、水溶性
ポリマーが存在しないと宿主ＤＮＡの混入が１５％と高
値であり、さらに精製を必要とした。(Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from a lysate without addition of a water-soluble polymer) The same operation as in Example 1 was performed without adding PEG. 3.9 μg of plasmid DNA pucia was recovered. The electrophoretic pattern of this plasmid DNA is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, in the absence of a water-soluble polymer, host DNA contamination was as high as 15%, necessitating further purification.
２施１
（口ＥＸ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）
３０％ＰＥＧ ６０００水溶液の代わりに１０％デキス
トラン＋１５００ （ファルマシア製１分子量約４５０
．０００ 、以下ＤＥＸとする）水溶液を用いて、実施
例１と同様の操作を行った。（Ａ）項の操作により溶液
中のＤＥＸ終濃度は１．２％となり、これをヒドロキシ
アパタイトカラムにチャージした。プラスミドＤＮＡ
ｐｕｃｉａが３．５μｇ回収された。このプラスミドＤ
ＮＡの電気泳動パターンを第２図２に、そして純度を表
１に示す。表１から明らかであるように、プラスミドＤ
ＮＡは純度９８％で得られ、宿主ＤＮＡは２．０％であ
り、かつＲＮＡは全く検出されなかった。2 steps 1 (Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from lysate containing EX) 10% dextran + 1500 (manufactured by Pharmacia, molecular weight approx. 450) instead of 30% PEG 6000 aqueous solution
．． The same operation as in Example 1 was performed using an aqueous solution (hereinafter referred to as DEX). By the operation in section (A), the final concentration of DEX in the solution was 1.2%, and this was charged to a hydroxyapatite column. plasmid DNA
3.5 μg of P. pucia were recovered. This plasmid D
The electrophoretic pattern of NA is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, plasmid D
NA was obtained with a purity of 98%, host DNA was 2.0%, and no RNA was detected.
裏施糎主
（ＰＶＡ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイトを用
いたプラスミドＤＮＡの精製）
３０％ＰＥＧ ６０００水溶液の代わりに１０％ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ、分子１１００．０００）水溶
液を用いて。Back application (Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from PVA-added lysate) Using 10% polyvinyl alcohol (PVA, 1100.000 molecule) aqueous solution instead of 30% PEG 6000 aqueous solution.
実施例１と同様の操作を行った。（＾）項の操作により
溶液中のＰＶＡ終濃度は１．２％となり、これをヒドロ
キシアパタイトカラムにチャージした。プラスミドＤＮ
Ａ ｐｕｃｉａが３．６μｇ回収された。このプラスミ
ドＤＮＡの電気泳動パターンを第２図３に。The same operation as in Example 1 was performed. By the operation in section (^), the final concentration of PVA in the solution was 1.2%, and this was charged onto a hydroxyapatite column. Plasmid DN
3.6 μg of A pucia was recovered. The electrophoresis pattern of this plasmid DNA is shown in Figure 2.3.
そして純度を表１に示す。表１から明らかであるように
、プラスミドＤＮＡは純度９８．５％で得られ。The purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, plasmid DNA was obtained with a purity of 98.5%.
宿主ＤＮ＾は１．５％であり、かつＲＮＡは全く検出さ
れなかった。Host DNA^ was 1.5% and no RNA was detected.
遺：ＪｔＬＬ
（ＰＥＧ添加溶菌液からの、 ＤＥ５２を用いたプラス
ミドＤＮＡの精製）
吸着剤としてヒドロキシアパタイトの代わりにイオン交
換セルロースであるＤＢＳ２ （ワットマン製）を用い
たこと、および（Ｂ）−４項におけるカラム溶離液とし
て０．１Ｍトリエチルアミン炭酸緩衝液（ｐＨ８，０）
の代わりにＩＭ ＮａＣ１を用いたこと以外は、実施例
１と同様の操作を行った。プラスミドＤＮＡ ｐ［Ｉｃ
１８を含む核酸が１３．７μｇ回収された。このプラス
ミドＤＮへの電気泳動パターンを第２図４に、そして純
度を表１に示す。表１から明らかであるように。Note: JtLL (Purification of plasmid DNA from PEG-added lysate using DE52) Use of ion-exchange cellulose DBS2 (manufactured by Whatman) instead of hydroxyapatite as an adsorbent, and (B)-4. 0.1M triethylamine carbonate buffer (pH 8,0) as column eluent in
The same operation as in Example 1 was performed except that IM NaCl was used instead of IM NaCl. Plasmid DNA p[Ic
13.7 μg of nucleic acid containing 18 was recovered. The electrophoresis pattern for this plasmid DN is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1.
宿主ＤＮＡの混入は２．０％と低い値であったがＲＮＡ
の混入が６８％と高値であったため、さらにＲＮａｓｅ
処理を行って該ＲＮＡを除去した。この操作により。Although host DNA contamination was as low as 2.0%, RNA
RNase contamination was as high as 68%.
Treatment was performed to remove the RNA. With this operation.
ＲＮ＾が混入していないプラスミドＤＮＡが４．１μｇ
回収された。4.1 μg of plasmid DNA that is not contaminated with RN^
Recovered.
１隻貫工
（ＰＥＧ添加添加ラプラスミド溶液の、 ５ｅｐＰａｋ
−Ｃ１８を用いたプラスミドＤＮＡの精製）
比較例１で得られた。宿主ＤＮＡの混入の多いプラスミ
ドＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ）リス・塩酸−１ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｈ７，５））に溶解させ
て粗プラスミド溶液とし、この溶液に３０％ＰＥＧ ６
０６０を加えてＰＥＧの終濃度を３％とした。この溶液
の２００μ２をＣ−１８逆相シリカゲル充填カラムであ
る５ｅｐＰａｋ−Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）にチャー
ジし、プラスミドＤＮＡを吸着させた。次いで、上記と
同様のＴＥ緩衝液を用いて十分にカラムを洗浄した後、
３０％エタノールにてプラスミドＤＮＡを溶出させた。1 package (5epPak of PEG-added Laplasmid solution)
-Purification of plasmid DNA using C18) Obtained in Comparative Example 1. Plasmid DNA that is heavily contaminated with host DNA is diluted with TE buffer (10mM) and Liss hydrochloric acid (1mM).
M ethylenediaminetetraacetic acid acetic acid H7,5)) to obtain a crude plasmid solution, and to this solution 30% PEG 6
060 was added to give a final PEG concentration of 3%. 200μ2 of this solution was charged to 5epPak-C18 (manufactured by Waters), which is a C-18 reverse phase silica gel packed column, and plasmid DNA was adsorbed. Next, after washing the column thoroughly using the same TE buffer as above,
Plasmid DNA was eluted with 30% ethanol.
このエタノ−ル溶出液を回収し、エタノールを揮発除去
した後、エタノール沈澱によりプラスミドＤＮＡを精製
した。This ethanol eluate was collected, the ethanol was removed by volatilization, and then the plasmid DNA was purified by ethanol precipitation.
この操作によりプラスミドＤＮＡ ｐＵｃ１８が３．２
μｇ得られた。このプラスミドＤＮＡの電気泳動パター
ンを第２図５に、そして純度を表１に示す。表１から明
らかであるように、プラスミドＤＮＡは純度９８％で得
られ、宿主ＤＮＡは２，０％であり、 ＰＥＧを用いた
この操作により、プラスミドＤＮＡが比較例１よりも精
製されたことが示された。By this operation, the plasmid DNA pUc18 was reduced to 3.2
μg was obtained. The electrophoretic pattern of this plasmid DNA is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, the plasmid DNA was obtained with a purity of 98% and the purity of the host DNA was 2.0%, indicating that the plasmid DNA was purified more than in Comparative Example 1 by this operation using PEG. Shown.
上較拠Ｉ
（冑分子量ＰＶＡ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタ
イトを用いたプラスミドＤＮＡの精製）分子量ｉｏｏ、
ｏｏｏのＰνへの代わりに分子量６００．０００のＰＶ
Ａを用いて、実施例３と同様の操作を行った。Reference I (Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from a lysate containing PVA) Molecular weight ioo,
PV of molecular weight 600.000 instead of ooo to Pν
Using A, the same operation as in Example 3 was performed.
使用濃度は実施例３と同じであったが、高分子量のポリ
マーを用いると溶液の粘度が上昇し、カラム操作中にカ
ラム充填剤が目詰まりして圧力が上昇した。そのため、
カラム処理時間が長くかかり。The concentration used was the same as in Example 3, but the use of a high molecular weight polymer increased the viscosity of the solution, which caused clogging of the column packing material and increased pressure during column operation. Therefore,
Column processing takes a long time.
取り扱いが非常に難しかった。プラスミドＤＮＡ ｐｕ
ｃｉｓの収量は１．８μｇであり、実施例３に比べて約
半分の量しか回収されなかった。このプラスミドＤＮＡ
の電気泳動パターンを第２図７に、そして純度を表１に
示す。表１から明らかなように、高分子量の水溶性ポリ
マーを用いるとプラスミドＤＮＡの収率がよくないうえ
、宿主ＤＮＡが８％混入していた。It was very difficult to handle. plasmid DNA pu
The yield of cis was 1.8 μg, which was only about half the amount recovered in Example 3. This plasmid DNA
The electrophoretic pattern is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, when a high molecular weight water-soluble polymer was used, the yield of plasmid DNA was not good, and 8% of host DNA was contaminated.
ル較拠主
（高濃度ＰＥＧ添加溶菌液からの、ヒドロキシアパタイ
トを用いたプラスミドＤＮＡの精製）３０％ＰＩＥＧ
６０００水溶液６０μｌを用いる代わりに。(Purification of plasmid DNA using hydroxyapatite from a lysate containing high concentration of PEG) 30% PIEG
Instead of using 60 μl of 6000 aqueous solution.
５０％ＰＥ６６０００水溶液４５０μ！を用いて実施例
１と同様の操作を行った。（八）項の操作により溶液中
のＰＥＧ終濃度は２５％となり、これをヒドロキシアパ
タイトカラムにチャージした。高濃度のＰＥＧを用いる
と、比較例２の場合と同様に溶液の粘度が上昇したため
、カラム処理時間が長くかかり、取り扱いが非常に難し
かった。プラスミドＤＮＡ ｐＬｌｃ１８の収量は２．
１ μｇであった。このプラスミドＤＮＡの電気泳動パ
ターンを第２図８に、そして純度を表１に示す。表１か
ら明らかなように、高濃度の水溶性ポリマーを用いると
ＲＮＡの混入はなかったが、宿主ＤＮＡが７％混入して
いた。50% PE66000 aqueous solution 450μ! The same operation as in Example 1 was performed using . The final concentration of PEG in the solution was made 25% by the operation in item (8), and this was charged onto a hydroxyapatite column. When a high concentration of PEG was used, the viscosity of the solution increased as in Comparative Example 2, so the column processing time was long and handling was extremely difficult. The yield of plasmid DNA pLlc18 is 2.
It was 1 μg. The electrophoretic pattern of this plasmid DNA is shown in FIG. 2, and the purity is shown in Table 1. As is clear from Table 1, when a high concentration water-soluble polymer was used, no RNA was contaminated, but 7% of host DNA was contaminated.
表１
（発明の効果）
本発明方法によれば、このように、菌体溶菌液からプラ
スミドＤＮＡ 、 ファージＤＮＡなどのＤＮＡを短
時間のうちに高純度・高収率で、かつ煩雑な操作を必要
とすることなく単離・精製することができる。本法を用
いてプラスミドＤＮＡ 、 ファージＤＮＡなどのＤＮ
Ａの単離・精製の自動化が可能となる。Table 1 (Effects of the Invention) According to the method of the present invention, DNA such as plasmid DNA and phage DNA can be obtained from a bacterial cell lysate in a short period of time with high purity and high yield, and without complicated operations. It can be isolated and purified without the need for it. Using this method, DNA such as plasmid DNA and phage DNA can be
It becomes possible to automate the isolation and purification of A.
このような方法は、 ＤＮＡの配列決定、 ［ｌＮＡ
の構築など遺伝子工学の各分野で広く利用され得る。Such methods include DNA sequencing, [lNA
It can be widely used in various fields of genetic engineering, such as the construction of.
土−区皿図証単星脱班
第１図は１本発明方法によりヒドロキシアパタイトカラ
ムを用いてＰＥＧ添加溶菌液からのプラスミドＤＮＡの
単離・精製を行ったときの溶出液の紫外線吸収をモニタ
ーした結果、およびＤＮＡの指標として加えられた３Ｈ
放射活性をモニターした結果を示すグラフ；そして第２
図は２本発明方法および他の方法により得られる精製Ｄ
ＮＡの電気泳動パターンである。Figure 1: Monitoring the ultraviolet absorption of the eluate when plasmid DNA was isolated and purified from the PEG-added lysate using a hydroxyapatite column according to the method of the present invention. The results and 3H added as an indicator of DNA
a graph showing the results of monitoring radioactivity; and a second
The figure shows two purified D obtained by the method of the present invention and another method.
This is an electrophoresis pattern of NA.
以上that's all
Claims (1)
溶性ポリマーとを、水溶性ポリマーの終濃度が０．０１
〜２０重量％となるように含む水溶性ポリマー含有溶菌
液を調製する工程； 該溶菌液を吸着剤と接触させて、該溶菌液中のＤＮＡを
該吸着剤に吸着・担持させる工程；および該ＤＮＡを吸
着・担持する吸着剤に該吸着剤と強い相互作用を有する
溶離液を接触させて、該ＤＮＡを溶出させる工程； を包含するＤＮＡの精製方法。[Scope of Claims] 1. Lysed bacterial cells and a water-soluble polymer having a molecular weight of 1,000 to 500,000 are combined in a manner that the final concentration of the water-soluble polymer is 0.01.
A step of preparing a lysis solution containing a water-soluble polymer in an amount of ~20% by weight; a step of bringing the lysis solution into contact with an adsorbent to adsorb and carry the DNA in the lysis solution on the adsorbent; A method for purifying DNA, comprising: contacting an adsorbent that adsorbs and supports DNA with an eluent that has a strong interaction with the adsorbent to elute the DNA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13531488A JPH01304886A (en) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | Method for purifying dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13531488A JPH01304886A (en) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | Method for purifying dna |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304886A true JPH01304886A (en) | 1989-12-08 |
Family
ID=15148842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13531488A Pending JPH01304886A (en) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | Method for purifying dna |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01304886A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5707812A (en) * | 1996-08-06 | 1998-01-13 | Vical Incorporated | Purification of plasmid DNA during column chromatography |
-
1988
- 1988-05-31 JP JP13531488A patent/JPH01304886A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5707812A (en) * | 1996-08-06 | 1998-01-13 | Vical Incorporated | Purification of plasmid DNA during column chromatography |
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