JP3195039B2 - 核酸のアニオン−交換分離の精度及び正確度の改良 - Google Patents
核酸のアニオン−交換分離の精度及び正確度の改良Info
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Description
【0001】発明の分野 本発明は核酸フラグメントのアニオン交換分離のための
新規溶媒に関する。これらの溶媒は、分子生物学、分析
生化学、臨床化学、産業的及び環境的微生物学及び分子
遺伝学における核酸の分析のためのクロマトグラフィー
方法の著しい改良をもたらす。
新規溶媒に関する。これらの溶媒は、分子生物学、分析
生化学、臨床化学、産業的及び環境的微生物学及び分子
遺伝学における核酸の分析のためのクロマトグラフィー
方法の著しい改良をもたらす。
【0002】関連する技術の記載 一本鎖DNAはホスホジエステル結合を通して共有結合
されるデオキシリボ−ホスフェートモノマーの鎖から成
り、そしてまた、個々のデオキシリボ環に共有結合され
る1つの芳香族複素環式“塩基”を含む。約2以上のpH
の水性溶媒においては、ひじょうに親水性の糖−ホスフ
ェートポリマー主鎖が、個々のホスホジエステルのため
の1つの負の電荷及びあらゆる末端ホスホモノエステル
のための1又は2つの負の電荷に寄与する。従って、D
NAはポリアニオンであり;正味の負の電荷は好ましく
は、鎖の長さに比例する。しかしながら、塩基はひじょ
うに疎水性であり、その結果、一本鎖は混合された親水
性−疎水性性質を有する。一本鎖DNAは、一定に及び
急速に変動し、そして時間−平均化された球形状を有す
るランダム−コイル形状を採用する。球体内で、ランダ
ム疎水性芳香族炭化水素積み重ね相互作用及び塩基対水
素結合は、鎖の種々の部分を一緒に結合せしめ、そして
ホスフェート基の静電反発作用が構造体の種々の部分を
別々に駆動せしめる傾向がある。これらの反対の傾向性
間のバランス及び従って平均の球体直径は、温度及び溶
媒組成、特にイオン強度に依存する。
されるデオキシリボ−ホスフェートモノマーの鎖から成
り、そしてまた、個々のデオキシリボ環に共有結合され
る1つの芳香族複素環式“塩基”を含む。約2以上のpH
の水性溶媒においては、ひじょうに親水性の糖−ホスフ
ェートポリマー主鎖が、個々のホスホジエステルのため
の1つの負の電荷及びあらゆる末端ホスホモノエステル
のための1又は2つの負の電荷に寄与する。従って、D
NAはポリアニオンであり;正味の負の電荷は好ましく
は、鎖の長さに比例する。しかしながら、塩基はひじょ
うに疎水性であり、その結果、一本鎖は混合された親水
性−疎水性性質を有する。一本鎖DNAは、一定に及び
急速に変動し、そして時間−平均化された球形状を有す
るランダム−コイル形状を採用する。球体内で、ランダ
ム疎水性芳香族炭化水素積み重ね相互作用及び塩基対水
素結合は、鎖の種々の部分を一緒に結合せしめ、そして
ホスフェート基の静電反発作用が構造体の種々の部分を
別々に駆動せしめる傾向がある。これらの反対の傾向性
間のバランス及び従って平均の球体直径は、温度及び溶
媒組成、特にイオン強度に依存する。
【0003】ほとんどの天然に存在するDNAは、二重
螺旋鎖を形成するために非共有的に相互作用する類似す
る又は同一の長さの2本の一本鎖から成る二本鎖であ
り、ここで4種の通常存在する塩基、アデニン(A)、
チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)は、
1つの鎖上の個々のAが他の鎖上のTに水素結合され
(逆もまた同様である)、そして1つの鎖上の個々のG
が他の鎖上のCに水素結合され(逆もまた同様である)
るように2種の相互作用する鎖上で、相補的配列で存在
する。この塩基対構造は、その軸にそって二重螺旋鎖内
に疎水性基を融離し、そして溶媒から分離し;2重螺旋
鎖の糖−ホスフェート鎖が二本鎖構造の外部で螺旋状に
降下し、溶媒に対する親水性ポリアニオン性面を示す。
異なった幅の2種の螺旋状溝、すなわち“主要”及び
“副”が、2種の糖−ホスフェート鎖を分離する。それ
らの溝は、水分子及び溶媒カチオンを結合するのに十分
に大きい。二重螺旋鎖構造はまた、数百以下の塩基対の
セグメントが球状に柔軟に渦巻くよりもむしろ効果的に
硬質で且つ線状であるように、二本鎖DNAを硬化す
る。数百〜数千の塩基対の長さの規模に基づけば、二本
鎖DNAはまた渦巻きにされるが、しかし一本鎖DNA
よりもゆるい。最近、二本鎖DNAにおける一定の配列
が二重螺旋鎖において湾曲性を誘発し、その結果、10
〜100個の塩基対の長さの規模に基づいては、もはや
線状でないことが明確になった(Hagerman,1
990,Annual Reviews of Bio
chemistry 59:755〜781を参照のこ
と)。
螺旋鎖を形成するために非共有的に相互作用する類似す
る又は同一の長さの2本の一本鎖から成る二本鎖であ
り、ここで4種の通常存在する塩基、アデニン(A)、
チミン(T)、グアニン(G)及びシトシン(C)は、
1つの鎖上の個々のAが他の鎖上のTに水素結合され
(逆もまた同様である)、そして1つの鎖上の個々のG
が他の鎖上のCに水素結合され(逆もまた同様である)
るように2種の相互作用する鎖上で、相補的配列で存在
する。この塩基対構造は、その軸にそって二重螺旋鎖内
に疎水性基を融離し、そして溶媒から分離し;2重螺旋
鎖の糖−ホスフェート鎖が二本鎖構造の外部で螺旋状に
降下し、溶媒に対する親水性ポリアニオン性面を示す。
異なった幅の2種の螺旋状溝、すなわち“主要”及び
“副”が、2種の糖−ホスフェート鎖を分離する。それ
らの溝は、水分子及び溶媒カチオンを結合するのに十分
に大きい。二重螺旋鎖構造はまた、数百以下の塩基対の
セグメントが球状に柔軟に渦巻くよりもむしろ効果的に
硬質で且つ線状であるように、二本鎖DNAを硬化す
る。数百〜数千の塩基対の長さの規模に基づけば、二本
鎖DNAはまた渦巻きにされるが、しかし一本鎖DNA
よりもゆるい。最近、二本鎖DNAにおける一定の配列
が二重螺旋鎖において湾曲性を誘発し、その結果、10
〜100個の塩基対の長さの規模に基づいては、もはや
線状でないことが明確になった(Hagerman,1
990,Annual Reviews of Bio
chemistry 59:755〜781を参照のこ
と)。
【0004】二本鎖DNAは、約50〜100℃の範囲
の温度に加熱することによって、一本鎖DNAの2つの
鎖を得るために、可逆的に“溶融”され得る。G−C塩
基対は、A−T塩基対よりも高い温度で溶融する傾向が
ある。なぜならば、それらの塩基対の相互作用が強いか
らである。溶媒組成物はまた、二重螺旋鎖の安定性に影
響を及ぼし;有機補助溶媒の添加又は水性溶媒における
塩濃度の低下は、塩基組成に関係なく、いづれかのDN
AのTm(DNAの半分が一本鎖に解離する温度)を下
げる。
の温度に加熱することによって、一本鎖DNAの2つの
鎖を得るために、可逆的に“溶融”され得る。G−C塩
基対は、A−T塩基対よりも高い温度で溶融する傾向が
ある。なぜならば、それらの塩基対の相互作用が強いか
らである。溶媒組成物はまた、二重螺旋鎖の安定性に影
響を及ぼし;有機補助溶媒の添加又は水性溶媒における
塩濃度の低下は、塩基組成に関係なく、いづれかのDN
AのTm(DNAの半分が一本鎖に解離する温度)を下
げる。
【0005】RNA構造は類似するが、しかしDNA構
造よりも複雑である。その一本鎖はDNA一本鎖にほと
んど同一であり、リボースによるデオキシリボースの置
換及びアデニンに対して塩基対でもあり得るウラシルに
よるチミンの置換において異なる。しかしながら、一本
鎖は、隣接する塩基配列は相補的であるので、しばしば
比較的短い自己対合二本鎖領域を含むけれども、二本鎖
RNAはまれである。RNAはDNAと同じポリアニオ
ン性質を有するが、しかし多数の一本鎖領域がそれを疎
水性にし、そして一本鎖及び二本鎖領域の混合物が、一
本鎖及び二本鎖DNAに見られる形状の規則性(球状又
は線状)を破壊する。
造よりも複雑である。その一本鎖はDNA一本鎖にほと
んど同一であり、リボースによるデオキシリボースの置
換及びアデニンに対して塩基対でもあり得るウラシルに
よるチミンの置換において異なる。しかしながら、一本
鎖は、隣接する塩基配列は相補的であるので、しばしば
比較的短い自己対合二本鎖領域を含むけれども、二本鎖
RNAはまれである。RNAはDNAと同じポリアニオ
ン性質を有するが、しかし多数の一本鎖領域がそれを疎
水性にし、そして一本鎖及び二本鎖領域の混合物が、一
本鎖及び二本鎖DNAに見られる形状の規則性(球状又
は線状)を破壊する。
【0006】種々のDNA分子を分離するための最っと
も通常の方法は、予備又は分析目的のためのいずれにせ
よ、厳密な長さ依存性ポリアニオン性質及び一本鎖及び
二本鎖の両構造の相当の形状規則性及び柔軟性を利用す
る。ほとんどの電気泳動性及びクロマトグラフィー性D
NA分離はポリマーの正味の電荷に直接的に又は間接的
に依存するが、電荷とポリマーの長さとの間の類似する
比例関係が、分離軸にそっての異なったDNA種の置換
においてサイズ−依存性差異をもたらす(ゲル電気泳動
においては距離として、細管電気泳動においては時間と
して及びクロマトグラフィーにおいては時間又は体積と
して通常表わされる)。大きな分子はよりゆっくり移動
し、そして従って、ゲルが荷電された溶質分子上に粘性
抵抗を及ぼすための節として作用するので、与えられた
電気泳動分離においてより短い距離を移動し;この抵抗
力は溶質と共に直接変化する。DNAのほとんどのクロ
マトグラフィー性分離は、グラジエント溶離を必要とし
て、ここで溶媒における溶離用溶質は、溶離の時間及び
連続して流れる溶媒の体積と共に組織的及び通常、連続
的に高められ;大きな分子は小さな分子よりもクロマト
グラフィー用樹脂により強く結合され;そして従って、
樹脂から置換されるべきクロマトグラフィー用溶離溶質
の高い濃度を必要とする。理想的な分離条件下で、電気
泳動移動速度及び距離又はクロマトグラフィー溶離時間
及び体積はDNA分子サイズに単調に依存し、そしてサ
イズに従って、特定のDNAフラグメントを同定するた
めに使用され得る。十分に最適化された分離において
は、電気泳動置換又はクロマトグラフィー溶離時間は、
分子サイズの対数の線状関数である。
も通常の方法は、予備又は分析目的のためのいずれにせ
よ、厳密な長さ依存性ポリアニオン性質及び一本鎖及び
二本鎖の両構造の相当の形状規則性及び柔軟性を利用す
る。ほとんどの電気泳動性及びクロマトグラフィー性D
NA分離はポリマーの正味の電荷に直接的に又は間接的
に依存するが、電荷とポリマーの長さとの間の類似する
比例関係が、分離軸にそっての異なったDNA種の置換
においてサイズ−依存性差異をもたらす(ゲル電気泳動
においては距離として、細管電気泳動においては時間と
して及びクロマトグラフィーにおいては時間又は体積と
して通常表わされる)。大きな分子はよりゆっくり移動
し、そして従って、ゲルが荷電された溶質分子上に粘性
抵抗を及ぼすための節として作用するので、与えられた
電気泳動分離においてより短い距離を移動し;この抵抗
力は溶質と共に直接変化する。DNAのほとんどのクロ
マトグラフィー性分離は、グラジエント溶離を必要とし
て、ここで溶媒における溶離用溶質は、溶離の時間及び
連続して流れる溶媒の体積と共に組織的及び通常、連続
的に高められ;大きな分子は小さな分子よりもクロマト
グラフィー用樹脂により強く結合され;そして従って、
樹脂から置換されるべきクロマトグラフィー用溶離溶質
の高い濃度を必要とする。理想的な分離条件下で、電気
泳動移動速度及び距離又はクロマトグラフィー溶離時間
及び体積はDNA分子サイズに単調に依存し、そしてサ
イズに従って、特定のDNAフラグメントを同定するた
めに使用され得る。十分に最適化された分離において
は、電気泳動置換又はクロマトグラフィー溶離時間は、
分子サイズの対数の線状関数である。
【0007】サイズ依存性核酸分離の同定値は、4種の
性能特性、すなわちサイズ範囲、サイズ分解能、移動の
精度及びサイズの正確さに依存する。数回の分離が、分
子サイズの大きさの1以上の広範なオーダーに対して線
状の対数サイズ検量線を与える。多くの分析物システム
は、サイズの大きさのいくつかのオーダーにわたっての
範囲のDNA種を包含するので、いくつかの異なった電
気泳動ゲル(例えば種々のゲル密度を用いる)又はクロ
マトグラフィー溶離が、前記システムを十分に特徴づけ
るために行なわれるべきである。サイズ分解能は、DN
Aの長さのいかに小さな差異が区別できる電気泳動バン
ド又はクロマトグラフィーピークをもたらすかに関し;
高い分解システムは通常、最っとも狭いサイズ範囲に近
づく。移動の精度は、DNA同定のために最っとも重要
な性能基準である。特定のフラグメントがいかに再現的
に一定の距離を移動し又は与えられた時間で溶離するか
が、フラグメントが特定のサイズを有し、そして完全に
異なった種でない信頼性を絶対的に決定する。電気泳動
及びクロマトグラフィー両分離の精度限界は、標準が分
析物のバンド又はピークを妨害しないことを注意しなが
ら、隣接するゲルレーンにおける外部分子サイズ標準を
時々流すことによって、又はサンプルと共に内部分子サ
イズ標準を流すことによって減じられる。分子サイズ精
度は、いかに正確に分析物種が移動距離又は溶離時間対
分子サイズ(又はその対数)の滑らかな検量線に陥るか
を言及する。大部分のサイズ標準又は分析物分子のため
の一致する検量線を遠ざかる種は、誤った分子サイズ値
を付与し、但し、それらは、分離例外が既知のサンプル
により正確に特徴づけられている限り、試験サンプルに
おいて正しく且つ正確に同定され得る。サイズ誤差の主
な危険性は、研究及び発見活動の間、新規分析物の誤っ
た特徴化である。
性能特性、すなわちサイズ範囲、サイズ分解能、移動の
精度及びサイズの正確さに依存する。数回の分離が、分
子サイズの大きさの1以上の広範なオーダーに対して線
状の対数サイズ検量線を与える。多くの分析物システム
は、サイズの大きさのいくつかのオーダーにわたっての
範囲のDNA種を包含するので、いくつかの異なった電
気泳動ゲル(例えば種々のゲル密度を用いる)又はクロ
マトグラフィー溶離が、前記システムを十分に特徴づけ
るために行なわれるべきである。サイズ分解能は、DN
Aの長さのいかに小さな差異が区別できる電気泳動バン
ド又はクロマトグラフィーピークをもたらすかに関し;
高い分解システムは通常、最っとも狭いサイズ範囲に近
づく。移動の精度は、DNA同定のために最っとも重要
な性能基準である。特定のフラグメントがいかに再現的
に一定の距離を移動し又は与えられた時間で溶離するか
が、フラグメントが特定のサイズを有し、そして完全に
異なった種でない信頼性を絶対的に決定する。電気泳動
及びクロマトグラフィー両分離の精度限界は、標準が分
析物のバンド又はピークを妨害しないことを注意しなが
ら、隣接するゲルレーンにおける外部分子サイズ標準を
時々流すことによって、又はサンプルと共に内部分子サ
イズ標準を流すことによって減じられる。分子サイズ精
度は、いかに正確に分析物種が移動距離又は溶離時間対
分子サイズ(又はその対数)の滑らかな検量線に陥るか
を言及する。大部分のサイズ標準又は分析物分子のため
の一致する検量線を遠ざかる種は、誤った分子サイズ値
を付与し、但し、それらは、分離例外が既知のサンプル
により正確に特徴づけられている限り、試験サンプルに
おいて正しく且つ正確に同定され得る。サイズ誤差の主
な危険性は、研究及び発見活動の間、新規分析物の誤っ
た特徴化である。
【0008】分離方法の全体の価値は、サイズ情報の質
の他に他の手段における性能に依存する。他の重要な分
析性質は、分析物定量化(精密度、精度、力学的範囲及
び検出限界)、分離された種の回収の容易性(後−分離
研究、たとえばDNA配列決定のための)、信頼性(妨
害、装置又は試薬の機能不全及び操作者の誤りを包含し
ない)、速度(サンプル当たりの時間)、処理量(時
間、日又は週当たりのサンプル)及び費用(装置、試薬
及び労力、たとえば労力の量及び質における)を包含す
る。
の他に他の手段における性能に依存する。他の重要な分
析性質は、分析物定量化(精密度、精度、力学的範囲及
び検出限界)、分離された種の回収の容易性(後−分離
研究、たとえばDNA配列決定のための)、信頼性(妨
害、装置又は試薬の機能不全及び操作者の誤りを包含し
ない)、速度(サンプル当たりの時間)、処理量(時
間、日又は週当たりのサンプル)及び費用(装置、試薬
及び労力、たとえば労力の量及び質における)を包含す
る。
【0009】最近、ゲル電気泳動は、サイズ依存性核酸
分離のために標準の方法になって来た。2種のゲルマト
リックスが通常使用される。すなわち容易に使用される
が、しかし低いサイズ分解能を与えるアガロース及び使
用するのに難かしく且つより危険性を伴うが、しかし特
に一本鎖DNAのための単一のヌクレオチドの差異を解
決する最大の可能な実施(十分に長いゲルにおいて)ま
で最良のサイズ分解能を与えるポリアクリルアミド。与
えられたゲル密度は、実際のDNAサイズ範囲の大きさ
の約1つよりも多くないオーダーを提供する。サイズ精
度はまれに測定され又は予測され;ゲル又は電場の非均
質性がしばしば、スラブゲルにおける複数のレーン間に
又は単一のレーン内に矛盾する移動をもたらす。種は一
般的に、他の種に対するおおよその移動性により同定さ
れ;そして絶対的な分析物の同定は、分離された種が既
知の配列のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに
対して相補的な塩基配列を含む場合にのみ正のシグナル
を付与する、核酸プロービング、最っとも通常にはドッ
トブロット又はサザン分析に基づかれる。ブロットする
ことによる同定は一般的に遅く、集中的な労力を要し、
そして比較的信頼ができず、そしてしばしば、分析用シ
グナルが通常、プローブルに基づいての放射性タッグに
より創造されるので危険である。
分離のために標準の方法になって来た。2種のゲルマト
リックスが通常使用される。すなわち容易に使用される
が、しかし低いサイズ分解能を与えるアガロース及び使
用するのに難かしく且つより危険性を伴うが、しかし特
に一本鎖DNAのための単一のヌクレオチドの差異を解
決する最大の可能な実施(十分に長いゲルにおいて)ま
で最良のサイズ分解能を与えるポリアクリルアミド。与
えられたゲル密度は、実際のDNAサイズ範囲の大きさ
の約1つよりも多くないオーダーを提供する。サイズ精
度はまれに測定され又は予測され;ゲル又は電場の非均
質性がしばしば、スラブゲルにおける複数のレーン間に
又は単一のレーン内に矛盾する移動をもたらす。種は一
般的に、他の種に対するおおよその移動性により同定さ
れ;そして絶対的な分析物の同定は、分離された種が既
知の配列のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに
対して相補的な塩基配列を含む場合にのみ正のシグナル
を付与する、核酸プロービング、最っとも通常にはドッ
トブロット又はサザン分析に基づかれる。ブロットする
ことによる同定は一般的に遅く、集中的な労力を要し、
そして比較的信頼ができず、そしてしばしば、分析用シ
グナルが通常、プローブルに基づいての放射性タッグに
より創造されるので危険である。
【0010】ゲル電気泳動は、二本鎖DNAのサイズ精
度に関しては信頼できない。なぜならば上記の分子曲率
は、分子が実際の2倍であることを十分に暗示するため
に電気泳動性移動を遅くするからである(Koo an
d Crothers,1988,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 85;1763〜17
67;Hagerman,1985,Biochemi
stry 24:7033〜7037;及びShore
など.,1981,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 78:4833〜4837)。ゲル電気
泳動は、他の性能限界を有する。バンドは最っとも通常
には、エチジウムによる染色により可視化され、ここで
前記エチジウムは、それが二本鎖(但し一本鎖ではな
い)DNAに結合する場合、強い螢光増強性を示す。そ
のような染色は、エチジウムが発癌性物質であるので危
険性を伴い;それは一本鎖DNAに対してひじょうに鈍
感であり;可逆性染料結合反応が実験条件に対してひじ
ょうに敏感であり、そして螢光が注意した検定を要する
ので、それは電気泳動により分離された種を定量化する
ために信頼できない。ゲル電気泳動は集中的な労力を要
し、そして操作者の変動性又は誤差を受けやすい。それ
は比較的遅いが(染色又は他の後−電気泳動検出を包含
する1回の操作当たり少なくとも数時間を要する)、し
かし数10種のサンプルが同時に操作され得るので、許
容できる処理量を加する。ゲルからの分離された種の回
収は遅く、且つ集中的な労力を要する。
度に関しては信頼できない。なぜならば上記の分子曲率
は、分子が実際の2倍であることを十分に暗示するため
に電気泳動性移動を遅くするからである(Koo an
d Crothers,1988,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 85;1763〜17
67;Hagerman,1985,Biochemi
stry 24:7033〜7037;及びShore
など.,1981,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 78:4833〜4837)。ゲル電気
泳動は、他の性能限界を有する。バンドは最っとも通常
には、エチジウムによる染色により可視化され、ここで
前記エチジウムは、それが二本鎖(但し一本鎖ではな
い)DNAに結合する場合、強い螢光増強性を示す。そ
のような染色は、エチジウムが発癌性物質であるので危
険性を伴い;それは一本鎖DNAに対してひじょうに鈍
感であり;可逆性染料結合反応が実験条件に対してひじ
ょうに敏感であり、そして螢光が注意した検定を要する
ので、それは電気泳動により分離された種を定量化する
ために信頼できない。ゲル電気泳動は集中的な労力を要
し、そして操作者の変動性又は誤差を受けやすい。それ
は比較的遅いが(染色又は他の後−電気泳動検出を包含
する1回の操作当たり少なくとも数時間を要する)、し
かし数10種のサンプルが同時に操作され得るので、許
容できる処理量を加する。ゲルからの分離された種の回
収は遅く、且つ集中的な労力を要する。
【0011】細管電気泳動が最近、少量(質量単位で)
のDNAに対してひじょうに敏感である早く、高い分解
性のサイズ依存性DNA分離を提供するように開発され
て来た。しかしながら、サイズ精度は良好でなく;個々
の種の定量化は難かしく且つ鈍感であり(DNA質量よ
りも、分子生物学者及び臨床化学者にとってより重要で
あるDNA濃度に関して;DNAは通常、多量に得られ
るが、しかししばしば比較的低い濃度である);有用な
量での分離された種の回収は、個々の分離において処理
されたDNAの質量がひじょうに少量であるので困難で
ある。
のDNAに対してひじょうに敏感である早く、高い分解
性のサイズ依存性DNA分離を提供するように開発され
て来た。しかしながら、サイズ精度は良好でなく;個々
の種の定量化は難かしく且つ鈍感であり(DNA質量よ
りも、分子生物学者及び臨床化学者にとってより重要で
あるDNA濃度に関して;DNAは通常、多量に得られ
るが、しかししばしば比較的低い濃度である);有用な
量での分離された種の回収は、個々の分離において処理
されたDNAの質量がひじょうに少量であるので困難で
ある。
【0012】液体クロマトグラフィー及び特に高圧液体
クロマトグラフィー(HPLC)は、DNA分離方法と
してさらに開発されたものである(Thompson,
1986,Biochromatography 1:
16〜20,22〜32及び68〜80;1987,B
iochromatography 2:4〜18を参
照のこと)。その分離化学は、分離圧力に無関係であ
り;後者の変数は、クロマトグラフィーマトリックスの
粒度及び分離のために必要とされる時間に逆比例して変
化する。大きな粒子吸着剤上で大気圧下で行なわれる場
合、多くの時間と数百mlの溶媒を必要とする分離は、2
〜10μmの直径の粒子上で5〜10気圧下で溶媒3〜
30mlを消費して3〜30分で完結され得る。定量的感
度は、分離体積に反比例し、そしてHPLCは、労力の
質又は量に対する要求を少なくするひじょうに自動化さ
れた方法である。液体クロマトグラフィーは通常、26
0nm近くの最大吸光度(λmax)の波長でその高い紫
外線(UV)吸光度を通してDNAを検出する。HPL
Cは、単一のコンピューター調節された装置が、その分
離を行ない、溶出時間の関数として溶離された吸光度を
測定し、個々のピーク(異なったDNA種に対応する)
における吸光度を定量化するためにその得られた溶離プ
ロフィールを分析し、溶離時間及び均等(コンピュータ
ーに貯蔵される検量線への比較により)の分子サイズに
関して個々のピークを同定し、そして追加の分析のため
に別々の容器における個々のピークを収集できるように
自動化される。HPLC UV吸光度検出器の高い感度
は、クロマトグラフィー用溶媒の0.1ml以下に約1/
1010gの核酸を含む、1/104 吸光度単位よりも高
くないピークの信頼できる定量化を与える。分光光度的
にモニターされたHPLCは、エチジウム染色されたゲ
ル電気泳動よりも、二本鎖DNAのために低いDNA検
出限界を有する。約1単位までの吸光度を測定するHP
LC UV吸光度検出器の広い力学的範囲は、螢光測定
の検量困難性を伴わないで、4オーダー以上の濃度の大
きさの範囲のDNAのHPLCによる定量化を可能にす
る。
クロマトグラフィー(HPLC)は、DNA分離方法と
してさらに開発されたものである(Thompson,
1986,Biochromatography 1:
16〜20,22〜32及び68〜80;1987,B
iochromatography 2:4〜18を参
照のこと)。その分離化学は、分離圧力に無関係であ
り;後者の変数は、クロマトグラフィーマトリックスの
粒度及び分離のために必要とされる時間に逆比例して変
化する。大きな粒子吸着剤上で大気圧下で行なわれる場
合、多くの時間と数百mlの溶媒を必要とする分離は、2
〜10μmの直径の粒子上で5〜10気圧下で溶媒3〜
30mlを消費して3〜30分で完結され得る。定量的感
度は、分離体積に反比例し、そしてHPLCは、労力の
質又は量に対する要求を少なくするひじょうに自動化さ
れた方法である。液体クロマトグラフィーは通常、26
0nm近くの最大吸光度(λmax)の波長でその高い紫
外線(UV)吸光度を通してDNAを検出する。HPL
Cは、単一のコンピューター調節された装置が、その分
離を行ない、溶出時間の関数として溶離された吸光度を
測定し、個々のピーク(異なったDNA種に対応する)
における吸光度を定量化するためにその得られた溶離プ
ロフィールを分析し、溶離時間及び均等(コンピュータ
ーに貯蔵される検量線への比較により)の分子サイズに
関して個々のピークを同定し、そして追加の分析のため
に別々の容器における個々のピークを収集できるように
自動化される。HPLC UV吸光度検出器の高い感度
は、クロマトグラフィー用溶媒の0.1ml以下に約1/
1010gの核酸を含む、1/104 吸光度単位よりも高
くないピークの信頼できる定量化を与える。分光光度的
にモニターされたHPLCは、エチジウム染色されたゲ
ル電気泳動よりも、二本鎖DNAのために低いDNA検
出限界を有する。約1単位までの吸光度を測定するHP
LC UV吸光度検出器の広い力学的範囲は、螢光測定
の検量困難性を伴わないで、4オーダー以上の濃度の大
きさの範囲のDNAのHPLCによる定量化を可能にす
る。
【0013】2種の主な液体クロマトグラフィー分離化
学、すなわちアニオン交換及びイオン対逆相がDNAの
ために使用される。アニオン交換においては、固体クロ
マトグラフィーマトリックスは、DNAの長さに直接関
連する強度でDNAポリアニオンを結合する多くの固定
された正の電荷をその表面上に含む。溶離塩の濃度は、
溶離時間及び密に充填されたマトリックスの円柱カラム
を通過する溶媒の量により通常連続して高められるの
で、DNAフラグメントは、溶解された塩がマトリック
スへのポリアニオンの結合を弱くするので、上昇するサ
イズのおおよそのオーダーで溶離される。イオン対逆相
分離においては、固体クロマトグラフィーマトリックス
は、その表面上に多くの固定された疎水性基を含み、そ
して溶媒は疎水性テトラアルキルアンモニウム又はトリ
アルキルアンモニウムクロリド、ブロミド又はアセテー
ト塩を含む。アルキルアンモニウムカチオンは、DNA
ポリアニオンに弱く結合し、それを電気的に中性及び疎
水性にし、そして疎水性DNA−アルキルアンモニウム
複合体は疎水性マトリックスに結合する。水性溶媒にお
ける低い極性有機補助溶媒の濃度は溶離時間にわたって
通常連続的に高められるので、DNAとマトリックスと
の間の疎水性相互作用は弱くされる。より長いDNA分
子は小さな分子よりもより強くマトリックスに結合し、
その結果、溶離オーダーは再びおおよそ、分子サイズに
平行し;大きなDNA分子は、溶離されるべき高い有機
補助溶媒濃度を必要とする。
学、すなわちアニオン交換及びイオン対逆相がDNAの
ために使用される。アニオン交換においては、固体クロ
マトグラフィーマトリックスは、DNAの長さに直接関
連する強度でDNAポリアニオンを結合する多くの固定
された正の電荷をその表面上に含む。溶離塩の濃度は、
溶離時間及び密に充填されたマトリックスの円柱カラム
を通過する溶媒の量により通常連続して高められるの
で、DNAフラグメントは、溶解された塩がマトリック
スへのポリアニオンの結合を弱くするので、上昇するサ
イズのおおよそのオーダーで溶離される。イオン対逆相
分離においては、固体クロマトグラフィーマトリックス
は、その表面上に多くの固定された疎水性基を含み、そ
して溶媒は疎水性テトラアルキルアンモニウム又はトリ
アルキルアンモニウムクロリド、ブロミド又はアセテー
ト塩を含む。アルキルアンモニウムカチオンは、DNA
ポリアニオンに弱く結合し、それを電気的に中性及び疎
水性にし、そして疎水性DNA−アルキルアンモニウム
複合体は疎水性マトリックスに結合する。水性溶媒にお
ける低い極性有機補助溶媒の濃度は溶離時間にわたって
通常連続的に高められるので、DNAとマトリックスと
の間の疎水性相互作用は弱くされる。より長いDNA分
子は小さな分子よりもより強くマトリックスに結合し、
その結果、溶離オーダーは再びおおよそ、分子サイズに
平行し;大きなDNA分子は、溶離されるべき高い有機
補助溶媒濃度を必要とする。
【0014】信頼でき、経済的で、感受性のDNAの定
量分析法としてのHPLCの前記利点にもかかわらず、
分離化学はサイズ分解能、範囲、精度又は正確さの点で
最適でない。イオン対逆相分離は遅く(数時間を要す
る)、しばしば溶離されたフラグメントの比較的低い回
収をもたらし、そしてサイズ−正確同定のためのそれら
の値を危険にさらす、分子サイズの関数としての保持時
間の時々の逆転を与える(Eriksonなど.,19
86,J.Chromatog.359:265〜27
4)。これらの分離のために使用される水性溶媒は、比
較的低い(1/103 〜1/10M)濃度のトリアルキ
ルアンモニウム(たとえばトリエチルアンモニウム)又
はテトラアルキルアンモニウム(たとえばテトラブチル
アンモニウム)塩を含み、そして5〜50%の範囲にわ
たって溶離有機補助触媒、たとえばアセトニトリルの濃
度を変える。
量分析法としてのHPLCの前記利点にもかかわらず、
分離化学はサイズ分解能、範囲、精度又は正確さの点で
最適でない。イオン対逆相分離は遅く(数時間を要す
る)、しばしば溶離されたフラグメントの比較的低い回
収をもたらし、そしてサイズ−正確同定のためのそれら
の値を危険にさらす、分子サイズの関数としての保持時
間の時々の逆転を与える(Eriksonなど.,19
86,J.Chromatog.359:265〜27
4)。これらの分離のために使用される水性溶媒は、比
較的低い(1/103 〜1/10M)濃度のトリアルキ
ルアンモニウム(たとえばトリエチルアンモニウム)又
はテトラアルキルアンモニウム(たとえばテトラブチル
アンモニウム)塩を含み、そして5〜50%の範囲にわ
たって溶離有機補助触媒、たとえばアセトニトリルの濃
度を変える。
【0015】本発明の前、種々の異なったイオン交換固
体に基づく二本鎖DNAのアニオン交換HPLC分離
は、分子サイズの関数としての保持時間の時々の逆転を
有し、サイズ精度フラグメント同定のためへのその使用
を妨げる(Katoなど.,1983,J.Chrom
atog.265:342〜346;Merionな
ど.,1988,Bio Techniques 6:2
46〜251;Katoなど.,1989,J.Chr
omatog.478:264〜268;Maaな
ど.,1990,J.Chromatog.508:6
1〜73;Muller,1986,Eur.J.Bi
ochem.155:203〜212;Heckerな
ど.,1985,J.Chromatog.326;2
51〜261;及びWestmanなど.,1987,
Anal.Biochem.166:158〜17
1)。ほとんどあらゆる場合、分子サイズに基づいて予
測されるよりも長い保持時間をたぶん有するDNAフラ
グメントはまた、異常に高いA−T含有率を有すること
が言及されている。しかしながら、対応策はこの効果の
ために提供されても又は示されてもなく、そして唯一の
理論、すなわちA−Tに富むDNAの曲率がそれを説明
するために示唆された(Heckerなど.,前記)。
ほとんどあらゆる場合、溶離塩は、一般的に0.3〜
1.2Mの濃度範囲で変えられるNaclであった。他
のアルカリ金属の塩化物塩も試みられたが、Naclよ
りも改良された性能は有さず、そしていくつかの溶離塩
アニオン、たとえばアセテート、トリクロロアセテー
ト、塩素酸塩及びスルフェートはひじょうに低められた
フラグメント分解能を付与し、又はまったく分離を与え
なかった(Westmanなど.,and Hecke
rなど.,前記)。
体に基づく二本鎖DNAのアニオン交換HPLC分離
は、分子サイズの関数としての保持時間の時々の逆転を
有し、サイズ精度フラグメント同定のためへのその使用
を妨げる(Katoなど.,1983,J.Chrom
atog.265:342〜346;Merionな
ど.,1988,Bio Techniques 6:2
46〜251;Katoなど.,1989,J.Chr
omatog.478:264〜268;Maaな
ど.,1990,J.Chromatog.508:6
1〜73;Muller,1986,Eur.J.Bi
ochem.155:203〜212;Heckerな
ど.,1985,J.Chromatog.326;2
51〜261;及びWestmanなど.,1987,
Anal.Biochem.166:158〜17
1)。ほとんどあらゆる場合、分子サイズに基づいて予
測されるよりも長い保持時間をたぶん有するDNAフラ
グメントはまた、異常に高いA−T含有率を有すること
が言及されている。しかしながら、対応策はこの効果の
ために提供されても又は示されてもなく、そして唯一の
理論、すなわちA−Tに富むDNAの曲率がそれを説明
するために示唆された(Heckerなど.,前記)。
ほとんどあらゆる場合、溶離塩は、一般的に0.3〜
1.2Mの濃度範囲で変えられるNaclであった。他
のアルカリ金属の塩化物塩も試みられたが、Naclよ
りも改良された性能は有さず、そしていくつかの溶離塩
アニオン、たとえばアセテート、トリクロロアセテー
ト、塩素酸塩及びスルフェートはひじょうに低められた
フラグメント分解能を付与し、又はまったく分離を与え
なかった(Westmanなど.,and Hecke
rなど.,前記)。
【0016】塩グラジエントは、1つのアニオン交換固
体に関して、ひじょうに小さなサイズの分解能が500
塩基対以上で生じる点まで、上昇するサイズのフラグメ
ントを分解するためにますます狭くされるにちがいない
ことが一般的に観察された(Westmanなど.,前
記)。この現象は、DNA溶離が濃度よりもむしろ塩の
活性により制御されるので生じることが示唆された(M
uller,前記)。塩、たとえばNaclは、塩濃度
が0.1Mの範囲で高められるにつれて活性率の低下を
示す。この低下は、塩濃度への塩活性の弱い比例をもた
らし、与えられた活性上昇を得るために必要とされる塩
濃度上昇を高め、そして従って保持時間の塩濃度感度を
低める。しかしながら、0.5〜1.0Mの塩濃度範囲
において、活性率はますます塩濃度非依存性になり、塩
活性もより強い塩濃度依存性にし、そして従って保持時
間の塩濃度感度を高める。
体に関して、ひじょうに小さなサイズの分解能が500
塩基対以上で生じる点まで、上昇するサイズのフラグメ
ントを分解するためにますます狭くされるにちがいない
ことが一般的に観察された(Westmanなど.,前
記)。この現象は、DNA溶離が濃度よりもむしろ塩の
活性により制御されるので生じることが示唆された(M
uller,前記)。塩、たとえばNaclは、塩濃度
が0.1Mの範囲で高められるにつれて活性率の低下を
示す。この低下は、塩濃度への塩活性の弱い比例をもた
らし、与えられた活性上昇を得るために必要とされる塩
濃度上昇を高め、そして従って保持時間の塩濃度感度を
低める。しかしながら、0.5〜1.0Mの塩濃度範囲
において、活性率はますます塩濃度非依存性になり、塩
活性もより強い塩濃度依存性にし、そして従って保持時
間の塩濃度感度を高める。
【0017】たった1つの場合において(Mulle
r,前記)、アニオン交換HPLC保持時間に対する温
度の効果が観察された。上昇する温度は、アニオン交換
固体へのDNA結合の強さを高めるが、しかしその現象
を定量化する努力は行なわれず、又はそれを保持時間精
度のための技術的な必要条件に関係づけなかった。保持
時間精度は従来技術に関係していない。
r,前記)、アニオン交換HPLC保持時間に対する温
度の効果が観察された。上昇する温度は、アニオン交換
固体へのDNA結合の強さを高めるが、しかしその現象
を定量化する努力は行なわれず、又はそれを保持時間精
度のための技術的な必要条件に関係づけなかった。保持
時間精度は従来技術に関係していない。
【0018】前記再調査は、一部又は完全に単一鎖の核
酸が溶媒及びクロマトグラフィーマトリックスに塩基を
露出し、そして従って強い配列−及び組成物依存性保持
時間を示すので、一本鎖DNA及びRNAのHPLCよ
りも単純であることが予測される二本鎖DNAのHPL
Cに対して集中された。しかしながら、これらの複雑な
相互作用は、溶離溶媒に有機補助溶媒を含むことによっ
て、塩基と最少に相互作用するクロマトグラフィーマト
リックスを選択することによって、又は塩基のいくつ
か、一般的には10個以上がアニオン性になるような高
いpHで操作することによって減じられ得る。塩基が負の
電荷を担持する場合、それらの間での塩基の積み重ね及
び水素結合相互作用が弱くされ、そしてその核酸は純粋
にランダムなコイル、すなわちポリマーの長さに直接関
係される半径及び正味の電荷に類似する。有機補助溶媒
は、塩基の積み重ね及び水素結合を弱くすることによっ
て、及び塩基−マトリックス相互作用を弱くすることに
よって、この挙動性単純化を促進する。
酸が溶媒及びクロマトグラフィーマトリックスに塩基を
露出し、そして従って強い配列−及び組成物依存性保持
時間を示すので、一本鎖DNA及びRNAのHPLCよ
りも単純であることが予測される二本鎖DNAのHPL
Cに対して集中された。しかしながら、これらの複雑な
相互作用は、溶離溶媒に有機補助溶媒を含むことによっ
て、塩基と最少に相互作用するクロマトグラフィーマト
リックスを選択することによって、又は塩基のいくつ
か、一般的には10個以上がアニオン性になるような高
いpHで操作することによって減じられ得る。塩基が負の
電荷を担持する場合、それらの間での塩基の積み重ね及
び水素結合相互作用が弱くされ、そしてその核酸は純粋
にランダムなコイル、すなわちポリマーの長さに直接関
係される半径及び正味の電荷に類似する。有機補助溶媒
は、塩基の積み重ね及び水素結合を弱くすることによっ
て、及び塩基−マトリックス相互作用を弱くすることに
よって、この挙動性単純化を促進する。
【0019】高いA−T含有率が、分子サイズに基づい
て単純に予測されるよりもより強く、二本鎖DNAのア
ニオン交換固体への結合を引き起こす傾向が観察される
場合、次の問題が発生する:溶離条件、たとえば温度又
は溶媒組成におけるある単純な変化が、A−Tに富むD
NAとG−Cに富むDNAとの間の構造的な差異がその
現象の原因であるもののすべてを削除することができる
か? Melchior and von Hippe
l,1973,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 70:292〜302は、テトラアルキル
アンモニウムイクド塩(特にテトラメチルアンモニウム
塩化物及びテトラエチルアンモニウム塩化物)及び少な
くとも1種のトリアルキルアンモニウム塩(トリエチル
アンモニウム塩化物)がG−Cに富むDNAとA−Tに
富むDNAとの間の溶融挙動の差異をひじょうに減じ、
そしてさらに排除できることを示した。しかしながら、
テトラメチルアンモニウムイオン及びテトラエチルアン
モニウムイオンは二本鎖DNAの安定性に対して劇的に
反対の効果を有し;前者はTmを高めるが、後者はTm
を低めた。これらの効果は、ひじょうに高い(2M以
上)塩濃度で、すなわち核酸のイオン対逆相HPLCに
これらの塩が使用される濃度範囲よりも高い1〜2の高
い濃度範囲で最っとも明らかであった。Shapiro
など.,1969,Biochemistry 9:3
219〜3232は、ポリリシンが好ましくはA−Tに
富むDNAに結合し、そしてそれを沈澱せしめ、そして
ひじょうに高い濃度でのテトラアルキルアンモニウム塩
の添加がこの選択を破壊し、そしてさらに反対にするこ
とを示した。
て単純に予測されるよりもより強く、二本鎖DNAのア
ニオン交換固体への結合を引き起こす傾向が観察される
場合、次の問題が発生する:溶離条件、たとえば温度又
は溶媒組成におけるある単純な変化が、A−Tに富むD
NAとG−Cに富むDNAとの間の構造的な差異がその
現象の原因であるもののすべてを削除することができる
か? Melchior and von Hippe
l,1973,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 70:292〜302は、テトラアルキル
アンモニウムイクド塩(特にテトラメチルアンモニウム
塩化物及びテトラエチルアンモニウム塩化物)及び少な
くとも1種のトリアルキルアンモニウム塩(トリエチル
アンモニウム塩化物)がG−Cに富むDNAとA−Tに
富むDNAとの間の溶融挙動の差異をひじょうに減じ、
そしてさらに排除できることを示した。しかしながら、
テトラメチルアンモニウムイオン及びテトラエチルアン
モニウムイオンは二本鎖DNAの安定性に対して劇的に
反対の効果を有し;前者はTmを高めるが、後者はTm
を低めた。これらの効果は、ひじょうに高い(2M以
上)塩濃度で、すなわち核酸のイオン対逆相HPLCに
これらの塩が使用される濃度範囲よりも高い1〜2の高
い濃度範囲で最っとも明らかであった。Shapiro
など.,1969,Biochemistry 9:3
219〜3232は、ポリリシンが好ましくはA−Tに
富むDNAに結合し、そしてそれを沈澱せしめ、そして
ひじょうに高い濃度でのテトラアルキルアンモニウム塩
の添加がこの選択を破壊し、そしてさらに反対にするこ
とを示した。
【0020】第2の現象は、テトラアルキルアンモニウ
ムのイオンがまた、好ましくは、A−Tに富むDNAに
結合することを包含し;この推測は同様にMelchi
orand von Hippelの結果を説明する。
Shapiroなど.,1969,Biochemis
try 9:3233〜3241は、いくつかのテトラ
アルキルアンモニウムイオンがG−Cに富むDNAによ
りもA−Tに富むDNAにより強く結合することを直接
的に示し、そしてアルカリ金属のカチオンに関しては見
られないこの現象が二重螺旋鎖の主要溝におけるテトラ
アルキルアンモニウムイオンの立体的固定化から生じる
ことを示唆した。Orosz andWetmur,1
977,Biopolymers 16:1183〜1
199は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチ
ル及びヘキシル基の種々の組合せを含む種々のテトラア
ルキルアンモニウムイオンの二本鎖DNA安定性に対す
る効果とプローブすることによって、その立体的解釈を
調査した。アルキル基のサイズの上昇はカチオンのより
ヘリックス−不安定化を引き起こす傾向があり、そして
エチルよりも大きなアルキル基に関しては、A−Tに富
む領域を安定化する能力を選択的に減じる傾向があっ
た。
ムのイオンがまた、好ましくは、A−Tに富むDNAに
結合することを包含し;この推測は同様にMelchi
orand von Hippelの結果を説明する。
Shapiroなど.,1969,Biochemis
try 9:3233〜3241は、いくつかのテトラ
アルキルアンモニウムイオンがG−Cに富むDNAによ
りもA−Tに富むDNAにより強く結合することを直接
的に示し、そしてアルカリ金属のカチオンに関しては見
られないこの現象が二重螺旋鎖の主要溝におけるテトラ
アルキルアンモニウムイオンの立体的固定化から生じる
ことを示唆した。Orosz andWetmur,1
977,Biopolymers 16:1183〜1
199は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチ
ル及びヘキシル基の種々の組合せを含む種々のテトラア
ルキルアンモニウムイオンの二本鎖DNA安定性に対す
る効果とプローブすることによって、その立体的解釈を
調査した。アルキル基のサイズの上昇はカチオンのより
ヘリックス−不安定化を引き起こす傾向があり、そして
エチルよりも大きなアルキル基に関しては、A−Tに富
む領域を安定化する能力を選択的に減じる傾向があっ
た。
【0021】二本鎖DNAのA−Tに富む領域へのテト
ラアルキルアンモニウム塩及びトリアルキルアンモニウ
ム塩の好ましい結合のこれらの指摘により発生する問題
は、そのような選択がアニオン交換固体に特に強く結合
するA−Tに富む二本鎖DNAの傾向を減じることがで
きるかいなかである。アルキルアンモニウムカチオンが
その濃度範囲、たぶん1M近くで、それらがアニオン交
換マトリックスからDNAを溶離する態様で作用する場
合、それらはアニオン交換HPLCをクロマトグラフィ
ー保持時間からのDNAフラグメントサイズの正確な評
価方法にすることができる。さらに、少なくとも1つの
アニオン交換固体のための二本鎖DNA親和性が上昇す
る温度と共に上昇する観察(Muller,前記)は、
溶離カチオンとDNAとの及び溶離アニオンとアニオン
交換固体との相互作用がその温度依存性を制御すること
ができることを示唆する。DNA−アニオン−交換−固
体相互作用のみがその温度依存性を制御する場合、親和
性は、温度が高められるにつれて低下するであろう。従
って、アルキルアンモニウム溶離塩は、クロマトグラフ
ィー保持時間の温度感度を変えることができる。この温
度感度が低いほど、高い保持時間精度をより容易に達成
することができ、保持時間にのみ基づいてDNAフラグ
メントを同定するHPLCの能力を改良することができ
る。
ラアルキルアンモニウム塩及びトリアルキルアンモニウ
ム塩の好ましい結合のこれらの指摘により発生する問題
は、そのような選択がアニオン交換固体に特に強く結合
するA−Tに富む二本鎖DNAの傾向を減じることがで
きるかいなかである。アルキルアンモニウムカチオンが
その濃度範囲、たぶん1M近くで、それらがアニオン交
換マトリックスからDNAを溶離する態様で作用する場
合、それらはアニオン交換HPLCをクロマトグラフィ
ー保持時間からのDNAフラグメントサイズの正確な評
価方法にすることができる。さらに、少なくとも1つの
アニオン交換固体のための二本鎖DNA親和性が上昇す
る温度と共に上昇する観察(Muller,前記)は、
溶離カチオンとDNAとの及び溶離アニオンとアニオン
交換固体との相互作用がその温度依存性を制御すること
ができることを示唆する。DNA−アニオン−交換−固
体相互作用のみがその温度依存性を制御する場合、親和
性は、温度が高められるにつれて低下するであろう。従
って、アルキルアンモニウム溶離塩は、クロマトグラフ
ィー保持時間の温度感度を変えることができる。この温
度感度が低いほど、高い保持時間精度をより容易に達成
することができ、保持時間にのみ基づいてDNAフラグ
メントを同定するHPLCの能力を改良することができ
る。
【0022】溶離塩カチオンの選択は二本鎖DNAのア
ニオン交換HPLCのサイズ精度への影響の最良の選択
を有するが、塩アニオンの選択は、分離の質に対して正
又は負の強い効果を有する。上記に示されたように、い
くつかのアニオンは、少なくともいくつかのアニオン交
換固体上でのピーク分解能を減じる。アニオンは、二本
鎖DNAの安定性に対して深い効果を有し、(Robi
nson and Grant,1966,J.Bio
l.Chem.241:4030〜4042);DNA
を溶融する傾向がある塩アニオンはDNAのA−T含有
率又は配列に対する保持時間感度を高めることができ
る。アニオン交換固体との塩アニオンの相互作用は、そ
れがアニオン交換工程の全体のエントロピー変化に寄与
するので、保持時間温度依存性に影響を及ぼすであろ
う。これに関しては、アニオン交換固体に弱く結合する
アニオンが好ましい。なぜならば、それらは最少のエン
トロピー変化に寄与するからである。最後に、DNAア
ニオン交換クロマトグラフィーのための溶離緩衝液にほ
とんど普遍的に使用されるクロリドアニオンは、HPL
Cポンプ、取付部品、カラム及び管に通常使用されるス
テンレス鋼の腐蝕を促進することが良く知られている。
いづれか他の緩衝アニオンが、HPLCのハードウェア
耐久性を改良し、そしてカラム及び分析物のFe(III
)による汚染を最少にすることにおいて好ましい。
ニオン交換HPLCのサイズ精度への影響の最良の選択
を有するが、塩アニオンの選択は、分離の質に対して正
又は負の強い効果を有する。上記に示されたように、い
くつかのアニオンは、少なくともいくつかのアニオン交
換固体上でのピーク分解能を減じる。アニオンは、二本
鎖DNAの安定性に対して深い効果を有し、(Robi
nson and Grant,1966,J.Bio
l.Chem.241:4030〜4042);DNA
を溶融する傾向がある塩アニオンはDNAのA−T含有
率又は配列に対する保持時間感度を高めることができ
る。アニオン交換固体との塩アニオンの相互作用は、そ
れがアニオン交換工程の全体のエントロピー変化に寄与
するので、保持時間温度依存性に影響を及ぼすであろ
う。これに関しては、アニオン交換固体に弱く結合する
アニオンが好ましい。なぜならば、それらは最少のエン
トロピー変化に寄与するからである。最後に、DNAア
ニオン交換クロマトグラフィーのための溶離緩衝液にほ
とんど普遍的に使用されるクロリドアニオンは、HPL
Cポンプ、取付部品、カラム及び管に通常使用されるス
テンレス鋼の腐蝕を促進することが良く知られている。
いづれか他の緩衝アニオンが、HPLCのハードウェア
耐久性を改良し、そしてカラム及び分析物のFe(III
)による汚染を最少にすることにおいて好ましい。
【0023】溶離塩におけるカチオン及びアニオンの組
合せは、さらに他の方法でHPLCポンプの耐久性及び
維持に影響を及ぼすことができる。少量の溶媒が、移動
部分上で析出物溶離溶媒を漏らす。水が蒸発した後、緩
衝塩が結晶化し、ピストン及びシールを引っかく研磨性
固体を形成する。DNAのアニオン交換クロマトグラフ
ィーの特に高い溶離塩濃度は、HPLCポンプ及びバル
ブに特に損傷を与える。しかしながら、溶離塩は結晶硬
度及び形状において異なりそして従って、研磨能力にお
いて異なり;Naclは特に研磨性であるが、しかしア
ルキルアンモニウムカチオン及びカルボキシレートアニ
オンの塩は柔らかな結晶を形成するはずである。ジアル
キルアミン又はトリアルキルアミンと短鎖脂肪性カルボ
ン酸(たとえば蟻酸及び酢酸)との間のいくらかの塩
は、揮発性である追加の利点を有する。なぜならば、そ
れらの成分の酸及び塩基が揮発性であるからである(テ
トラアルキルアンモニウム塩はこの性質を共有しな
い)。揮発性塩は、たぶんほとんど移動部分を研磨せ
ず、そしてまた、それらが後−HPLC処理を妨害する
場合、クロマトグラフィー処理されたDNAの回収され
たサンプルから容易に除去される。
合せは、さらに他の方法でHPLCポンプの耐久性及び
維持に影響を及ぼすことができる。少量の溶媒が、移動
部分上で析出物溶離溶媒を漏らす。水が蒸発した後、緩
衝塩が結晶化し、ピストン及びシールを引っかく研磨性
固体を形成する。DNAのアニオン交換クロマトグラフ
ィーの特に高い溶離塩濃度は、HPLCポンプ及びバル
ブに特に損傷を与える。しかしながら、溶離塩は結晶硬
度及び形状において異なりそして従って、研磨能力にお
いて異なり;Naclは特に研磨性であるが、しかしア
ルキルアンモニウムカチオン及びカルボキシレートアニ
オンの塩は柔らかな結晶を形成するはずである。ジアル
キルアミン又はトリアルキルアミンと短鎖脂肪性カルボ
ン酸(たとえば蟻酸及び酢酸)との間のいくらかの塩
は、揮発性である追加の利点を有する。なぜならば、そ
れらの成分の酸及び塩基が揮発性であるからである(テ
トラアルキルアンモニウム塩はこの性質を共有しな
い)。揮発性塩は、たぶんほとんど移動部分を研磨せ
ず、そしてまた、それらが後−HPLC処理を妨害する
場合、クロマトグラフィー処理されたDNAの回収され
たサンプルから容易に除去される。
【0024】明らかには、DNAのアニオン交換HPL
Cのための最適の溶媒組成物は多くの基準を包含し、そ
のいくつかは相互に不適合性である。従来の溶離塩、す
なわちNaclは多くの理由のために最適でないことが
明確であり、すなわちそれらの理由とは、(1)サイズ
精度を減じる、DNAのA−T含有率に対する保持時間
感度、(2)サイズ精度を減じるひじょうに高い保持時
間温度感度、(3)減じられた実際のサイズ範囲をもた
らす、DNAフラグメントサイズの上昇につれての塩濃
度に対する段階的に増強する保持時間感度及び(4)H
PLCのハードウェアを化学的及び物理的に損傷を与え
る傾向を包含する。本発明は、これらの関係のすべてを
提供する改良されたHPLC溶媒を提供する。
Cのための最適の溶媒組成物は多くの基準を包含し、そ
のいくつかは相互に不適合性である。従来の溶離塩、す
なわちNaclは多くの理由のために最適でないことが
明確であり、すなわちそれらの理由とは、(1)サイズ
精度を減じる、DNAのA−T含有率に対する保持時間
感度、(2)サイズ精度を減じるひじょうに高い保持時
間温度感度、(3)減じられた実際のサイズ範囲をもた
らす、DNAフラグメントサイズの上昇につれての塩濃
度に対する段階的に増強する保持時間感度及び(4)H
PLCのハードウェアを化学的及び物理的に損傷を与え
る傾向を包含する。本発明は、これらの関係のすべてを
提供する改良されたHPLC溶媒を提供する。
【0025】発明の要約 第1の観点において、本発明は、アニオン交換固体、特
に粒状のクロマトグラフィー用マトリックスからの核
酸、特に二本鎖DNAの塩グラジエント溶離のために最
適化された溶媒を含んでなる。この溶媒の実質的な成分
は、(a)ジ、トリ又はテトラ−アルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、たとえばホルメー
ト、アセテート、過塩素酸塩、ニトレート、クロリド、
ブロミド、メタンスルホネート及びエタンスルホネート
のいづれかを含んで成る、0.5〜1.5Mの濃度範囲
での溶離性、及び(b)約0.05Mよりも高くない濃
度で存在し、そして約4〜約8の間の溶媒pHを調節す
る、約3.5〜8.5の範囲のpKa の緩衝酸である。好
ましくは、緩衝酸はカチオン性であり、その結果、その
接合体塩基はアニオン交換固体に結合しない。本発明の
この観点の1つの態様はまた、核酸を含んで成る。もう
1つの態様は、製造、貯蔵、輸送のために便利なアニオ
ン交換溶媒の濃縮形を含んで成る。
に粒状のクロマトグラフィー用マトリックスからの核
酸、特に二本鎖DNAの塩グラジエント溶離のために最
適化された溶媒を含んでなる。この溶媒の実質的な成分
は、(a)ジ、トリ又はテトラ−アルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、たとえばホルメー
ト、アセテート、過塩素酸塩、ニトレート、クロリド、
ブロミド、メタンスルホネート及びエタンスルホネート
のいづれかを含んで成る、0.5〜1.5Mの濃度範囲
での溶離性、及び(b)約0.05Mよりも高くない濃
度で存在し、そして約4〜約8の間の溶媒pHを調節す
る、約3.5〜8.5の範囲のpKa の緩衝酸である。好
ましくは、緩衝酸はカチオン性であり、その結果、その
接合体塩基はアニオン交換固体に結合しない。本発明の
この観点の1つの態様はまた、核酸を含んで成る。もう
1つの態様は、製造、貯蔵、輸送のために便利なアニオ
ン交換溶媒の濃縮形を含んで成る。
【0026】第2の観点において、本発明は、核酸を伴
って、又は伴わないで、アニオン交換溶媒とアニオン交
換固体、特に合成有機ポリマー性主鎖を有する固体との
組合せを含んで成る。第3の観点において、本発明は、
分子サイズで異なる核酸のアニオン交換分離のための塩
グラジエント溶離方法を含んで成り、ここで前記核酸は
アニオン交換固体に結合され、そして次に、溶離塩濃度
が時間と共に高められるような態様で本発明の第1の観
点の一連の溶媒により洗浄される。溶出の後、前記溶媒
は、UV吸光度により核酸について分析される。
って、又は伴わないで、アニオン交換溶媒とアニオン交
換固体、特に合成有機ポリマー性主鎖を有する固体との
組合せを含んで成る。第3の観点において、本発明は、
分子サイズで異なる核酸のアニオン交換分離のための塩
グラジエント溶離方法を含んで成り、ここで前記核酸は
アニオン交換固体に結合され、そして次に、溶離塩濃度
が時間と共に高められるような態様で本発明の第1の観
点の一連の溶媒により洗浄される。溶出の後、前記溶媒
は、UV吸光度により核酸について分析される。
【0027】好ましい態様の記載 本発明の利点 本発明は、核酸、特に二本鎖DNAのアニオン交換分離
及び分析のために従来技術よりも少なくとも4種の改良
点を提供する。
及び分析のために従来技術よりも少なくとも4種の改良
点を提供する。
【0028】(1)核酸、特に二本鎖DNAが核酸の塩
基組成又は塩基配列並びにその長さに依存するオーダー
でアニオン交換固体から溶離されることが通常観察され
る。しばしば、長さに厳密に基づく分離が、特定の核酸
フラグメントを同定する方法として最っとも所望され
る。本発明のアニオン交換溶媒は、信頼できる同定を可
能にする長さ依存性分離を調和して付与する最初の溶媒
である。それらは、サイズ依存性DNA同定の最適態様
としてゲル電気泳動に代わるHPLCのような早く、自
動化された、定量的に正確なアニオン交換方法を可能に
する。ゲル電気泳動は、HPLCよりもより遅く、より
集中的な労力を要せず、定量的に低く、そして一般的に
低い信頼性のものである。
基組成又は塩基配列並びにその長さに依存するオーダー
でアニオン交換固体から溶離されることが通常観察され
る。しばしば、長さに厳密に基づく分離が、特定の核酸
フラグメントを同定する方法として最っとも所望され
る。本発明のアニオン交換溶媒は、信頼できる同定を可
能にする長さ依存性分離を調和して付与する最初の溶媒
である。それらは、サイズ依存性DNA同定の最適態様
としてゲル電気泳動に代わるHPLCのような早く、自
動化された、定量的に正確なアニオン交換方法を可能に
する。ゲル電気泳動は、HPLCよりもより遅く、より
集中的な労力を要せず、定量的に低く、そして一般的に
低い信頼性のものである。
【0029】(2)クロマトグラフィー溶離プロフィー
ルにおける位置に基づく信頼できるDNAフラグメント
同定は、種々のサンプルがクロマトグラフィー処理され
る場合、その位置が再現され得る精度に依存する。特に
合成有機ポリマーアニオン交換固体に基づく二本鎖DN
Aのアニオン交換分離は、従来の溶離塩;すなわちNa
clが使用される場合、非常に温度感受性である。必要
とされる溶離精度を得るために十分に密接にクロマトグ
ラフィー分離をサーモスタット制御することは困難であ
る。本発明の溶媒は、溶離の温度感受性をひじょうに減
じ、ひじょうに正確なサーモスタット制御を必要とする
ことによるクロマトグラフィー装置の出費を高めない
で、核酸分子サイズの評価に高い精度を提供する。
ルにおける位置に基づく信頼できるDNAフラグメント
同定は、種々のサンプルがクロマトグラフィー処理され
る場合、その位置が再現され得る精度に依存する。特に
合成有機ポリマーアニオン交換固体に基づく二本鎖DN
Aのアニオン交換分離は、従来の溶離塩;すなわちNa
clが使用される場合、非常に温度感受性である。必要
とされる溶離精度を得るために十分に密接にクロマトグ
ラフィー分離をサーモスタット制御することは困難であ
る。本発明の溶媒は、溶離の温度感受性をひじょうに減
じ、ひじょうに正確なサーモスタット制御を必要とする
ことによるクロマトグラフィー装置の出費を高めない
で、核酸分子サイズの評価に高い精度を提供する。
【0030】(3)二本鎖DNAの塩グラジエントアニ
オン交換分離は、拡大するサイズのDNAフラグメント
を分解するためにますます狭いグラジエントを必要とす
る。溶離塩としてNaclを用いての従来の溶媒による
長さ約103 個以上の塩基対のフラグメントの溶離は、
その塩グラジエントは従来のクロマトグラフィー装置に
より正確に制御されるには狭過ぎるので、良好でないサ
イズ分解能を有する。本発明のアニオン交換溶媒は、溶
離塩濃度感度が核酸分子サイズと共に上昇し、アニオン
交換クロマトグラフィーが許容できる分解能を有する実
際のサイズ範囲を拡張する程度を減じる。
オン交換分離は、拡大するサイズのDNAフラグメント
を分解するためにますます狭いグラジエントを必要とす
る。溶離塩としてNaclを用いての従来の溶媒による
長さ約103 個以上の塩基対のフラグメントの溶離は、
その塩グラジエントは従来のクロマトグラフィー装置に
より正確に制御されるには狭過ぎるので、良好でないサ
イズ分解能を有する。本発明のアニオン交換溶媒は、溶
離塩濃度感度が核酸分子サイズと共に上昇し、アニオン
交換クロマトグラフィーが許容できる分解能を有する実
際のサイズ範囲を拡張する程度を減じる。
【0031】(4)アニオン交換固体からの二本鎖核酸
の従来のNaclグラジエント溶離は、異なったサイズ
のフラグメントのために同一の温度感受性を示す。この
現象は、異なったサイズのフラグメントの分解が溶離温
度を変えることによって改良され得ないことを包含す
る。本発明の溶媒は、大きなフラグメントに対して高い
溶離温度感受性を付与し、溶離温度を高めることによっ
て分解能の単純な改良を可能にする。
の従来のNaclグラジエント溶離は、異なったサイズ
のフラグメントのために同一の温度感受性を示す。この
現象は、異なったサイズのフラグメントの分解が溶離温
度を変えることによって改良され得ないことを包含す
る。本発明の溶媒は、大きなフラグメントに対して高い
溶離温度感受性を付与し、溶離温度を高めることによっ
て分解能の単純な改良を可能にする。
【0032】定義 核酸は、1つのペントースの5′−OHを次のペントー
スの3′−OHとの間をホスホジエステル結合でのホス
ホリル基により連結されるペントースのオリゴマー又は
ポリマーを含んで成り、そして個々のペントースは、第
1炭素原子に対するグリコシド結合に芳香族複素環式
“塩基”を担持する。ペントースがリボースである場
合、核酸はRNAである。ペントースが2−デオキシリ
ボースである場合、核酸はDNAである。核酸ポリマー
の末端でのいづれかのホスホリル基を除く個々のホスホ
リル基は、約2〜3以上のpH値で単一の負の電荷を担持
し、その結果、核酸の全体の負の電荷は、ヌクレオチド
(nt)又は塩基対(bp)の単位でしばしば表わされ
るその長さにほぼ比例する。広範囲の種類の塩基のいづ
れかがペントースに結合され得るが、しかしたった5
種:アデニン(“A”)、チミン(DNAにおいてのみ
“T”)、ウラシル(RNAにおいて“U”)、グアニ
ン(“G”)及びシトシン(“C”)が天然に存在する
DNA及びRNAにおいて優勢に存在する。
スの3′−OHとの間をホスホジエステル結合でのホス
ホリル基により連結されるペントースのオリゴマー又は
ポリマーを含んで成り、そして個々のペントースは、第
1炭素原子に対するグリコシド結合に芳香族複素環式
“塩基”を担持する。ペントースがリボースである場
合、核酸はRNAである。ペントースが2−デオキシリ
ボースである場合、核酸はDNAである。核酸ポリマー
の末端でのいづれかのホスホリル基を除く個々のホスホ
リル基は、約2〜3以上のpH値で単一の負の電荷を担持
し、その結果、核酸の全体の負の電荷は、ヌクレオチド
(nt)又は塩基対(bp)の単位でしばしば表わされ
るその長さにほぼ比例する。広範囲の種類の塩基のいづ
れかがペントースに結合され得るが、しかしたった5
種:アデニン(“A”)、チミン(DNAにおいてのみ
“T”)、ウラシル(RNAにおいて“U”)、グアニ
ン(“G”)及びシトシン(“C”)が天然に存在する
DNA及びRNAにおいて優勢に存在する。
【0033】RNAは通常、単一のリボヌクレオチドポ
リマー鎖から成る。一本鎖DNAは単一のデオキシリボ
ヌクレオチドポリマー鎖である。しかしながら、相補的
塩基配列の2つのDNA鎖は二本鎖DNAを形成するた
めに二量体化することができる。ほぼ相補的な塩基配列
のDNA及びRNA鎖は、二本鎖DNAに構造的に類似
するDNA−RNAハイブリッドを形成するために二量
体化することができる。しばしば、個々のRNA又はR
NA鎖は、局部的な二本鎖領域を形成するために折りた
たみを可能にするポリマー鎖の種々の部分においてほぼ
相互に相補する塩基配列を有する。塩基は相補的に単純
な規則を従がえる:AはT又はUと対合し;GはCと対
合し;最高の安定した二本鎖構造は、2つの鎖が、1つ
の鎖の5′−OHが他の鎖の3′−OHに対して塩基相
補性であるように“逆平行”配向を有する場合に生じ
る。
リマー鎖から成る。一本鎖DNAは単一のデオキシリボ
ヌクレオチドポリマー鎖である。しかしながら、相補的
塩基配列の2つのDNA鎖は二本鎖DNAを形成するた
めに二量体化することができる。ほぼ相補的な塩基配列
のDNA及びRNA鎖は、二本鎖DNAに構造的に類似
するDNA−RNAハイブリッドを形成するために二量
体化することができる。しばしば、個々のRNA又はR
NA鎖は、局部的な二本鎖領域を形成するために折りた
たみを可能にするポリマー鎖の種々の部分においてほぼ
相互に相補する塩基配列を有する。塩基は相補的に単純
な規則を従がえる:AはT又はUと対合し;GはCと対
合し;最高の安定した二本鎖構造は、2つの鎖が、1つ
の鎖の5′−OHが他の鎖の3′−OHに対して塩基相
補性であるように“逆平行”配向を有する場合に生じ
る。
【0034】アニオン交換分離は、1つの相、通常固体
(但し時々液体である)における固定された正の電荷
が、第1相と接触する第2相、通常液体における負の分
子を結合する工程である。結合された負の分子は、2つ
の相の単純な分離により第2相における電気的に中性又
は正の分子から分離され得る。それらは、新規組成物
が、第1相へのより強く結合されたアニオンの誘引を弱
めるよりも一層、第1相へのより弱く結合されたアニオ
ンの誘引を弱めるように、元の第2相からの異なった組
成の新鮮な液体と第1相とを接触することによってお互
い分離され得る。結合されたアニオンは、新しい液体が
第1相からそれを置換することで続く場合に“溶離”さ
れる。第2相が、第1相に結合するアニオンをより強
く、漸進的に妨害する液体により反復して置換される場
合、その工程は“グラジエント溶離”と呼ばれる。溶離
液体が逐次的段階におけるよりもむしろ時間にわたって
滑らかに組成において変えられる場合、グラジエント溶
離は、“連続的”であり;他の場合、それは“段階的”
溶離である。
(但し時々液体である)における固定された正の電荷
が、第1相と接触する第2相、通常液体における負の分
子を結合する工程である。結合された負の分子は、2つ
の相の単純な分離により第2相における電気的に中性又
は正の分子から分離され得る。それらは、新規組成物
が、第1相へのより強く結合されたアニオンの誘引を弱
めるよりも一層、第1相へのより弱く結合されたアニオ
ンの誘引を弱めるように、元の第2相からの異なった組
成の新鮮な液体と第1相とを接触することによってお互
い分離され得る。結合されたアニオンは、新しい液体が
第1相からそれを置換することで続く場合に“溶離”さ
れる。第2相が、第1相に結合するアニオンをより強
く、漸進的に妨害する液体により反復して置換される場
合、その工程は“グラジエント溶離”と呼ばれる。溶離
液体が逐次的段階におけるよりもむしろ時間にわたって
滑らかに組成において変えられる場合、グラジエント溶
離は、“連続的”であり;他の場合、それは“段階的”
溶離である。
【0035】好ましくは、第1相は固体である。この
“アニオン交換固体”は、そのサイズ、形状、多孔性及
び機械的性質を定義する電気的に中性の“主鎖”材料及
び好ましくはその主鎖に共有結合される正に荷電された
“官能基”から成る。主鎖材料の3種の最っとも通常の
種類はシリカ、多糖類及び合成ポリオレフィンであり;
2種の主なポリオレフィンサブクラスはポリスチレン及
びポリアクリル酸樹脂である。後者は、種々の置換され
たアクリル酸アミド(“ポリアクリルアミド”)及びア
クリル酸エステル(“ポリアクリレート”)のポリマー
を含んで成り、ここでアクリル酸モノマーは2−又は3
−位置の炭素原子上にアルキル置換基を有しても良く又
は有さなくても良い。前記2種の最っとも通常の陽性官
能基は、主鎖に共有結合されるジエチルアミノエチル
(DEAE;〔(CH3 CH2 )2 N−CH2 −CH2
−〕n )及び主鎖に共有結合され得るか又は非共有的に
吸着され得るかのポリエチレンイミン(PEI:〔−C
H2 CH2 NH−〕n )である。アニオン交換固体を接
触する液体が約9〜11以下のpHの水性溶媒である場
合、DEAE及びPEIの窒素原子はプロトン化され、
そして従って正に荷電される。pHが低くなれば、官能基
の多くの画分がカチオンになる。与えられたアニオン交
換固体におけるほとんどの官能基が正に荷電されるpH領
域は、主に主鎖の構造及び主鎖の表面上の官能基の密度
に依存する。
“アニオン交換固体”は、そのサイズ、形状、多孔性及
び機械的性質を定義する電気的に中性の“主鎖”材料及
び好ましくはその主鎖に共有結合される正に荷電された
“官能基”から成る。主鎖材料の3種の最っとも通常の
種類はシリカ、多糖類及び合成ポリオレフィンであり;
2種の主なポリオレフィンサブクラスはポリスチレン及
びポリアクリル酸樹脂である。後者は、種々の置換され
たアクリル酸アミド(“ポリアクリルアミド”)及びア
クリル酸エステル(“ポリアクリレート”)のポリマー
を含んで成り、ここでアクリル酸モノマーは2−又は3
−位置の炭素原子上にアルキル置換基を有しても良く又
は有さなくても良い。前記2種の最っとも通常の陽性官
能基は、主鎖に共有結合されるジエチルアミノエチル
(DEAE;〔(CH3 CH2 )2 N−CH2 −CH2
−〕n )及び主鎖に共有結合され得るか又は非共有的に
吸着され得るかのポリエチレンイミン(PEI:〔−C
H2 CH2 NH−〕n )である。アニオン交換固体を接
触する液体が約9〜11以下のpHの水性溶媒である場
合、DEAE及びPEIの窒素原子はプロトン化され、
そして従って正に荷電される。pHが低くなれば、官能基
の多くの画分がカチオンになる。与えられたアニオン交
換固体におけるほとんどの官能基が正に荷電されるpH領
域は、主に主鎖の構造及び主鎖の表面上の官能基の密度
に依存する。
【0036】最っとも通常には、アニオン交換分離にお
いては、溶離液体は水性電解質であり;そしてグラジエ
ント溶離は水に溶解される完全に解離された塩の濃度を
高めることによって達成される。アニオン交換溶媒にお
ける溶離塩濃度の上昇は、アニオン交換固体へのアニオ
ン、たとえば核酸の結合を弱める。本発明の目的のため
には、0.5〜1.5Mのおおよその濃度範囲で存在す
る溶離塩は、ジ、トリ又はテトラアルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、好ましくはホルメー
ト、アセテート、クロリド、グロミド、ニトレート、過
塩素酸塩、メタンスルホネート、リン酸二水素又はエタ
ンスルホネートのいづれかから成る。好ましくは、アン
モニウムカチオン上のアルキル基はメチル又はエチル基
であり、そしてメチル基が最っとも好ましい。メチル及
びエチル基の両者を含むカチオンもまた可能であるが、
しかしたった1つの又は他のアルキル基を含むカチオン
よりも調製するのに困難である。溶離塩は、溶離溶媒を
製造するために水に溶解される固体として調製され得、
又は溶離塩の溶液は、アルキルアミン又はアルキルアン
モニウム水酸化物の水溶液と共にプロトン化されたモノ
アニオン(たとえば蟻酸、酢酸、塩酸)から成る酸を理
論的な等モル量で混合することによって調製され得る。
いては、溶離液体は水性電解質であり;そしてグラジエ
ント溶離は水に溶解される完全に解離された塩の濃度を
高めることによって達成される。アニオン交換溶媒にお
ける溶離塩濃度の上昇は、アニオン交換固体へのアニオ
ン、たとえば核酸の結合を弱める。本発明の目的のため
には、0.5〜1.5Mのおおよその濃度範囲で存在す
る溶離塩は、ジ、トリ又はテトラアルキルアンモニウム
カチオン及び種々のモノアニオン、好ましくはホルメー
ト、アセテート、クロリド、グロミド、ニトレート、過
塩素酸塩、メタンスルホネート、リン酸二水素又はエタ
ンスルホネートのいづれかから成る。好ましくは、アン
モニウムカチオン上のアルキル基はメチル又はエチル基
であり、そしてメチル基が最っとも好ましい。メチル及
びエチル基の両者を含むカチオンもまた可能であるが、
しかしたった1つの又は他のアルキル基を含むカチオン
よりも調製するのに困難である。溶離塩は、溶離溶媒を
製造するために水に溶解される固体として調製され得、
又は溶離塩の溶液は、アルキルアミン又はアルキルアン
モニウム水酸化物の水溶液と共にプロトン化されたモノ
アニオン(たとえば蟻酸、酢酸、塩酸)から成る酸を理
論的な等モル量で混合することによって調製され得る。
【0037】アニオン交換溶媒は、溶解されたアルキル
アンモニウム塩を含むだけでなく、また、所望するpHを
達成するために十分な塩基と一緒に、約3.5〜約8.
5の間の pKa(酸分子の半分が陽子を失っているpH)を
有する弱酸を添加することによって、約4〜約8のpHで
緩衝化される。好ましくは、緩衝酸濃度は約0.05M
を越えないであろう。また好ましくは、緩衝酸はそれ自
体カチオン性であり(すなわち、それは緩衝酸カチオン
及びもう1つの酸、通常、強い無機酸のアニオン性複合
塩基の塩として供給され得る)、その結果、その複合塩
基はアニオン性ではない。アニオン性緩衝複合塩基は、
所望する値からpHを低める手段で、アニオン交換固体に
結合することができる。特に好ましい緩衝酸は、Goo
dなど.,1966,Biochemistry 5:
467〜477により記載される“両性イオン緩衝液”
により供給され、そして現在、生化学試薬会社から高純
度で入手できる。
アンモニウム塩を含むだけでなく、また、所望するpHを
達成するために十分な塩基と一緒に、約3.5〜約8.
5の間の pKa(酸分子の半分が陽子を失っているpH)を
有する弱酸を添加することによって、約4〜約8のpHで
緩衝化される。好ましくは、緩衝酸濃度は約0.05M
を越えないであろう。また好ましくは、緩衝酸はそれ自
体カチオン性であり(すなわち、それは緩衝酸カチオン
及びもう1つの酸、通常、強い無機酸のアニオン性複合
塩基の塩として供給され得る)、その結果、その複合塩
基はアニオン性ではない。アニオン性緩衝複合塩基は、
所望する値からpHを低める手段で、アニオン交換固体に
結合することができる。特に好ましい緩衝酸は、Goo
dなど.,1966,Biochemistry 5:
467〜477により記載される“両性イオン緩衝液”
により供給され、そして現在、生化学試薬会社から高純
度で入手できる。
【0038】好ましいアニオン交換分離方法は、“クロ
マトグラフィー”であり、ここで通常、粒状形でのアニ
オン交換固体が、初期結合反応のために前記固体に核酸
を運び、そして溶離塩濃度が高められるにつれて前記固
体からそれらを効果的に除去する連続的に流れるアニオ
ン交換溶媒と接触せしめられる。粒状アニオン交換固体
は好ましくは、円柱状のカラムに充填され;溶媒がカラ
ムの一端から他端に流れる。液体クロマトグラフィーの
特に好ましい態様はHPLCであり、ここでアニオン交
換固体粒子はひじょうに小さく(通常直径2〜10μ
m)、そして高圧(数百〜数千ポンド/平方インチ)が
カラムを通して溶媒に力を加えるのに必要とされるほど
密接して充填される。そのような小さな粒子は、数分の
時間的規模で分離を可能にする、アニオン交換結合及び
溶離反応をひじょうに急速に受け、そしてこれはさら
に、1〜2オーダーの大きさの範囲の長さ(たとえば5
0〜500又は5,000個の塩基対)の多くの異なっ
た核酸種のお互いからの分離を可能にする。
マトグラフィー”であり、ここで通常、粒状形でのアニ
オン交換固体が、初期結合反応のために前記固体に核酸
を運び、そして溶離塩濃度が高められるにつれて前記固
体からそれらを効果的に除去する連続的に流れるアニオ
ン交換溶媒と接触せしめられる。粒状アニオン交換固体
は好ましくは、円柱状のカラムに充填され;溶媒がカラ
ムの一端から他端に流れる。液体クロマトグラフィーの
特に好ましい態様はHPLCであり、ここでアニオン交
換固体粒子はひじょうに小さく(通常直径2〜10μ
m)、そして高圧(数百〜数千ポンド/平方インチ)が
カラムを通して溶媒に力を加えるのに必要とされるほど
密接して充填される。そのような小さな粒子は、数分の
時間的規模で分離を可能にする、アニオン交換結合及び
溶離反応をひじょうに急速に受け、そしてこれはさら
に、1〜2オーダーの大きさの範囲の長さ(たとえば5
0〜500又は5,000個の塩基対)の多くの異なっ
た核酸種のお互いからの分離を可能にする。
【0039】発明を実施するための態様 二本鎖DNA又はDNA−RNAハイブリッド又は一本
鎖DNA又はRNAであり得る核酸は、有機化学者、生
化学者及び分子生物学者に良く知られた多くの方法のい
づれかによりアニオン交換クロマトグラフィーのために
調製される。DNA又はRNAは、良く知られ、そして
商業的に利用できる方法により固相上に通常調製される
合成物であり得る。それは、天然に存在し又は人工的に
生長せしめられた生物(生存又は死んだ)、たとえば疾
病の診断又は予後、たとえば治療のモニターのために収
集される動物又はヒトの臨床的試験サンプルに得られる
生物又は細胞から単離され得る。核酸のクロマトグラフ
ィー分析は、試験サンプルが比較的少ない種類の及び明
確な核酸種を含む場合、有益に単純化され、その結果、
溶離プロフィールは、UV吸光度の低いハックグラウン
ド上で目だつ容易に解決でき、そして同定できるピーク
から成る。
鎖DNA又はRNAであり得る核酸は、有機化学者、生
化学者及び分子生物学者に良く知られた多くの方法のい
づれかによりアニオン交換クロマトグラフィーのために
調製される。DNA又はRNAは、良く知られ、そして
商業的に利用できる方法により固相上に通常調製される
合成物であり得る。それは、天然に存在し又は人工的に
生長せしめられた生物(生存又は死んだ)、たとえば疾
病の診断又は予後、たとえば治療のモニターのために収
集される動物又はヒトの臨床的試験サンプルに得られる
生物又は細胞から単離され得る。核酸のクロマトグラフ
ィー分析は、試験サンプルが比較的少ない種類の及び明
確な核酸種を含む場合、有益に単純化され、その結果、
溶離プロフィールは、UV吸光度の低いハックグラウン
ド上で目だつ容易に解決でき、そして同定できるピーク
から成る。
【0040】クロマトグラフィー分析のためにDNAを
提供する好ましい手段は、通常知られており、そして実
施されているポリマラーゼ鎖反応(PCR)、すなわち
1又は数個の特定の核酸配列、通常50〜1,000bp
の大きさの範囲での分子の数をひじょうに増幅する方法
であり、この方法は好ましくはサイズに基づくアニオン
交換HPLC分離のために適切である。PCR方法は、
アメリカ特許第4,683,195号;第4,683,
202号;第4,800,159号;第4,889,8
18号及び第4,965,188号(これらは引用によ
り本明細書に組込まれる)により詳細に記載されてい
る。いづれか単一のPCRは、特に1990年2月16
日に出願されたアメリカ特許第481,501号(引用
により本明細書に組込まれる)に記載されるワックス蒸
気バリヤーを使用するHot Sfart(TM)法に
より行なわれる場合、約1/1010M〜1/107 M
の、クロマトグラフィーピークのUV吸光度検出のため
に必要とされる正確な濃度範囲で、1又は数個のDNA
フラグメントを生成する傾向がある。実際、本発明は、
特にアメリカ特許第481,501号と組合して、アニ
オン交換HPLCを、分子サイズに基づいてのPCR生
成物の同定及びPCR生成物の収量の定量化のための最
適な方法にする。アニオン交換HPLC分析のために適
切な核酸を供給するための、単独又はPCRと一緒に使
用されるもう1つの好ましい方法は、制限エンドヌクレ
アーゼによる消化であり、この方法は、比較的均質のD
NAのために、限定された及びしばしば低い数の良く定
義されたフラグメントを生成する。
提供する好ましい手段は、通常知られており、そして実
施されているポリマラーゼ鎖反応(PCR)、すなわち
1又は数個の特定の核酸配列、通常50〜1,000bp
の大きさの範囲での分子の数をひじょうに増幅する方法
であり、この方法は好ましくはサイズに基づくアニオン
交換HPLC分離のために適切である。PCR方法は、
アメリカ特許第4,683,195号;第4,683,
202号;第4,800,159号;第4,889,8
18号及び第4,965,188号(これらは引用によ
り本明細書に組込まれる)により詳細に記載されてい
る。いづれか単一のPCRは、特に1990年2月16
日に出願されたアメリカ特許第481,501号(引用
により本明細書に組込まれる)に記載されるワックス蒸
気バリヤーを使用するHot Sfart(TM)法に
より行なわれる場合、約1/1010M〜1/107 M
の、クロマトグラフィーピークのUV吸光度検出のため
に必要とされる正確な濃度範囲で、1又は数個のDNA
フラグメントを生成する傾向がある。実際、本発明は、
特にアメリカ特許第481,501号と組合して、アニ
オン交換HPLCを、分子サイズに基づいてのPCR生
成物の同定及びPCR生成物の収量の定量化のための最
適な方法にする。アニオン交換HPLC分析のために適
切な核酸を供給するための、単独又はPCRと一緒に使
用されるもう1つの好ましい方法は、制限エンドヌクレ
アーゼによる消化であり、この方法は、比較的均質のD
NAのために、限定された及びしばしば低い数の良く定
義されたフラグメントを生成する。
【0041】本発明のためには、アニオン交換固体に適
用される試験サンプル核酸は、その試験サンプルが、ア
ニオン交換固体に核酸をできるだけ堅く結合し、又は対
象の核酸を溶離するために効果的な同じ塩濃度範囲でア
ニオン交換固体から溶離される実質的な量のUV−吸光
物質を含む場合、有意に精製されない。そのような妨害
物質が存在する場合、それらは、いづれか通常利用でき
る分子生物学技法のマニュアルに記載されるように、フ
ェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿法により
除去される。好ましくは、アニオン交換固体に適用され
るサンプルは、アニオン交換固体を被覆し、又は詰まら
せる粒状物質を除去するために処理されるであろう。粒
状物を除去するための好ましい方法は、約0.45μm
よりも大きくない孔サイズを有するフィルターを通して
の注射器駆動性及び遠心分離器駆動性通過及びたとえば
マイクロ遠心分離による少なくとも10,000 rpmで
少なくとも5分間の単純な遠心分離を包含する。濾過は
遠心分離のみよりも好ましく;両方法は化学者、生物学
者及び分子生物学者に良く知られている市販の多くの装
置及び使い捨て装置のいづれかにより行なわれ得る。試
験サンプル調製の最後の詳細は、好ましくは核酸がグラ
ジエント溶離の出発溶媒に組成上近い溶媒に溶解される
べきであることである。
用される試験サンプル核酸は、その試験サンプルが、ア
ニオン交換固体に核酸をできるだけ堅く結合し、又は対
象の核酸を溶離するために効果的な同じ塩濃度範囲でア
ニオン交換固体から溶離される実質的な量のUV−吸光
物質を含む場合、有意に精製されない。そのような妨害
物質が存在する場合、それらは、いづれか通常利用でき
る分子生物学技法のマニュアルに記載されるように、フ
ェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿法により
除去される。好ましくは、アニオン交換固体に適用され
るサンプルは、アニオン交換固体を被覆し、又は詰まら
せる粒状物質を除去するために処理されるであろう。粒
状物を除去するための好ましい方法は、約0.45μm
よりも大きくない孔サイズを有するフィルターを通して
の注射器駆動性及び遠心分離器駆動性通過及びたとえば
マイクロ遠心分離による少なくとも10,000 rpmで
少なくとも5分間の単純な遠心分離を包含する。濾過は
遠心分離のみよりも好ましく;両方法は化学者、生物学
者及び分子生物学者に良く知られている市販の多くの装
置及び使い捨て装置のいづれかにより行なわれ得る。試
験サンプル調製の最後の詳細は、好ましくは核酸がグラ
ジエント溶離の出発溶媒に組成上近い溶媒に溶解される
べきであることである。
【0042】クロマトグラフィー分析物が二本鎖DNA
であるが、しかし試験サンプルがRNA又は一本鎖DN
Aを含むことが予測される場合、2つの好ましい方法
が、前記分析物の溶離プロフィールと前記後者の2種の
タイプの核酸との実質的な妨害を最少にするために存在
する。1つの態様は、まず、同じ酵素による消化から二
本鎖DNAを保護するために、分子生物学において良く
知られた酸素濃度、温度及び緩衝組成物条件下で、RN
Aに対して特異的なヌクレアーゼ(たとえばRNアーゼ
又はRNアーゼT1)又は一本鎖DNAに対して特異的
なヌクレアーゼ(たとえばアスペルギラス オリザエ
(Aspergillus oryzae)からのヌク
レアーゼS1又はヤエナリ(mung beam)のヌ
クレアーゼ)により試験サンプルを処理することから成
る。
であるが、しかし試験サンプルがRNA又は一本鎖DN
Aを含むことが予測される場合、2つの好ましい方法
が、前記分析物の溶離プロフィールと前記後者の2種の
タイプの核酸との実質的な妨害を最少にするために存在
する。1つの態様は、まず、同じ酵素による消化から二
本鎖DNAを保護するために、分子生物学において良く
知られた酸素濃度、温度及び緩衝組成物条件下で、RN
Aに対して特異的なヌクレアーゼ(たとえばRNアーゼ
又はRNアーゼT1)又は一本鎖DNAに対して特異的
なヌクレアーゼ(たとえばアスペルギラス オリザエ
(Aspergillus oryzae)からのヌク
レアーゼS1又はヤエナリ(mung beam)のヌ
クレアーゼ)により試験サンプルを処理することから成
る。
【0043】他の態様は、この結合特異性を強化する溶
媒及び温度条件下で一本鎖DNAを結合する固体材料と
試験サンプルとをまず接触することから成る。次に、R
NA又は一本鎖DNAが結合している固体材料が残存す
る液体試験サンプルから除去される場合(たとえば、遠
心分離又は濾過により)、その試験サンプルはアニオン
交換固体への適用のために準備できている。好ましく
は、この接触は、クロマトグラフィー溶離に使用される
第1溶媒とほぼ同じ組成の溶媒(たとえば約0.5〜
1.0の濃度範囲でジアルキルアンモニウム、トリアル
キルアンモニウム又はテトラアルキルアンモニウム塩を
含む)で行なわれる。
媒及び温度条件下で一本鎖DNAを結合する固体材料と
試験サンプルとをまず接触することから成る。次に、R
NA又は一本鎖DNAが結合している固体材料が残存す
る液体試験サンプルから除去される場合(たとえば、遠
心分離又は濾過により)、その試験サンプルはアニオン
交換固体への適用のために準備できている。好ましく
は、この接触は、クロマトグラフィー溶離に使用される
第1溶媒とほぼ同じ組成の溶媒(たとえば約0.5〜
1.0の濃度範囲でジアルキルアンモニウム、トリアル
キルアンモニウム又はテトラアルキルアンモニウム塩を
含む)で行なわれる。
【0044】RNA及び一本鎖DNAの特異的結合のた
めの好ましい固体は、膜の形で通常利用できるニトロセ
ルロース及び固体支持体に共有結合されるアラルキルア
ミンのいづれかである。そのようなアラルキルアミンの
例は、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミ
ン、フェニルブチルアミン及びナフチルエチレンジアミ
ンである。特に便利な固体支持体は、粒状の、エポキシ
ド由来の多孔性又は非多孔性アクリルマトリックス、た
とえばAlltech Associates,In
c.により供給されるHEMA−100EH Bioで
ある。アラルキルアミンは、Alltechにより供給
される指示に従って、エポキシド担持の支持体と反応せ
しめられ得る。市販の固定化されたアラルキルアミンは
フェニルブチルアミンEupergit(Rohm P
harma)である。しかしながら、それは、アラルキ
ルアミン変性のエポキシド担持性HEMAに比べて、劣
っている能力、結合運動学及び耐性を有する。試験サン
プル処理のために使用される固体支持体の量は、固体か
ら処理されたサンプルの回収を増強するために、予備試
験サンプルの手探り試験の後、最少化され得る。
めの好ましい固体は、膜の形で通常利用できるニトロセ
ルロース及び固体支持体に共有結合されるアラルキルア
ミンのいづれかである。そのようなアラルキルアミンの
例は、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミ
ン、フェニルブチルアミン及びナフチルエチレンジアミ
ンである。特に便利な固体支持体は、粒状の、エポキシ
ド由来の多孔性又は非多孔性アクリルマトリックス、た
とえばAlltech Associates,In
c.により供給されるHEMA−100EH Bioで
ある。アラルキルアミンは、Alltechにより供給
される指示に従って、エポキシド担持の支持体と反応せ
しめられ得る。市販の固定化されたアラルキルアミンは
フェニルブチルアミンEupergit(Rohm P
harma)である。しかしながら、それは、アラルキ
ルアミン変性のエポキシド担持性HEMAに比べて、劣
っている能力、結合運動学及び耐性を有する。試験サン
プル処理のために使用される固体支持体の量は、固体か
ら処理されたサンプルの回収を増強するために、予備試
験サンプルの手探り試験の後、最少化され得る。
【0045】HPLC分析が二本鎖DNAであり、妨害
性RNA又は一本鎖DNAがたぶん存在し、そして前記
処理がたぶん有益である試験サンプルの1つの種類は、
PCR生成物である。初期PCR標的がゲノムDNAに
含まれる場合、そのゲノムDNAは実質的に、PCR熱
循環の最後までに一本鎖化されるであろう。PCR増幅
のための試験サンプルはしばしば、同様にRNAを含
む。PCR生成物はまた、一本鎖合成オリゴヌクレオチ
ドである天然プライマーを伴う。
性RNA又は一本鎖DNAがたぶん存在し、そして前記
処理がたぶん有益である試験サンプルの1つの種類は、
PCR生成物である。初期PCR標的がゲノムDNAに
含まれる場合、そのゲノムDNAは実質的に、PCR熱
循環の最後までに一本鎖化されるであろう。PCR増幅
のための試験サンプルはしばしば、同様にRNAを含
む。PCR生成物はまた、一本鎖合成オリゴヌクレオチ
ドである天然プライマーを伴う。
【0046】本発明のアニオン交換溶媒は、標準の化学
的除去により脱イオン又はガラス蒸留水中において製造
される。いくつかの溶離塩、たとえばテトラメチルアン
モニウムクロリドは、ひじょうに精製された固体として
市販されている。しかしながら、多くは、等モル量の市
販の塩基、たとえばトリメチルアミン及びテトラメチル
アンモニウム水酸化物、及び酸、たとえば蟻酸、酢酸、
硝酸、過塩素酸、メタンスルホン酸及びスルホン酸を混
合することによって調製され得る。成分である酸及び塩
基のモル濃度は、分析化学の従来の方法により標準化さ
れた酸又は塩基により指示薬又は電位差エンドポイント
に滴定することによってあらかじめ決定され得る。多く
の市販のアルキルアンモニウム塩は吸湿性であり、そし
て多くの酸及び塩基は種々の濃度の濃縮水溶液として供
給されるので、溶媒調製物の精度は、注意して滴定され
た成分から製造される溶液の導電性、密度又は屈折率の
注意した測定により促進される。次に、後者の溶液は、
これらの容易に測定された物性の記録された値を適合す
るために集中的に調製され得、酸−塩基滴定の労力のか
かる方法を回避する。
的除去により脱イオン又はガラス蒸留水中において製造
される。いくつかの溶離塩、たとえばテトラメチルアン
モニウムクロリドは、ひじょうに精製された固体として
市販されている。しかしながら、多くは、等モル量の市
販の塩基、たとえばトリメチルアミン及びテトラメチル
アンモニウム水酸化物、及び酸、たとえば蟻酸、酢酸、
硝酸、過塩素酸、メタンスルホン酸及びスルホン酸を混
合することによって調製され得る。成分である酸及び塩
基のモル濃度は、分析化学の従来の方法により標準化さ
れた酸又は塩基により指示薬又は電位差エンドポイント
に滴定することによってあらかじめ決定され得る。多く
の市販のアルキルアンモニウム塩は吸湿性であり、そし
て多くの酸及び塩基は種々の濃度の濃縮水溶液として供
給されるので、溶媒調製物の精度は、注意して滴定され
た成分から製造される溶液の導電性、密度又は屈折率の
注意した測定により促進される。次に、後者の溶液は、
これらの容易に測定された物性の記録された値を適合す
るために集中的に調製され得、酸−塩基滴定の労力のか
かる方法を回避する。
【0047】本発明の溶媒における溶離塩の最終濃度は
0.5〜1.5Mの間であろう。溶離塩アニオンが強酸
の複合塩基(たとえばブロミド、クロリド、ニトレー
ト、過塩素酸酸塩、メタンスルホネート及びエタンスル
ホネート)である場合、溶離塩は4〜8pH範囲での少々
の効果的な緩衝能力を提供する。従って、所望するpHの
1pH単位(好ましくは1/2pH単位)以内の pKaを有す
る追加の緩衝酸が溶媒に添加され、好ましくは0.01
〜0.05Mの範囲での最終濃度が達成される。特に好
ましい緩衝酸は、Goodなど.,1966,Bioc
hemistry 5 :467〜477により記載される合成両性イオン緩
衝液、又はそれらの複合塩基(アミン)の塩、たとえば
ピペラジニウムクロリド、メチルピペラジニウムクロリ
ド及びエチレンジアミンジヒドロクロリドとして供給さ
れるカチオン性酸種(プロトン化されたアミン)であ
る。十分な追加の塩基は、4〜8の所望するpHに希釈緩
衝酸を調節するために添加されるべきである。溶媒から
すべての塩化物を排除することが所望される場合、同等
の緩衝は、所望するpH値を達成するために、溶離塩を調
製するために使用される十分な酸と塩基性アミン(たと
えばピペラジン又はエチレンジアミン)とを組合すこと
によって得られる。低いpH値は、たぶん二本鎖DNAを
変性し、そしてA,G,及びC塩基上に正の電荷を付与
する。高いpH値は、官能基が第1、第2又は第3アミン
(たとえばジエチルアミノエチル基及びポリエチレンミ
ミン)であるアニオン交換固体の正味のカチオン電荷を
減じる傾向がある。8以上のpH値は、第4アミン官能基
で担持するマトリックス上で、アニオン交換分離が行な
われる場合、不必要であるが、しかし約10以上のpH
は、二本鎖DNAがそれらの高いpH値で変性する傾向が
あるので、すべてのアニオン交換固体上での二本鎖DN
A分離のためには不都合である。アニオン交換固体がシ
リカ主鎖を有する場合、約8(好ましくは7)以上の溶
媒pH値は、それらが主鎖を溶解するので、回避されるべ
きである。
0.5〜1.5Mの間であろう。溶離塩アニオンが強酸
の複合塩基(たとえばブロミド、クロリド、ニトレー
ト、過塩素酸酸塩、メタンスルホネート及びエタンスル
ホネート)である場合、溶離塩は4〜8pH範囲での少々
の効果的な緩衝能力を提供する。従って、所望するpHの
1pH単位(好ましくは1/2pH単位)以内の pKaを有す
る追加の緩衝酸が溶媒に添加され、好ましくは0.01
〜0.05Mの範囲での最終濃度が達成される。特に好
ましい緩衝酸は、Goodなど.,1966,Bioc
hemistry 5 :467〜477により記載される合成両性イオン緩
衝液、又はそれらの複合塩基(アミン)の塩、たとえば
ピペラジニウムクロリド、メチルピペラジニウムクロリ
ド及びエチレンジアミンジヒドロクロリドとして供給さ
れるカチオン性酸種(プロトン化されたアミン)であ
る。十分な追加の塩基は、4〜8の所望するpHに希釈緩
衝酸を調節するために添加されるべきである。溶媒から
すべての塩化物を排除することが所望される場合、同等
の緩衝は、所望するpH値を達成するために、溶離塩を調
製するために使用される十分な酸と塩基性アミン(たと
えばピペラジン又はエチレンジアミン)とを組合すこと
によって得られる。低いpH値は、たぶん二本鎖DNAを
変性し、そしてA,G,及びC塩基上に正の電荷を付与
する。高いpH値は、官能基が第1、第2又は第3アミン
(たとえばジエチルアミノエチル基及びポリエチレンミ
ミン)であるアニオン交換固体の正味のカチオン電荷を
減じる傾向がある。8以上のpH値は、第4アミン官能基
で担持するマトリックス上で、アニオン交換分離が行な
われる場合、不必要であるが、しかし約10以上のpH
は、二本鎖DNAがそれらの高いpH値で変性する傾向が
あるので、すべてのアニオン交換固体上での二本鎖DN
A分離のためには不都合である。アニオン交換固体がシ
リカ主鎖を有する場合、約8(好ましくは7)以上の溶
媒pH値は、それらが主鎖を溶解するので、回避されるべ
きである。
【0048】本発明のアニオン交換溶媒はまた、添加
物、たとえば低濃度でのキレート剤(たとえば0.1〜
10mMの濃度範囲でのEDTA又はDTPA)又は有機
補助溶媒、たとえば0.1〜10%の濃度範囲でのアセ
トニトリル、ホルムアミド及びN−メチルピロリバンを
含むことができる。キレート剤は、核酸調製に通常見出
され、そして核酸に堅く結合されるMg2+のアニオン交換
分離での妨害を防ぐことができる。それはまた、Fe(II
I )酸化状態の錯イオンとして通常存在する遍在性汚染
物である偶発的な鉄が、溶解されたO2 による核酸酸化
及び分解を触媒することを防ぐことができる。鉄触媒の
酸化反応を阻止するための特に好ましいキレート剤は、
Ciba−Geigyにより製造され、そしてSigm
a Chemical Co.,により売られているデ
フェロキサミンメシレートであり;0.1mM濃度のこの
化合物が適切に保護性である。有機補助溶媒は、厳密に
サイズ依存性分離、より厳密には、二本鎖DNAよりも
一本鎖DNA及びRNAを妨害する、核酸とアニオン交
換固体との間の非イオン性相互作用の阻止を助けること
ができる。そのような阻止のための必要性は、アニオン
交換固体の主鎖の正確な化学に依存する。有機補助溶媒
の回避は、それらが通常、酸化的活性鉄により汚染され
るので、好ましい。
物、たとえば低濃度でのキレート剤(たとえば0.1〜
10mMの濃度範囲でのEDTA又はDTPA)又は有機
補助溶媒、たとえば0.1〜10%の濃度範囲でのアセ
トニトリル、ホルムアミド及びN−メチルピロリバンを
含むことができる。キレート剤は、核酸調製に通常見出
され、そして核酸に堅く結合されるMg2+のアニオン交換
分離での妨害を防ぐことができる。それはまた、Fe(II
I )酸化状態の錯イオンとして通常存在する遍在性汚染
物である偶発的な鉄が、溶解されたO2 による核酸酸化
及び分解を触媒することを防ぐことができる。鉄触媒の
酸化反応を阻止するための特に好ましいキレート剤は、
Ciba−Geigyにより製造され、そしてSigm
a Chemical Co.,により売られているデ
フェロキサミンメシレートであり;0.1mM濃度のこの
化合物が適切に保護性である。有機補助溶媒は、厳密に
サイズ依存性分離、より厳密には、二本鎖DNAよりも
一本鎖DNA及びRNAを妨害する、核酸とアニオン交
換固体との間の非イオン性相互作用の阻止を助けること
ができる。そのような阻止のための必要性は、アニオン
交換固体の主鎖の正確な化学に依存する。有機補助溶媒
の回避は、それらが通常、酸化的活性鉄により汚染され
るので、好ましい。
【0049】(a)0.5〜1.5M濃度でのアルキル
アンモニウム溶離塩の存在及び(b)3.5〜8.5の
pKaを有する0.01Mの緩衝酸により供給される緩衝
液に少なくとも同等の、pH4〜8の範囲の緩衝液の他
に、本発明のアニオン交換溶媒は溶離された核酸の分光
光度アッセイを可能にするために、次の第3番目の必要
条件:特に260nm近くでの十分なUV透明度を満足す
べきである。蒸留水に対する0.01以下の260nmで
の吸光度(1cmの路の長さ)が好ましく、二成分グラジ
エント溶離における両緩衝液がほぼ同じ吸光度を有する
限り、0.01〜0.1の吸光度は許容できる。厳密な
吸光度遮断は存在しないが、吸光度が約0.1を越える
程度は、ひじょうに少量の核酸を分析する能力を制限す
る。従って、アニオン交換溶媒を調製する重要な部分
は、色彩形成反応、主に縮合及び酸化を好まない条件下
でUV−透過成分の獲得及び成分及び最終溶媒の貯蔵で
ある。好ましい条件は、暗やみ、低温度及びそれらの水
性含有物中へのUV−吸収性材料(主に酸化防止剤)を
それ自体浸出せしめないプラスチック容器の使用であ
る。好ましくは吸収された酸化活性金属、たとえば鉄を
除去するために、強い無機酸、たとえばHNO3 に飽和
させた後、ガラス容器が許容できる。色彩形成を最少に
することにおいては、本発明の溶媒が有機補助溶媒を含
み、そして0.05M又はそれ以下、好ましくは0.0
2Mよりも高くない緩衝液濃度に緩衝酸を制限すること
が好ましい。溶媒pHが約7〜約4の間であり、又は第四
アンモニウム官能基がアニオン交換固体に使用される場
合、塩におけるpH緩衝のための必要性は最少である。
アンモニウム溶離塩の存在及び(b)3.5〜8.5の
pKaを有する0.01Mの緩衝酸により供給される緩衝
液に少なくとも同等の、pH4〜8の範囲の緩衝液の他
に、本発明のアニオン交換溶媒は溶離された核酸の分光
光度アッセイを可能にするために、次の第3番目の必要
条件:特に260nm近くでの十分なUV透明度を満足す
べきである。蒸留水に対する0.01以下の260nmで
の吸光度(1cmの路の長さ)が好ましく、二成分グラジ
エント溶離における両緩衝液がほぼ同じ吸光度を有する
限り、0.01〜0.1の吸光度は許容できる。厳密な
吸光度遮断は存在しないが、吸光度が約0.1を越える
程度は、ひじょうに少量の核酸を分析する能力を制限す
る。従って、アニオン交換溶媒を調製する重要な部分
は、色彩形成反応、主に縮合及び酸化を好まない条件下
でUV−透過成分の獲得及び成分及び最終溶媒の貯蔵で
ある。好ましい条件は、暗やみ、低温度及びそれらの水
性含有物中へのUV−吸収性材料(主に酸化防止剤)を
それ自体浸出せしめないプラスチック容器の使用であ
る。好ましくは吸収された酸化活性金属、たとえば鉄を
除去するために、強い無機酸、たとえばHNO3 に飽和
させた後、ガラス容器が許容できる。色彩形成を最少に
することにおいては、本発明の溶媒が有機補助溶媒を含
み、そして0.05M又はそれ以下、好ましくは0.0
2Mよりも高くない緩衝液濃度に緩衝酸を制限すること
が好ましい。溶媒pHが約7〜約4の間であり、又は第四
アンモニウム官能基がアニオン交換固体に使用される場
合、塩におけるpH緩衝のための必要性は最少である。
【0050】本発明のアニオン交換溶媒のいくつかの処
理は、UV−吸収性不純物を除去するために及び多くの
そのような不純物の生成を遅くするために有用である。
UV−吸収性不純物は実質的に芳香族有機化合物から構
成され、それはそのような化合物を選択的に吸着する固
体と溶媒とを接触することによって除去され得る。その
ような固体は、木炭、ピーズ化されたマクロ網状ポリス
チレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばXAD−2,
XAD−16及びXAD−4、及びアクリル酸樹脂、た
とえばXAD−7及びXAD−8(Rohm and
Haas)、及び高温分解されたビーズ化マクロ網状ポ
リスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばAmbe
rsorb(R)XE−340,XE−347及びXE
−348(Rohm and Haas)を包含する。
理は、UV−吸収性不純物を除去するために及び多くの
そのような不純物の生成を遅くするために有用である。
UV−吸収性不純物は実質的に芳香族有機化合物から構
成され、それはそのような化合物を選択的に吸着する固
体と溶媒とを接触することによって除去され得る。その
ような固体は、木炭、ピーズ化されたマクロ網状ポリス
チレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばXAD−2,
XAD−16及びXAD−4、及びアクリル酸樹脂、た
とえばXAD−7及びXAD−8(Rohm and
Haas)、及び高温分解されたビーズ化マクロ網状ポ
リスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、たとえばAmbe
rsorb(R)XE−340,XE−347及びXE
−348(Rohm and Haas)を包含する。
【0051】溶媒着色(UVにおいて)が製造及び貯蔵
の間、酸化副反応に起因する限り、それは、不純物とし
て存在し、そして溶媒における溶解された酸素により溶
媒成分の酸化を触媒することを担当する酸化活性遷移金
属、主にFe,Cr, Co及びCuの吸着性除去により減じられ
得る。遷移金属汚染物を除去する好ましい態様は、溶媒
又はそれが製造される成分とキレート固体とを接触せし
めることである。市販のキレート固体は、Chelex20及び
100(BioRad Laboratories), Amberlite(R)IRC-718(Rohm
and Haas), Chelite(R)C, N及びP(Serva Biochemical
s), Duolite(R)ES346, ES466 及びES467(Chemical Proc
ess Co.), Bio-Rex and Chelex Chelating Membranes(B
io-Rad Laboratories) 及びChelating Sepharose Fast
Flow(Pharmacia LKB Biotechnology)を包含する。
の間、酸化副反応に起因する限り、それは、不純物とし
て存在し、そして溶媒における溶解された酸素により溶
媒成分の酸化を触媒することを担当する酸化活性遷移金
属、主にFe,Cr, Co及びCuの吸着性除去により減じられ
得る。遷移金属汚染物を除去する好ましい態様は、溶媒
又はそれが製造される成分とキレート固体とを接触せし
めることである。市販のキレート固体は、Chelex20及び
100(BioRad Laboratories), Amberlite(R)IRC-718(Rohm
and Haas), Chelite(R)C, N及びP(Serva Biochemical
s), Duolite(R)ES346, ES466 及びES467(Chemical Proc
ess Co.), Bio-Rex and Chelex Chelating Membranes(B
io-Rad Laboratories) 及びChelating Sepharose Fast
Flow(Pharmacia LKB Biotechnology)を包含する。
【0052】溶媒又はそれらの成分と芳香族化合物を選
択的に結合する固体との接触は、溶媒における懸濁され
た固体又は成分の水性濃縮物を攪拌し、続いて固体の沈
降及び上清液体のデカント又は濾過により達成され得
る。他方、固体が円柱状カラムに充填され、そしてこの
カラムを通して、溶媒又は溶媒成分の溶液が、溶媒から
の不純物の完全な除去がもたらされる十分に遅い速度で
通される。いくらかの吸着性固体がフィルター形での多
孔性プラスチックマトリックスに埋封されて利用され、
その結果、効果的な接触が、比較的低い適用圧力下でフ
ィルターを通してのアニオン交換溶媒の通過のみを必要
とする。
択的に結合する固体との接触は、溶媒における懸濁され
た固体又は成分の水性濃縮物を攪拌し、続いて固体の沈
降及び上清液体のデカント又は濾過により達成され得
る。他方、固体が円柱状カラムに充填され、そしてこの
カラムを通して、溶媒又は溶媒成分の溶液が、溶媒から
の不純物の完全な除去がもたらされる十分に遅い速度で
通される。いくらかの吸着性固体がフィルター形での多
孔性プラスチックマトリックスに埋封されて利用され、
その結果、効果的な接触が、比較的低い適用圧力下でフ
ィルターを通してのアニオン交換溶媒の通過のみを必要
とする。
【0053】アニオン交換溶媒調製の最終的な有用態様
は、好ましくは減菌フィルター及び受容体を用いて、
0.22μmよりも大きくない呼称孔サイズのフィルタ
ーを通しての真空又は圧力下でのマイクロ濾過である。
特に好ましいフィルター材料は、Anotec Sep
aratoonsにより製造され、そして多くの実験用
試薬及び装置供給者により売られている0.02μmの
孔サイズのアルミナハネカム膜である。そのような濾過
は、クロマトグラフィー装置に損傷を与える粒状材料を
除去するだけでなく、また溶媒成分を代謝することがで
きる細菌を除去することによって溶媒の貯蔵寿命を拡張
する。
は、好ましくは減菌フィルター及び受容体を用いて、
0.22μmよりも大きくない呼称孔サイズのフィルタ
ーを通しての真空又は圧力下でのマイクロ濾過である。
特に好ましいフィルター材料は、Anotec Sep
aratoonsにより製造され、そして多くの実験用
試薬及び装置供給者により売られている0.02μmの
孔サイズのアルミナハネカム膜である。そのような濾過
は、クロマトグラフィー装置に損傷を与える粒状材料を
除去するだけでなく、また溶媒成分を代謝することがで
きる細菌を除去することによって溶媒の貯蔵寿命を拡張
する。
【0054】本発明のアニオン交換溶媒及び方法は、当
業者に良く知られており、そして商業的な試薬及び装置
市場により多く支持される種々の溶離型(イソクラティ
クな、段階的グラジエント、連続グラジエント、塩グラ
ジエント、pHグラジエント)で、多くの異なったアニオ
ン交換固体(膜、フェルト、紙、大きな粒子、小さな粒
子、多孔性粒子、非多孔性粒子、球状粒子、不規則粒
子)に供給され得る。しかしながら、平均約2〜10μ
mの小さなアニオン交換粒子に基づく分析的なHPLC
分離が、本発明の改良点から最っとも十分に利益を受け
る。
業者に良く知られており、そして商業的な試薬及び装置
市場により多く支持される種々の溶離型(イソクラティ
クな、段階的グラジエント、連続グラジエント、塩グラ
ジエント、pHグラジエント)で、多くの異なったアニオ
ン交換固体(膜、フェルト、紙、大きな粒子、小さな粒
子、多孔性粒子、非多孔性粒子、球状粒子、不規則粒
子)に供給され得る。しかしながら、平均約2〜10μ
mの小さなアニオン交換粒子に基づく分析的なHPLC
分離が、本発明の改良点から最っとも十分に利益を受け
る。
【0055】HPLC装置の最っとも重要な成分は、カ
ラム及びその充填物である。分析的な分離のためには、
カラムの内径は10mmを越えず、そして好ましくは、5
mmを越えず;カラムの長さは50mmを越えず、そして1
0mmほどの短さであり得る。最っとも好ましい充填物
は、4.6×35mmのステンレス鋼カラムに充填される
“DEAE−NPR”としてTosoh Corpor
ationにより製造され、そしてSupelco,t
heNest Group及びthe Derkin−
Elmer Corporationにより売られてい
る、ジエチルアミノエチル官能基を担持する2.5μm
の直径の非多孔性有機ポリマー(アクリル)材料であ
る。4.6×50又は150mmのステンレス鋼に充填す
る“PL−SAX”としてPolymerLabora
tories Limitedにより製造され、そして
Polymer Laboratories,the
Perkin Elmer Corporation、
及びPer Soptive Biosystemsに
より売られている、親水性ポリマーにより被覆され、そ
して第四アンモニウム基を担持する8μmの直径の多孔
性(1000A又は4000Aの呼称孔サイズ)ポリス
チレンマトリックスは前記のものより好ましくない。ま
た、4×50mmのプラスチックカラムに充填される“P
roPacPA1”又は“NucleoPac PA−
100”としてDionex Corporation
により製造され、そして売られている、第四アンモニウ
ム官能基を担持する0.2μmの非多孔性ポリスチレン
ビーズにより被覆される10μmの直径の非多孔性ポリ
スチレン球体から成る球状粒子は前記のものより好まし
くない。また、4×50mmのステンレス鋼カラムに充填
されるそれぞれ“Nacleogen 4000−7”
又は“Nucleosil 4000−7”としてMa
chery−Nagelにより製造され、そしてRai
ninにより売られている、ジエチルアミノエチル担持
のシラン又はポリエチレンイミンにより共有被覆される
7μmの直径の多孔性(4000Aの呼称孔サイズ)シ
リカ材料は前記のものより好ましくない。また、4.6
×100mmのステンレス鋼カラムに充填される“Gen
−Pak FAX”としてWaters Chroma
tographyDivision of Milli
pore Corporationにより製造され、そ
して売られている、ジエチルアミノエチル官能基を担持
する2.5μmの直径の非多孔性アクリル酸ポリマービ
ーズは前記のものより好ましくない。プラスチックの末
端取付部品を有する5×50mmのガラスカラムに充填さ
れる“Mono−Q”としてPharmacia LK
Bにより製造され、そして売られる、第四アミン官能基
を担持する10μmの直径の多孔性(400〜600A
の呼称孔サイズ)アクリル酸ポリマー材料はまた、前記
のものより好ましくない。
ラム及びその充填物である。分析的な分離のためには、
カラムの内径は10mmを越えず、そして好ましくは、5
mmを越えず;カラムの長さは50mmを越えず、そして1
0mmほどの短さであり得る。最っとも好ましい充填物
は、4.6×35mmのステンレス鋼カラムに充填される
“DEAE−NPR”としてTosoh Corpor
ationにより製造され、そしてSupelco,t
heNest Group及びthe Derkin−
Elmer Corporationにより売られてい
る、ジエチルアミノエチル官能基を担持する2.5μm
の直径の非多孔性有機ポリマー(アクリル)材料であ
る。4.6×50又は150mmのステンレス鋼に充填す
る“PL−SAX”としてPolymerLabora
tories Limitedにより製造され、そして
Polymer Laboratories,the
Perkin Elmer Corporation、
及びPer Soptive Biosystemsに
より売られている、親水性ポリマーにより被覆され、そ
して第四アンモニウム基を担持する8μmの直径の多孔
性(1000A又は4000Aの呼称孔サイズ)ポリス
チレンマトリックスは前記のものより好ましくない。ま
た、4×50mmのプラスチックカラムに充填される“P
roPacPA1”又は“NucleoPac PA−
100”としてDionex Corporation
により製造され、そして売られている、第四アンモニウ
ム官能基を担持する0.2μmの非多孔性ポリスチレン
ビーズにより被覆される10μmの直径の非多孔性ポリ
スチレン球体から成る球状粒子は前記のものより好まし
くない。また、4×50mmのステンレス鋼カラムに充填
されるそれぞれ“Nacleogen 4000−7”
又は“Nucleosil 4000−7”としてMa
chery−Nagelにより製造され、そしてRai
ninにより売られている、ジエチルアミノエチル担持
のシラン又はポリエチレンイミンにより共有被覆される
7μmの直径の多孔性(4000Aの呼称孔サイズ)シ
リカ材料は前記のものより好ましくない。また、4.6
×100mmのステンレス鋼カラムに充填される“Gen
−Pak FAX”としてWaters Chroma
tographyDivision of Milli
pore Corporationにより製造され、そ
して売られている、ジエチルアミノエチル官能基を担持
する2.5μmの直径の非多孔性アクリル酸ポリマービ
ーズは前記のものより好ましくない。プラスチックの末
端取付部品を有する5×50mmのガラスカラムに充填さ
れる“Mono−Q”としてPharmacia LK
Bにより製造され、そして売られる、第四アミン官能基
を担持する10μmの直径の多孔性(400〜600A
の呼称孔サイズ)アクリル酸ポリマー材料はまた、前記
のものより好ましくない。
【0056】HPLC分析物がポリマラーゼ鎖反応又は
分析規模の制限酵素消化の二本鎖DNA生成物である場
合、上記の市販のアニオン交換カラムは、理想的にはD
NA種のサイズによる急速な分析及び同定には適切でな
い。それらはすべて大き過ぎるので、特にグラジエント
溶離が2〜10分の時間規模に基づいて行なわれる場
合、有意なピークの広がりが生じる。分析用PCR及び
制限消化の規模はひじょうに小さいので、HPLCカラ
ム上に注入される得られるDNAの量はめったに1μg
を越えず、そしてしばしば1ngに近く、従ってそれらの
カラムのはるか能力以下である。さらに、これらのカラ
ムのすべては、全体のカラム層断面にわたって均質に多
孔性である末端フリットを使用する。この企画は、ピー
クの広がりを引き起こす。なぜならばカラムの上部に入
る溶媒が、端でよりも中央でより急速に流れるので、均
等な速度で全体の末端フリットを通して押し流さないか
らである。この流れのパターンは、層の端近くのHPL
C吸着剤に結合する分析物の、カラム軸近くに結合する
分析物よりもよりゆっくりした溶離を引き起こす傾向が
ある。これらのカラムの企画の問題の最適な解決法は次
の通りである。クロマトグラフィー用樹脂が、約2mm〜
6mmの直径及び約10mm〜約30mmの長さを有する円柱
状カラムに、クロマトグラフィー業界において良く知ら
れている方法により充填されるべきである。これらのカ
ラムは、底部末端フリット(その多孔性部分は完全にそ
の層断面を被覆する)及び上部末端フリット(その多孔
性部分はカラム軸に集中されたベンド断面の画分のみを
被覆する)を有すべきである。4.6mmの内径のカラム
に関しては、制限された直径の多孔性プラグを有するそ
のような末端フリットの選択がUpchurch Sc
ientificから入手できる。
分析規模の制限酵素消化の二本鎖DNA生成物である場
合、上記の市販のアニオン交換カラムは、理想的にはD
NA種のサイズによる急速な分析及び同定には適切でな
い。それらはすべて大き過ぎるので、特にグラジエント
溶離が2〜10分の時間規模に基づいて行なわれる場
合、有意なピークの広がりが生じる。分析用PCR及び
制限消化の規模はひじょうに小さいので、HPLCカラ
ム上に注入される得られるDNAの量はめったに1μg
を越えず、そしてしばしば1ngに近く、従ってそれらの
カラムのはるか能力以下である。さらに、これらのカラ
ムのすべては、全体のカラム層断面にわたって均質に多
孔性である末端フリットを使用する。この企画は、ピー
クの広がりを引き起こす。なぜならばカラムの上部に入
る溶媒が、端でよりも中央でより急速に流れるので、均
等な速度で全体の末端フリットを通して押し流さないか
らである。この流れのパターンは、層の端近くのHPL
C吸着剤に結合する分析物の、カラム軸近くに結合する
分析物よりもよりゆっくりした溶離を引き起こす傾向が
ある。これらのカラムの企画の問題の最適な解決法は次
の通りである。クロマトグラフィー用樹脂が、約2mm〜
6mmの直径及び約10mm〜約30mmの長さを有する円柱
状カラムに、クロマトグラフィー業界において良く知ら
れている方法により充填されるべきである。これらのカ
ラムは、底部末端フリット(その多孔性部分は完全にそ
の層断面を被覆する)及び上部末端フリット(その多孔
性部分はカラム軸に集中されたベンド断面の画分のみを
被覆する)を有すべきである。4.6mmの内径のカラム
に関しては、制限された直径の多孔性プラグを有するそ
のような末端フリットの選択がUpchurch Sc
ientificから入手できる。
【0057】適切なアニオン交換カラムの場合、核酸分
離は、本発明の溶媒及び方法により広範囲の市販のHP
LC装置に基づいて行なわれ得る。二成分グラジエント
溶媒供給システム、少なくとも±0.1℃の精度にサー
モスタットするカラム及び260nmでのUV分光光度検
出が、本発明のために好ましい。しかしながら、完全な
グラジエント分離による3分以下での50〜1,000
bpサイズ範囲の二本鎖DNAのひじょうに早い効果的な
分析が、HPLC装置が次の基準を満たす場合にTos
oh DEAE−NPR材料上で得られる:溶媒ミキサ
ーとカラムとの間の100μL以下の合計体積、1.5
μL/分ほどの合計流速、100ms以下の検出器応答、
及び10μL以下の検出器体積。さらに、カラムと検出
器との間の管の長さを2cm以下に減じ、そして注入器を
カラムに連結する管及び注入器をサーモスタットするこ
とが好ましい。
離は、本発明の溶媒及び方法により広範囲の市販のHP
LC装置に基づいて行なわれ得る。二成分グラジエント
溶媒供給システム、少なくとも±0.1℃の精度にサー
モスタットするカラム及び260nmでのUV分光光度検
出が、本発明のために好ましい。しかしながら、完全な
グラジエント分離による3分以下での50〜1,000
bpサイズ範囲の二本鎖DNAのひじょうに早い効果的な
分析が、HPLC装置が次の基準を満たす場合にTos
oh DEAE−NPR材料上で得られる:溶媒ミキサ
ーとカラムとの間の100μL以下の合計体積、1.5
μL/分ほどの合計流速、100ms以下の検出器応答、
及び10μL以下の検出器体積。さらに、カラムと検出
器との間の管の長さを2cm以下に減じ、そして注入器を
カラムに連結する管及び注入器をサーモスタットするこ
とが好ましい。
【0058】本発明のアニオン交換溶媒の最っとも正確
な使用のためには、従来のHPLC溶媒溜めの改良が、
その溜めが使用されるにつれて保持時間の短縮を引き起
こすであろう水の蒸発及びその得られる溶離塩の濃度を
最少にすることが所望される。この改良においては、溶
媒が、液体上に最少の蒸気空間が存在するように、より
硬質の溜めのシェル内の折りたたみ式のプラスチックバ
ッグに閉じ込められ;そのバッグは堅く密封される(但
し、HPLCポンプの出口を除く)。溜めの内容物が使
用されるにつれて、バッグは空気との最少の溶媒の接触
を維持するために折りたたまれる。好ましくは、そのバ
ッグは、水及び空気の両者への最少の透過性を有するプ
ラスチックから製造される。また好ましくは、溶媒は、
バッグ中への導入の前、当業界において良く知られた方
法によりガス抜きされる。次に、水蒸気のための機会を
高める通常のヘリウムスパージを伴わないでHPLCポ
ンプに気泡を有さない溶媒を供給することが可能であ
る。HPLC溶媒蒸発を減じるのに良く適合された折り
たたみ式テフロンライナーを含む2.5Lの高密度ポリ
エチレン溜が、NOW Technologies(M
inneapolis,MN)から市販されている。
な使用のためには、従来のHPLC溶媒溜めの改良が、
その溜めが使用されるにつれて保持時間の短縮を引き起
こすであろう水の蒸発及びその得られる溶離塩の濃度を
最少にすることが所望される。この改良においては、溶
媒が、液体上に最少の蒸気空間が存在するように、より
硬質の溜めのシェル内の折りたたみ式のプラスチックバ
ッグに閉じ込められ;そのバッグは堅く密封される(但
し、HPLCポンプの出口を除く)。溜めの内容物が使
用されるにつれて、バッグは空気との最少の溶媒の接触
を維持するために折りたたまれる。好ましくは、そのバ
ッグは、水及び空気の両者への最少の透過性を有するプ
ラスチックから製造される。また好ましくは、溶媒は、
バッグ中への導入の前、当業界において良く知られた方
法によりガス抜きされる。次に、水蒸気のための機会を
高める通常のヘリウムスパージを伴わないでHPLCポ
ンプに気泡を有さない溶媒を供給することが可能であ
る。HPLC溶媒蒸発を減じるのに良く適合された折り
たたみ式テフロンライナーを含む2.5Lの高密度ポリ
エチレン溜が、NOW Technologies(M
inneapolis,MN)から市販されている。
【0059】本発明の核酸のHPLC分離は、(a)約
0.5〜約1Mの濃度で溶離塩を含む出発溶媒組成物に
よりカラムを平衡化し、(b)核酸含有サンプルを約1
μL〜約100μL(好ましくは約10μL)の体積で
注入し、(c)約2分〜約30分の間隔で約1M〜約
1.5Mの値に溶離塩濃度を高める連続グラジエントプ
ログラムを開始し,そして(d)260nm領域でのUV
吸光度を記録することによって、最適にもたらされる。
場合によっては、分光光度検出器からの流出液は、等体
積の画分又は個々のクロマトグラフィーピークを得るた
めに選択された画分に集められ得る。溶離プロフィー
ル、すなわち吸光度対時間又は体積のグラフが、多くの
市販のマイクロコンピューターベースのデータシステム
のいづれかで数的に記録される場合、それは、クロマト
グラフィー処理試験が完結する場合に最適に比較され得
る。
0.5〜約1Mの濃度で溶離塩を含む出発溶媒組成物に
よりカラムを平衡化し、(b)核酸含有サンプルを約1
μL〜約100μL(好ましくは約10μL)の体積で
注入し、(c)約2分〜約30分の間隔で約1M〜約
1.5Mの値に溶離塩濃度を高める連続グラジエントプ
ログラムを開始し,そして(d)260nm領域でのUV
吸光度を記録することによって、最適にもたらされる。
場合によっては、分光光度検出器からの流出液は、等体
積の画分又は個々のクロマトグラフィーピークを得るた
めに選択された画分に集められ得る。溶離プロフィー
ル、すなわち吸光度対時間又は体積のグラフが、多くの
市販のマイクロコンピューターベースのデータシステム
のいづれかで数的に記録される場合、それは、クロマト
グラフィー処理試験が完結する場合に最適に比較され得
る。
【0060】グラジエントプログラムの選択の他に効果
的なHPLC分離の企画における主な判定事は、注入す
る核酸の量の選択に関する。この決定は、試験サンプル
が不足しておらず又は高価でない場合、特に短い分離時
間による手探り法により最適化され得る。他方、それ
は、分光測光及び材料バランスの原理を用いて近められ
得る。現代のHPLC分光光度検出器は、1/104 の
吸光度単位(AU)以下の検出限界を有し、そして1/
103 〜1/102 のAUの強い高さのピークを付与す
る。(a)HPLC検出器の光路、(b)いかに多くの
明確なピークを、サンプルが生成するか、(c)いかに
多量の核酸を、与えられた体積の試験サンプルが含む
か、及び(d)いかに多くの体積を、そのピークが溶離
するかの推定値が与えられる場合、1/103 AU以上
の平均吸光度(最大吸光度の約半分)を有するピークを
付与するであろう試験サンプル体積を推定することがで
きる。1μgの二本鎖DNAは、260nmの吸光度の約
0.02AUmLを含む。それが約0.1mLの体積の10
種のピーク間に分布される場合、個々のピークは10mm
の光路を伴って約0.02AU又は5mmの光路を伴って
0.01AUの平均吸光度を有するであろう。
的なHPLC分離の企画における主な判定事は、注入す
る核酸の量の選択に関する。この決定は、試験サンプル
が不足しておらず又は高価でない場合、特に短い分離時
間による手探り法により最適化され得る。他方、それ
は、分光測光及び材料バランスの原理を用いて近められ
得る。現代のHPLC分光光度検出器は、1/104 の
吸光度単位(AU)以下の検出限界を有し、そして1/
103 〜1/102 のAUの強い高さのピークを付与す
る。(a)HPLC検出器の光路、(b)いかに多くの
明確なピークを、サンプルが生成するか、(c)いかに
多量の核酸を、与えられた体積の試験サンプルが含む
か、及び(d)いかに多くの体積を、そのピークが溶離
するかの推定値が与えられる場合、1/103 AU以上
の平均吸光度(最大吸光度の約半分)を有するピークを
付与するであろう試験サンプル体積を推定することがで
きる。1μgの二本鎖DNAは、260nmの吸光度の約
0.02AUmLを含む。それが約0.1mLの体積の10
種のピーク間に分布される場合、個々のピークは10mm
の光路を伴って約0.02AU又は5mmの光路を伴って
0.01AUの平均吸光度を有するであろう。
【0061】最適なHPLCグラジエント溶離プロフィ
ールは通常、手探り法により選択される。対象のピーク
のすべてをお互いから及びカラム上に保持されないUV
吸収性材料の通常観察される“注入スパイク”から分離
する溶離塩の開始及び最終濃度が見出された後すぐに、
グラジエントの平均的勾配が所望する間隔で分離をもた
らすために選択される。この間隔内でのグラジエントの
正確な形状は、特定のピークの分析を増強するために、
又はしばしば、保持時間対DNAフラグメントサイズの
対数の線状グラフを創造するために形成され得る。二本
鎖DNAのアニオン交換分離に関しては、その得られた
形状は、たぶん上方に向かっての凸形状を有する。本発
明の理解及び実施を促進するために、多くの例示的な例
が下記に与えられる。
ールは通常、手探り法により選択される。対象のピーク
のすべてをお互いから及びカラム上に保持されないUV
吸収性材料の通常観察される“注入スパイク”から分離
する溶離塩の開始及び最終濃度が見出された後すぐに、
グラジエントの平均的勾配が所望する間隔で分離をもた
らすために選択される。この間隔内でのグラジエントの
正確な形状は、特定のピークの分析を増強するために、
又はしばしば、保持時間対DNAフラグメントサイズの
対数の線状グラフを創造するために形成され得る。二本
鎖DNAのアニオン交換分離に関しては、その得られた
形状は、たぶん上方に向かっての凸形状を有する。本発
明の理解及び実施を促進するために、多くの例示的な例
が下記に与えられる。
【0062】
【実施例】例1 溶離塩としてNaclを用いての二本鎖DNAのアニオ
ン交換HPLC分離 二本鎖DNAサンプルは、10mMのトリス−cl及び50
mMの Kclの溶液(pH8.3)中で1/5に希釈された1
0mMのトリス−cl及び1mMおEDTAの溶液(pH8.
0)に供給されるプラスミドpBR322(Boehr
inger Mannheim)のエンドヌクレアーゼ
Hae III消化物であった。それは、次の塩基対での分
子サイズのブラント末端化されたフラグメントを含む:
51,57,64,80,89,104,123,12
4,184,192,213,234,264,43
4,458,504,540及び587。HPLC溶媒
は次のものである:10mMのシクロヘキシルアミノエタ
ンスルホン酸(CHES、25℃で pKa9.50)及び
50mMのNaclを含む緩衝液A、pH8.99;10mM
のCHES及び700mMのNaclを含む緩衝液B、pH
8.77。HPLC装置は次のものから成る:10WS
Cヘッドを有する二軸Gilsonモデル302ポン
プ、65μLの混合チャンバーを有するGilsonモ
デル811動的ミキサー、Gilsonモデル802B
マノメーターモジュール、50μLのループを有するG
ilsonモデル231サンプル注入器、Jone C
hromatography Ltd.からのカラムヒ
ーター、8μL(10mmの路)の流動セル及び20msの
応答時間設定を有するPerkin−Elnaerモデ
ルLC−95UV/Visible分光光度検出吸光
度、及びPC−ATのみにおいてGilsonモデル7
15コントローラーソフトウェア(バージョン1.0)
により制御され、そしてモニターされるGilsonモ
デル621データモジュール。カラム温度は、カラム本
体にテープにより設置されているテフロン被覆された1
/20インチの直径タイプTサーモカップルをモニター
するPhysitermpモデルBAT−12電気温度
計により±0.1℃の誤差で測定された。
ン交換HPLC分離 二本鎖DNAサンプルは、10mMのトリス−cl及び50
mMの Kclの溶液(pH8.3)中で1/5に希釈された1
0mMのトリス−cl及び1mMおEDTAの溶液(pH8.
0)に供給されるプラスミドpBR322(Boehr
inger Mannheim)のエンドヌクレアーゼ
Hae III消化物であった。それは、次の塩基対での分
子サイズのブラント末端化されたフラグメントを含む:
51,57,64,80,89,104,123,12
4,184,192,213,234,264,43
4,458,504,540及び587。HPLC溶媒
は次のものである:10mMのシクロヘキシルアミノエタ
ンスルホン酸(CHES、25℃で pKa9.50)及び
50mMのNaclを含む緩衝液A、pH8.99;10mM
のCHES及び700mMのNaclを含む緩衝液B、pH
8.77。HPLC装置は次のものから成る:10WS
Cヘッドを有する二軸Gilsonモデル302ポン
プ、65μLの混合チャンバーを有するGilsonモ
デル811動的ミキサー、Gilsonモデル802B
マノメーターモジュール、50μLのループを有するG
ilsonモデル231サンプル注入器、Jone C
hromatography Ltd.からのカラムヒ
ーター、8μL(10mmの路)の流動セル及び20msの
応答時間設定を有するPerkin−Elnaerモデ
ルLC−95UV/Visible分光光度検出吸光
度、及びPC−ATのみにおいてGilsonモデル7
15コントローラーソフトウェア(バージョン1.0)
により制御され、そしてモニターされるGilsonモ
デル621データモジュール。カラム温度は、カラム本
体にテープにより設置されているテフロン被覆された1
/20インチの直径タイプTサーモカップルをモニター
するPhysitermpモデルBAT−12電気温度
計により±0.1℃の誤差で測定された。
【0063】アニオン交換HPLCカラムは、Supe
lco又はPerkin−Elmer Corpora
tionにより供給される、4.6×35mmのToso
hDEAE−NPRカラムであった。次の溶媒グラジエ
ントプログラムが1.0mL/分の合計の流速で供給され
た(注入からの時間、すべてのグラジエントセグメント
は線状である。):O時間で8%緩衝液B(0.516
MのNacl);0.30分で27%緩衝液B(0.5
54MのNacl);1.30分で50%緩衝液B
(0.600MのNacl);1.60分で50%緩衝
液B;1.70分で100%緩衝液液B;(0.700
MのNacl);2.10分で10%の緩衝液B;2.
20分で8%緩衝液B。
lco又はPerkin−Elmer Corpora
tionにより供給される、4.6×35mmのToso
hDEAE−NPRカラムであった。次の溶媒グラジエ
ントプログラムが1.0mL/分の合計の流速で供給され
た(注入からの時間、すべてのグラジエントセグメント
は線状である。):O時間で8%緩衝液B(0.516
MのNacl);0.30分で27%緩衝液B(0.5
54MのNacl);1.30分で50%緩衝液B
(0.600MのNacl);1.60分で50%緩衝
液B;1.70分で100%緩衝液液B;(0.700
MのNacl);2.10分で10%の緩衝液B;2.
20分で8%緩衝液B。
【0064】図1は、カラムが30.4℃でサーモスタ
ットされ、そして10μLのDNAサンプル(約0.5
μgのDNA)が注入される場合の代表的な溶離プロフ
ィールを示し;吸光度は260nmでモニターされた。点
線は、ミキサー、注入器及びカラムのフリー溶媒体積の
ために、溶離プロフィールから約0.3mL(0.3分)
左側に移動された塩グラジエントプログラムを示す。公
開された分析法(Westmanなど.,1987,A
nal.Biochem.166:158〜171,及
びKatoなど.,1989,J.Chromato
g.478:264〜268)に基づいてのbpでのフラ
グメントサイズ同定は、個々のピークに対して与えられ
る。それは、保持時間に基づくフラグメント組成の効果
の多くの証拠を示し;123bpのピークは、それをオー
バーラップする代わりに、124bpのピークを従え;1
92bpのピークは213bpのピークを従がえ;458bp
のピークは504,540bpのオーバーラップするピー
クを従える。
ットされ、そして10μLのDNAサンプル(約0.5
μgのDNA)が注入される場合の代表的な溶離プロフ
ィールを示し;吸光度は260nmでモニターされた。点
線は、ミキサー、注入器及びカラムのフリー溶媒体積の
ために、溶離プロフィールから約0.3mL(0.3分)
左側に移動された塩グラジエントプログラムを示す。公
開された分析法(Westmanなど.,1987,A
nal.Biochem.166:158〜171,及
びKatoなど.,1989,J.Chromato
g.478:264〜268)に基づいてのbpでのフラ
グメントサイズ同定は、個々のピークに対して与えられ
る。それは、保持時間に基づくフラグメント組成の効果
の多くの証拠を示し;123bpのピークは、それをオー
バーラップする代わりに、124bpのピークを従え;1
92bpのピークは213bpのピークを従がえ;458bp
のピークは504,540bpのオーバーラップするピー
クを従える。
【0065】図2は、bpでの分子サイズの対数に対する
保持時間の検量線を示す。ほとんどのピークは許容でき
る直線上に存在するが、6種のピークは明らかに、サイ
ズのみに基づいて予測されるよりも強く保持される。1
23bp、192bp及び458bpのピークは、単に異常な
フラグメントではなく;234bp、267bp及び587
bpのピークはまた、クロマトグラフィーマトリックスに
対して非サイズ依存性の追加の化学吸着の形跡を示すp
BR322プラスミドの塩基配列及び制限地図に基づく
組成分析は、A−T含有率に関して、この集団における
すべてのフラグメント間の異常なフラグメントの等級程
度は次の通りであることを示す:#1、458bp(5
7.4%A−T);#2、587bp(56.7%A−
T);#3、192bp(52.6%A−T);#4、2
67bp(49.1%A−T);#6、123bp(43.
9%A−T);#10、234bp(41.0%A−
T)。234bpのフラグメントの例外に関しては、異常
に保持されたフラグメントは、最高のA−T含有率を有
する種である傾向があるが、但し、それらのフラグメン
トは、天然に存在するDNA間で利用できるものの見通
しからひじょうに高いA−T含有率を有さない。明らか
に、そのような分離は、前もって特徴づけられていない
DNA分子のサイズを正確に予測することは期待され得
ない。
保持時間の検量線を示す。ほとんどのピークは許容でき
る直線上に存在するが、6種のピークは明らかに、サイ
ズのみに基づいて予測されるよりも強く保持される。1
23bp、192bp及び458bpのピークは、単に異常な
フラグメントではなく;234bp、267bp及び587
bpのピークはまた、クロマトグラフィーマトリックスに
対して非サイズ依存性の追加の化学吸着の形跡を示すp
BR322プラスミドの塩基配列及び制限地図に基づく
組成分析は、A−T含有率に関して、この集団における
すべてのフラグメント間の異常なフラグメントの等級程
度は次の通りであることを示す:#1、458bp(5
7.4%A−T);#2、587bp(56.7%A−
T);#3、192bp(52.6%A−T);#4、2
67bp(49.1%A−T);#6、123bp(43.
9%A−T);#10、234bp(41.0%A−
T)。234bpのフラグメントの例外に関しては、異常
に保持されたフラグメントは、最高のA−T含有率を有
する種である傾向があるが、但し、それらのフラグメン
トは、天然に存在するDNA間で利用できるものの見通
しからひじょうに高いA−T含有率を有さない。明らか
に、そのような分離は、前もって特徴づけられていない
DNA分子のサイズを正確に予測することは期待され得
ない。
【0066】図3は、上記の実験と同一の実験で測定さ
れた、図1及び2からのピークのサンプルの保持時間温
度依存性を示し、但し、前記実験とは、次の点で異な
る:カラム温度が0.2℃にわたって異なり;30.4
℃のデータ点は6回の反復試験の平均を示す。ひじょう
に低い温度変化が1℃当たり平均0.41分のひじょう
に大きな保持時間移動を引き起こすことができることが
示される。この高い温度感受性の真の有意性は、塩基対
割り当ての温度感受性を得るために図2の傾斜により保
持時間温度感受性を割ることによって得られ、すなわち
Δlogbp/Δ℃=0.375である。0.1℃の温度
不安定性は、フラグメントサイズ、危険なピーク同定及
び実験から実験に調和するピークにおいて9%の不安定
性を生成するであろう。
れた、図1及び2からのピークのサンプルの保持時間温
度依存性を示し、但し、前記実験とは、次の点で異な
る:カラム温度が0.2℃にわたって異なり;30.4
℃のデータ点は6回の反復試験の平均を示す。ひじょう
に低い温度変化が1℃当たり平均0.41分のひじょう
に大きな保持時間移動を引き起こすことができることが
示される。この高い温度感受性の真の有意性は、塩基対
割り当ての温度感受性を得るために図2の傾斜により保
持時間温度感受性を割ることによって得られ、すなわち
Δlogbp/Δ℃=0.375である。0.1℃の温度
不安定性は、フラグメントサイズ、危険なピーク同定及
び実験から実験に調和するピークにおいて9%の不安定
性を生成するであろう。
【0067】図1の他の注目すべき特徴は、51〜58
7bp(より密接には、保持時間変則を伴わないピークの
ためには51〜700bp)間でフラグメント化する塩濃
度範囲はたった0.08Mであり、そして塩グラジエン
トの傾斜が溶離の最後でゼロに近づくことである。これ
らの事実は、保持時間及びピーク同定の正確性を得るた
めに実験から実験でのひじょうに正確なグラジエント制
御のための必要性及び約1,000bp以上の大きなフラ
グメントを正確に分析するための良好でない予測を示
す。
7bp(より密接には、保持時間変則を伴わないピークの
ためには51〜700bp)間でフラグメント化する塩濃
度範囲はたった0.08Mであり、そして塩グラジエン
トの傾斜が溶離の最後でゼロに近づくことである。これ
らの事実は、保持時間及びピーク同定の正確性を得るた
めに実験から実験でのひじょうに正確なグラジエント制
御のための必要性及び約1,000bp以上の大きなフラ
グメントを正確に分析するための良好でない予測を示
す。
【0068】これらの問題(分子サイズの誤差、分子サ
イズの不正確さ及び限定された分子サイズ範囲)は、従
来のHPLC溶媒が使用される場合、二本鎖DNAフラ
グメントを同定するためにアニオン交換HPLCを用い
ることの困難性を示す。本明細書に示されるような実験
は、溶離pHを6.0に下げ及び24〜40℃の範囲でカ
ラム温度を変えることは、本明細書に示される問題を軽
減しないが、但し、pHの低下は異なった問題を排除する
ことを示す。pH8以上で、保持時間はひじょうにpH感受
性であり、その結果、高いpHの緩衝液による(O2 吸収
を伴う緩衝液調製物及び酸化の小さな誤差が、保持時間
の精度を破壊する。pH6〜8で、保持時間はpH依存性で
はなく、その結果、8以下のpH値が、分子サイズの割り
当てにおける高い精度のために好ましい。
イズの不正確さ及び限定された分子サイズ範囲)は、従
来のHPLC溶媒が使用される場合、二本鎖DNAフラ
グメントを同定するためにアニオン交換HPLCを用い
ることの困難性を示す。本明細書に示されるような実験
は、溶離pHを6.0に下げ及び24〜40℃の範囲でカ
ラム温度を変えることは、本明細書に示される問題を軽
減しないが、但し、pHの低下は異なった問題を排除する
ことを示す。pH8以上で、保持時間はひじょうにpH感受
性であり、その結果、高いpHの緩衝液による(O2 吸収
を伴う緩衝液調製物及び酸化の小さな誤差が、保持時間
の精度を破壊する。pH6〜8で、保持時間はpH依存性で
はなく、その結果、8以下のpH値が、分子サイズの割り
当てにおける高い精度のために好ましい。
【0069】例2 溶離塩としてテトラメチルアンモニウムクロリドを用い
ての二本鎖DNAのアニオン交換HPLC分離 DNAサンプル、HPLC装置、HPLCカラム、HP
LC流速、分光光度検出器の設定及び一般的な実験企画
は、例1に記載される通りであった。HPLC溶離は次
の通りであった:10mMの2−(N−モルホリノ)エタ
ンスルホン酸(MES, pKa=20℃で6.15)及び
800テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)
を含む緩衝液A;10mMのMES、及び1500mMのT
MACを含む緩衝液B、pH6.04。次のグラジエント
プログラムが使用された(すべてのグラジエントセグメ
ントは直線である):0時間で12%緩衝液B(0.8
84MのTMAC);1.00分で35%緩衝液B
(1.045MのTMAC);3分で45%緩衝液B
(1.115MのTMAC);3.10分で100%緩
衝液B;3.60分で100%緩衝液B;3.70分で
12%緩衝液B。
ての二本鎖DNAのアニオン交換HPLC分離 DNAサンプル、HPLC装置、HPLCカラム、HP
LC流速、分光光度検出器の設定及び一般的な実験企画
は、例1に記載される通りであった。HPLC溶離は次
の通りであった:10mMの2−(N−モルホリノ)エタ
ンスルホン酸(MES, pKa=20℃で6.15)及び
800テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)
を含む緩衝液A;10mMのMES、及び1500mMのT
MACを含む緩衝液B、pH6.04。次のグラジエント
プログラムが使用された(すべてのグラジエントセグメ
ントは直線である):0時間で12%緩衝液B(0.8
84MのTMAC);1.00分で35%緩衝液B
(1.045MのTMAC);3分で45%緩衝液B
(1.115MのTMAC);3.10分で100%緩
衝液B;3.60分で100%緩衝液B;3.70分で
12%緩衝液B。
【0070】図4は、カラムが29.7℃でサーモスタ
ットされ、そして10μLのDNAサンプルが注入され
る場合の代表的な溶離プロフィールを示す。個々のピー
クに見られる主な肩は、カラムの上部でのボイドの形跡
であり、そしてカラムの方向を逆にし、又はカラムを取
り換えることによって排除され;それはピークの保持時
間分析を妨害しなかった。この溶離プロフィールは図2
のプロフィールとは性質上異なる。図4におけるピーク
にわたってのフラグメントサイズの割り当てを得るため
には、類似する形状の塩グラジエントが9.5分間にわ
たって適用され、15倍の多量のDNAサンプルが注入
され、ピークが刻々の試験管に集められ、そして個々の
集められた連動が4%アガロースゲル中で電気泳動さ
れ、これは続いて臭化エチジウムにより染色された。螢
光バンドパターンは、制限消化物のフラグメントが、図
4におけるピーク割り当てを判断する分子サイズの厳格
なオーダーでアニオン交換カラムから溶離されることを
明確に示した。事実、遅いサイズ検量クロマトグラフィ
ー試験は、図4に見られるよりも良好なピーク分析を付
与し、いづれかの場合においては基本分析ではないが、
8番目のピークを184及び192bp成分に及び13番
目のピークをその458,504,及び540bpの成分
に分割する。
ットされ、そして10μLのDNAサンプルが注入され
る場合の代表的な溶離プロフィールを示す。個々のピー
クに見られる主な肩は、カラムの上部でのボイドの形跡
であり、そしてカラムの方向を逆にし、又はカラムを取
り換えることによって排除され;それはピークの保持時
間分析を妨害しなかった。この溶離プロフィールは図2
のプロフィールとは性質上異なる。図4におけるピーク
にわたってのフラグメントサイズの割り当てを得るため
には、類似する形状の塩グラジエントが9.5分間にわ
たって適用され、15倍の多量のDNAサンプルが注入
され、ピークが刻々の試験管に集められ、そして個々の
集められた連動が4%アガロースゲル中で電気泳動さ
れ、これは続いて臭化エチジウムにより染色された。螢
光バンドパターンは、制限消化物のフラグメントが、図
4におけるピーク割り当てを判断する分子サイズの厳格
なオーダーでアニオン交換カラムから溶離されることを
明確に示した。事実、遅いサイズ検量クロマトグラフィ
ー試験は、図4に見られるよりも良好なピーク分析を付
与し、いづれかの場合においては基本分析ではないが、
8番目のピークを184及び192bp成分に及び13番
目のピークをその458,504,及び540bpの成分
に分割する。
【0071】図5は、図4におけるピークのためにbpで
の分子サイズの対数に対する保持時間の検量線を示す。
現在、ピークは、滑らかな曲線上に存在する(ピーク分
析により可能にされる程度に)。非直線は、塩グラジエ
ントプログラムの形状を細かに区別する必要性を単純に
もたらし;0〜3分の間の二直線グラジエントは滑らか
な曲線により交換されるべきである。フラグメント組成
について心配しないで、正確に分子サイズを予測するで
あろう線上分子サイズ検量線が得られる。
の分子サイズの対数に対する保持時間の検量線を示す。
現在、ピークは、滑らかな曲線上に存在する(ピーク分
析により可能にされる程度に)。非直線は、塩グラジエ
ントプログラムの形状を細かに区別する必要性を単純に
もたらし;0〜3分の間の二直線グラジエントは滑らか
な曲線により交換されるべきである。フラグメント組成
について心配しないで、正確に分子サイズを予測するで
あろう線上分子サイズ検量線が得られる。
【0072】図6は、図4及び5の実験と同一の実験で
測定される、図4及び5からのほとんどのピークの保持
時間温度依存性を示し、但し、前記実験とは、カラム温
度が2.4℃にわたって異なることで異なっている。T
MACは、次の2種の点で、Naclに見出される感受
性よりも異なった保持時間温度感受性を示す:(a)傾
斜は0.41分/℃からひじょうにゆるくなり、そして
(b)傾斜はフラグメントサイズにほぼ比例する。最初
の事実の論理的な結果は、TMACが許容できる保持時
間程度を得るためにHPLCカラムのサーモスタットを
ひじょうに単純にすることである。第2の事実の論理的
な結果は、サイズ分析が、温度が高められるにつれて、
有意に高められることである。事実、保持時間温度感受
性の底下は、図3及び6におけるグラフの傾斜の単純な
比較から推測されるよりも大きい。なぜならば、TMA
C実験におけるグラジエントはNacl実験におけるグ
ラジエントよりも、持続期間で1.9倍長いからであ
る。より信頼できる比較のためには、図6の傾斜は1.
9により割り算されるべきである。
測定される、図4及び5からのほとんどのピークの保持
時間温度依存性を示し、但し、前記実験とは、カラム温
度が2.4℃にわたって異なることで異なっている。T
MACは、次の2種の点で、Naclに見出される感受
性よりも異なった保持時間温度感受性を示す:(a)傾
斜は0.41分/℃からひじょうにゆるくなり、そして
(b)傾斜はフラグメントサイズにほぼ比例する。最初
の事実の論理的な結果は、TMACが許容できる保持時
間程度を得るためにHPLCカラムのサーモスタットを
ひじょうに単純にすることである。第2の事実の論理的
な結果は、サイズ分析が、温度が高められるにつれて、
有意に高められることである。事実、保持時間温度感受
性の底下は、図3及び6におけるグラフの傾斜の単純な
比較から推測されるよりも大きい。なぜならば、TMA
C実験におけるグラジエントはNacl実験におけるグ
ラジエントよりも、持続期間で1.9倍長いからであ
る。より信頼できる比較のためには、図6の傾斜は1.
9により割り算されるべきである。
【0073】分子サイズの割り当て精度に対する溶離塩
交換の効果は表1に明確に示され、ここで、推定された
分子サイズの温度感受性をカラム5で評価するために、
図5(第4段)の対応する傾斜により図6(第3段)の
傾斜で割り算し;この変換は、2種の実験におけるグラ
ジエントプログラムの差異及び検量曲線形状の差異のた
めに正しい。究極的な実際の関係は第6段に要約され;
Naclにおいては、分離は1%以内でフラグメントサ
イズの精度を維持するために0.01℃以内にサーモス
タットされるべきであり、そして0.07℃の熱精度は
TMACにおいて同じか又はより良好なサイズ精度を生
むであろう。
交換の効果は表1に明確に示され、ここで、推定された
分子サイズの温度感受性をカラム5で評価するために、
図5(第4段)の対応する傾斜により図6(第3段)の
傾斜で割り算し;この変換は、2種の実験におけるグラ
ジエントプログラムの差異及び検量曲線形状の差異のた
めに正しい。究極的な実際の関係は第6段に要約され;
Naclにおいては、分離は1%以内でフラグメントサ
イズの精度を維持するために0.01℃以内にサーモス
タットされるべきであり、そして0.07℃の熱精度は
TMACにおいて同じか又はより良好なサイズ精度を生
むであろう。
【0074】図4はTMACの他の機能的な利点を示
し:保持時間の塩濃度感受性が減じられ(溶離塩濃度範
囲は、0.08Mの代わりに0.23Mである)、そし
てグラジエント傾斜は最大のフラグメントの分析のため
にゼロに近づかない。これらの事実は、グラジエント精
度が、特に1,000bp又はそれ以上のオーダーでのフ
ラグメントのために、分子サイズ精度を制限せず;TM
ACはNaclよりも大きな分析用分子サイズ範囲を付
与することを包含する。
し:保持時間の塩濃度感受性が減じられ(溶離塩濃度範
囲は、0.08Mの代わりに0.23Mである)、そし
てグラジエント傾斜は最大のフラグメントの分析のため
にゼロに近づかない。これらの事実は、グラジエント精
度が、特に1,000bp又はそれ以上のオーダーでのフ
ラグメントのために、分子サイズ精度を制限せず;TM
ACはNaclよりも大きな分析用分子サイズ範囲を付
与することを包含する。
【0075】TMACの分子サイズ精度利点は、塩グラ
ジエントが図1におけるのと同じ合計のグラジエント期
間を付与するために圧縮される場合に保存される。分子
サイズ分析はNaclにおけるよりもTMACにおいて
が悪く思えるが(少数のピークが分析される)、Nac
lにおける高い分析性は、組成物依存性保持時間の例外
から生じる。二本鎖DNAフラグメントの信頼でき且つ
正確な分析のためには、好ましくは、保持時間が厳密に
サイズ依存性であり、そしてサイズ分析性が次のような
方法により改良される:(a)HPLC流速の上昇(た
とえば1.0から1.5mL/分に)、(b)検出器にカ
ラムを連結する管の長さ及び直径を最小にすること、
(c)長さ直径割合及び合計の長さを減じるためにカラ
ム寸法の改良、及び(d)カラムの上部での死空間を最
小にするためにカラムの直径よりも小さな直径を有する
カラム入口フリットを用いること。
ジエントが図1におけるのと同じ合計のグラジエント期
間を付与するために圧縮される場合に保存される。分子
サイズ分析はNaclにおけるよりもTMACにおいて
が悪く思えるが(少数のピークが分析される)、Nac
lにおける高い分析性は、組成物依存性保持時間の例外
から生じる。二本鎖DNAフラグメントの信頼でき且つ
正確な分析のためには、好ましくは、保持時間が厳密に
サイズ依存性であり、そしてサイズ分析性が次のような
方法により改良される:(a)HPLC流速の上昇(た
とえば1.0から1.5mL/分に)、(b)検出器にカ
ラムを連結する管の長さ及び直径を最小にすること、
(c)長さ直径割合及び合計の長さを減じるためにカラ
ム寸法の改良、及び(d)カラムの上部での死空間を最
小にするためにカラムの直径よりも小さな直径を有する
カラム入口フリットを用いること。
【0076】
【表1】
【図1】これは、制限エンドヌクレアーゼHae IIIに
よるプラスミドpBR322の消化により創造された二
本鎖DNAフラグメントの分離のためのアニオン交換H
PLC溶離を示し、ここでNaclが溶離塩として使用
される。
よるプラスミドpBR322の消化により創造された二
本鎖DNAフラグメントの分離のためのアニオン交換H
PLC溶離を示し、ここでNaclが溶離塩として使用
される。
【図2】これは、保持時間がフラグメントの長さ(塩基
対)の対数に対してグラフ化される場合、図1における
溶離プロフィールから得られる分子サイズ検量線を示
し、ここでフラグメントサイズの割り当て(それぞれの
ピーク上で示される)は、別々の集められたクロマトグ
ラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づいて行
なわれた。
対)の対数に対してグラフ化される場合、図1における
溶離プロフィールから得られる分子サイズ検量線を示
し、ここでフラグメントサイズの割り当て(それぞれの
ピーク上で示される)は、別々の集められたクロマトグ
ラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づいて行
なわれた。
【図3】これは、図1における分離と同一の一連の分離
からの保持時間データを用いて、図1及び2の制限フラ
グメントのための温度に対するアニオン交換HPLC保
持時間のグラフを示し、但し、それらが示される種々の
温度でサーモスタットされる事実で異なる。
からの保持時間データを用いて、図1及び2の制限フラ
グメントのための温度に対するアニオン交換HPLC保
持時間のグラフを示し、但し、それらが示される種々の
温度でサーモスタットされる事実で異なる。
【図4】これは図1における分離にひじょうに類似する
分離からのアニオン交換HPLC溶離プロフィールを示
し、ここでテトラメチルアンモニウムクロリドが溶離塩
としてNaclの代わりに使用された。
分離からのアニオン交換HPLC溶離プロフィールを示
し、ここでテトラメチルアンモニウムクロリドが溶離塩
としてNaclの代わりに使用された。
【図5】これは、図4における溶離プロフィールから得
られる、図2における検量線のような分子サイズ検量線
を示し、ここでフラグメントサイズの割り当て(それぞ
れのピーク上で示される)は、別々の集められたクロマ
トグラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づい
て行なわれた。
られる、図2における検量線のような分子サイズ検量線
を示し、ここでフラグメントサイズの割り当て(それぞ
れのピーク上で示される)は、別々の集められたクロマ
トグラフィーピークのアガロースゲル電気泳動に基づい
て行なわれた。
【図6】これは、図4における分離のような一連の分離
からの保持時間データを用いて、図3におけるような温
度に対するアニオン交換HPLC保持時間のグラフを示
し、但し、それらが示される種々の温度でサーモスタッ
トされる事実で異なる。
からの保持時間データを用いて、図3におけるような温
度に対するアニオン交換HPLC保持時間のグラフを示
し、但し、それらが示される種々の温度でサーモスタッ
トされる事実で異なる。
Claims (33)
- 【請求項1】 4〜8の範囲のpHを有する、核酸のア
ニオン−交換クロマトグラフィーのための有用な水性溶
媒であって: (a) (1)ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニ
ウム及びテトラアルキルアンモニウム(ここで前記アル
キル基はメチル及びエチルのいづれかの組合せである)
から成る群から選択されたカチオン及び (2)ブロミド、クロリド、アセテート、ホルメート、
ニトレート、過塩素酸塩、リン酸二水素、エタンスルホ
ネート及びメタンスルホネートからなる群から選択され
たアニオンから成り、カチオン(1)とアニオン(2)
が等モル濃度である0.5 〜1.5Mの濃度範囲の溶離
塩及び (b)3.5〜8.5の範囲のpKaを有する緩衝酸
(該酸は0.05Mを越えない濃度を有する)を含有す
ることを特徴とする、核酸のアニオン−交換クロマトグ
ラフィーのために有用な水性溶媒。 - 【請求項2】 前記緩衝酸がカチオン性であり、そして
電荷上カチオン性又は中性である複合塩基を有する請求
項1記載の溶媒。 - 【請求項3】 前記アニオンがホルメートである請求項
1記載の溶媒。 - 【請求項4】 水性組成物であって、水中における前記
組成物の1/2〜1/20の希釈度が請求項1記載の溶
媒をもたらすように、請求項1記載の溶媒の2〜20倍
濃縮物を含有している水性組成物。 - 【請求項5】 また、1μg/l〜1g/lの濃度範囲
で核酸を含有している請求項4記載の組成物。 - 【請求項6】 前記核酸が二本鎖DNAを含有している
請求項5記載の組成物。 - 【請求項7】 請求項1記載の溶媒とアニオン−交換固
体との組み合わせ物を含有している組成物。 - 【請求項8】 前記固体がポリアクリル酸主鎖を含有し
ている請求項7記載の組成物。 - 【請求項9】 前記固体がジエチルアミノエチル官能基
を含有している請求項7記載の組成物。 - 【請求項10】 前記固体がポリエチレンイミン官能基
を含有している請求項7記載の組成物。 - 【請求項11】 前記固体が10μm〜2μmの間の平
均直径を有する粒子を含有している請求項7記載の組成
物。 - 【請求項12】 前記固体が実質的に非多孔性である請
求項7記載の組成物。 - 【請求項13】 前記固体がポリスチレン主鎖を含有し
ている請求項7記載の組成物。 - 【請求項14】 さらに、1μg/l〜1g/lの濃度
範囲で核酸を含有している請求項7記載の組成物。 - 【請求項15】 分子の大きさの差異に基づいて核酸を
分離し、そして分析するための方法であって:この方法
は、 (a)核酸を含む試験サンプルとアニオン−交換固体と
を接触せしめ; (b)段階(a)の固体と請求項1記載の一連の溶媒と
を接触せしめ、ここで溶離塩の濃度を、溶媒の主部分
が、前記接触の後、前記固体から分離されるように、
0.5Mから1.5Mに計画的に高め、そして (c)核酸について前記一連の溶媒を分析することを含
んでいる、核酸を分離し、分析する方法。 - 【請求項16】 前記固体を含む溶離塩濃度を連続して
高める請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 前記固体から分離された溶媒中におけ
る核酸の濃度を、250nm〜290nmの波長範囲での紫
外線吸光度により測定する請求項15記載の方法。 - 【請求項18】 前記固体は10μm〜2μmの間の平
均直径の粒子を含有している請求項15記載の方法。 - 【請求項19】 前記固体が、1mm〜6mmの直径及
び10mm〜60mmの長さの円柱状形のカラム中に含
まれている請求項18記載の方法。 - 【請求項20】 前記工程を完結するために必要とされ
る合計時間が2分〜30分の間である請求項15記載の
方法。 - 【請求項21】 液体試験サンプル中の一本鎖DNA
(ssDNA)及びRNAを含有する汚染物から液体試
験サンプル中の二本鎖DNA(dsDNA)を分離する
方法において、 a)前記試験サンプルを担体物質に共有結合しているア
ラルキルアミン分子を有する固体担体物質と接触させ;
かつ b)前記固体担体物質を前記液体試験サンプルから分離
させる工程を含んでいる、液体試験サンプル中の二本鎖
DNA(dsDNA)を分離する方法。 - 【請求項22】 前記アラルキルアミンを、実質的にフ
ェニルブチルアミン、フェニルプロピルアミン、フェニ
ルエチルアミン及びナフチルエチルアミンより成る群か
ら選択する請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 前記試験サンプルは、ジアルキルアン
モニウム、トリアルキルアンモニウム又はテトラアルキ
ルアンモニウム塩を含有している請求項21に記載の方
法。 - 【請求項24】 前記塩は、0.5〜1.0Mの濃度範囲
で存在している請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記試験サンプルをクロマトグラフィ
分離プロセスにかける更なる工程を含んでいる請求項2
1に記載の方法。 - 【請求項26】 前記クロマトグラフィ法は高圧液体ク
ロマトグラフィである請求項25に記載の方法。 - 【請求項27】 4〜8の範囲のpHを有する、核酸の
アニオン−交換クロマトグラフィーのための有用な水性
溶媒であって: (a) (1)ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニ
ウム及びテトラアルキルアンモニウム(ここで前記アル
キル基はメチル及びエチルのいづれかの組合せである)
から成る群から選択されたカチオン及び (2)ブロミド、クロリド、アセテート、ホルメート、
ニトレート、過塩素酸塩、リン酸二水素、エタンスルホ
ネート及びメタンスルホネートからなる群から選択され
たアニオンから成り、カチオン(1)とアニオン(2)
が等モル濃度である0.5 〜1.5Mの濃度範囲の溶離
塩及び (b)3.5〜8.5の範囲のpKaを有する緩衝酸
(該酸は0.05Mを越えない濃度を有する)から成
る、核酸のアニオン−交換クロマトグラフィーのために
有用な水性溶媒を含有する請求項21に記載の方法。 - 【請求項28】 前記試験サンプルをクロマトグラフィ
分離工程にかける更なる工程を含んでいる請求項27に
記載の方法。 - 【請求項29】 前記クロマトグラフィ法は高圧液体ク
ロマトグラフィである請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 前記固体担体は、アクリルマトリック
スである請求項21に記載の方法。 - 【請求項31】 前記固体担体は、エポキシド−誘導体
化された多孔性又は非多孔性の粒状アクリルマトリック
スである請求項30に記載の方法。 - 【請求項32】 前記分離工程は、前記試験サンプルを
濾過して前記担体物質を除去する工程を含んでいる請求
項21に記載の方法。 - 【請求項33】 前記分離工程には、前記試験サンプル
を遠心分離器中に置き、前記サンプルを遠心分離して前
記液体試験サンプルから前記固体担体物質を分離させる
ことを包含する請求項21に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67973691A | 1991-04-03 | 1991-04-03 | |
US679736 | 1991-04-03 |
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---|---|---|---|
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KR (1) | KR920019931A (ja) |
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GR (1) | GR930300019T1 (ja) |
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US5630924A (en) | 1995-04-20 | 1997-05-20 | Perseptive Biosystems, Inc. | Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis |
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