JP5101102B2 - 核酸を抽出するための方法 - Google Patents
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Description
a)カリウムイオン、ここで上記酸性水溶液中のカリウムイオンの最終濃度は、0.3Mから飽和濃度の範囲内である;および
b)上記酸性水溶液のpHを2.0〜4.0の範囲内に調整するための酸。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で7本、1〜7の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)250μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)次いで、450μlの溶液Dをカラムに添加し、この溶液Dを含むカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離し、プラスミドDNAを溶液E中に溶出した。
溶液Aは、20μg/ml RNase A、50mM Tris-HCl(pH8.0)、および10mM EDTA(pH8.0)を含有する;
溶液Bは、0.2M NaOHおよび1%SDSを含有する;
溶液Cは、2.5M KClおよび酢酸(HAC)を含有する。溶液C中の種々のHAC濃度を表1に示す;
溶液Dは、70%エタノールである;そして
溶液Eは、10mM Tris-HClおよび5mM EDTA、pH8.0を含有する。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で7本、1〜7の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)250μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離し、プラスミドDNAを溶液E中に溶出した。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液Cは、2M HACおよび種々の濃度のKClを含有する。溶液C中の種々のKCl濃度を表2に示す。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で3本、1〜3の番号を付した)に入れ、30秒間12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)それぞれ500μlの溶液C1、C2、C3を添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。プラスミドDNAは、カラムから溶液E中に溶出された。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液C1、C2、およびC3は、2M HACと、(C1の場合)K2SO4、(C2の場合)KNO3、または(C3の場合)KClとを含有する。K2SO4、KNO3、およびKClの濃度を表3に示す。
手順:
1)7μgのDNAを含有する200μlの水溶液を移した;
2)100μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(1)と混合した;
3)(1)と(2)との混合溶液をカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。混合溶液を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
4)450μlの溶液Dをカラムに添加し、次いで、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
5)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
6)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。DNAは、水溶液から溶液E中に溶出された;そして
7)カラムから溶出されたDNAの収量は、5.1μgであった(260nmで測定)。
溶液DおよびEは実施例1と同様である。溶液Cは、1M HACおよび2.5M KClを含有する。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で4本、1〜4の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)それぞれ500μlの溶液C1、C2、C3、C4を添加し、A、B、およびCの混合溶液のpHを3.1にした。A、B、およびCの混合溶液を、管を逆さにして上下させることにより充分に混合し、4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。プラスミドDNAは、カラムから溶液E中に溶出された。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液C1は、0.2M HClおよび2.5M KClを含有する。溶液C2は、0.2M HNO3および2.5M KClを含有する。溶液C3は、0.1M H2SO4および2.5M KClを含有する。溶液C4は、4M HACおよび2.5M KClを含有する(表4)。
Claims (4)
- 核酸の分離および精製のための方法であって、
(a)カリウムイオン含有酸性水溶液の適切な量を、核酸を含む原料の生物材料に添加する工程;
(b)該カリウムイオン含有酸性水溶液を該原料の生物材料と混合する工程であって、ここで、混合結合溶液中の該カリウムイオンの濃度が0.3Mから飽和濃度までの範囲内であり、そして該混合結合溶液のpHが2.0〜4.0の範囲内であり;ここで、該カリウムイオンが、K2SO4、KNO3、KCl、酢酸カリウム、およびそれらの混合物からなる群から選択され;そしてここで、該酸性水溶液が、酢酸、プロピオン酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、工程;
(c)該混合結合溶液中の該カリウムイオンの該濃度および該pHを維持しながら珪素含有材料を該混合結合溶液に追加の結合剤の不在下で添加する工程であって、ここで、該原料の生物材料中の該核酸が、該珪素含有材料に結合可能である、工程;
(d)該珪素含有材料と結合した核酸を不純物から分離する工程;および
(e)該珪素含有材料から核酸を分離および溶出する工程
からなる、方法。 - 前記所望の核酸がDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記混合結合溶液中のカリウムイオンの濃度が1M以上である、請求項1に記載の方法。
- 前記混合結合溶液のpHが2.6〜3.9である、請求項1に記載の方法。
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