JPH0242969A

JPH0242969A - 生物学的試料の処理装置

Info

Publication number: JPH0242969A
Application number: JP19170488A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Yamamoto; 達夫山本; Tadashi Kikyoya; 正桔梗谷
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1988-07-30
Filing date: 1988-07-30
Publication date: 1990-02-13
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: JPH084490B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、生物学的試料の処理装置、特に複数の試料を
同時かつ連続的に処理し得る自動化された試料の処理装
置に関する。

（従来の技術）生物学的試料から所望の物質を単離・精製する場合には
、該物質の種類に応じて種々の方法が採用される。例え
ば、バイオテクノロジーの分野において、菌体や細胞か
らのＤＮＡの分離・精製には。

ボイリング法、アルカリ法などが採用されている。

これらの方法によれば、比較的大きな規模でのＤＮＡの
分離・精製ができ、　　ＤＮＡを１００μｇ以上の量で
得ることが可能である。しかし、これらの方法は。

いずれも複雑な工程を必要とする手作業であり自動化さ
れにくい。手作業であるためＯＮへの回収率や純度など
にバラツキが生じ、技術差による個人間の格差も大きい
。さらに、このような方法で得られたＤＮＡには、　　
ＲＮＡ、各種蛋白質、多糖類などが混入しており、その
ままではＤＮ＾の配列分析。

プラスミドＤＮＡからの断片の精製などの各種実験が正
しくなされ得ない。

生物学的試料を自動的に処理し、高純度で目的とする物
質を単離・精製し得る装置としては。

般に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が。

高性能であり、しかも再現性に優れていることから、広
範囲に利用されている。しかし２例えば菌体からＤＮＡ
の分離を目的として、このＩＩＰＬｃ装置に菌体溶解物
を試料として供給するときには、該試料中の多量の不純
物（セルデブリスなど）による分離カラムの損傷などを
防ぐため、試料の前処理を行う必要がある。さらに、カ
ラムの再生などの操作が煩雑であり、完全に自動的な分
離・精製操作を行なうことができない。

他方９分離分析技術の進歩により、　ＨＰＬＣのような
高価な装置を用いず、ミニカラムを用いた簡単なカラム
操作によって、比較的精度よ（分析を行う方法の開発が
進められている。ミニカラムとは。

プラスチック製のカラムに充填剤が充填された小型のオ
ープンカラムであり、ディスポーザブルカラムとして市
販されている。しかし、このミニカラムによる分析は、
いずれもバッチ法による手作業でなされている。従って
、複数の試料を分析する場合、各試料、洗浄液、溶離液
などの一定量を計量した後、順序よく供給しなければな
らず、煩雑である。ミニカラムを利用して自動的に生物
学的試料の処理を行ない、目的とする成分を簡便かつ高
純度で単離・精製し得る装置の開発が望まれる。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記従来の問題を解決するものであり。

その目的とするところは、複数の試料を同時かつ連続的
に処理し、試料中の目的とする成分を簡単な操作で大量
に単離・精製し得る生物学的試料の処理装置を提供する
ことにある。本発明の他の目的は、比較的大量の菌体を
連続的に処理し、該菌体中のＤＮＡを簡便かつ高純度で
単離・精製することの可能な生物学的試料の処理装置を
提供することにある。

（課題を解決するための手段）本発明の生物学的試料の処理装置は、少なくともその一
部に吸着剤が充填されたカラムであって。

カラム振盪手段と連結されたカラム；該カラムに供給さ
れるべき前処理試料を収容するための槽であって、該前
処理試料を濾過するためのフィルターを備えた前処理試
料槽；該カラムに連結され。

カラム処理を行うためのカラム処理用媒質を収容する媒
質収容容器；該前処理試料槽から該カラムに該前処理試
料を供給するための供給手段Ａ；該媒質収容容器から該
カラムに該処理用媒質を供給するための供給手段Ｂ；お
よび該カラム振盪手段および該供給手段ＡおよびＢを制
御するための制御手段；を有し、そのことにより上記目
的が達成される。

本発明の生物学的試料の処理装置は、少なくともその一
部に吸着剤が充填されたカラムであって。

カラム振盪手段と連結されたカラム；咳カラムに供給さ
れるべき前処理試料または前処理されるべき試料を収容
するための槽であって、該前処理試料または該槽内で前
処理された試料を濾過するためのフィルターを備え、か
つ前処理試料槽振盪手段と連結された前処理試料槽；該
カラムおよび／または該前処理試料槽に連結され、試料
の前処理を行うための試料処理用媒質、カラム処理を行
なうためのカラム処理用媒質および／または試料を個別
に収容する試料・媒質収容容器；該試料・媒質収容容器
から該前処理試料槽に該試料処理用媒質および／または
試料を供給するための供給手段Ｃ；該前処理試料槽から
該カラムに該前処理試料または該槽内で前処理された試
料を供給するための供給手段Ａ　３８ｇ試料・媒質収容
容器から該カラムに該カラム処理用媒質を供給するため
の供給手段Ｂ；および該カラム振盪手段、該前処理試料
槽振盪手段、および供給手段Ａ、ＢおよびＣを制御する
ための制御手段；を有し、そのことにより上記目的が達
成される。

本発明の生物学的試料の処理装置は９例えば。

第１図に示すように、カラム１．前処理試料槽２゜複数
の媒質収容容器３１．供給手段Ａ４．供給手段Ｂ５．お
よび供給手段ＡおよびＢを制御する制御手段７．を有す
る。

カラム１は２例えば、第１図に示すように、カラムの一
方の空間に充填された吸着剤でなる吸着剤ＪｉｌＯと、
該カラムの他方の部分に形成された空間でなるリザーバ
一部分１１とを有する。リザーバ一部分１１において前
処理試料やカラム処理用媒質の保持がなされ得る。吸着
剤層１０において試料中の成分が吸着される。この吸着
剤層１０とリザーバ一部分１１との間、および吸着剤Ｊ
ｉｉｌＯとカラム端部との間には、フィルター１３およ
び１２が装着されている。カラム１の底部（吸着剤層側
の端部を意味する）には、下方へ突出する溶出液の流出
口１４゜およびこの流出口１４と接続された回収用チュ
ーブ１５およびバルブ１６が配設されている。カラム１
の上端部には、カラム１内を気密に密閉し得るカラム栓
１７が装着され、かつチューブ１８およびバルブ１９が
装着されている。チューブ１８およびバルブ１９により
、カラム１内の媒質の交換時に残留した媒質を系外に除
去すること、およびカラム１内を開放系にすることが可
能である。カラム１には、前処理試料、カラム処理用媒
質などを供給するためのチューブ４１および５１が連結
されている。

カラム１は、カラム保持台１００に保持される。

カラム保持台１００は、カラム１を垂直状態に保持する
一対の保持具１０１および１０１と、各保持具１０１を
その片面に取付けた固定板１０２を有する。このカラム
保持台１００は、振盪手段８と連結されている。振盪手
段８は１例えば、このカラム保持台１００の固定板１０
２を中央部に取付けた回転軸８４と、該回転軸８４の両
端部を回動可能に支持する支持体８５とを有する。この
カラム保持台１００および振盪手段８において、各保持
具１０１は、固定板、１０２および回転軸８４を介して
、支持体８５に回動可能に支持されている。それゆえ、
この振盪手段８では３回転軸８４の回動により、カラム
１が振盪（回動）され得る。カラムｌは１回転軸８４の
まわりに１８０９まで回動可能である。カラムｌが回動
することにより、リザーバ一部に注入された前処理試料
を撹拌することが可能であり、さらに、９０°以上に回
動させることによりリザーバ一部に残留したカラム処理
用媒質などを、系外に速やかに除去することができる。

前処理試料槽２は、前処理試料を収容するための槽であ
って、前処理容器２０およびフィルター２１を有する。

前処理試料槽２は、第１図に示すように、チューブ４１
（供給手段Ａ４に包含される）を介してカラム１に連結
されている。前処理容器２０の上端部には、該容器内を
気密に密閉し得る前処理容蓋栓２２が装着され、かつ該
容器内を開放系にするためのチューブ２３およびバルブ
２４が装着される。フィルター２１は、前処理試料中の
細胞殻など。

カラム操作中にカラムの吸着剤の目詰まりを引き起こす
ような物質を濾過する働きを有し、その形状および設置
箇所は特に限定されない。ここでは。

フィルター２１は、有底円筒状であり、前処理容器２０
内に前処理容蓋栓２２を挿通して延びるチューブ４１の
先端部に取りつけられている。このほか７例えば１球状
のフィルターが用いられる。フィルターの孔径は、　０
．０５〜１ｉａｒ、好ましくは０．１〜０．５ａｍの範
囲とされる。０．０５＋ｎ＋ａを下まわると、目詰まり
を起こしやすくなり、１ｍｍを越えると固形分を有効に
除去できない。フィルターの素材は特に限定されないが
、金属、プラスチック、またはセラミックスなどの焼結
材が好適である。後述の試料の処理操作において、フィ
ルター２１が存在しない場１よ合にＣ２前処理された試料に含まれる固形成分はに送ら
れたときに、捕捉された固形成分が溶解し孤て溶陽液中に混入する恐れがある。本発明においては、
カラム外の前処理試料槽２にフィルターが設けられてい
るので、このような混入が回避される。

カラム処理用媒質を収容する複数の媒質収容容器３１は
、いずれもチューブ５１（供給手段Ｂ５に包含される）
を介してカラム１のリザーバ一部分１１に接続されてい
る。これら複数の媒質収容容器。

例えば、容器３１１．３１２．３１３．３１４．３１５
には、それぞれに洗浄液、溶離液、再生液などが収容さ
れる。これらの溶液は、試料のカラム処理を行なうため
のカラム処理用媒質である。

供給手段Ａ４は、前処理試料槽２内の前処理試料をカラ
ム１に供給するために設けられる。この供給手段Ａ４は
２例えば、チューブ４１およびポンプ４２で構成される
。チューブ４１の一端はカラム１のカラム栓１７を挿通
してリザーバ一部１１に接続され、他端は、前処理試料
槽２２を挿通して前処理容器２０内に開口している。供
給手段Ｂ５は、媒質収容容器３１内の媒質をカラム１に
供給するために設けられる。この供給手段Ｂ５は１例え
ば、チューブ５１および５１１〜５１５．ポンプ５３．
およびバルブ５２で構成される。チューブ５１の一端は
、カラム１のカラム栓１７を挿通してリザーバ一部１１
に接続され、他端は、バルブ５２を介してチューブ５１
１〜５１５に接続されている。チューブ５１１〜５１５
は、それぞれ容器３１１〜３１５と接続されている。ポ
ンプ５３はチューブ５の任意の箇所に設けられる。容器
内は、上記ポンプの動力によりこのチューブ５１１〜５
１５および５１内を通って容器３１からカラム１に供給
される。バルブ５２は、複数の容器３１のうちの所定の
容器をカラム１に連通させるための切り換えバルブであ
る。ポンプ５３は、　ＩＩＰＬＣに用いられるような高
級なポンプでなくてもよく１通常の多連式のチューブポ
ンプでかまわない。バルブ５２は、カラム１にチューブ
５１１〜５１５および５１を介して連結された複数の容
器３１のうちから、いずれかの容器を試料処理目的に応
じてカラムに選択的に連通させる機能を有する。このバ
ルブとしては２通常。

切り換えバルブが用いられる。

制御手段７は９例えばコンピュータでなり、ポンプ４２
．５３．バルブ１６．１９．２４．５２．およびカラム
振盪装置８や後述のフラクションコレクター７０に接続
されている。この制御手段７は、ポンプの流量調整、バ
ルブの切換え、カラム１の振盪およびフラクションコレ
クターなどを制御するために設けられる。この制御手段
７により、ポンプによ容器とカラムとの選択的連通が、
自動的になされる。例えば、コンピュータでなる制御手
段は、あらかじめインプットされた情報に基づいて、複
数また。フラクションコレクターにより複数のカラムを
使って複数の試料を分析する場合にも、制御手段７によ
り、所望の回収容器７００（後述）が選択され得る。

第２図は、第１図の装置と同様であるが、供給手段Ａお
よびＢの連結状態が異なる。第２図の装置においては、
チューブ５１の一端がカラム１に直接連結されずにチュ
ーブ４１　（供給手段Ａに包含される）に、ポンプ４２
の上流側（前処理試料槽側）においてバルブ５４を介し
て接続されている。チューブ４１のバルブ５４よりも下
流の部分が、供給手段ＡとＢとで共用されている。バル
ブ５４を切り換えることにより前処理試料槽２からの前
処理試料または媒質収容容器３１からの媒質がポンプ４
２を介してカラム１へ供給され得る。

本発明の装置の他の実施Ｂ様を第３図に示す。

この装置においては、前処理試料槽２で未処理の試料を
処理し、これを自動的にカラム１に供給し。

カラム処理を行なうことが可能である。この装置の前処
理試料槽２は、前処理試料槽保持台２００に保持される
。前処理試料槽保持台２００は、前処理試料槽を垂直状
態に保持する一対の保持具２０１および２０１と、各保
持具をその片面に取付けた固定板２０２とを有する。こ
の前処理試料槽保持台２００は、振盪手段９と連結され
る。振盪手段９は９例えば、この前処理試料槽保持台２
００の固定板２０２を中央部に取付けた回転軸９１と該
回転軸９１の両端部を回動可能に支持する支持体９２と
を有する。この前処理試料槽保持台２００および振盪手
段９において、各保持具２０１は、固定板２０２および
回転軸９１を介して支持体９２に回動可能に支持されて
いる。

それゆえ、この振盪手段９では回転軸９１の回動により
前処理試料槽２が振盪（回動）され得る。この前処理試
料槽２には、後述の試料・媒質収容容器からの試料や試
料処理用媒質が供給され、前処理試料槽が回動すること
により供給された試料や媒質が撹拌され、試料の前処理
がなされる。

さらに第３図の装置においては、試料の前処理を行なう
ための試料処理用媒質および／または試料を個別に収容
するための複数の試料・媒質収容容器３２が設けられる
。これら複数の容器１例えば。

３２１、３２２．３２３．３２４．３２５には、それぞ
れに試料。

試料処理用媒質、さらに必要に応じて洗浄液などが収容
される。これらの試料や試料処理用媒質は。

供給手段Ｃ６により前処理試料槽２に供給される。

供給手段Ｃ６は１例えば、チューブ６１および６１１〜
６１５．ポンプ６３およびバルブ６２により構成される
。

チューブ６１の一端は前処理試料槽２の前処理容器枠２
２を挿通して前処理容器２０内に開口し、他端は。

バルブ６２を介してチューブ６１１〜６１５に接続され
ている。チューブ６１１〜６１５はそれぞれ、容器３２
１〜３２５と接続されている。容器３２内の試料や試料
処理用媒質は、ポンプ６３の動力により、このチューブ
６１１〜６１５および６１内を通って、前処理試料槽２
に供給される。バルブ６２は、複数の容器３２のうちの
所定の容器を前処理試料槽２に連通させるための切換え
バルブである。ポンプ６３としては。

上記ポンプ５３と同様１例えば、多連式のチューブポン
プなどが使用される。

この第３図の装置においては、制御手段７は。

さらに上記振盪手段９および供給手段Ｃ６に接続されて
おり、ポンプの流量調整、バルブの切換え。

前処理試料槽２の振盪などを制御する。

第４図の装置は、第３図の装置と実質的に同様であるが
、供給手段Ａ、Ｂ、Ｃや媒質収容用の容器の接続形態が
異なる。第４図の装置においては。

チューブ５１の一端がカラムｌに直接連結されずに。

チューブ４１（供給手段Ａに包含される）のポンプ４２
の上流側にバルブ５４を介して接続されている。

この装置においては、チューブ４１のバルブ５４よりも
下流の部分が供給手段ＡとＢとで共用されている。バル
ブ５４を切り換えることにより前処理試料槽２からの前
処理試料、または媒質収容容器３１からの媒質がポンプ
４２を介してカラム１へ供給される。

第５図の装置では、第３図および第４図の媒質収容容器
３１および試料・媒質収容容器３２の代わりに、複数の
試料・媒質収容容器３が設けられる。

この複数の容器３２例えば３３Ｌ　３３２．３３３．３
３４および３３５には、それぞれ個別に、試料、試料処
理用媒質（例えば溶菌剤）、洗浄液、溶離液、再生液な
どが収容されている。これらの容器３は、供給手段Ｃに
より前処理試料槽２に接続される。供給手段Ｃは、ここ
では、チューブ６０１．　６０２．６０３゜６０４、６
０５および６１０．バルブ６００．およびポンプ６３を
包含する。ポンプ６３はチューブ６１０の任意の場所に
設けられており、ポンプ６３とバルブ６００との間にバ
ルブ５５を介してチューブ５１が接続されている。

バルブ６００および５５を適宜切り換えることにより。

例えば容器３３１〜３３５内の試料や試料処理用媒質を
前処理試料槽２へ供給すること；および該容器内のカラ
ム処理用媒質をカラム１内へ供給することが可能である
。

第６図の装置においては、第５図のチューブ５１の一端
がカラム１に直接連結されずにチューブ４１のポンプ４
２の上流側にバルブ５６を介して接続される。バルブ６
００および５５を操作することにより。

容器３の試料および試料処理用媒質を前処理試料槽２に
供給すること；バルブ５５および５６を操作することに
より、前処理された試料を前処理試料槽２からカラム１
へ供給すること；およびバルブ６００゜５５および５６
を切り換えることにより容器３のカラム処理用媒質をカ
ラム１へ供給することが可能である。

本発明の装置は、カラム１および前処理試料槽２を複数
個設けて複数個の試料を同時に処理し得る装置とするこ
とも可能である。カラム１と前処理試料槽２とを複数個
有し、フラクションコレクターが配置された装置の例を
第７図に示す、第７図の装置においては、複数のチュー
ブ６１０が、バルブ６００からポンプ６３を経て複数の
前処理試料槽２に接続され、さらに複数のチューブ４１
が該前処理試料槽２からポンプ４２を経て複数のカラム
１に接続されている。チューブ６１０および４１は、そ
れぞれ複数のチューブ５１により連結されている。複数
のカラム１の下流にフラクションコレクター７０が、該
カラム１とこのフラクションコレクター７０の受は部７
１０の回収容器７００とが相対応するように配置される
。第７図における複数の前処理試料槽２の部分断面平面
図を第８図に示す。

（以下余白）本発明の装置および方法は、各種生体由来の試料の分析
、該試料からの目的とする成分の単離などに用いられる
。本発明装置は、フィルターを備えた前処理試料槽を有
するため、試料の分析、単離などが効果的に行われる。

ここで、試料の前処理工程とは、微生物菌体などの細胞
の溶解工程。

タンパク溶解工程、抽出工程などをさしていう。

本発明の装置は、　ＤＮＡを含む試料、特に菌体など細
胞を含む試料からのＤＮＡの単離に好適に用いられる。

特に大腸菌細胞からのプラスミドＤＮＡ　（１０’ダル
トンオーダー）およびさらに高分子量のＤＮ＾（１０８
ダルトンオーダー）の単離に適している。本装置は、大
腸菌細胞以外の細胞２例えば真核細胞に対しても使用さ
れ得る。

上記装置において、使用されるカラムに充填されるべき
吸着剤、カラム処理用媒質（例えば、洗浄液、溶離液）
などの種類は、装置の使用目的によって異なり、その目
的に応じて適宜選択される。

カラム１の吸着剤としては９例えば、イオン交換ゲル、
逆相系ゲル、順相系ゲルがある。イオン交換ゲルには、
　ＤＥＡＥセファロース、　　ＱＡＩＥセファロース、
　０Ｍセファロース、ＳＰセファロースなどがある。

逆相系ゲルとしては、Ｃｌ１ｌシリカゲル、フ講ニルシ
リカゲルなどが挙げられる。順相系ゲルにはシリカゲル
などがある。他に使用可能な吸着剤としては１例えば、
ヒドロキシアパタイトデンプン。

セルロース、活性炭がある。例えば、　　ＤＮＡを含む
試料の二本鎖ＤＮ＾（ｄｓＤＮＡ）のみを選択的に吸着
させる場合には、ヒドロキシアパタイトが好適に用いら
れる。

試料の前処理（溶菌、タンパク溶解、抽出など）に用い
る前処理液（試料をあらかじめ処理するときに、あるい
は試料処理用媒質として用いられる）には９例えば、洗
剤、塩、溶解酵素、アルカリ剤。

キレート剤、カオトロピック剤、尿素などを含む溶液が
使用され得る。キレート剤または溶解酵素は１例えば、
細胞からＤＮＡを単離する方法では。

細胞溶解に際して、細胞壁を弱めるために用いられる。

キレート剤には、　ＥＤＴＡ、　　８−ヒドロキシキノ
リンなどがある。溶解酵素としてはりゾチーム。

プロテイナーゼになどが挙げられる。洗剤は、溶解酵素
またはキレート剤により弱められた細胞壁を溶解させる
ために用いられる。洗剤には９例えば、ドデシルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＳ）　。

トリトンＸ−１００，Ｎｏｎ１ｄｅｔ、ラウロイルサル
コシンがある。例えばＳＯＳの濃度は、０．１〜２％の
範囲で使用され、０．５〜１％の範囲が好適である。尿
素は２通常、２〜８Ｍの濃度で用いられる。８Ｍ尿素は
ほぼ飽和濃度に対応する。処理されるべき試料が大腸菌
の場合に、好ましい前処理液の組み合わせは、　　０．
２Ｍ　ＮａＯＨ，１％ＳＯ３，５０ｍＭ　）リス・ＨＣ
Ｉ（ｐｌ＋　８．０）、　１０＋ｗＭ　ＥＤＴＡ、　１
ｍｇ／　ｍｌリゾチームである。試料が真核細胞であれ
ば、　　ＩＭＮａＣｌ、　　１％ＳＯＳ、　　５０ｍＭ
　）リス−１（Ｃ１（ｐＨ８，０）　、　１０ｎ＋Ｍ　
ＩＩ！ｌ０ＴＡ、　　１　ｍｇ／ｍ！プロテイナーゼに
である。

カラム処理用の媒質として用いられる溶離液としては９
例えば吸着剤を構成する成分（アニオンおよびカチオン
）の少なくとも一方、好ましくは両方と強い相互作用を
有する溶媒が使用され得る。

例えばヒドロキシアパタイト（その主成分はリン酸カル
シウムである）を用いてＤＮＡを単離・精製する場合に
は、該リン酸カルシウムのリン酸成分およびカルシウム
成分の少なくとも一方、好ましくは両方と強い相互作用
を有する溶媒、ことに。

難溶性の塩を形成しうる塩溶液が使用され得る。

そのような塩溶液のなかでは、解離定数が小さい塩の溶
液であり、かつＤＮＡなどの核酸との親和性が高いもの
が好適である。さらに水やアルコール系溶媒に可溶であ
り、エタノール沈澱により析出することのない塩が選択
される。例えばヒドロキシアパタイトを吸着剤とする場
合に、使用される塩のアニオン成分としては炭酸；およ
び蟻酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸が好適である
。カチオン成分としては、アンモニア；ジエチルアミン
、トリエチルアミンなどのアルキルアミン類；エタノー
ルアミン、プロパツールアミンなどのアルカノールアミ
ン類；およびピリジン、アニリンなどの芳香族アミン類
が好適である。このような成分でなる塩を含む溶離液と
しては、特にトリエチルアミン炭酸緩衝液が好適である
。トリエチルアミン炭酸緩衝液は揮発性であるため、　
　ＤＮＡを含む溶出液の溶媒を留去したり凍結乾燥する
ことにより口Ｎへのみを高純度で回収することが可能と
なる。

溶離液の濃度は、使用する溶離液の種類により異なるが
１例えばトリエチルアミン炭酸緩衝液を使用する場合に
は、　１０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２Ｍ、　さ
らに好ましくは１００ｍＭ〜ＬＭの範囲である。

このように、　５０ｍＭ以下の低濃度であってもＤＮＡ
を溶離することか可能である。

吸着剤層の洗浄に用いられる洗浄液には、一般に、キレ
ート剤、カオトロピック剤が含有される。

これらキレート剤、カオトロピック剤としては。

前処理液に使用した試薬がいずれも用いられ得る。

本発明の装置を用いた生物学的試料の処理を。

第１図に示す装置および第６図に示す装置を用いて説明
する。まず、溶菌、抽出などの試料の前処理をあらかじ
め系外で行ない７第１図の装置の前処理試料槽２にこの
前処理された試料を入れる。

前処理試料は供給手段Ａ４を介してカラム１に供給され
る。次いで、吸着剤層１０に送られ、前処理試料中の所
望の成分が吸着剤に効果的に吸着される。次に、必要に
応じて容器３１１から洗浄液を供給手段Ｂ５を介してカ
ラム１に供給して洗浄を行なう。さらに、バルブ５２を
切り換えて、容器３１２から溶離液をカラムｌに供給す
る。これにより吸着剤層ＩＯに吸着されていた目的とす
る成分が溶出する。これを適当な測定装置に導いて測定
するか。

溶出画分を集めて目的とする成分を得る。溶出後。

カラムを再生して再利用する場合には、再びバルブ５２
を切り換えて容器３１３から再生液をカラム１に供給す
る。洗浄液から溶離液、溶離液から再生液に切り換える
際に、あるいは、洗浄液や溶離液の種類を変える場合に
は、カラム振盪手段８によりカラム１を約１８０°回動
させ、カラム内の媒質をチューブ１８を通じて除去すれ
ば、媒質の交換が速やかになされ得る。

第６図に示す装置は、試料の前処理をあわせて行なう場
合に使用される。まず、菌体懸濁液などの試料を容器３
３１からチューブ６０１および６１０を介してポンプ６
３により前処理試料槽２に供給する。

次にバルブ６００を切り換え、容器３３２から試料処理
用媒質（例えば、溶菌剤）を前処理試料槽２に供給する
。振盪手段９により前処理試料槽内の試料と媒質とを混
合し、試料の前処理を行なう。さらに、必要に応じてバ
ルブ６００を切り換え、容器３３３から別の試料処理用
媒質（例えば、中和剤）を前処理試料槽２へ供給し、振
盪して混合する。

このようにして調製された前処理試料は、フィルター２
１で濾過され、チューブ４１を介してポンプ４２により
カラムｌへ供給される。カラム１では、第は、バルブ６
００．５５および５６を切り換えることにより、容器３
３４．３３５などからチューブ６１０．５１．４１を介
してカラム１内へ供給される。

カラム１から溶出された溶離液を適当な手段で処理する
ことにより所望の物質の単離・精製などが行なわれる。

例えば、上記装置により、菌体から、　　ＤＮＡを単離
する場合には、試料として菌体を含む懸濁液を用い、前
処理液として溶解酵素（リゾチーム、プロテイナーゼに
など）、キレート剤（ＥＤＴ＾など）。

洗剤（ドデシル硫酸ナトリウムなど）などを含む溶液が
用いられる。このような前処理液を供給することにより
、前処理試料槽２で菌体の溶菌処理がなされる。つまり
、菌体の細胞壁はキレート剤や溶解酵素により弱められ
、洗剤により溶解される。得られた溶菌液はカラムｌの
吸着剤層に供給され、吸着剤層の吸着剤と接触する。吸
着剤としてはヒドロキシアパタイトなどが好適に利用さ
れ。

例えば０．１５〜０．２５Ｍの燐酸緩衝液を溶媒として
通液することにより、溶菌液中のｄｓ　ＤＮＡが選択的
に吸着される。溶菌液中のＲＮＡ　、蛋白質、多糖類な
どは吸着されずにカラム１外へ排出される。次に。

ＤＮＡを吸着・担持した吸着剤に、容器３から溶離液を
供給してこれを接触させる。例えば、　ＤＮＡを吸着・
担持するヒドロキシアパタイトにトリエチルアミン炭酸
緩衝液を接触させると、炭酸イオンがヒドロキシアパタ
イトのカルシウムと結合して難溶性の炭酸カルシウムを
生成し、一方トリエチルアミンはヒドロキシアパタイト
の燐酸部分と塩を形成し、その結果、　ＤＮＡはヒドロ
キシアパタイトから脱着する。例えば、ヒドロキシアパ
タイトカラムのベツド容量の２倍量のトリエチルアミン
炭酸緩衝液を通液することにより、吸着されているＤＮ
Ａのほぼ全量を回収することができる。このようにして
回収される溶出液を通常のエタノール沈澱処理に付すこ
とにより精製ＤＮＡが得られる。

溶出液中のトリエチルアミン炭酸塩はエタノールに溶解
するため、　ＤＮＡに混入してその純度を低下させるこ
とがない。エタノール沈澱処理の代わりに溶媒の減圧留
去や凍結乾燥を行うことによってもトリエチルアミン炭
酸塩が揮発・除去され（脱塩が達成され）で高純度のＤ
ＮＡが得られる。

本発明の試料の処理装置は、上記のようなりＮＡの単離
・精製の他に、タンパクの溶解・抽出にも用いられる。

１施■ 以下に本発明を実施例につき説明する。

第６図に示す装置であって、かつ複数のカラムと前処理
試料槽とを有する装置（カラムおよび前処理試料槽の数
はそれぞれ１０個である）を用い。

大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離を以下のようにし
て行なった。

（Ａ）菌体の培養ニプラスミドｐＢＲ３２２を含有する大腸菌ＨＢ　１０１
株を。

２００ｍｆＬＢ培地にて一晩培養した。この培養液を６
００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離し、菌体を沈澱させ
た。

（Ｂ）菌体の溶菌およびプラスミドＤＮＡの単離第６図
に示す上記装置を準備した。カラム１には、８Ｍ尿素−
０，２０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトを充填した（ベツドボリューム５　
ｍｌ　；直径２．５　ｃ＋ｓ　Ｘ　１　ｃｍ）。前処理
試料槽２のフィルター２１としては、メタルファイバー
チューブエレメントＦ＾０３（孔径０　、４　ｍｍ　、
富士フィルター■製）を用いた。試料・媒質容器３のう
ち、容器３３１には、　０．２Ｎ　　ＮａＯＨ−０，１
％Ｔｗｅｅｎ　８０（Ｔｗｅｅｎ　８０は半井化学薬品
■製）水溶液を；容器３３２には、　０．７５Ｍ酢酸カ
リウム水溶液を；容器３３３には、８Ｍ尿素−０，２４
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）を；容器３３４には、１
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ１１６．８）を収容した
。各容器３３１〜３３５に連結するチューブ６０１〜６
０５に加えて、カラム１内に空気を送るためのチューブ
（図外）が設けられている。

その一端はバルブ６００に連結され、他端は外気に開放
されている。

（Ａ）項で得られた菌体をＧ置緩衝液５ｄに懸濁させた
。この懸濁液にリゾチームを最終濃度が２■／ｄとなる
ように加え、３７°Ｃにて１５分間保持した。これに、
プラスミドＤＮＡの単離収率を測定する目的で、３１（
でインビトロ標識されたプラスミドＤＮへ（’Ｈ−ｐＢ
Ｒ３２２）を１μＣ４に相当する量だけ添加した。この
混合物を上記装置の前処理容器２０内に入れ、前処理試
料槽２２を閉じた。バルブ２４を開放し。

バルブ５５および６００を操作して、容器３３１を前処
理試料槽２に連通ずるようにした。該容器３３１から、
　０．２Ｎ　ＮａＯＨ−０，１％Ｔｗｅｅｎ　８０水溶
液１０−をポンプ６３により前処理試料槽２へ供給した
。バルブ２４を閉じ、振盪装置９により固定板２０２を
１０回回動させ、前処理試料槽２内の混合物の撹拌を行
なった。さらに室温にて１０分間放置し、菌体を完全に
溶解させた。次に、バルブ２４を開放し、バルブ６００
を切り換えて容器３３２が前処理試料槽２に連通ずるよ
うにした。ポンプ６３により容器３３２から０．７５Ｍ
酢酸カリウム水溶液３０ｄを前処理試料槽２に供給した
。バルブ２４を閉じ、振盪装置９により固定板２０２を
１０回回動させ、前処理試料槽２内の溶液の撹拌を行な
った。

次に、バルブ２４を開け、バルブ５５を容器３と前処理
試料槽２とが連通しないように切り換え、さらにバルブ
５６を前処理試料槽２とカラム１とが連通ずるように切
り換えた。バルブ１９を開放し、バルブ１６を閉じた後
、ポンプ４２により前処理試料槽２内の上記前処理され
た試料をチューブ４１を介してカラム１へ供給した。前
処理された試料はフィルター２１により濾過されてカラ
ム１のリザーバー部分に導入された。次にバルブ５５．
５４および６００を操作し、カラム１がチューブ４１．
５１．６１０および図外のチューブを介して外気に開放
されるようにした。カラム１のバルブ１９を閉じ、バル
ブ１６を開放し、ポンプ４２によりカラムｌ内に空気を
送り込み、リザーバ一部分の前処理試料を４０ｄ／ｈｒ
の速度で吸着剤層１０に導入した。（以上、チャージ操
作）。これにより前処理試料中のプラスミドＤＮＡが吸
着剤層１０に吸着される。

次にバルブ６００を操作し、容器３３３がカラム１に連
通するようにし、該容器３３３内の８Ｍ尿素０．２４Ｍ
リン酸緩衝液（ｐ）１６．８）をカラム１ヘボンプ４２
により供給した。該緩衝液は４０Ｉｎｌ／ｈｒの流速で
２００　ｍｌ供給された。これにより吸着剤に吸着しな
かったタンパク、　　ＲＮＡなどが洗浄・除去された。

続いて、カラム１のバルブ１６を閉じ、バルブ１９を開
放し、バルブ６００を図外のチューブを介してカラム１
が外気に連通ずるように切り換えて、ポンプ４２により
カラム１内に空気を導入した。振盪手段８によりカラム
ｌを約１８０°回動し、リザーバ一部分１１に残留して
いる上記緩衝液をチューブ１８から系外へ除去した。ポ
ンプ４２を停止した後、カラム１をもとの位置に戻した
。（以上、洗浄操作１）。

次に、バルブ６００を操作し、容器３３４とカラム１と
が連通ずるようにし、バルブ１９を閉じ、バルブ１６を
開放した後、該容器３３４内の１０ｍＭ　トリス・塩酸
緩衝液（ｐＨ６，８）をカラム１ヘボンプ４２により供
給した。該緩衝液は４０ｄ／ｈｒの流速で１５ｄ供給さ
れた。続いて、上記と同様の要領でカラムを回動し、リ
ザーバー１１内に残留した緩衝液をチューブ１８から系
外へ除去した。（以上、洗浄操作２）。

カラム１をもとの位置に戻した後、バルブ６００を操作
し、容器３３５とカラム１とが連通ずるようにした。バ
ルブ１９を閉じ、バルブ１６を開放とした後、ポンプ４
２により該容器３３５内の０．２Ｍ）リエチルアミンー
炭酸緩衝液（ｐＨ８，０）をカラム１に供給した。該緩
衝液は４０戚／ｈｒの流速で２０戚供給された。チュー
ブ１５から流出する溶出液の最初の５−を廃棄し１次の
１５−を回収した。（以上、溶出操作）。

以上の工程において、各バルブの切換操作および開閉操
作、ポンプの運転、および振盪手段の操作はすべて制御
手段７であるコンピューターにより制御された。

上記各工程において、カラム１のチューブ１５から溶出
する溶出液を２６０ｎｍの紫外線吸光度’（ＵＶ吸収ス
ペクトル）および放射活性（３ｕのカウント数）により
モニターした。その結果を第９図に示す。

第９図から明らかなように、溶出操作開始後、紫外線吸
収および放射活性が上昇し、プラスミドＤＮＡが溶出さ
れているのがわかる。チャージ操作時および洗浄操作時
における紫外線吸収の増大は、主として吸着剤に吸着さ
れなかったＲＮＡおよびタンパクに起因する。

（Ｃ）プラスミドＤＮＡの回収：（Ｂ）項で得られた溶出液約１５　ｍｌに３Ｍ酢酸ナト
リウムを１．５ｄを加えた後、２倍量のエタノールでエ
タノール沈澱を行い、プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２
２）約１００　ｕ　ｇを回収した。

（発明の効果）本発明の装置は、このように、カラムに、前処理試料槽
および試料・媒質収容容器が供給手段を介して連結され
、それらの働きが制御手段によりコントロールされるた
め、生物学的試料の処理が効果的に行なわれる。前処理
試料槽内にはフィルターが設けられるため、前処理され
た試料が濾過され、カラムの目詰まりが回避され、その
結果。

カラム寿命が延びるとともに、目的成分への不純成分の
混入の可能性が低くなる。本発明装置のうち、特に、前
処理試料槽に試料・媒質収容容器を接続し、該前処理試
料槽を振盪手段に連結した装置を用いると、試料の前処
理、および試料からの所定成分の精製・単離が繁雑な操
作を必要とすることなく、連続して短時間のうちに行な
われ得る。

カラムおよび前処理試料槽を複数個並列に配した装置を
利用すれば、複数の試料を同時にかつ連続的に大量に処
理することが可能である。本装置は。

特に菌体からのＤＮＡの単離・精製に好適に用いられる
。

４、　゛　　の　　　なＦ！■ 第１図〜第７図は１本発明の生物学的試料の処理装置の
例を示す・模式図、第８図は、第７図の装置における前
処理試料槽付近の接続状態を示す部分断面平面図、そし
て第９図は、実施例における溶出液の溶出量と、プラス
ミドＤＮＡに起因する紫外線吸光度および放射活性（３
Ｈカウント）との関係を示すグラフである。

１・・・カラム、２・・・前処理試料槽、３．３２・・
・試料・媒質収容容器、４・・・供給手段Ａ、５・・・
供給手段Ｂ。

６・・・供給手段Ｃ，７・・・制御手段、８・・・カラ
ム振盪手段、９・・・振盪手段、２１・・・フィルター
、３１・・・媒質収容容器、７０・・・フラクションコ
レクター、　１００・・・カラム保持台、２００・・・
前処理試料槽保持台。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、少なくともその一部に吸着剤が充填されたカラムで
あって、カラム振盪手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前処理試料を収容するための
槽であって、該前処理試料を濾過するためのフィルター
を備えた前処理試料槽；該カラムに連結され、カラム処理を行うためのカラム処
理用媒質を収容する媒質収容容器；該前処理試料槽から
該カラムに該前処理試料を供給するための供給手段Ａ；該媒質収容容器から該カラムに該処理用媒質を供給する
ための供給手段Ｂ；および該カラム振盪手段、および該供給手段ＡおよびＢを制御
するための制御手段；を有する生物学的試料の処理装置。２、少なくともその一部に吸着剤が充填されたカラムで
あって、カラム振盪手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前処理試料または前処理され
るべき試料を収容するための槽であって、該前処理試料
または該槽内で前処理された試料を濾過するためのフィ
ルターを備え、かつ前処理試料槽振盪手段と連結された
前処理試料槽；該カラムおよび／または該前処理試料槽に連結され、試
料の前処理を行うための試料処理用媒質、カラム処理を
行なうためのカラム処理用媒質および／または試料を個
別に収容する試料・媒質収容容器；該試料・媒質収容容器から該前処理試料槽に該試料処理
用媒質および／または試料を供給するための供給手段Ｃ
；該前処理試料槽から該カラムに該前処理試料または該槽
内で前処理された試料を供給するための供給手段Ａ；該試料・媒質収容容器から該カラムに該カラム処理用媒
質を供給するための供給手段Ｂ；および該カラム振盪手
段、該前処理試料槽振盪手段、および供給手段Ａ、Ｂお
よびＣを制御するための制御手段；を有する生物学的試料の処理装置。