JP7394301B2 - 二本鎖核酸の融解温度上昇化剤及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法およびこれを実施するためのキットに関する。より具体的には、特定の構造を有する両性共重合体を含む二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法およびこれを実施するためのキットに関する。

特定の細菌やウィルスを同定したり、ヒトの疾患易罹患性や薬剤反応性などを判定したりするために、ゲノム核酸中の変異を検出することが広く行われ、最近では、ゲノム核酸の１塩基の変異を、正確、迅速、および低コストで検出し得ることが要求されるようになっている。

ゲノム核酸の変異を検出する方法として、種々の方法が開発されており、例えば、基準核酸とその相補鎖からなる二本鎖核酸を試料核酸と共存させ、相補鎖が試料核酸と置換する速度または率を測定することで、試料核酸中の基準核酸に対するミスマッチを検出する方法が提案されている（特許文献１乃至３）。この方法では、ポリリジンやポリアルギニンなどのカチオン性高分子を主鎖として、デキストランやポリエチレングリコール等を側鎖としてグラフト重合したポリマーを添加することで、相補鎖が試料核酸と置換する速度を促進して検出感度を高めており、一塩基のミスマッチでも検出できるとされている。しかし、この方法は、相補鎖の試料核酸への置換をＦＲＥＴ法で検出するものであり、基準核酸および相補鎖を蛍光色素で標識しておくことが必要となるため、これを不要とできればより便利である。

ＦＲＥＴ法等のように蛍光色素で標識した核酸を用いずにゲノム核酸の変異を検出可能な方法としては、融解温度（Ｔｍ）を利用して二本鎖核酸のミスマッチを検出する方法がある。
融解温度（Ｔｍ）は、二本鎖核酸の５０％が一本鎖に変性する温度をいい、相補的な関係にあるフルマッチ二本鎖に比べ、相補的な関係にないミスマッチ二本鎖では、融解温度（Ｔｍ）が低くなる。このため、この現象を利用して、試料核酸の基準核酸に対する変異を検出したり、この現象により生じる核酸増幅効率の差を通じて標的配列を検出したりすることができる。ただし、一塩基のミスマッチによって生じる融解温度（Ｔｍ）の変化は１～３℃程度であるとされ、融解温度（Ｔｍ）を利用してゲノム核酸中のごく僅かな変異を検出するには、感度を高める工夫が必要になる。

この点、融解曲線を解析して僅かな変異を検出可能とする方法がなされている（特許文献４および５）。しかし、これらの方法では、厳密な温度制御が必要なため高精度な恒温装置が必要となり、実用上より簡便な方法が望まれる。
また、上述した特許文献１では、上記カチオン性ポリマーの存在下および非存在下で、一塩基のミスマッチを有する２０ｍｅｒ二本鎖核酸、およびフルマッチの２０ｍｅｒ二本鎖核酸のＴｍ値が測定され、それぞれのカチオン性高分子ポリマーの存在によるＴｍ上昇値が示されている。残念ながら、ミスマッチの二本鎖核酸と、フルマッチの二本鎖核酸とで、カチオン性ポリマーの存在によるＴｍ上昇値はいずれも１５℃程度であり、両者に有意な差はない。

国際公開第０３／０１８８４１ Ａ１号パンフレット 特開２００１-７８７６９号 特開２００８-２７８７７９号 特開２００５－５８１０７号 特開２００３－５２８６２６号 国際公開２０１６／１６７３２０ Ａ１号パンフレット 特許第６２４２３３６号 特許第５８１３２６３号 特許第４７３１３２４号 特許第４３８３１７８号 特許第５０３０９９８号 特許第４１５１７５１号 特開第２００１－８９４９６号公報 国際公開第２００３／０６８７９５号パンフレット 国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット 特許第３７５６３１３号

本発明は、以上のような従来技術における問題に対処し得る、新規な二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の上昇化剤、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法、およびこれらの方法を実施するキットを提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討の結果、特定のカチオン性構成単位（１）と、特定のアニオン性構成単位（２）とを含む両性共重合体（以下、「特定両性共重合体」と略称することがある。）を核酸溶液に添加すると、相補的な関係にあるフルマッチの二本鎖核酸における特定両性共重合体の存在によるＴｍ上昇値と、相補的な関係にないミスマッチの二本鎖核酸における特定両性共重合体の存在によるＴｍ上昇値との差が拡大し、これにより一塩基レベルでもミスマッチを検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の融解温度上昇化剤、核酸ミスマッチの検出方法、試料核酸の基準核酸に対する変異の検出方法、核酸ミスマッチ検出キットおよび変異検出キットを提供するものである。
［１］ 二本鎖核酸の融解温度上昇化剤であって、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）

（式中、Ｒ^１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）

（式中、Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘ^ａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）

（式中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）

（式中Ｒ^６は水素原子又はメチル基、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）

（式中Ｒ^９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）

（式中Ｒ^１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、を含む両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［２］ 前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれる、［１］に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［３］ 前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１］又は［２］に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［４］ 試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法であって、
（１）［１］～［３］の何れか１項に記載する二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記プローブ核酸と前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
（２）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程と
を含む、核酸ミスマッチの検出方法。
［５］ 前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定する、請求項４に記載の核酸ミスマッチの検出方法。
［６］ 試料核酸と、プローブ核酸との間の核酸ミスマッチ検出キットであって、
前記プローブ核酸と、
前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
を含む、核酸ミスマッチ検出キット。
［７］ 試料核酸と基準核酸との間の変異の検出方法であって、
（１）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
（２）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在下による、前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程と
を含む、変異の検出方法。
［８］ 前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、変異が存在すると判定する、［７］に記載の変異の検出方法。
［９］ 試料核酸と、基準核酸との間の変異検出キットであって、
前記基準核酸と、
前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
を含む、変異検出キット。
［１０］
二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を製造するための、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）

（式中、Ｒ^１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）

（式中、Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘ^ａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）

（式中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）

（式中Ｒ^６は水素原子又はメチル基、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）

（式中Ｒ^９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）

（式中Ｒ^１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、
を含む、両性共重合体の使用。
［１１］
前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれることを特徴とする、［１０］に記載の使用。
［１２］
前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１０］又は［１１］に記載の使用。
［１３］
二本鎖核酸の融解温度を上昇させる方法であって、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）

（式中、Ｒ^１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）

（式中、Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘ^ａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）

（式中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）

（式中Ｒ^６は水素原子又はメチル基、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）

（式中Ｒ^９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）

（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）

（式中Ｒ^１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、
を含む、両性共重合体を、二本鎖核酸と溶液中で混合して、前記二本鎖核酸の融解温度を上昇させる方法。
［１４］
前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１３］又は［１４］に記載の方法。

本発明によれば、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）を利用して、簡易且つ高感度に、二本鎖核酸ミスマッチを検出することができる。従って、基準核酸（例えば、野生型ゲノム核酸）に対する試料核酸の変異の有無を二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）を利用して、簡易且つ高感度で検査することができる。

ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：３０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：３０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：８０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：８０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１０００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１０００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：２００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：２００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ５０モル％アセチル化ポリアリルアミン（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ５０モル％アセチル化ポリアリルアミン（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ポリアクリルアミドの存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ポリアクリルアミドの存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ_２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーとＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対するＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーとＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対するＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。

本発明の実施の形態を詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に限定して理解されるべきものではない。
本発明は、特定の構成単位を含む両性共重合体を含む二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチまたは基準核酸に対する試料核酸中の変異を検出する方法、およびこれら方法を実施するためのキットに関する。以下、これら実施形態について詳細に説明する。

１．二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤
本発明の一の実施形態は、特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤に関する。この二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、特定両性共重合体のみで構成されていてもよく、特定両性共重合体をヌクレアーゼフリーの媒体（例えば、水）に溶解した水溶液のように、それ以外の成分を含んでいてもよい。
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、二本鎖核酸の融解温度を１６．０℃以上、好ましくは、２０．０℃以上、上昇させる。特に二本鎖核酸がミスマッチを含まない二本鎖核酸（フルマッチ二本鎖核酸）である場合、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、フルマッチ二本鎖核酸の融解温度を２０．０℃以上、好ましくは２５．０℃以上、特に好ましくは３０．０℃以上上昇させる。

特定両性共重合体
特定両性共重合体は、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）と、特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）とを含むものであり、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のみで構成されていてもよく、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）に加えて、それ以外の構成単位を有していてもよい。それ以外の構成単位としては、後述のノニオン性構成単位（３）や、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）及び特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）のいずれにも該当しない構造のカチオン性又はアニオン性の構成単位を挙げることができる。

カチオン性構成単位（１）
特定両性共重合体を構成するカチオン性構成単位（１）は、下記の構成単位（１－１）、構成単位（１－２）、構成単位（１－３）及び構成単位（１－４）からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位である。
以下に一般式等を用いて示す様に、カチオン性構成単位（１）はその構造中にカチオン基としてアミノ基を有するものであるが、良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点から、該アミノ基は第２級又は第３級のアミノ基であることが好ましい。
特定両性共重合体は、カチオン性構成単位（１）１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含んでいてもよい。２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含む場合の当該２種類以上のカチオン性構成単位（１）は、ともに構成単位（１－１）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（１－２）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（１－３）に分類される構成単位の組み合わせ、又はともに構成単位（１－４）に分類される構成単位の組み合わせであってもよく、構成単位（１－１）から（１－４）のうち互いに異なるものに分類される構成単位同士の組み合わせであってもよい。
特定両性共重合体においては、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、前記カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものであることが特に好ましく、前記カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）であることが最も好ましい。

構成単位（１－１）
構成単位（１－１）は、下記一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。

式中、Ｒ^１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。Ｒ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、水素原子、またはメチル基であることが特に好ましい。

構成単位（１－１）は、上記の構造式（１－ａ）、又は（１－ｂ）で示される構造の無機酸塩、若しくは有機酸塩等である構造、すなわち酸付加塩である構造を有していてもよい。
特定両性共重合体が構成単位（１－１）を有する場合、特定両性共重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、付加塩を有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からＨＣｌ等の付加塩を除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、付加塩型の構成単位（１－１）を用いることは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
入手の容易さや反応の制御性等の観点から、この実施形態の構成単位（１－１）における無機酸塩、又は有機酸塩は、塩酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、又はアルキルサルフェート塩であることが好ましく、塩酸塩であることが特に好ましい。

構成単位（１－２）
構成単位（１－２）は、下記一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）で表される構造を有する構成単位である。

式中、Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、又は炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘ^ａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。
Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、メチル基、またはエチル基であることが特に好ましい。
良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点からは、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一方が水素原子であることが好ましい。

カウンターイオンＸ^ａ－には特に限定はないが、入手の容易さや反応の制御性等の観点から、塩素イオン、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、又はアルキルサルフェートイオンであることが好ましく、塩素イオン、又はエチルサルフェートイオンであることが特に好ましい。
特定両性共重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、カウンターイオンを有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からカウンターイオンを除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、カウンターイオン型の構成単位（１－２）を有する特定両性共重合体を使用することは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。

構成単位（１－３）
構成単位（１－３）は、下記一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。

式中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。
Ｒ^４及びＲ^５として好ましい炭素数１～１２のアルキル基又は炭素数７～１０のアラルキル基は、直鎖状、枝分かれ状のいずれであってもよい。その例としてはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ベンジル基などが挙げられる。また、Ｒ^４及びＲ^５として好ましい炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられるが、これらには限定されない。
Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、水素原子、またはメチル基であることが特に好ましい。
良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点からは、Ｒ^４及びＲ^５の両方が同時には水素原子とならないことが好ましい。

構成単位（１－３）が一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造の酸付加塩である場合の付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。

構成単位（１－４）
構成単位（１－４）は、下記一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。

式中Ｒ^６は水素原子又はメチル基、Ｒ^７およびＲ^８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。
Ｒ^６は、メチル基であることが好ましく、ｎは２～３であることが好ましく、Ｒ^７およびＲ^８はそれぞれメチル基であることが好ましい。
構成単位（１－４）が一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造の酸付加塩である場合の付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。

特定両性共重合体の全構成単位に占めるカチオン性構成単位（１）の割合は、通常１０～７０モル％であり、好ましくは１５～６０モル％であり、特に好ましくは２０～５５モル％である。２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含む場合の上記割合は、当該２種類以上のカチオン性構成単位（１）の合計量に基づいて定義される。

アニオン性構成単位（２）
本発明において用いられる特定両性共重合体を構成するアニオン性構成単位（２）は、下記の構成単位（２－１）、構成単位（２－２）、構成単位（２－３）及び構成単位（２－４）からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位である。
特性両性共重合体は、アニオン性構成単位（２）１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上のアニオン性構成単位（２）を含んでいてもよい。２種類以上のアニオン性構成単位（２）を含む場合の当該２種類以上のアニオン性構成単位（２）は、ともに構成単位（２－１）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（２－２）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（２－３）に分類される構成単位の組み合わせ、又はともに構成単位（２－４）に分類される構成単位の組み合わせであってもよく、構成単位（２－１）から（２－４）のうち互いに異なるものに分類される構成単位同士の組み合わせであってもよい。
特定両性共重合体においては、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、前記アニオン性構成単位（２）が構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものであることが特に好ましい。

構成単位（２－１）
構成単位（２－１）は、下記一般式（ＩＩ－ａ）で表される構造を有する構成単位である。

式中Ｒ^９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅを表す。
Ｒ^９は、水素であることが好ましく、Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。構成単位（２－１）は、マレイン酸から導かれるものであることが特に好ましい。

構成単位（２－２）
構成単位（２－２）は、下記一般式（ＩＩ－ｂ）で表される構造を有する構成単位である。

式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅを表す。
Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。

構成単位（２－３）
構成単位（２－３）は、下記一般式（ＩＩ－ｃ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。

式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。

構成単位（２－４）
構成単位（２－４）は、下記一般式（ＩＩ－ｄ）で表される構造を有する構成単位である。

式中、Ｒ¹⁰は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
Ｒ^１０は、水素であることが好ましく、Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。
構成単位（２－４）は、(メタ)アクリル酸から導かれるものであることが好ましく、アクリル酸から導かれるものであることが特に好ましい。

特定両性共重合体におけるアニオン性構成単位（２）として、１種類のみのアニオン性構成単位（２）を単独で用いてもよいし、複数種類の互いに異なる構造のアニオン性構成単位（２）を組み合わせて用いてもよい。
複数種類の互いに異なるアニオン性構成単位を用いる場合、それぞれのアニオン性構成単位は、同一の一般構造式（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩ－ｃ）又は（ＩＩ－ｄ）で表される範囲内において互いに異なる構造を有していてもよいし、異なる一般構造式で表される互いに異なる構造を有していてもよい。前者の場合、例えば、一般構造式（ＩＩ－ａ）で表されるが、Ｙの元素が互いに異なることによって構造が互いに異なる、複数種類のアニオン性構成単位（２）を用いてもよい。後者の場合、例えば、構造式（ＩＩ－ａ）で表される構造を有する１のアニオン性構成単位（２－１）と、構造式（ＩＩ－ｄ）で表される構造を有する他のアニオン性構成単位（２－４）とを用いてもよい。

特定両性共重合体は、上記カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）を含むので、カチオン性及びアニオン性を有する両性共重合体となる。
特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）及び特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）を含む特定両性共重合体を用いることで、二本鎖核酸ミスマッチが存在する場合としない場合との二本鎖核酸融解温度の差を顕著に拡大するメカニズムは必ずしも明らかではないが、カチオン性構成単位のカチオン密度が高すぎると、核酸間の結合を強化し過ぎて、二本鎖核酸融解温度の測定自体が難しくなり、カチオン性構成単位のカチオン密度が低すぎると、二本鎖核酸融解温度の上昇が小さくなりミスマッチの検出感度が低くなることから、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）のポジティブチャージと特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）のネガティブチャージとが適度に干渉し、核酸間の結合を適度に強化しているものと推定される。

上述の様に二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、特定両性共重合体において、カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものであることが好ましく、アニオン性構成単位（２）が構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものであることが好ましいので、カチオン性構成単位（１）として構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものを有し、アニオン性構成単位（２）として構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものを有する特定両性共重合体を特に好ましく用いることができる。

カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との合計が特定両性共重合体の全構成単位に占める割合には特に制限は無いが、通常２５モル％以上であり、好ましくは３０～９０モル％であり、より好ましくは３５～７５モル％であり、特に好ましくは４０～６０モル％である。
カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との割合にも特に制限は無いが、モル比（カチオン構成単位（１）：アニオン性構成単位（２））で通常０．１：１～２：１であり、好ましくは０．３：１～０．８：１であり、より好ましくは０．４：１～１．２：１であり、特に好ましくは０．５：１～１：１である。
特定両性共重合体における、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のモル比は、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）の構造が既知である場合、特定両性共重合体をイソプロピルアルコール又はアセトン等の有機溶媒で再沈し、再沈物について、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００ＩＩ ＣＨＮＳ／Ｏ全自動元素分析装置又は同等の性能の装置を用いて、前記構成単位の構造に応じた適宜のモードで分析することで特定することができる。なお、測定は、キャリアーガスとしてヘリウムガスを使用し、錫カプセルに固体試料を量りとり、燃焼管内に落下して純酸素ガス中で燃焼温度１８００℃以上で試料を燃焼し、分離カラム及び熱伝導検出器によるフロンタルクロマトグラフィー方式で各測定成分を検出し、校正係数を用いて各元素の含有率を定量することで行うことができる。ここで、特定両性共重合体におけるカチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）の構造が未知である場合、上記元素分析装置による測定の前に、１Ｈ－ＮＭＲ又は１３Ｃ－ＮＭＲを用いた公知の方法により、それぞれの構成単位の構造を特定する。また、特定両性共重合体の製造（共重合）において供給した各単量体の量、及び特定両性共重合体に取り込まれずに残留した各単量体の量から計算することもできる。なお、特定両性共重合体における各単量体から導かれる構成単位の割合（モル比）は、各構成単位の仕込み組成（モル比）とほぼ一致するため、本明細書では便宜的にモノマーの配合比を構成単位の割合（モル比）として取り扱う事がある。

それ以外の構成単位
特定両性共重合体は、上記カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）に加えて、それ以外の構成単位を有していてもよい。
それ以外の構成単位としては、ノニオン性構成単位（３）や、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のいずれにも該当しないカチオン性又はアニオン性の構成単位を挙げることができる。
カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との間に位置することで、両者のスペーサーとして機能して、各構成単位のポジティブチャージとネガティブチャージとの干渉を調整し、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能となることから、特定両性共重合体はノニオン性構成単位（３）を含むことが好ましい。また、ノニオン性構成単位は、カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との間に位置することが好ましい。特に、カチオン性構成単位が、上記一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造である場合には、ノニオン性構成単位がスペーサーとして特に有効に機能することから、特定両性共重合体はノニオン性構成単位（３）を含むことが特に好ましい。

ノニオン性構成単位（３）
本実施形態におけるノニオン性構成単位（３）は、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）と共重合可能な非イオン性の単量体から導かれる構成単位であればよく、特にそれ以外の制限はないが、メタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、アクリルアミド系単量体、二酸化硫黄等から導かれる構成単位を、好ましく用いることができる。より具体的な例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリルアミド、Ｎ－メチルメタクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド塩化メチル４級塩、アクリロイルモルフォリン、イソプロピルアクリルアミド、４-ｔ-ブチルシクロヘキシルアクリレート、又は二酸化硫黄から導かれる構成単位を挙げることができる。アクリルアミドから導かれる構成単位を使用することが特に好ましい。
ノニオン性構成単位（３）は、通常、単量体として非イオン性の単量体を用いることで、高分子中に導入することができる。
特定両性共重合体がノニオン性構成単位（３）を有する場合のノニオン性構成単位（３）の含有量には特に制限はなく、またノニオン性構成単位（３）の種類によってもその好適な量は異なるが、アニオン性構成単位（２）とのモル比が、ノニオン性構成単位（３）／アニオン性構成単位（２）＝０．１／１～１／１であることが好ましく０．２／１～０．８／１であることがより好ましく、０．３／１～０．７／１であることがさらに好ましく、０．４／１～０．６／１であることが特に好ましい。
ノニオン性構成単位（３）がメタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、又はアクリルアミド系単量体から導かれる場合には、上記比率は０．１／１～１／１であることが好ましく０．２／１～０．８／１であることがより好ましく、０．３／１～０．７／１であることがさらに好ましく、０．４／１～０．６／１であることが特に好ましい。
ノニオン性構成単位（３）が二酸化硫黄から導かれる場合には、上記比率は０．１／１～１／１であることが好ましく、０．２／１～１／１であることが特に好ましい。

特定両性共重合体の製造方法
特定両性共重合体の製造方法には特に制限はなく、従来当該技術分野において公知の方法で製造することができるが、例えばカチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、及びアニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体、並びに所望によりノニオン性構成単位（３）に対応する構造のノニオン性単量体等のそれ以外の単量体を共重合することにより製造することができる。

カチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、アニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体等を共重合する場合の溶媒は特に限定されず、水系の溶媒であっても、アルコール、エーテル、スルホキシド、アミド等の有機系の溶媒であってもよいが、水系の溶媒であることが好ましい。
カチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、アニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体等を共重合する場合の単量体濃度は、単量体の種類により、また共重合を行う溶媒の種類により、異なるが、水系の溶媒の場合通常１０～７５質量％である。この共重合反応は、通常、ラジカル重合反応であり、ラジカル重合触媒の存在下に行なわれる。ラジカル重合触媒の種類は特に限定されるものでなく、その好ましい例として、ｔ－ブチルハイドロパーオキサイドなどの過酸化物、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩、アゾビス系、ジアゾ系などの水溶性アゾ化合物が挙げられる。

ラジカル重合触媒の添加量は、一般的には全単量体に対して０．１～２０モル％、好ましくは１．０～１０モル％である。重合温度は一般的には０～１００℃、好ましくは５～８０℃であり、重合時間は一般的には１～１５０時間、好ましくは５～１００時間である。重合雰囲気は、大気中でも重合性に大きな問題を生じないが、窒素などの不活性ガスの雰囲気で行なうこともできる。

２．試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法
本発明の他の実施形態は、試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法に関し、この方法は、
（１）前記特定両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
（２）前記特定両性共重合体の存在による、試料核酸と、プローブ核酸との二本鎖核酸融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程とを含む。

（１）の工程において、融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）は、特定両性共重合体の存在下における、プローブ核酸とそれに相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の核酸融解温度（Ｔｍ１）、並びに特定両性共重合体の不在下における、プローブ核酸とそれに相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸融解温度（Ｔｍ２）をそれぞれ測定し、Ｔｍ１－Ｔｍ２を算出することにより決定する。
同様に、（２）の工程において、融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）は、特定両性共重合体の存在下における、試料核酸とプローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ１）、並びに特定両性共重合体の不在下における、試料核酸とプローブ核酸との二本鎖核酸融解温度（Ｔｍ２）をそれぞれ測定し、Ｔｍ１－Ｔｍ２を算出することにより決定する。

本願明細書において、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも含まれる。また、非天然型核酸も含む。試料核酸およびプローブ核酸に相補的な配列を含む核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのあらゆる核酸を含み得る。また、プローブ核酸およびプローブ核酸に相補的な配列を含む核酸は、天然型核酸でも非天然型核酸でもよい。非天然型核酸は、人工ヌクレオチドをその一部に含むＤＮＡ又はＲＮＡであり、人工ヌクレオチドとしては、例えば、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、またはモルホリノ核酸を少なくとも一部に含む核酸等が挙げられる（これら非天然型核酸の詳細は、例えば、特許文献６～１６等に記載されており、参照によりその内容を本願明細書に組み込む）。

試料核酸及びプローブ核酸の重合度は、特に限定されないが、検出感度の点から、通常、４～１００ｍｅｒであり、好ましくは、５～５０ｍｅｒであり、より好ましくは、６～３０ｍｅｒであり、さらに好ましくは、７～２０ｍｅｒであり、特に好ましくは、８～１５ｍｅｒである。

試料核酸及びプローブ核酸のＧＣ含量は、特に限定さないが、検出感度の点から、通常、３０～８０％であり、好ましくは、５０～７５％である。

二本鎖核酸の融解温度の測定は、通常核酸水溶液を用いて行うが、溶媒は、ヌクレアーゼフリーな水性媒体であればよく、典型的にはヌクレアーゼフリーな水である。また、核酸は、緩衝液中に溶解してもよく、例えば、核酸分析試薬で用いられる核酸用緩衝液を使用することができる。また、核酸水溶液は、特定両性共重合体による融解温度（Ｔｍ）の上昇に影響を及ぼさない範囲で、界面活性剤を含んでもよく、核酸分析試薬で用いられる界面活性剤が挙げられる。

二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定において、特定両性共重合体は、通常、０．０３～３．０質量％の濃度で溶液中に含有させることができ、０．２～２．０質量％の濃度で溶液中に含有させることが好ましい。

本発明の一の実施形態では、特定両性共重合体に加え、ＭｇＣｌ_２等の既知の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を反応液に含んでもよい。ただし、ＭｇＣｌ_２を含む場合、その濃度は、５ｍＭ以下とすることが好ましい。また、融解温度（Ｔｍ）の上昇に影響を及ぼさない範囲で、ＮａＣｌなどの塩を含んでもよい。この場合、塩は、３００ｍＭ以下とすることが好ましい。

二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定において、試料核酸およびプローブ核酸は、通常、それぞれ１０～１０００μＭの濃度で測定を行うことができ、３０～３００μＭの濃度で測定を行うことが好ましい。
溶液ｐＨは、３．０～１１．０とすることができ、５．０～９．０とすることが好ましい。

二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定における温度スケジュールは、二本鎖核酸の変性を検出する方法によっても異なるが、基本的には、完全に二本鎖が形成される温度から徐々に温度を上昇させて二本鎖核酸の変性を生じさせればよい。
二本鎖核酸の変性を検出する方法としては、核酸の紫外線領域（例えば、２６０nm）での吸光度が二本鎖核酸の変性に伴って変化するのを利用する方法、蛍光色素、酵素、発光色素等で標識した、プローブ核酸、またはプローブ核酸およびそれに相補的な配列を有する核酸を利用して、二本鎖核酸の形成の程度を検出する方法（例えば、ＦＲＥＴ法）、および蛍光色素等を二本鎖核酸形成時に核酸間に取り込ませ、二本鎖核酸の変性に伴う蛍光強度の減少を利用する方法（例えば、インターカレータ―法）がある。
蛍光色素等で標識したプローブ核酸を準備する必要がなく、簡単な装置でリアルタイムな分析が可能な点で、蛍光色素等を二本鎖核酸形成時に核酸間に取り込ませ、二本鎖核酸の変性に伴う蛍光強度の減少を利用する方法（例えば、インターカレータ―法）が好ましい。なお、本願明細書中でＴｍの具体的数値に言及する場合、特に他の方法を特定しない限り、実施例１に記載する方法で測定された数値を意味し、基準ΔＴｍ、試料ΔＴｍおよびΔΔＴｍの具体的数値は、この様にして得られたＴｍから計算で求められた値を意味する。

試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出感度は、核酸の長さ、核酸のＧＣ含量、塩濃度等の条件で感度が変わり得るが、本発明の検出方法においては、核酸の重合度が２０以下であれば、一塩基のミスマッチであっても、通常、前記基準ΔＴｍが前記試料ΔＴｍよりも５．０℃以上高くなる。従って、前記基準ΔＴｍが、前記試料ΔＴｍよりも５．０℃以上高くなった場合に、二本鎖核酸ミスマッチが存在すると判定することが好ましく、擬陽性を低減するという観点からは、好ましくは、７．５℃以上高い場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定することがより好ましく、１０．０℃以上高い場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定することが特に好ましい。

３．試料核酸の基準核酸に対する変異の検出方法
上記の核酸ミスマッチの検出方法の一態様として、基準核酸（例えば、野生型ゲノム核酸）に対する試料核酸の変異の有無を検出することができる。具体的には、上記検出方法におけるプローブ核酸として、野生型ゲノム核酸のアンチセンス鎖を用い、プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸として、当該野生型ゲノム核酸のセンス鎖を用い、上記と同様にして、プローブ核酸、すなわち野生型ゲノム核酸のアンチセンス鎖と、試料核酸との核酸ミスマッチを検出することで、試料核酸中の野生型ゲノム核酸センス鎖に対する変異を検出することができる。換言すると、本発明の他の実施形態により、試料核酸における基準核酸に対する変異を検出する方法であって、
（１）特定両性共重合体の存在による、前記基準核酸と、前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を測定する工程と、
（２）特定両性共重合体の存在による、前記試料核酸と、前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
（３）前記試料ΔＴｍと前記基準ΔＴｍとの差（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程とを含む、変異の検出方法が提供される。

４．核酸ミスマッチ検出キットおよび変異検出キット
本発明の他の実施形態において、上述した試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチを検出する方法、ならびに試料核酸における基準核酸に対する変異を検出する方法を実施するためのキットが提供される。具体的には、一の実施形態において、
プローブ核酸と、
前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤と
を含む、試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチを検出するためのキットが提供される。

また、他の実施形態において、
基準核酸と、
前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤と
を含む、試料核酸における基準核酸に対する変異を検出するためのキットが提供される。

これらキットにおける、「プローブ核酸」、「プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸」、「基準核酸」、「基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸」および「特定両性共重合体」の詳細および好ましい形態は、前述の通りである。
また、これらに加えて、水性媒体、緩衝液、界面活性剤、塩、他の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、二本鎖核酸を検出するための試薬等の、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定に使用し得る他の成分を含み得、これらについても前述の通りである。特に、核酸ミスマッチ検出および変異検出を容易にするという点から、二本鎖核酸を検出するための試薬として、インターカレーター性蛍光色素を含むことが好ましい。

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１］
ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を含むポリマー水溶液を、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として使用して、ミスマッチ二本鎖とフルマッチ二本鎖におけるＴｍ上昇幅を比較し、ミスマッチの検出について当該共重合体を評価した。
１．ポリマー水溶液（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）と、アクリル酸（モノマー３）とを以下の重合条件１で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とモノマー３に由来する構成単位３とのモル比が１：１：２である、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を調製した。
重合条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩(固形分濃度５１．２質量％)を１６．１５ｇ(０．０４モル相当)、アクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を２．９３ｇ(０．０４モル相当)、アクリル酸(固形分濃度９９％質量％)を５．８２ｇ(０．０８モル相当)、蒸留水を１４３．８６ｇ仕込み、６０℃に昇温した。２時間毎に、水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマー全量に対してそれぞれ０．２５、０．５、０．５、０．７５モル％となる量だけ、２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を添加し、一晩反応を継続した。

２．基準核酸、相補的な配列からなる核酸および変異を有する核酸
基準核酸のヌクレオチド配列に対して１塩基の変異を検出可能か評価するために、以下のオリゴＤＮＡを用いた。

３．反応液の調製
以下の反応液１乃至４を調製した。なお、蛍光色素溶液中の蛍光色素は、インターカレーター性蛍光色素に該当する。

４．二本鎖融解曲線の作成
調製した各反応液を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にセットし、９５℃で１５秒間加熱した後、１０℃で１分間保温し、次いで、０．３秒毎に蛍光計測を実施しながら、９５℃まで昇温させて二本鎖融解曲線を得、その後、９５℃で１５秒間保持した。

［参照例］
参考として、上記ポリマー水溶液に代えて、従来から二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として知られている塩化マグネシウム溶液を用いて二本鎖融解曲線を得た。
具体的には、上記反応液２および４に代え、以下の反応液５および６を調製し、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得た。

［試験結果］
図１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖との間のＴｍ値は、３７．０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖との間のＴｍ値は、６７．３０℃となり、３０．３０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖との間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖との間のＴｍ値は、５３．３５℃となり、１９．１０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１１．２０℃の差が認められた。

［実施例２］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、マレイン酸（モノマー２）とを以下の重合条件２で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１である、ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
重合条件２：温度計、撹拌機、冷却管を備えた５００ｍLの四つ口フラスコに６６．７８％ジアリルアミン塩酸塩１６０．０７ｇ（０．８０モル）、無水マレイン酸７８．４５ｇ（０．８０モル）、蒸留水９１．８６ｇを仕込み、内温を５０℃に昇温した。２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマーの全量に対して０．５質量％となる量だけ添加し重合を開始した。過硫酸アンモニウムの量がそれぞれ４時間後にモノマー全量に対して０．５質量％、２０、２６時間後にモノマー全量に対して１．０質量％、４５、５１時間後にモノマー全量に対して１．５質量％となる量だけ、前記過硫酸アンモニウム水溶液を添加し、６８時間反応させた。

図３に、それぞれ反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図４に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図３に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３７．００℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６９．８５℃となり、３２．８５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５６．０５℃となり、２１．８０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、１１．０５℃の差が認められた。

［実施例３］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルメチルアミン（モノマー１）と、マレイン酸（モノマー２）とを以下の重合条件３で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１である、ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
重合条件３：温度計、撹拌機、冷却管を備えた２０Ｌの四つ口フラスコに無水マレイン酸１．８６ｋｇ（１９．０モル）と蒸留水０．３４ｋｇを仕込み、ジアリルメチルアミン（DAMA）２．１１ｋｇ（１９．０モル）を冷却下で滴下した。その後、内温を５０℃に昇温した。２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマーの全量に対して０．５質量％となる量だけ添加し重合を開始させた。３、２１、２５時間後に１．０質量％添加し、さらに一晩反応させた。

図５に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図６に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図５に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３７．００℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６５．０５℃となり、２８．０５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５０．９５℃となり、１６．７０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、１１．３５℃の差が認められた。

［実施例４］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）と、アクリル酸（モノマー３）とを以下の重合条件４で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とモノマー３に由来する構成単位３とのモル比が１：１：２である、ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
重合条件４：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、ジアリルアミン塩酸塩 (固形分濃度６５．４０質量％)を２０．４３ｇ（０．１モル相当）、蒸留水を１１０．９ｇ仕込み、６５℃に昇温した。水溶液中の過硫酸アンモニウムの量がモノマー全量に対して２．０モル％となる量、２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を添加後、３０分経過してからアクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を７．１１ｇ (０．１モル相当)、アクリル酸(固形分濃度９９質量％)を１４．５６ｇ (０．２モル相当)、蒸留水を２１．１５ｇ混合した溶液を３時間かけて滴下し、一晩反応を継続した。

図７に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図８に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図７に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３８．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６７．６８℃となり、２９．２８℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図８に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３１．６４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５３．３９℃となり、２１．７５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、７．５３℃の差が認められた。

［比較例１］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量（Ｍｗ）が３０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－０３、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
図９に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１０に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図９および１０に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。

［比較例２］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが８０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－０８、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
図１１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１１および１２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。

［比較例３］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１５０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－１５Ｃ、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
図１３に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１４に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１３および１４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。

［比較例４］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、アリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー２）とを以下の重合条件５で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１０００００である、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
重合条件５：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５７．２２質量％のアリルアミン塩酸塩２４５．２４ｇ（１．５０モル）と６５．２２質量％のジアリルアミン塩酸塩３０７．３１ｇ（１．５０モル）を仕込み、６０℃に昇温した。３０質量％のＶ－５０（２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）懸濁液を、当該懸濁液中のＶ－５０の量がモノマー全量に対して０．５０質量％となる量だけ添加し重合を開始させた。３時間後に０．５０質量％、２４、２７、４８、５１、５４時間後に０．２５質量％添加し、さらに一晩反応させた。
図１５に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１６に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１５および１６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。

［比較例５］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、アリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー２）とを以下の重合条件６で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が４：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが２００００である、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
重合条件６：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５７．２２質量％のアリルアミン塩酸塩４９０．４８ｇ（３．００モル）と６５．２２質量％のジアリルアミン塩酸塩１５３．６６ｇ（０．７５モル）を仕込み、６０℃に昇温した。３０質量％のＶ－５０（２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）懸濁液を、当該懸濁液中のＶ－５０量がモノマー全量に対して１．００質量％となる量だけ添加し、重合を開始させた。２４時間後に１．００質量％、４８時間後に０．５０質量％添加し、さらに一晩反応させた。
図１７に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１８に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１７および１８に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。

［比較例６］
以下の反応条件１により得られた、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１５０００である、５０モル％アセチル化ポリアリルアミンを用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
図１９に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２０に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１９および２０に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
反応条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた２０Ｌの四つ口フラスコに１５．１５質量％のアリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－１５Ｃ、ニットーボーメディカル製）１７．００ｋｇ（４５．１１モル）を仕込んだ。その後、冷却しながら無水酢酸２．３７ｋｇ（２２．５５モル）を滴下し、室温で一晩反応させた。

［比較例７］
ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが２００００であり、以下の重合条件７で重合してなる、ポリアクリルアミドを用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
重合条件７：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、蒸留水を１８６．５９ｇ仕込み、６０℃に昇温した。過硫酸アンモニウムを０．７５ｇ添加した後、アクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を２５．６５ｇ(０．３５モル相当)、蒸留水を３６．５５ｇ混合した溶液を５時間かけて滴下し、一晩反応を継続した。
図２１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２１に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３８．４となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、４９．８１℃となり、１１．４１℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図２２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３１．６４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、４２．１４℃となり、１０．５０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸と相補鎖との間と、変異鎖と相補鎖との間では、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、僅か０．９１℃の差しか認められなかった。

以下に試験結果を纏めて示す。

［実施例５］
基準核酸に対する相補鎖として、一部がＢＮＡで構成されている非天然オリゴＤＮＡを用いて、実施例１と同様にして、ミスマッチの検出についてジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を評価した。
１．ポリマー水溶液（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、実施例１で用いたジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を調製した。

２．基準核酸、相補的な配列からなる核酸および変異を有する核酸
基準核酸のヌクレオチド配列に対して１塩基の変異を検出可能か評価するために、以下のオリゴＤＮＡを用いた。

３．反応液の調製
以下の反応液１乃至４を調製した。

４．二本鎖融解曲線の作成
調製した各反応液を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にセットし、９５℃で１５秒間加熱した後、１０℃で１分間保温し、次いで、０．３秒毎に蛍光計測を実施しながら、９５℃まで昇温させて二本鎖融解曲線を得、その後、９５℃で１５秒間保持した。

[試験結果]
図２３に、反応液１および２から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２４に、反応液３および４から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２３に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６３．７４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、９２．９５℃となり、２９．２１℃のＴｍ値の上昇が認められた。

また、図２４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６２．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、７９．９２℃となり、１７．５２℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１１．６９℃の差が認められた。

［実施例６］
二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、実施例２で用いたジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を用いた以外は、実施例５と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。

図２５に、それぞれ反応液１および２から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２６に、反応液３および４から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２５に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６３．７４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、９２．９５℃となり、２９．２１℃のＴｍ値の上昇が認められた。
また、図２６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６２．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、８１．１０℃となり、１８．６０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
この結果、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１０．６１℃の差が認められた。

実施例５および６の試験の結果を纏めて以下に示す。

Claims (9)

1. 二本鎖核酸の融解温度上昇化剤であって、
   一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
   
   （式中、Ｒ^１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、並びに
   一般式（１－ｆ）
   
   （式中Ｒ^６は水素原子又はメチル基、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
   からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
   一般式（ＩＩ－ａ）
   
   （式中Ｒ^９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、並びに、
   一般式（ＩＩ－ｄ）
   
   （式中Ｒ^１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ_４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
   からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、を含む両性共重合体を含むことを特徴とする、二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
2. 前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
3. 前記ノニオン性構成単位（３）は、メタクリルアミド系単量体またはアクリルアミド系単量体から導かれる構成単位である、請求項２に記載の融解温度上昇化剤。
4. 試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法であって、
   （１）請求項１～３の何れか１項に記載する二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記プローブ核酸と前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
   （２）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
   （３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程と
   を含むことを特徴とする、核酸ミスマッチの検出方法。
5. 前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定する、請求項４に記載の核酸ミスマッチの検出方法。
6. 試料核酸と、プローブ核酸との間の核酸ミスマッチ検出キットであって、
   前記プローブ核酸と、
   前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
   請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
   を含む、核酸ミスマッチ検出キット。
7. 試料核酸の基準核酸に対する変異を検出する方法であって、
   （１）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
   （２）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在下による、前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
   （３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程と
   を含む、変異の検出方法。
8. 前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、変異が存在すると判定する、請求項７に記載の変異の検出方法。
9. 試料核酸と、基準核酸との間の変異検出キットであって、
   前記基準核酸と、
   前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
   請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
   を含む、変異検出キット。

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