WO2023106190A1 - 二本鎖核酸の融解温度上昇化剤及びその用途 - Google Patents

二本鎖核酸の融解温度上昇化剤及びその用途 Download PDF

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WO2023106190A1
WO2023106190A1 PCT/JP2022/044338 JP2022044338W WO2023106190A1 WO 2023106190 A1 WO2023106190 A1 WO 2023106190A1 JP 2022044338 W JP2022044338 W JP 2022044338W WO 2023106190 A1 WO2023106190 A1 WO 2023106190A1
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nucleic acid
double
structural unit
melting temperature
group
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尚宏 藤村
亜美 橘
智朗 内木
実 竹内
洋子 照内
晃司 渡邉
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日東紡績株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to an agent for raising the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid, a method for detecting a mismatch in a double-stranded nucleic acid or a mutation with respect to a reference nucleic acid in a sample nucleic acid using the same, and a kit for carrying out the same. . More specifically, an agent for increasing the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid containing an amphoteric copolymer having a specific structure, and a mismatch in a double-stranded nucleic acid or mutation with respect to a reference nucleic acid in a sample nucleic acid using the same and kits for doing the same.
  • Detecting mutations in genomic nucleic acids is widely used to identify specific bacteria and viruses, and to determine human disease susceptibility and drug responsiveness. There is a growing need to be able to detect base mutations accurately, rapidly, and at low cost.
  • Patent Documents 1 to 3 Various methods have been developed as methods for detecting mutations in genomic nucleic acids. Methods have been proposed for detecting mismatches to a reference nucleic acid in a sample nucleic acid by measuring the ratio.
  • a cationic polymer such as polylysine or polyarginine is used as a main chain, and dextran, polyethylene glycol, or the like is used as a side chain. It is said that even a single base mismatch can be detected.
  • this method detects the substitution of the sample nucleic acid by the complementary strand by the FRET method, and requires the reference nucleic acid and the complementary strand to be labeled with a fluorescent dye. Convenient.
  • Methods such as the FRET method that can detect mutations in genomic nucleic acids without using fluorescent dye-labeled nucleic acids include methods that use the melting temperature (Tm) to detect mismatches in double-stranded nucleic acids.
  • the melting temperature (Tm) refers to the temperature at which 50% of a double-stranded nucleic acid denatures into a single strand.
  • the melting temperature (Tm) is lowered. Therefore, this phenomenon can be used to detect mutations in a sample nucleic acid relative to a reference nucleic acid, or to detect target sequences through differences in nucleic acid amplification efficiency caused by this phenomenon.
  • the change in melting temperature (Tm) caused by a single base mismatch is said to be about 1 to 3°C. It is necessary to devise ways to increase
  • Patent Documents 4 and 5 a method has been developed that enables the detection of slight mutations by analyzing melting curves.
  • Patent Documents 4 and 5 since these methods require strict temperature control, a high-precision constant temperature apparatus is required, and practically simpler methods are desired.
  • Patent Document 1 described above the Tm values of a 20-mer double-stranded nucleic acid having a single-base mismatch and a full-match 20-mer double-stranded nucleic acid are measured in the presence and absence of the cationic polymer. , the Tm increase due to the presence of the cationic macromolecular polymer is shown.
  • both the mismatched double-stranded nucleic acid and the fully-matched double-stranded nucleic acid show a Tm increase of about 15° C. due to the presence of the cationic polymer, and there is no significant difference between the two.
  • the present invention provides novel agents for increasing the melting temperature (Tm) of double-stranded nucleic acids, mismatches in double-stranded nucleic acids, or mutations in reference nucleic acids in sample nucleic acids, which can address the problems in the prior art as described above. It is an object to provide methods of detection and kits for carrying out these methods.
  • an amphoteric copolymer containing a specific cationic structural unit (1) and a specific anionic structural unit (2) (hereinafter abbreviated as "specific amphoteric copolymer” ) is added to the nucleic acid solution, the increase in Tm due to the presence of the specific amphoteric copolymer in the complementary full-matched double-stranded nucleic acid and the non-complementary mismatched double-stranded nucleic acid
  • the difference from the increase in Tm value due to the presence of the specific amphoteric copolymer in 1 was expanded, and it was found that mismatches could be detected even at the single base level, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following melting temperature raising agent, method for detecting nucleic acid mismatch, method for detecting mutation of sample nucleic acid with respect to reference nucleic acid, kit for detecting nucleic acid mismatch, and kit for detecting mutation.
  • An agent for increasing the melting temperature of a double-stranded nucleic acid general formula (Ia) or general formula (Ib)
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • a method for detecting a nucleic acid mismatch between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid comprising: (1) the probe nucleic acid and a base sequence complementary to the probe nucleic acid with or without the addition of the agent for increasing the melting temperature of the double-stranded nucleic acid according to any one of [1] to [3] Measuring the melting temperature of the double-stranded nucleic acid with the nucleic acid comprising the amphoteric copolymer, the increase value of the melting temperature between the probe nucleic acid and the nucleic acid comprising the base sequence complementary to the probe nucleic acid ( determining a reference ⁇ Tm); (2) Measuring the melting temperature of the double-stranded nucleic acid of the sample nucleic acid and the probe nu
  • sample ⁇ Tm melting temperature
  • probe nucleic acid determining an increase in melting temperature (sample ⁇ Tm) of the double-stranded nucleic acid between the sample nucleic acid and the probe nucleic acid due to the presence of the amphoteric copolymer; (3) A method for detecting nucleic acid mismatch, comprising the step of determining the presence or absence of nucleic acid mismatch based on the value ( ⁇ Tm) obtained by subtracting the sample ⁇ Tm from the reference ⁇ Tm. [5] The method for detecting a nucleic acid mismatch according to [4], wherein the presence of a nucleic acid mismatch is determined when the ⁇ Tm is 5.0°C or higher.
  • a method for detecting a mutation between a sample nucleic acid and a reference nucleic acid comprising: (1) the reference nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence complementary to the reference nucleic acid with or without the addition of the agent for increasing the melting temperature according to any one of [1] to [3]; The melting temperature of the double-stranded nucleic acid is measured, and the increase in the melting temperature of the double-stranded nucleic acid between the reference nucleic acid and the nucleic acid having a base sequence complementary to the reference nucleic acid due to the presence of the amphoteric copolymer (reference ⁇ Tm); (2) the sample nucleic acid and the nucleic acid having a base sequence complementary to the reference nucleic acid with or without the addition of the agent for increasing the melting temperature according to any one of [1] to [3]; The melting temperature of the double-stranded nucleic acid is measured, and the increase in the melting temperature of the double-stranded nucleic acid between
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • General formula (1-e) (
  • a method for increasing the melting temperature of a double-stranded nucleic acid comprising: general formula (Ia) or general formula (Ib) (In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.)
  • a structural unit (1-1) having a structure represented by or a structure that is an acid addition salt thereof, general formula (Ic) or general formula (Id) (wherein R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or a an aralkyl group,
  • the cationic structural unit (1) is selected from the group consisting of structural unit (1-1) and structural unit (1-4), The method according to [13], wherein the anionic structural unit (2) is selected from the group consisting of structural unit (2-1) and structural unit (2-4). [15] The method according to [13] or [14], wherein the amphoteric copolymer further contains a nonionic structural unit (3).
  • a double-stranded nucleic acid mismatch can be easily and highly sensitively detected using the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid. Therefore, the presence or absence of mutation in a sample nucleic acid relative to a reference nucleic acid (eg, wild-type genomic nucleic acid) can be easily and highly sensitively tested using the melting temperature (Tm) of the double-stranded nucleic acid.
  • Tm melting temperature
  • Figure 2 shows a duplex melting curve between a nucleic acid oligomer with and a perfectly complementary strand oligomer to a reference nucleic acid oligomer. Double-strand melting curves between the reference nucleic acid oligomer and the complementary strand oligomer in the presence or absence of diallylamine hydrochloride/maleic acid copolymer, or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer were determined. show.
  • a nucleic acid oligomer having a single base mutation relative to a reference nucleic acid oligomer and a reference nucleic acid in the presence or absence of a diallylamine hydrochloride-maleic acid copolymer, or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer Double-strand melting curves between oligomers and perfectly complementary oligomers are shown.
  • a nucleic acid oligomer having a single base mutation relative to a reference nucleic acid oligomer and a reference nucleic acid in the presence or absence of a diallylmethylamine-maleic acid copolymer, or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer Double-strand melting curves between oligomers and perfectly complementary oligomers are shown. Double-strand melting between a reference nucleic acid oligomer and a complementary strand oligomer in the presence or absence of a diallylamine hydrochloride-acrylamide-acrylic acid copolymer, or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer. curve.
  • a duplex melting curve between a complementary strand oligomer to a reference nucleic acid oligomer is shown.
  • Main strand melting curves are shown.
  • a nucleic acid having a single-base mutation relative to a reference nucleic acid oligomer in the presence or absence of an allylamine polymer (weight average molecular weight (Mw): 3000), or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer
  • a duplex melting curve between an oligomer and a complementary strand oligomer to a reference nucleic acid oligomer is shown.
  • Two-way chain between the reference nucleic acid oligomer and the perfectly complementary strand oligomer in the presence or absence of an allylamine polymer (weight average molecular weight (Mw): 8000), or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer.
  • Main strand melting curves are shown.
  • a duplex melting curve between an oligomer and a complementary strand oligomer to a reference nucleic acid oligomer is shown. Two strands between the reference nucleic acid oligomer and the complementary strand oligomer in the presence or absence of an allylamine polymer (weight average molecular weight (Mw): 15000), or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer. Strand melting curves are shown.
  • Mw weight average molecular weight
  • Mw weight average molecular weight
  • Figure 3 shows duplex melting curves between nucleic acid oligomers with single base mutations and perfectly complementary oligomers to a reference nucleic acid oligomer.
  • Mw weight average molecular weight
  • Figure 3 shows duplex melting curves between nucleic acid oligomers with single base mutations and perfectly complementary oligomers to a reference nucleic acid oligomer.
  • the reference nucleic acid oligomer and the complementary strand oligomer were examined.
  • the double-strand melting curves are shown in between. In the presence or absence of 50 mol% acetylated polyallylamine (weight average molecular weight (Mw): 15000), or in the presence of MgCl2 instead of the copolymer, one base relative to the reference nucleic acid oligomer
  • Figure 3 shows duplex melting curves between nucleic acid oligomers with mutations and the perfect complementary strand oligomers to the reference nucleic acid oligomers. Duplex melting curves between a reference nucleic acid oligomer and a complementary strand oligomer in the presence or absence of polyacrylamide or in the presence of MgCl 2 instead of the copolymer are shown.
  • a nucleic acid oligomer having a single base mutation and a perfectly complementary strand oligomer to the reference nucleic acid oligomer shows the double-strand melting curve between .
  • Figure 2 shows duplex melting curves between a reference nucleic acid oligomer and a BNA complementary strand oligomer in the presence or absence of dimethylaminopropyl methacrylamide hydrochloride-acrylamide-acrylic acid copolymer.
  • nucleic acid oligomer having a single nucleotide mutation relative to the reference nucleic acid oligomer and a BNA complementary strand oligomer to the reference nucleic acid oligomer.
  • the double-strand melting curves are shown.
  • Figure 2 shows duplex melting curves between a reference nucleic acid oligomer and a BNA complementary strand oligomer in the presence or absence of diallylamine hydrochloride-maleic acid copolymer.
  • the present invention provides an agent for increasing the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid containing an amphoteric copolymer containing specific constitutional units, and using the same to eliminate mismatches in the double-stranded nucleic acid or mutations in the sample nucleic acid with respect to the reference nucleic acid. It relates to methods of detection and kits for carrying out these methods. These embodiments will be described in detail below.
  • Tm Melting Temperature Raising Agent for Double-Stranded Nucleic Acid
  • Tm-increasing agent may be composed of only the specific amphoteric copolymer, and may be used as an aqueous solution in which the specific amphoteric copolymer is dissolved in a nuclease-free medium (e.g., water). It may contain other ingredients.
  • the double-stranded nucleic acid Tm-raising agent raises the melting temperature of the double-stranded nucleic acid by 16.0°C or higher, preferably 20.0°C or higher.
  • the Tm-raising agent for the double-stranded nucleic acid raises the melting temperature of the full-match double-stranded nucleic acid to 20.0°C or higher. , preferably 25.0° C. or more, particularly preferably 30.0° C. or more.
  • the specific amphoteric copolymer contains a cationic structural unit (1) having a specific structure and an anionic structural unit (2) having a specific structure, and the cationic structural unit ( 1) and the anionic structural unit (2) only, or in addition to the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2), it may have other structural units. .
  • Other structural units do not correspond to nonionic structural units (3) described later, cationic structural units (1) having a specific structure, or anionic structural units (2) having a specific structure. Mention may be made of cationic or anionic building blocks of the structure.
  • the cationic structural unit (1) constituting the specific amphoteric copolymer is the following structural unit (1-1), structural unit (1-2), structural unit (1-3) and structural unit (1-4) is at least one cationic constitutional unit selected from the group consisting of As shown below using general formulas, etc., the cationic structural unit (1) has an amino group as a cationic group in its structure. Preferably, the amino group is a secondary or tertiary amino group.
  • the specific amphoteric copolymer may contain only one type of cationic structural unit (1), or may contain two or more types of cationic structural units (1).
  • the two or more types of cationic structural units (1) are a combination of structural units that are both classified as structural units (1-1), and a structural unit ( 1-2), a combination of structural units that are both classified as structural units (1-3), or a combination of structural units that are both classified as structural units (1-4), Alternatively, it may be a combination of structural units classified into different groups among the structural units (1-1) to (1-4).
  • the cationic structural unit (1) is the structural unit (1-1).
  • the structural unit (1-4) and most preferably the cationic structural unit (1) is the structural unit (1-1).
  • the structural unit (1-1) is a structural unit having a structure represented by the following general formula (Ia) or general formula (Ib), or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group or a benzyl group, particularly preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • Structural unit (1-1) is a structure that is an inorganic acid salt or an organic acid salt of the structure represented by the above structural formula (1-a) or (1-b), that is, a structure that is an acid addition salt may have
  • the specific amphoteric copolymer has the structural unit (1-1)
  • the process of removing an addition salt such as HCl from a polymer is complicated and causes an increase in cost. Therefore, an addition salt-type structural unit (1- Using 1) is a preferable embodiment from the viewpoint of cost and the like.
  • the inorganic acid salt or organic acid salt in the structural unit (1-1) of this embodiment is hydrochloride, carboxylate, sulfonate, or alkyl sulfate salt. is preferred, and hydrochloride is particularly preferred.
  • the structural unit (1-2) is a structural unit having a structure represented by general formula (Ic) or general formula (Id) below.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • X a- represents a counter ion
  • a represents the valence of the counter ion.
  • R 2 and R 3 are each independently preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group or a benzyl group, and particularly preferably a methyl group or an ethyl group. At least one of R 2 and R 3 is preferably a hydrogen atom from the viewpoint of achieving a good effect of increasing the Tm value.
  • the counter ion X a- is not particularly limited, it is preferably a chloride ion, a carboxylate ion, a sulfonate ion, or an alkyl sulfate ion from the viewpoint of availability, controllability of the reaction, and the like. or ethyl sulfate ion is particularly preferred.
  • a diallylamine monomer having a counterion from the viewpoint of production cost and the like. The process of removing counter ions from the polymer is complicated and causes an increase in cost. Using the specific amphoteric copolymer having the above is a preferred embodiment from the viewpoint of cost and the like.
  • the structural unit (1-3) is a structural unit having a structure represented by the following general formula (Ie) or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a hydroxyl group, an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 5 to 6 carbon atoms. indicates a group.
  • An alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms which are preferable as R 4 and R 5 may be linear or branched.
  • Examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, decyl group and dodecyl group. , benzyl group and the like.
  • Preferred examples of cycloalkyl groups having 5 to 6 carbon atoms as R 4 and R 5 include, but are not limited to, cyclopentyl and cyclohexyl groups.
  • R 4 and R 5 are each independently preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group or a benzyl group, particularly preferably a hydrogen atom or a methyl group. From the viewpoint of achieving a good effect of increasing the Tm value, it is preferable that both R 4 and R 5 are not hydrogen atoms at the same time.
  • the type of the addition salt is not particularly limited, but availability, ease of reaction control, etc. in terms of, for example, hydrochlorides, sulfates, phosphates, nitrates, sulfites, phosphites, nitrites, hydrobromides, acetates, amidosulfates, methanesulfonates, trifluoroacetates , p-toluenesulfonate and the like can be used.
  • hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates are preferred, and hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates having a structure derived from monoallylamine are particularly preferred.
  • the structural unit (1-4) is a structural unit having a structure represented by the following general formula (If) or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • R 6 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 7 and R 8 each independently represent an alkyl group having 1-4 carbon atoms
  • n is an integer of 2-4.
  • R 6 is preferably a methyl group
  • n is preferably 2 to 3
  • R 7 and R 8 are each preferably a methyl group.
  • the type of the addition salt is not particularly limited, but availability, ease of reaction control, etc.
  • hydrochlorides, sulfates, phosphates, nitrates, sulfites, phosphites, nitrites, hydrobromides, acetates, amidosulfates, methanesulfonates, trifluoroacetates , p-toluenesulfonate and the like can be used.
  • hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates are preferred, and hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates having a structure derived from monoallylamine are particularly preferred.
  • the proportion of the cationic structural unit (1) in the total structural units of the specific amphoteric copolymer is usually 10 to 70 mol%, preferably 15 to 60 mol%, particularly preferably 20 to 55 mol%. be.
  • the above ratio is defined based on the total amount of the two or more types of cationic structural units (1).
  • Anionic building block (2) The anionic structural unit (2) constituting the specific amphoteric copolymer used in the present invention includes the following structural unit (2-1), structural unit (2-2), structural unit (2-3) and structural unit It is at least one anionic structural unit selected from the group consisting of (2-4).
  • the characteristic amphoteric copolymer may contain only one type of anionic structural unit (2), or may contain two or more types of anionic structural units (2).
  • the two or more types of anionic structural units (2) are a combination of structural units that are both classified as structural units (2-1), and a structural unit ( A combination of structural units classified as 2-2), a combination of structural units that are both classified as structural units (2-3), or a combination of structural units that are both classified as structural units (2-4) Alternatively, it may be a combination of structural units classified into different groups among the structural units (2-1) to (2-4).
  • the anionic structural unit (2) is the structural unit (2-1) because mismatches in double-stranded nucleic acids or mutations with respect to the reference nucleic acid in the sample nucleic acid can be detected more reliably. and structural units (2-4) are particularly preferred.
  • Structural unit (2-1) The structural unit (2-1) is a structural unit having a structure represented by general formula (II-a) below.
  • R 9 is hydrogen or a methyl group
  • Y is independently hydrogen, Na, K, NH 4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1/ represents 3Fe.
  • R9 is preferably hydrogen and Y is preferably hydrogen or Na.
  • Structural unit (2-1) is particularly preferably derived from maleic acid.
  • the structural unit (2-2) is a structural unit having a structure represented by general formula (II-b) below.
  • Y independently represents hydrogen, Na, K, NH 4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1/3Fe for each carboxyl group to be bonded.
  • Y is preferably hydrogen or Na.
  • the structural unit (2-3) is a structural unit having a structure represented by general formula (II-c) below or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • Y is hydrogen, Na, K, NH 4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1/3Fe independently for each carboxyl group to be bound.
  • Y is preferably hydrogen or Na.
  • the structural unit (2-4) is a structural unit having a structure represented by general formula (II-d) below.
  • R 10 is hydrogen or a methyl group
  • Y is independently hydrogen, Na, K, NH 4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1 /3Fe.
  • R 10 is preferably hydrogen and Y is preferably hydrogen or Na.
  • the structural unit (2-4) is preferably derived from (meth)acrylic acid, and particularly preferably derived from acrylic acid.
  • each anionic structural unit (2) in the specific amphoteric copolymer only one type of anionic structural unit (2) may be used alone, or a plurality of types of anionic structural units (2) having mutually different structures may be used. They may be used in combination.
  • each anionic structural unit has the same general structural formula (II-a), (II-b), (II-c) or (II-d). They may have mutually different structures within the range represented, or may have mutually different structures represented by different general structural formulas.
  • a plurality of types of anionic structural units (2) having different structures due to the different elements of Y may be used.
  • one anionic structural unit (2-1) having a structure represented by structural formula (II-a) and another anion having a structure represented by structural formula (II-d) A sexual structural unit (2-4) may also be used.
  • the specific amphoteric copolymer contains the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2), it is an amphoteric copolymer having cationic and anionic properties.
  • double-stranded nucleic acid mismatch may or may not be present.
  • the mechanism that remarkably widens the difference in the melting temperature of double-stranded nucleic acids is not necessarily clear, if the cation density of the cationic constitutional unit is too high, the binding between nucleic acids will be strengthened too much, and the melting temperature of double-stranded nucleic acids will increase.
  • the cationic structural unit (1) is the structural unit (1- 1) and the structural unit (1-4)
  • the anionic structural unit (2) is preferably selected from the group consisting of the structural unit (2-1) and the structural unit (2-4). Since it is preferably selected, it has one selected from the group consisting of the structural unit (1-1) and the structural unit (1-4) as the cationic structural unit (1), and the anionic structural unit (2 ) is selected from the group consisting of structural units (2-1) and (2-4).
  • the ratio of the total of the cationic structural units (1) and the anionic structural units (2) to the total structural units of the specific amphoteric copolymer is usually 25 mol% or more, preferably 30%. 90 mol %, more preferably 35 to 75 mol %, particularly preferably 40 to 60 mol %.
  • the ratio of the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2) is not particularly limited, but the molar ratio (cationic structural unit (1):anionic structural unit (2)) is usually 0.1: 1 to 2:1, preferably 0.3:1 to 0.8:1, more preferably 0.4:1 to 1.2:1, particularly preferably 0.5:1 to 1:1.
  • the molar ratio of the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2) in the specific amphoteric copolymer is The specific amphoteric copolymer is reprecipitated with an organic solvent such as isopropyl alcohol or acetone, and the reprecipitate is analyzed using a Perkin Elmer 2400II CHNS/O fully automatic elemental analyzer or an apparatus with equivalent performance to determine the structure of the structural unit. It can be specified by analyzing in an appropriate mode according to.
  • helium gas was used as a carrier gas
  • a solid sample was weighed into a tin capsule, dropped into a combustion tube, and the sample was burned at a combustion temperature of 1800°C or higher in pure oxygen gas. It can be performed by detecting each measurement component by a frontal chromatography method using a detector and quantifying the content of each element using a calibration coefficient.
  • 1H-NMR or 13C-NMR is performed before measurement by the above elemental analyzer.
  • the structure of each structural unit is specified by the known method used.
  • the specific amphoteric copolymer may have other structural units in addition to the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2). Examples of other structural units include nonionic structural units (3) and cationic or anionic structural units that do not correspond to either the cationic structural units (1) or the anionic structural units (2). can. Positioned between the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2), it functions as a spacer between the two to adjust the interference between the positive charge and the negative charge of each structural unit.
  • the specific amphoteric copolymer preferably contains a nonionic constitutional unit (3), since mismatches in strand nucleic acids or mutations in the sample nucleic acid with respect to the reference nucleic acid can be detected more reliably.
  • the nonionic structural unit is preferably located between the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2).
  • the cationic structural unit is a structure represented by the general formula (If) or a structure that is an acid addition salt thereof
  • the nonionic structural unit functions particularly effectively as a spacer.
  • the specific amphoteric copolymer particularly preferably contains a nonionic structural unit (3).
  • Nonionic building block (3) The nonionic structural unit (3) in the present embodiment may be a structural unit derived from a nonionic monomer copolymerizable with the cationic structural unit (1) and the anionic structural unit (2). Although there are no other restrictions, structural units derived from methacrylic acid ester-based monomers, acrylic acid ester-based monomers, methacrylamide-based monomers, acrylamide-based monomers, sulfur dioxide, etc. are preferably used. be able to.
  • More specific examples include methyl methacrylate, ethyl methacrylate, butyl methacrylate, methyl acrylate, ethyl acrylate, butyl acrylate, methacrylamide, N-methylmethacrylamide, dimethylmethacrylamide, N-(3- from dimethylaminopropyl)methacrylamide, acrylamide, dimethylacrylamide, hydroxyethylacrylamide, dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylacrylamide methyl chloride quaternary salt, acryloylmorpholine, isopropylacrylamide, 4-t-butylcyclohexyl acrylate, or sulfur dioxide Derived building blocks can be mentioned.
  • the nonionic structural unit (3) can be usually introduced into the polymer by using a nonionic monomer as the monomer.
  • the content of the nonionic structural unit (3) is not particularly limited, and the suitable amount is also depending on the type of the nonionic structural unit (3).
  • the nonionic structural unit (3) is derived from a methacrylic acid ester-based monomer, an acrylic acid ester-based monomer, a methacrylamide-based monomer, or an acrylamide-based monomer
  • the above ratio is 0.1. /1 to 1/1, more preferably 0.2/1 to 0.8/1, further preferably 0.3/1 to 0.7/1, and 0.4 /1 to 0.6/1 is particularly preferred.
  • the nonionic structural unit (3) is derived from sulfur dioxide, the ratio is preferably 0.1/1 to 1/1, particularly preferably 0.2/1 to 1/1. .
  • the method for producing the specific amphoteric copolymer is not particularly limited, and it can be produced by a method known in the art.
  • the solvent for copolymerizing a cationic monomer having a structure corresponding to the cationic structural unit (1), an anionic monomer having a structure corresponding to the anionic structural unit (2), etc. is not particularly limited. or organic solvents such as alcohols, ethers, sulfoxides, and amides, but water-based solvents are preferred.
  • the monomer concentration is Although it varies depending on the type of polymer and the type of solvent for copolymerization, it is usually 10 to 75% by mass in the case of an aqueous solvent.
  • This copolymerization reaction is usually a radical polymerization reaction and is carried out in the presence of a radical polymerization catalyst.
  • the type of radical polymerization catalyst is not particularly limited, and preferred examples thereof include peroxides such as t-butyl hydroperoxide, persulfates such as ammonium persulfate, sodium persulfate and potassium persulfate, azobis-based catalysts, Examples include water-soluble azo compounds such as diazo compounds.
  • the amount of the radical polymerization catalyst added is generally 0.1 to 20 mol%, preferably 1.0 to 10 mol%, relative to the total monomers.
  • the polymerization temperature is generally 0-100° C., preferably 5-80° C.
  • the polymerization time is generally 1-150 hours, preferably 5-100 hours.
  • the atmosphere for polymerization the atmosphere does not cause any serious problem in polymerizability, but the atmosphere can be carried out in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen.
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for detecting nucleic acid mismatch between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid, the method comprising: (1) a step of determining an increase (reference ⁇ Tm) in the melting temperature of a double-stranded nucleic acid between the probe nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence complementary to the probe nucleic acid due to the presence of the specific amphoteric copolymer; , (2) determining an increase in the melting temperature of a double-stranded nucleic acid (sample ⁇ Tm) between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid due to the presence of the specific amphoteric copolymer; (3) determining the presence or absence of nucleic acid mismatch based on a value ( ⁇ Tm) obtained by subtracting the sample ⁇ Tm from the reference ⁇ Tm.
  • the increase in melting temperature is the nucleic acid melting temperature of the double-stranded nucleic acid of the probe nucleic acid and the nucleic acid having a complementary base sequence thereto in the presence of the specific amphoteric copolymer.
  • Tm1 the double-stranded nucleic acid melting temperature of the probe nucleic acid and the nucleic acid having a complementary base sequence thereto in the absence of the specific amphoteric copolymer, and calculating Tm1-Tm2.
  • the melting temperature increase value is the melting temperature (Tm1) of the double-stranded nucleic acid of the sample nucleic acid and the probe nucleic acid in the presence of the specific amphoteric copolymer
  • Tm2 double-stranded nucleic acid melting temperature
  • nucleic acid includes both DNA and RNA. It also includes non-natural nucleic acids. Nucleic acids containing sequences complementary to sample nucleic acids and probe nucleic acids can include any nucleic acid such as genomic DNA, cDNA, genomic RNA, mRNA, rRNA. In addition, the probe nucleic acid and the nucleic acid containing a sequence complementary to the probe nucleic acid may be natural nucleic acids or non-natural nucleic acids. The non-natural nucleic acid is DNA or RNA containing an artificial nucleotide in its part.
  • artificial nucleotides include BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid), phosphate group or a nucleic acid containing at least a part of a morpholino nucleic acid (details of these non-natural nucleic acids are described, for example, in Patent Documents 6 to 16, etc., and reference is made to the contents thereof. are incorporated herein).
  • the degree of polymerization of the sample nucleic acid and probe nucleic acid is not particularly limited, but from the viewpoint of detection sensitivity, it is usually 4 to 100 mer, preferably 5 to 50 mer, more preferably 6 to 30 mer, more preferably 6 to 30 mer. is 7-20mer, particularly preferably 8-15mer.
  • the GC content of the sample nucleic acid and probe nucleic acid is not particularly limited, but from the viewpoint of detection sensitivity, it is usually 30-80%, preferably 50-75%.
  • the melting temperature of double-stranded nucleic acids is usually measured using an aqueous nucleic acid solution, but the solvent may be any nuclease-free aqueous medium, typically nuclease-free water. Nucleic acids may also be dissolved in buffers, for example, buffers for nucleic acids used in nucleic acid analysis reagents can be used. In addition, the nucleic acid aqueous solution may contain a surfactant within a range that does not affect the increase in the melting temperature (Tm) of the specific amphoteric copolymer, and examples thereof include surfactants used in nucleic acid analysis reagents.
  • Tm melting temperature
  • the specific amphoteric copolymer can usually be contained in the solution at a concentration of 0.03 to 3.0% by mass, and a concentration of 0.2 to 2.0% by mass. It is preferably contained in the solution at a concentration of 0 mass %.
  • the reaction liquid may contain a known melting temperature (Tm) raising agent such as MgCl 2 in addition to the specific amphoteric copolymer.
  • Tm melting temperature
  • MgCl 2 concentration is preferably 5 mM or less.
  • a salt such as NaCl may be contained within a range that does not affect the increase in melting temperature (Tm). In this case, the salt is preferably 300 mM or less.
  • the sample nucleic acid and the probe nucleic acid can usually be measured at a concentration of 10 to 1000 ⁇ M, preferably at a concentration of 30 to 300 ⁇ M.
  • the solution pH can range from 3.0 to 11.0, preferably from 5.0 to 9.0.
  • the temperature schedule for measuring the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid varies depending on the method for detecting denaturation of the double-stranded nucleic acid.
  • the temperature may be raised to cause denaturation of the double-stranded nucleic acid.
  • Methods for detecting denaturation of double-stranded nucleic acids include methods utilizing changes in the absorbance of nucleic acids in the ultraviolet region (e.g., 260 nm) accompanying denaturation of double-stranded nucleic acids, fluorescent dyes, enzymes, and luminescent dyes.
  • a method of detecting the degree of formation of a double-stranded nucleic acid using a probe nucleic acid, or a probe nucleic acid and a nucleic acid having a sequence complementary thereto e.g., FRET method
  • a method for example, the intercalator method in which the fluorescence intensity is reduced as the double-stranded nucleic acid is denatured by being incorporated between the nucleic acids during the formation of the double-stranded nucleic acid.
  • a method for example, the intercalator method that utilizes the decrease in fluorescence intensity associated with crystallization is preferred.
  • Tm in the present specification, unless otherwise specified, it means a value measured by the method described in Example 1, and reference ⁇ Tm, sample ⁇ Tm and ⁇ Tm.
  • a specific numerical value means a value obtained by calculation from the Tm thus obtained.
  • the sensitivity for detecting a nucleic acid mismatch between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid may vary depending on conditions such as the length of the nucleic acid, the GC content of the nucleic acid, and the salt concentration. is 20 or less, the reference ⁇ Tm is usually higher than the sample ⁇ Tm by 5.0° C. or more even with a single base mismatch. Therefore, when the reference ⁇ Tm is 5.0° C. or more higher than the sample ⁇ Tm, it is preferable to determine that a double-stranded nucleic acid mismatch exists.
  • a nucleic acid mismatch exists when the temperature is 0.5°C or higher, and it is particularly preferable to determine that a nucleic acid mismatch exists when the temperature is 10.0°C or higher.
  • the presence or absence of mutation in a sample nucleic acid with respect to a reference nucleic acid can be detected.
  • the antisense strand of a wild-type genomic nucleic acid is used as the probe nucleic acid in the above detection method, and the sense strand of the wild-type genomic nucleic acid is used as the nucleic acid having a base sequence complementary to the probe nucleic acid.
  • nucleic acid mismatch between the probe nucleic acid, that is, the antisense strand of the wild-type genomic nucleic acid and the sample nucleic acid mutations in the sample nucleic acid relative to the wild-type genomic nucleic acid sense strand can be detected.
  • a method for detecting mutations in a sample nucleic acid relative to a reference nucleic acid comprising: (1) measuring an increase in melting temperature (reference ⁇ Tm) between the reference nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence complementary to the reference nucleic acid due to the presence of the specific amphoteric copolymer; (2) measuring an increase in melting temperature (sample ⁇ Tm) between the sample nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence complementary to the reference nucleic acid due to the presence of the specific amphoteric copolymer; (3) determining the presence or absence of a mutation based on the difference ( ⁇ Tm) between the sample ⁇ Tm and the reference ⁇ Tm.
  • nucleic Acid Mismatch Detection Kits and Mutation Detection Kits In other embodiments of the present invention, the methods for detecting nucleic acid mismatches between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid and for detecting mutations in a sample nucleic acid with respect to a reference nucleic acid as described above are performed.
  • a kit is provided for Specifically, in one embodiment, a probe nucleic acid; a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the probe nucleic acid; A kit for detecting nucleic acid mismatch between a sample nucleic acid and a probe nucleic acid is provided, which contains a specific amphoteric copolymer and an agent for increasing the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid.
  • Tm melting temperature
  • a reference nucleic acid a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the reference nucleic acid;
  • a kit for detecting a mutation in a sample nucleic acid with respect to a reference nucleic acid which contains a specific amphoteric copolymer and an agent for increasing the melting temperature (Tm) of a double-stranded nucleic acid.
  • probe nucleic acid "nucleic acid having a complementary nucleotide sequence to the probe nucleic acid”
  • reference nucleic acid nucleic acid having a complementary nucleotide sequence to the reference nucleic acid
  • specific amphoteric copolymer in these kits Details and preferred forms are as described above.
  • the melting temperature of double-stranded nucleic acids such as aqueous media, buffer solutions, surfactants, salts, other melting temperature (Tm) raising agents, reagents for detecting double-stranded nucleic acids, etc. It may contain other components that can be used to measure (Tm), and these are also described above.
  • the reagent for detecting double-stranded nucleic acid contains an intercalating fluorescent dye.
  • Example 1 Using an aqueous polymer solution containing dimethylaminopropyl methacrylamide hydrochloride/acrylamide/acrylic acid copolymer as a Tm-raising agent for double-stranded nucleic acids, comparing the extent of Tm increase between mismatched and fully-matched duplexes and evaluated the copolymers for mismatch detection.
  • Aqueous polymer solution (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acids) Dimethylaminopropyl methacrylamide hydrochloride (monomer 1), acrylamide (monomer 2), and acrylic acid (monomer 3) are copolymerized under the following polymerization conditions 1 as an agent for increasing the Tm of double-stranded nucleic acids.
  • Polymerization condition 1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer, and a condenser tube, 16.15 g (equivalent to 0.04 mol) of dimethylaminopropyl methacrylamide hydrochloride (solid content concentration: 51.2% by mass) ), 2.93 g (equivalent to 0.04 mol) of acrylamide (97% by mass of solid content), 5.82 g (equivalent to 0.08 mol) of acrylic acid (99% by mass of solid content), 143 g of distilled water 0.86 g was charged and the temperature was raised to 60°C.
  • ammonium persulfate aqueous solution was added in amounts such that the amount of ammonium persulfate in the aqueous solution was 0.25, 0.5, 0.5, and 0.75 mol%, respectively, relative to the total amount of the monomer. was added and the reaction continued overnight.
  • oligo DNAs were used to evaluate whether a single base mutation can be detected in the nucleotide sequences of the reference nucleic acid, the nucleic acid comprising a complementary sequence, and the reference nucleic acid having a mutation .
  • reaction liquids 1 to 4 were prepared.
  • the fluorescent dye in the fluorescent dye solution corresponds to an intercalating fluorescent dye.
  • [Test results] 1 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5, and FIG. 2 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 1 the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 37.0° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 67.30°C, and an increase in Tm value of 30.30°C was observed. was taken.
  • FIG. 1 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 2 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 1 the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 37.0° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 34.25° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acids).
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 53.35°C, resulting in a Tm value increase of 19.10°C. Admitted.
  • the reference nucleic acid and the complementary strand and between the mutant strand and the complementary strand there was a difference of 11.20° C. in the increase in Tm value in the presence of the polymer (Tm-increasing agent for double-stranded nucleic acid). Admitted.
  • Example 2 As an agent for increasing the Tm of a double-stranded nucleic acid, diallylamine hydrochloride (monomer 1) and maleic acid (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 2, and a structural unit 1 derived from monomer 1 and a monomer A double-strand melting curve was obtained from each reaction solution in the same manner as in Example 1, except that a diallylamine hydrochloride/maleic acid copolymer having a molar ratio of 1:1 to the structural unit 2 derived from 2 was used.
  • the Tm increase width between the reference nucleic acid and the complementary strand (reference ⁇ Tm) and the Tm increase width between the mutant strand and the complementary strand (sample ⁇ Tm) due to the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) are calculated. was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • Polymerization condition 2 160.07 g (0.80 mol) of 66.78% diallylamine hydrochloride, 78.45 g (0.80 mol) of maleic anhydride are placed in a 500 mL four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser tube.
  • aqueous solution of ammonium persulfate was added in such an amount that the amount of ammonium persulfate in the aqueous solution was 0.5% by mass relative to the total amount of the monomers to initiate polymerization.
  • the amount of ammonium persulfate was 0.5% by mass relative to the total amount of monomers after 4 hours, 1.0% by mass relative to the total amount of monomers after 20 and 26 hours, and 1.5% by mass relative to the total amount of monomers after 45 and 51 hours.
  • % of the aqueous solution of ammonium persulfate was added and reacted for 68 hours.
  • FIG. 3 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5, respectively
  • FIG. 4 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6, respectively.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 37.00° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 69.85°C, and an increase in Tm value of 32.85°C was observed. .
  • FIG. 3 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5, respectively
  • FIG. 4 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6, respectively.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 37.00° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 69.85°C, and an increase in
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 34.25° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 56.05°C, and an increase in Tm value of 21.80°C was observed. rice field.
  • the reference nucleic acid and the complementary strand and between the mutant strand and the complementary strand there was a difference of 11.05°C in the increase in Tm value in the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid). Admitted.
  • Example 3 As an agent for increasing the Tm of a double-stranded nucleic acid, diallylmethylamine (monomer 1) and maleic acid (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 3, and a structural unit 1 derived from monomer 1 and a monomer A double-strand melting curve was obtained from each reaction solution in the same manner as in Example 1, except that a diallylmethylamine/maleic acid copolymer having a molar ratio of 1:1 to the structural unit 2 derived from 2 was used.
  • the Tm increase width between the reference nucleic acid and the complementary strand (reference ⁇ Tm) and the Tm increase width between the mutant strand and the complementary strand (sample ⁇ Tm) due to the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) are calculated. was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • Polymerization condition 3 1.86 kg (19.0 mol) of maleic anhydride and 0.34 kg of distilled water were charged into a 20 L four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser, and diallylmethylamine (DAMA) 2 was added.
  • FIG. 5 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 6 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 5 the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 37.00° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 65.05°C, and an increase in Tm value of 28.05°C was observed.
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 34.25° C.
  • Example 4 As a double-stranded nucleic acid Tm increasing agent, diallylamine hydrochloride (monomer 1), acrylamide (monomer 2), and acrylic acid (monomer 3) are copolymerized under the following polymerization conditions 4 to obtain monomer 1.
  • Polymerization condition 4 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a cooling tube, 20.43 g (equivalent to 0.1 mol) of diallylamine hydrochloride (solid content concentration 65.40% by mass), distilled water was charged, and the temperature was raised to 65°C. After adding 28.5% by mass of ammonium persulfate aqueous solution in an amount such that the amount of ammonium persulfate in the aqueous solution is 2.0 mol% with respect to the total amount of monomers, acrylamide (solid content concentration 97% by mass) is added after 30 minutes.
  • diallylamine hydrochloride solid content concentration 65.40% by mass
  • FIG. 7 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 8 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 7 the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 38.40° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 67.68°C, and an increase in Tm value of 29.28°C was observed.
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 31.64° C.
  • FIG. 9 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 10 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 9 and 10 in the presence of the above polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid), no clear peak was detected, making it difficult to determine the Tm value.
  • Example 2 Example 1 except that an allylamine polymer (product name: PAA-08, manufactured by Nittobo Medical) having a weight-average molecular weight Mw of 8000 obtained by GPC measurement was used as the double-stranded nucleic acid Tm-raising agent. Similarly, a double-strand melting curve was obtained from each reaction solution, and then the Tm increase width (reference ⁇ Tm) between the reference nucleic acid and the complementary strand due to the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) and the mutant strand and the Tm increase width between the complementary strands (sample ⁇ Tm) was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • an allylamine polymer product name: PAA-08, manufactured by Nittobo Medical
  • FIG. 11 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 12 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 11 and 12 in the presence of the above polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid), no clear peak was detected, making it difficult to determine the Tm value.
  • Example 3 Example 1 except that an allylamine polymer (product name: PAA-15C, manufactured by Nittobo Medical) having a weight average molecular weight Mw of 15,000 obtained by GPC measurement was used as the double-stranded nucleic acid Tm-raising agent. Similarly, a double-strand melting curve was obtained from each reaction solution, and then the Tm increase width (reference ⁇ Tm) between the reference nucleic acid and the complementary strand due to the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) and the mutant strand and the Tm increase width between the complementary strands (sample ⁇ Tm) was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • an allylamine polymer product name: PAA-15C, manufactured by Nittobo Medical
  • FIG. 13 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 14 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 13 and 14 in the presence of the above polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid), no clear peak was detected, making it difficult to determine the Tm value.
  • Allylamine hydrochloride (monomer 1) and diallylamine hydrochloride (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 5 as a Tm-increasing agent for double-stranded nucleic acids, and structural unit 1 derived from monomer 1 and The molar ratio with the structural unit 2 derived from the monomer 2 is 1:1, and the weight average molecular weight Mw obtained by GPC measurement is 100000, except for using allylamine hydrochloride/diallylamine hydrochloride copolymer. - An oligo duplex melting test was performed.
  • Polymerization condition 5 245.24 g (1.50 mol) of 57.22% by mass of allylamine hydrochloride and 65.22% by mass of diallylamine hydrochloride were placed in a 1 L four-necked flask equipped with a thermometer, stirrer and condenser. 307.31 g (1.50 mol) was charged and the temperature was raised to 60°C. 30% by mass of V-50 (2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride) suspension was prepared so that the amount of V-50 in the suspension was 0.50 relative to the total amount of monomers. Polymerization was initiated by adding an amount to achieve the mass %.
  • FIG. 15 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 16 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 15 and 16 in the presence of the above polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid), no clear peak was detected, making it difficult to determine the Tm value.
  • allylamine hydrochloride (monomer 1) and diallylamine hydrochloride (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 6, and structural unit 1 derived from monomer 1 and The molar ratio with the structural unit 2 derived from the monomer 2 is 4: 1, and the weight average molecular weight Mw obtained by GPC measurement is 20000, except for using an allylamine hydrochloride/diallylamine hydrochloride copolymer. - An oligo duplex melting test was performed.
  • Polymerization condition 6 490.48 g (3.00 mol) of 57.22% by mass of allylamine hydrochloride and 65.22% by mass of diallylamine hydrochloride in a 1 L four-necked flask equipped with a thermometer, stirrer and condenser. 153.66 g (0.75 mol) was charged and the temperature was raised to 60°C. 30% by mass of V-50 (2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride) suspension, the amount of V-50 in the suspension is 1.00 mass relative to the total amount of monomers % to initiate polymerization. 1.00% by mass was added after 24 hours, and 0.50% by mass was added after 48 hours, and further reacted overnight.
  • FIG. 17 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5
  • FIG. 18 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6.
  • FIG. 17 and 18 in the presence of the above polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid), no clear peak was detected, making it difficult to determine the Tm value.
  • Example 6 Two samples from each reaction solution were used in the same manner as in Example 1, except that 50 mol% acetylated polyallylamine having a weight average molecular weight Mw of 15,000 as measured by GPC, which was obtained under the following reaction conditions 1, was used. A strand melting curve is obtained, and then the Tm increase between the reference nucleic acid and the complementary strand (reference ⁇ Tm) and the Tm increase between the mutant strand and the complementary strand ( The sample ⁇ Tm) was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated. 19 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5, and FIG. 20 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6. FIG. As shown in FIGS.
  • reaction conditions 1 15.15 mass% allylamine polymer (product name: PAA-15C, manufactured by Nittobo Medical) 17.00 kg (45.11 mol) was added. After that, 2.37 kg (22.55 mol) of acetic anhydride was added dropwise while cooling, and the mixture was allowed to react overnight at room temperature.
  • Example 7 A double-strand melting curve was obtained from each reaction solution in the same manner as in Example 1, except that polyacrylamide having a weight-average molecular weight Mw obtained by GPC measurement of 20,000 and polymerized under the following polymerization conditions 7 was used. Then, the Tm increase width between the reference nucleic acid and the complementary strand (reference ⁇ Tm) and the Tm increase width between the mutant strand and the complementary strand (sample ⁇ Tm) due to the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) are calculated. was determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • Polymerization condition 7 186.59 g of distilled water was charged into a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser tube, and the temperature was raised to 60°C. After adding 0.75 g of ammonium persulfate, a mixed solution of 25.65 g (equivalent to 0.35 mol) of acrylamide (solid concentration: 97% by mass) and 36.55 g of distilled water was added dropwise over 5 hours, and overnight. Continue the reaction. 21 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1, 2 and 5, and FIG. 22 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3, 4 and 6. FIG. As shown in FIG.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 38.4 in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the complementary strand was 49.81°C, and an increase in Tm value of 11.41°C was observed.
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 31.64° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the mutant strand and the complementary strand was 42.14°C, and an increase in Tm value of 10.50°C was observed. rice field.
  • the increase in Tm value in the presence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid) was only 0.91. Only a difference of °C was observed.
  • Example 5 A non-natural oligo DNA partly composed of BNA was used as a complementary strand to the reference nucleic acid, and mismatch detection was performed in the same manner as in Example 1 by dimethylaminopropyl methacrylamide hydrochloride/acrylamide/acrylic acid copolymerization. Coalescence was evaluated.
  • Aqueous polymer solution (agent for increasing Tm of double-stranded nucleic acid)
  • oligo DNAs were used to evaluate whether a single base mutation can be detected in the nucleotide sequences of the reference nucleic acid, the nucleic acid comprising a complementary sequence, and the reference nucleic acid having a mutation .
  • reaction liquids 1 to 4 were prepared.
  • FIG. 23 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1 and 2
  • FIG. 24 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3 and 4.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 63.74° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 92.95°C, and an increase in Tm value of 29.21°C was observed. rice field.
  • the Tm value between the mutant strand and the BNA complementary strand was 62.40° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the mutant strand and the BNA complementary strand was 79.92°C, and an increase in Tm value of 17.52°C was observed. was taken.
  • Example 6 Except for using an aqueous polymer solution containing 10.0% by mass of the diallylamine hydrochloride/maleic acid copolymer used in Example 2 and having a pH of 7.0 as an agent for increasing the Tm of a double-stranded nucleic acid, A double-strand melting curve was obtained from each reaction solution in the same manner as in Example 5, and then the Tm increase width between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand (reference ⁇ Tm ) and the extent of increase in Tm between the mutant strand and the BNA complementary strand (sample ⁇ Tm) were determined, and the difference between the two ( ⁇ Tm) was calculated.
  • reference ⁇ Tm the Tm increase width between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand
  • example ⁇ Tm the extent of increase in Tm between the mutant strand and the BNA complementary strand
  • FIG. 25 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1 and 2, respectively, and FIG. 26 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3 and 4.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 63.74° C. in the absence of the polymer (double-stranded nucleic acid Tm-raising agent).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 92.95°C, and an increase in Tm value of 29.21°C was observed. rice field.
  • FIG. 25 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 1 and 2, respectively
  • FIG. 26 shows the double-strand melting curves obtained from reactions 3 and 4.
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 63.74° C. in the absence of the polymer (double-stranded nucleic acid Tm-raising agent).
  • the Tm value between the reference nucleic acid and the BNA complementary strand was 92.95°C, and
  • the Tm value between the mutant strand and the BNA complementary strand was 62.40° C. in the absence of the polymer (Tm-raising agent for double-stranded nucleic acid).
  • the Tm value between the mutant strand and the BNA complementary strand was 81.10°C, and an increase in Tm value of 18.60°C was observed. was taken.
  • the increase in Tm value in the presence of the polymer was 10.61°C. A difference was observed.

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Abstract

従来技術における問題に対処し得る、新規な二重鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の上昇化剤、二重鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法、およびこれらの方法を実施するキットを提供する。　特定のカチオン性構成単位（１）と、特定のアニオン性構成単位（２）とを含む両性共重合体を含む、二重鎖核酸の融解温度上昇化剤、これを用いる核酸ミスマッチの検出方法および試料核酸の基準核酸に対する変異の検出方法、ならびにこれを含む、核酸ミスマッチ検出キットおよび変異検出キット。

Description

二本鎖核酸の融解温度上昇化剤及びその用途
　本発明は、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法およびこれを実施するためのキットに関する。より具体的には、特定の構造を有する両性共重合体を含む二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法およびこれを実施するためのキットに関する。
　特定の細菌やウィルスを同定したり、ヒトの疾患易罹患性や薬剤反応性などを判定したりするために、ゲノム核酸中の変異を検出することが広く行われ、最近では、ゲノム核酸の１塩基の変異を、正確、迅速、および低コストで検出し得ることが要求されるようになっている。
　ゲノム核酸の変異を検出する方法として、種々の方法が開発されており、例えば、基準核酸とその相補鎖からなる二本鎖核酸を試料核酸と共存させ、相補鎖が試料核酸と置換する速度または率を測定することで、試料核酸中の基準核酸に対するミスマッチを検出する方法が提案されている（特許文献１乃至３）。この方法では、ポリリジンやポリアルギニンなどのカチオン性高分子を主鎖として、デキストランやポリエチレングリコール等を側鎖としてグラフト重合したポリマーを添加することで、相補鎖が試料核酸と置換する速度を促進して検出感度を高めており、一塩基のミスマッチでも検出できるとされている。しかし、この方法は、相補鎖の試料核酸への置換をＦＲＥＴ法で検出するものであり、基準核酸および相補鎖を蛍光色素で標識しておくことが必要となるため、これを不要とできればより便利である。
　ＦＲＥＴ法等のように蛍光色素で標識した核酸を用いずにゲノム核酸の変異を検出可能な方法としては、融解温度（Ｔｍ）を利用して二本鎖核酸のミスマッチを検出する方法がある。
　融解温度（Ｔｍ）は、二本鎖核酸の５０％が一本鎖に変性する温度をいい、相補的な関係にあるフルマッチ二本鎖に比べ、相補的な関係にないミスマッチ二本鎖では、融解温度（Ｔｍ）が低くなる。このため、この現象を利用して、試料核酸の基準核酸に対する変異を検出したり、この現象により生じる核酸増幅効率の差を通じて標的配列を検出したりすることができる。ただし、一塩基のミスマッチによって生じる融解温度（Ｔｍ）の変化は１～３℃程度であるとされ、融解温度（Ｔｍ）を利用してゲノム核酸中のごく僅かな変異を検出するには、感度を高める工夫が必要になる。
　この点、融解曲線を解析して僅かな変異を検出可能とする方法がなされている（特許文献４および５）。しかし、これらの方法では、厳密な温度制御が必要なため高精度な恒温装置が必要となり、実用上より簡便な方法が望まれる。
　また、上述した特許文献１では、上記カチオン性ポリマーの存在下および非存在下で、一塩基のミスマッチを有する２０ｍｅｒ二本鎖核酸、およびフルマッチの２０ｍｅｒ二本鎖核酸のＴｍ値が測定され、それぞれのカチオン性高分子ポリマーの存在によるＴｍ上昇値が示されている。残念ながら、ミスマッチの二本鎖核酸と、フルマッチの二本鎖核酸とで、カチオン性ポリマーの存在によるＴｍ上昇値はいずれも１５℃程度であり、両者に有意な差はない。
国際公開第０３／０１８８４１　Ａ１号パンフレット 特開２００１-７８７６９号 特開２００８-２７８７７９号 特開２００５－５８１０７号 特開２００３－５２８６２６号 国際公開２０１６／１６７３２０　Ａ１号パンフレット 特許第６２４２３３６号 特許第５８１３２６３号 特許第４７３１３２４号 特許第４３８３１７８号 特許第５０３０９９８号 特許第４１５１７５１号 特開第２００１－８９４９６号公報 国際公開第２００３／０６８７９５号パンフレット 国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット 特許第３７５６３１３号
　本発明は、以上のような従来技術における問題に対処し得る、新規な二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の上昇化剤、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異を検出する方法、およびこれらの方法を実施するキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意検討の結果、特定のカチオン性構成単位（１）と、特定のアニオン性構成単位（２）とを含む両性共重合体（以下、「特定両性共重合体」と略称することがある。）を核酸溶液に添加すると、相補的な関係にあるフルマッチの二本鎖核酸における特定両性共重合体の存在によるＴｍ上昇値と、相補的な関係にないミスマッチの二本鎖核酸における特定両性共重合体の存在によるＴｍ上昇値との差が拡大し、これにより一塩基レベルでもミスマッチを検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の融解温度上昇化剤、核酸ミスマッチの検出方法、試料核酸の基準核酸に対する変異の検出方法、核酸ミスマッチ検出キットおよび変異検出キットを提供するものである。
［１］　二本鎖核酸の融解温度上昇化剤であって、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中Ｒ６は水素原子又はメチル基、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中Ｒ９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中Ｒ１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、を含む両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［２］　前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
　前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれる、［１］に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［３］　前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１］又は［２］に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
［４］　試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法であって、
　（１）［１］～［３］の何れか１項に記載する二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記プローブ核酸と前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
　（２）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
　（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程と
を含む、核酸ミスマッチの検出方法。
［５］　前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定する、請求項４に記載の核酸ミスマッチの検出方法。
［６］　試料核酸と、プローブ核酸との間の核酸ミスマッチ検出キットであって、
　前記プローブ核酸と、
　前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
　［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
を含む、核酸ミスマッチ検出キット。
［７］　試料核酸と基準核酸との間の変異の検出方法であって、
　（１）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
　（２）［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在下による、前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
　（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程と
を含む、変異の検出方法。
［８］　前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、変異が存在すると判定する、［７］に記載の変異の検出方法。
［９］　試料核酸と、基準核酸との間の変異検出キットであって、
　前記基準核酸と、
　前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
　［１］～［３］の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
を含む、変異検出キット。
［１０］
　二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を製造するための、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中Ｒ６は水素原子又はメチル基、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中Ｒ９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中Ｒ１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、
を含む、両性共重合体の使用。
［１１］
　前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
　前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれることを特徴とする、［１０］に記載の使用。
［１２］
　前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１０］又は［１１］に記載の使用。
［１３］
　二本鎖核酸の融解温度を上昇させる方法であって、
一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
一般式（１－ｅ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
一般式（１－ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（式中Ｒ６は水素原子又はメチル基、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
一般式（ＩＩ－ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（式中Ｒ９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
一般式（ＩＩ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
一般式（ＩＩ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
一般式（ＩＩ－ｄ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式中Ｒ１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、
を含む、両性共重合体を、二本鎖核酸と溶液中で混合して、前記二本鎖核酸の融解温度を上昇させる方法。
［１４］
　前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
　前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］
　前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、［１３］又は［１４］に記載の方法。
　本発明によれば、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）を利用して、簡易且つ高感度に、二本鎖核酸ミスマッチを検出することができる。従って、基準核酸（例えば、野生型ゲノム核酸）に対する試料核酸の変異の有無を二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）を利用して、簡易且つ高感度で検査することができる。
ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：３０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：３０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：８０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：８０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１０００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：１０００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：２００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体（重量平均分子量（Ｍｗ）：２００００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ５０モル％アセチル化ポリアリルアミン（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ５０モル％アセチル化ポリアリルアミン（重量平均分子量（Ｍｗ）：１５０００）の存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ポリアクリルアミドの存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーと相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ポリアクリルアミドの存在下または非存在下、あるいは当該共重合体に代え、ＭｇＣｌ２の存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対する完全相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーとＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対するＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーとＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。 ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体の存在下または非存在下での、基準核酸オリゴマーに対して１塩基の変異を有する核酸オリゴマーと基準核酸オリゴマーに対するＢＮＡ相補鎖オリゴマーとの間の二本鎖融解曲線を示す。
　本発明の実施の形態を詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に限定して理解されるべきものではない。
　本発明は、特定の構成単位を含む両性共重合体を含む二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、これを用いて二本鎖核酸におけるミスマッチまたは基準核酸に対する試料核酸中の変異を検出する方法、およびこれら方法を実施するためのキットに関する。以下、これら実施形態について詳細に説明する。
１．二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤
　本発明の一の実施形態は、特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤に関する。この二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、特定両性共重合体のみで構成されていてもよく、特定両性共重合体をヌクレアーゼフリーの媒体（例えば、水）に溶解した水溶液のように、それ以外の成分を含んでいてもよい。
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、二本鎖核酸の融解温度を１６．０℃以上、好ましくは、２０．０℃以上、上昇させる。特に二本鎖核酸がミスマッチを含まない二本鎖核酸（フルマッチ二本鎖核酸）である場合、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤は、フルマッチ二本鎖核酸の融解温度を２０．０℃以上、好ましくは２５．０℃以上、特に好ましくは３０．０℃以上上昇させる。
　特定両性共重合体
　特定両性共重合体は、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）と、特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）とを含むものであり、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のみで構成されていてもよく、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）に加えて、それ以外の構成単位を有していてもよい。それ以外の構成単位としては、後述のノニオン性構成単位（３）や、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）及び特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）のいずれにも該当しない構造のカチオン性又はアニオン性の構成単位を挙げることができる。
　カチオン性構成単位（１）
　特定両性共重合体を構成するカチオン性構成単位（１）は、下記の構成単位（１－１）、構成単位（１－２）、構成単位（１－３）及び構成単位（１－４）からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位である。
　以下に一般式等を用いて示す様に、カチオン性構成単位（１）はその構造中にカチオン基としてアミノ基を有するものであるが、良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点から、該アミノ基は第２級又は第３級のアミノ基であることが好ましい。
　特定両性共重合体は、カチオン性構成単位（１）１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含んでいてもよい。２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含む場合の当該２種類以上のカチオン性構成単位（１）は、ともに構成単位（１－１）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（１－２）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（１－３）に分類される構成単位の組み合わせ、又はともに構成単位（１－４）に分類される構成単位の組み合わせであってもよく、構成単位（１－１）から（１－４）のうち互いに異なるものに分類される構成単位同士の組み合わせであってもよい。
　特定両性共重合体においては、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、前記カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものであることが特に好ましく、前記カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）であることが最も好ましい。
　構成単位（１－１）
　構成単位（１－１）は、下記一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、水素原子、またはメチル基であることが特に好ましい。
　構成単位（１－１）は、上記の構造式（１－ａ）、又は（１－ｂ）で示される構造の無機酸塩、若しくは有機酸塩等である構造、すなわち酸付加塩である構造を有していてもよい。
　特定両性共重合体が構成単位（１－１）を有する場合、特定両性共重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、付加塩を有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からＨＣｌ等の付加塩を除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、付加塩型の構成単位（１－１）を用いることは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
　入手の容易さや反応の制御性等の観点から、この実施形態の構成単位（１－１）における無機酸塩、又は有機酸塩は、塩酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、又はアルキルサルフェート塩であることが好ましく、塩酸塩であることが特に好ましい。
　構成単位（１－２）
　構成単位（１－２）は、下記一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）で表される構造を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、又は炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。
　Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、メチル基、またはエチル基であることが特に好ましい。
　良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点からは、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方が水素原子であることが好ましい。
　カウンターイオンＸａ－には特に限定はないが、入手の容易さや反応の制御性等の観点から、塩素イオン、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、又はアルキルサルフェートイオンであることが好ましく、塩素イオン、又はエチルサルフェートイオンであることが特に好ましい。
　特定両性共重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、カウンターイオンを有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からカウンターイオンを除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、カウンターイオン型の構成単位（１－２）を有する特定両性共重合体を使用することは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
　構成単位（１－３）
　構成単位（１－３）は、下記一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。
　Ｒ４及びＲ５として好ましい炭素数１～１２のアルキル基又は炭素数７～１０のアラルキル基は、直鎖状、枝分かれ状のいずれであってもよい。その例としてはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ベンジル基などが挙げられる。また、Ｒ４及びＲ５として好ましい炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられるが、これらには限定されない。
　Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、水素原子、またはメチル基であることが特に好ましい。
　良好なＴｍ値上昇効果を実現する等の観点からは、Ｒ４及びＲ５の両方が同時には水素原子とならないことが好ましい。
　構成単位（１－３）が一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造の酸付加塩である場合の付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
　中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。
　構成単位（１－４）
　構成単位（１－４）は、下記一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　式中Ｒ６は水素原子又はメチル基、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。
　Ｒ６は、メチル基であることが好ましく、ｎは２～３であることが好ましく、Ｒ７およびＲ８はそれぞれメチル基であることが好ましい。
　構成単位（１－４）が一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造の酸付加塩である場合の付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
　中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。
　特定両性共重合体の全構成単位に占めるカチオン性構成単位（１）の割合は、通常１０～７０モル％であり、好ましくは１５～６０モル％であり、特に好ましくは２０～５５モル％である。２種類以上のカチオン性構成単位（１）を含む場合の上記割合は、当該２種類以上のカチオン性構成単位（１）の合計量に基づいて定義される。
　アニオン性構成単位（２）
　本発明において用いられる特定両性共重合体を構成するアニオン性構成単位（２）は、下記の構成単位（２－１）、構成単位（２－２）、構成単位（２－３）及び構成単位（２－４）からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位である。
　特性両性共重合体は、アニオン性構成単位（２）１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上のアニオン性構成単位（２）を含んでいてもよい。２種類以上のアニオン性構成単位（２）を含む場合の当該２種類以上のアニオン性構成単位（２）は、ともに構成単位（２－１）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（２－２）に分類される構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（２－３）に分類される構成単位の組み合わせ、又はともに構成単位（２－４）に分類される構成単位の組み合わせであってもよく、構成単位（２－１）から（２－４）のうち互いに異なるものに分類される構成単位同士の組み合わせであってもよい。
　特定両性共重合体においては、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、前記アニオン性構成単位（２）が構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものであることが特に好ましい。
　構成単位（２－１）
　構成単位（２－１）は、下記一般式（ＩＩ－ａ）で表される構造を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　式中Ｒ９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅを表す。
　Ｒ９は、水素であることが好ましく、Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。構成単位（２－１）は、マレイン酸から導かれるものであることが特に好ましい。
　構成単位（２－２）
　構成単位（２－２）は、下記一般式（ＩＩ－ｂ）で表される構造を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅを表す。
　Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。
　構成単位（２－３）
　構成単位（２－３）は、下記一般式（ＩＩ－ｃ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
　Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。
　構成単位（２－４）
　構成単位（２－４）は、下記一般式（ＩＩ－ｄ）で表される構造を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　式中、Ｒ10は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
　Ｒ１０は、水素であることが好ましく、Ｙは水素またはＮａであることが好ましい。
　構成単位（２－４）は、(メタ)アクリル酸から導かれるものであることが好ましく、アクリル酸から導かれるものであることが特に好ましい。
　特定両性共重合体におけるアニオン性構成単位（２）として、１種類のみのアニオン性構成単位（２）を単独で用いてもよいし、複数種類の互いに異なる構造のアニオン性構成単位（２）を組み合わせて用いてもよい。
　複数種類の互いに異なるアニオン性構成単位を用いる場合、それぞれのアニオン性構成単位は、同一の一般構造式（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩ－ｃ）又は（ＩＩ－ｄ）で表される範囲内において互いに異なる構造を有していてもよいし、異なる一般構造式で表される互いに異なる構造を有していてもよい。前者の場合、例えば、一般構造式（ＩＩ－ａ）で表されるが、Ｙの元素が互いに異なることによって構造が互いに異なる、複数種類のアニオン性構成単位（２）を用いてもよい。後者の場合、例えば、構造式（ＩＩ－ａ）で表される構造を有する１のアニオン性構成単位（２－１）と、構造式（ＩＩ－ｄ）で表される構造を有する他のアニオン性構成単位（２－４）とを用いてもよい。
　特定両性共重合体は、上記カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）を含むので、カチオン性及びアニオン性を有する両性共重合体となる。
　特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）及び特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）を含む特定両性共重合体を用いることで、二本鎖核酸ミスマッチが存在する場合としない場合との二本鎖核酸融解温度の差を顕著に拡大するメカニズムは必ずしも明らかではないが、カチオン性構成単位のカチオン密度が高すぎると、核酸間の結合を強化し過ぎて、二本鎖核酸融解温度の測定自体が難しくなり、カチオン性構成単位のカチオン密度が低すぎると、二本鎖核酸融解温度の上昇が小さくなりミスマッチの検出感度が低くなることから、特定の構造を有するカチオン性構成単位（１）のポジティブチャージと特定の構造を有するアニオン性構成単位（２）のネガティブチャージとが適度に干渉し、核酸間の結合を適度に強化しているものと推定される。
　上述の様に二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能であることから、特定両性共重合体において、カチオン性構成単位（１）が構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものであることが好ましく、アニオン性構成単位（２）が構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものであることが好ましいので、カチオン性構成単位（１）として構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれるものを有し、アニオン性構成単位（２）として構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれるものを有する特定両性共重合体を特に好ましく用いることができる。
　カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との合計が特定両性共重合体の全構成単位に占める割合には特に制限は無いが、通常２５モル％以上であり、好ましくは３０～９０モル％であり、より好ましくは３５～７５モル％であり、特に好ましくは４０～６０モル％である。
　カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との割合にも特に制限は無いが、モル比（カチオン構成単位（１）：アニオン性構成単位（２））で通常０．１：１～２：１であり、好ましくは０．３：１～０．８：１であり、より好ましくは０．４：１～１．２：１であり、特に好ましくは０．５：１～１：１である。
　特定両性共重合体における、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のモル比は、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）の構造が既知である場合、特定両性共重合体をイソプロピルアルコール又はアセトン等の有機溶媒で再沈し、再沈物について、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４００ＩＩ　ＣＨＮＳ／Ｏ全自動元素分析装置又は同等の性能の装置を用いて、前記構成単位の構造に応じた適宜のモードで分析することで特定することができる。なお、測定は、キャリアーガスとしてヘリウムガスを使用し、錫カプセルに固体試料を量りとり、燃焼管内に落下して純酸素ガス中で燃焼温度１８００℃以上で試料を燃焼し、分離カラム及び熱伝導検出器によるフロンタルクロマトグラフィー方式で各測定成分を検出し、校正係数を用いて各元素の含有率を定量することで行うことができる。ここで、特定両性共重合体におけるカチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）の構造が未知である場合、上記元素分析装置による測定の前に、１Ｈ－ＮＭＲ又は１３Ｃ－ＮＭＲを用いた公知の方法により、それぞれの構成単位の構造を特定する。また、特定両性共重合体の製造（共重合）において供給した各単量体の量、及び特定両性共重合体に取り込まれずに残留した各単量体の量から計算することもできる。なお、特定両性共重合体における各単量体から導かれる構成単位の割合（モル比）は、各構成単位の仕込み組成（モル比）とほぼ一致するため、本明細書では便宜的にモノマーの配合比を構成単位の割合（モル比）として取り扱う事がある。
　それ以外の構成単位
　特定両性共重合体は、上記カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）に加えて、それ以外の構成単位を有していてもよい。
　それ以外の構成単位としては、ノニオン性構成単位（３）や、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）のいずれにも該当しないカチオン性又はアニオン性の構成単位を挙げることができる。
　カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との間に位置することで、両者のスペーサーとして機能して、各構成単位のポジティブチャージとネガティブチャージとの干渉を調整し、二本鎖核酸のミスマッチもしくは試料核酸中の基準核酸に対する変異をより確実に検出可能となることから、特定両性共重合体はノニオン性構成単位（３）を含むことが好ましい。また、ノニオン性構成単位は、カチオン性構成単位（１）とアニオン性構成単位（２）との間に位置することが好ましい。特に、カチオン性構成単位が、上記一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造である場合には、ノニオン性構成単位がスペーサーとして特に有効に機能することから、特定両性共重合体はノニオン性構成単位（３）を含むことが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位（３）
　本実施形態におけるノニオン性構成単位（３）は、カチオン性構成単位（１）及びアニオン性構成単位（２）と共重合可能な非イオン性の単量体から導かれる構成単位であればよく、特にそれ以外の制限はないが、メタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、アクリルアミド系単量体、二酸化硫黄等から導かれる構成単位を、好ましく用いることができる。より具体的な例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリルアミド、Ｎ－メチルメタクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド塩化メチル４級塩、アクリロイルモルフォリン、イソプロピルアクリルアミド、４-ｔ-ブチルシクロヘキシルアクリレート、又は二酸化硫黄から導かれる構成単位を挙げることができる。アクリルアミドから導かれる構成単位を使用することが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位（３）は、通常、単量体として非イオン性の単量体を用いることで、高分子中に導入することができる。
　特定両性共重合体がノニオン性構成単位（３）を有する場合のノニオン性構成単位（３）の含有量には特に制限はなく、またノニオン性構成単位（３）の種類によってもその好適な量は異なるが、アニオン性構成単位（２）とのモル比が、ノニオン性構成単位（３）／アニオン性構成単位（２）＝０．１／１～１／１であることが好ましく０．２／１～０．８／１であることがより好ましく、０．３／１～０．７／１であることがさらに好ましく、０．４／１～０．６／１であることが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位（３）がメタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、又はアクリルアミド系単量体から導かれる場合には、上記比率は０．１／１～１／１であることが好ましく０．２／１～０．８／１であることがより好ましく、０．３／１～０．７／１であることがさらに好ましく、０．４／１～０．６／１であることが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位（３）が二酸化硫黄から導かれる場合には、上記比率は０．１／１～１／１であることが好ましく、０．２／１～１／１であることが特に好ましい。
　特定両性共重合体の製造方法
　特定両性共重合体の製造方法には特に制限はなく、従来当該技術分野において公知の方法で製造することができるが、例えばカチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、及びアニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体、並びに所望によりノニオン性構成単位（３）に対応する構造のノニオン性単量体等のそれ以外の単量体を共重合することにより製造することができる。
　カチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、アニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体等を共重合する場合の溶媒は特に限定されず、水系の溶媒であっても、アルコール、エーテル、スルホキシド、アミド等の有機系の溶媒であってもよいが、水系の溶媒であることが好ましい。
　カチオン性構成単位（１）に対応する構造のカチオン性単量体、アニオン性構成単位（２）に対応する構造のアニオン性単量体等を共重合する場合の単量体濃度は、単量体の種類により、また共重合を行う溶媒の種類により、異なるが、水系の溶媒の場合通常１０～７５質量％である。この共重合反応は、通常、ラジカル重合反応であり、ラジカル重合触媒の存在下に行なわれる。ラジカル重合触媒の種類は特に限定されるものでなく、その好ましい例として、ｔ－ブチルハイドロパーオキサイドなどの過酸化物、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩、アゾビス系、ジアゾ系などの水溶性アゾ化合物が挙げられる。
　ラジカル重合触媒の添加量は、一般的には全単量体に対して０．１～２０モル％、好ましくは１．０～１０モル％である。重合温度は一般的には０～１００℃、好ましくは５～８０℃であり、重合時間は一般的には１～１５０時間、好ましくは５～１００時間である。重合雰囲気は、大気中でも重合性に大きな問題を生じないが、窒素などの不活性ガスの雰囲気で行なうこともできる。
２．試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法
　本発明の他の実施形態は、試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法に関し、この方法は、
　（１）前記特定両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
　（２）前記特定両性共重合体の存在による、試料核酸と、プローブ核酸との二本鎖核酸融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
　（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程とを含む。
　（１）の工程において、融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）は、特定両性共重合体の存在下における、プローブ核酸とそれに相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の核酸融解温度（Ｔｍ１）、並びに特定両性共重合体の不在下における、プローブ核酸とそれに相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸融解温度（Ｔｍ２）をそれぞれ測定し、Ｔｍ１－Ｔｍ２を算出することにより決定する。
　同様に、（２）の工程において、融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）は、特定両性共重合体の存在下における、試料核酸とプローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ１）、並びに特定両性共重合体の不在下における、試料核酸とプローブ核酸との二本鎖核酸融解温度（Ｔｍ２）をそれぞれ測定し、Ｔｍ１－Ｔｍ２を算出することにより決定する。
　本願明細書において、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも含まれる。また、非天然型核酸も含む。試料核酸およびプローブ核酸に相補的な配列を含む核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのあらゆる核酸を含み得る。また、プローブ核酸およびプローブ核酸に相補的な配列を含む核酸は、天然型核酸でも非天然型核酸でもよい。非天然型核酸は、人工ヌクレオチドをその一部に含むＤＮＡ又はＲＮＡであり、人工ヌクレオチドとしては、例えば、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、またはモルホリノ核酸を少なくとも一部に含む核酸等が挙げられる（これら非天然型核酸の詳細は、例えば、特許文献６～１６等に記載されており、参照によりその内容を本願明細書に組み込む）。
　試料核酸及びプローブ核酸の重合度は、特に限定されないが、検出感度の点から、通常、４～１００ｍｅｒであり、好ましくは、５～５０ｍｅｒであり、より好ましくは、６～３０ｍｅｒであり、さらに好ましくは、７～２０ｍｅｒであり、特に好ましくは、８～１５ｍｅｒである。
　試料核酸及びプローブ核酸のＧＣ含量は、特に限定さないが、検出感度の点から、通常、３０～８０％であり、好ましくは、５０～７５％である。
　二本鎖核酸の融解温度の測定は、通常核酸水溶液を用いて行うが、溶媒は、ヌクレアーゼフリーな水性媒体であればよく、典型的にはヌクレアーゼフリーな水である。また、核酸は、緩衝液中に溶解してもよく、例えば、核酸分析試薬で用いられる核酸用緩衝液を使用することができる。また、核酸水溶液は、特定両性共重合体による融解温度（Ｔｍ）の上昇に影響を及ぼさない範囲で、界面活性剤を含んでもよく、核酸分析試薬で用いられる界面活性剤が挙げられる。
　二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定において、特定両性共重合体は、通常、０．０３～３．０質量％の濃度で溶液中に含有させることができ、０．２～２．０質量％の濃度で溶液中に含有させることが好ましい。
　本発明の一の実施形態では、特定両性共重合体に加え、ＭｇＣｌ２等の既知の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を反応液に含んでもよい。ただし、ＭｇＣｌ２を含む場合、その濃度は、５ｍＭ以下とすることが好ましい。また、融解温度（Ｔｍ）の上昇に影響を及ぼさない範囲で、ＮａＣｌなどの塩を含んでもよい。この場合、塩は、３００ｍＭ以下とすることが好ましい。
　二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定において、試料核酸およびプローブ核酸は、通常、それぞれ１０～１０００μＭの濃度で測定を行うことができ、３０～３００μＭの濃度で測定を行うことが好ましい。
　溶液ｐＨは、３．０～１１．０とすることができ、５．０～９．０とすることが好ましい。
　二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定における温度スケジュールは、二本鎖核酸の変性を検出する方法によっても異なるが、基本的には、完全に二本鎖が形成される温度から徐々に温度を上昇させて二本鎖核酸の変性を生じさせればよい。
　二本鎖核酸の変性を検出する方法としては、核酸の紫外線領域（例えば、２６０nm）での吸光度が二本鎖核酸の変性に伴って変化するのを利用する方法、蛍光色素、酵素、発光色素等で標識した、プローブ核酸、またはプローブ核酸およびそれに相補的な配列を有する核酸を利用して、二本鎖核酸の形成の程度を検出する方法（例えば、ＦＲＥＴ法）、および蛍光色素等を二本鎖核酸形成時に核酸間に取り込ませ、二本鎖核酸の変性に伴う蛍光強度の減少を利用する方法（例えば、インターカレータ―法）がある。
　蛍光色素等で標識したプローブ核酸を準備する必要がなく、簡単な装置でリアルタイムな分析が可能な点で、蛍光色素等を二本鎖核酸形成時に核酸間に取り込ませ、二本鎖核酸の変性に伴う蛍光強度の減少を利用する方法（例えば、インターカレータ―法）が好ましい。なお、本願明細書中でＴｍの具体的数値に言及する場合、特に他の方法を特定しない限り、実施例１に記載する方法で測定された数値を意味し、基準ΔＴｍ、試料ΔＴｍおよびΔΔＴｍの具体的数値は、この様にして得られたＴｍから計算で求められた値を意味する。
　試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出感度は、核酸の長さ、核酸のＧＣ含量、塩濃度等の条件で感度が変わり得るが、本発明の検出方法においては、核酸の重合度が２０以下であれば、一塩基のミスマッチであっても、通常、前記基準ΔＴｍが前記試料ΔＴｍよりも５．０℃以上高くなる。従って、前記基準ΔＴｍが、前記試料ΔＴｍよりも５．０℃以上高くなった場合に、二本鎖核酸ミスマッチが存在すると判定することが好ましく、擬陽性を低減するという観点からは、好ましくは、７．５℃以上高い場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定することがより好ましく、１０．０℃以上高い場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定することが特に好ましい。
３．試料核酸の基準核酸に対する変異の検出方法
　上記の核酸ミスマッチの検出方法の一態様として、基準核酸（例えば、野生型ゲノム核酸）に対する試料核酸の変異の有無を検出することができる。具体的には、上記検出方法におけるプローブ核酸として、野生型ゲノム核酸のアンチセンス鎖を用い、プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸として、当該野生型ゲノム核酸のセンス鎖を用い、上記と同様にして、プローブ核酸、すなわち野生型ゲノム核酸のアンチセンス鎖と、試料核酸との核酸ミスマッチを検出することで、試料核酸中の野生型ゲノム核酸センス鎖に対する変異を検出することができる。換言すると、本発明の他の実施形態により、試料核酸における基準核酸に対する変異を検出する方法であって、
　（１）特定両性共重合体の存在による、前記基準核酸と、前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を測定する工程と、
　（２）特定両性共重合体の存在による、前記試料核酸と、前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
　（３）前記試料ΔＴｍと前記基準ΔＴｍとの差（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程とを含む、変異の検出方法が提供される。
４．核酸ミスマッチ検出キットおよび変異検出キット
　本発明の他の実施形態において、上述した試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチを検出する方法、ならびに試料核酸における基準核酸に対する変異を検出する方法を実施するためのキットが提供される。具体的には、一の実施形態において、
　プローブ核酸と、
　前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
　特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤と
を含む、試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチを検出するためのキットが提供される。
　また、他の実施形態において、
　基準核酸と、
　前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
　特定両性共重合体を含む、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤と
を含む、試料核酸における基準核酸に対する変異を検出するためのキットが提供される。
　これらキットにおける、「プローブ核酸」、「プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸」、「基準核酸」、「基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸」および「特定両性共重合体」の詳細および好ましい形態は、前述の通りである。
　また、これらに加えて、水性媒体、緩衝液、界面活性剤、塩、他の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、二本鎖核酸を検出するための試薬等の、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定に使用し得る他の成分を含み得、これらについても前述の通りである。特に、核酸ミスマッチ検出および変異検出を容易にするという点から、二本鎖核酸を検出するための試薬として、インターカレーター性蛍光色素を含むことが好ましい。
　以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
　ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を含むポリマー水溶液を、二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として使用して、ミスマッチ二本鎖とフルマッチ二本鎖におけるＴｍ上昇幅を比較し、ミスマッチの検出について当該共重合体を評価した。
１．ポリマー水溶液（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）と、アクリル酸（モノマー３）とを以下の重合条件１で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とモノマー３に由来する構成単位３とのモル比が１：１：２である、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を調製した。
　重合条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩(固形分濃度５１．２質量％)を１６．１５ｇ(０．０４モル相当)、アクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を２．９３ｇ(０．０４モル相当)、アクリル酸(固形分濃度９９％質量％)を５．８２ｇ(０．０８モル相当)、蒸留水を１４３．８６ｇ仕込み、６０℃に昇温した。２時間毎に、水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマー全量に対してそれぞれ０．２５、０．５、０．５、０．７５モル％となる量だけ、２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を添加し、一晩反応を継続した。
２．基準核酸、相補的な配列からなる核酸および変異を有する核酸
　基準核酸のヌクレオチド配列に対して１塩基の変異を検出可能か評価するために、以下のオリゴＤＮＡを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
３．反応液の調製
　以下の反応液１乃至４を調製した。なお、蛍光色素溶液中の蛍光色素は、インターカレーター性蛍光色素に該当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
４．二本鎖融解曲線の作成
　調製した各反応液を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にセットし、９５℃で１５秒間加熱した後、１０℃で１分間保温し、次いで、０．３秒毎に蛍光計測を実施しながら、９５℃まで昇温させて二本鎖融解曲線を得、その後、９５℃で１５秒間保持した。
［参照例］
　参考として、上記ポリマー水溶液に代えて、従来から二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として知られている塩化マグネシウム溶液を用いて二本鎖融解曲線を得た。
　具体的には、上記反応液２および４に代え、以下の反応液５および６を調製し、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
［試験結果］
　図１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖との間のＴｍ値は、３７．０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖との間のＴｍ値は、６７．３０℃となり、３０．３０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖との間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖との間のＴｍ値は、５３．３５℃となり、１９．１０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１１．２０℃の差が認められた。
［実施例２］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、マレイン酸（モノマー２）とを以下の重合条件２で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１である、ジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　重合条件２：温度計、撹拌機、冷却管を備えた５００ｍLの四つ口フラスコに６６．７８％ジアリルアミン塩酸塩１６０．０７ｇ（０．８０モル）、無水マレイン酸７８．４５ｇ（０．８０モル）、蒸留水９１．８６ｇを仕込み、内温を５０℃に昇温した。２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマーの全量に対して０．５質量％となる量だけ添加し重合を開始した。過硫酸アンモニウムの量がそれぞれ４時間後にモノマー全量に対して０．５質量％、２０、２６時間後にモノマー全量に対して１．０質量％、４５、５１時間後にモノマー全量に対して１．５質量％となる量だけ、前記過硫酸アンモニウム水溶液を添加し、６８時間反応させた。
　図３に、それぞれ反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図４に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図３に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３７．００℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６９．８５℃となり、３２．８５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５６．０５℃となり、２１．８０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、１１．０５℃の差が認められた。
［実施例３］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルメチルアミン（モノマー１）と、マレイン酸（モノマー２）とを以下の重合条件３で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１である、ジアリルメチルアミン・マレイン酸共重合体を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　重合条件３：温度計、撹拌機、冷却管を備えた２０Ｌの四つ口フラスコに無水マレイン酸１．８６ｋｇ（１９．０モル）と蒸留水０．３４ｋｇを仕込み、ジアリルメチルアミン（DAMA）２．１１ｋｇ（１９．０モル）を冷却下で滴下した。その後、内温を５０℃に昇温した。２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマーの全量に対して０．５質量％となる量だけ添加し重合を開始させた。３、２１、２５時間後に１．０質量％添加し、さらに一晩反応させた。
　図５に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図６に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図５に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３７．００℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６５．０５℃となり、２８．０５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３４．２５℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５０．９５℃となり、１６．７０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、１１．３５℃の差が認められた。
［実施例４］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）と、アクリル酸（モノマー３）とを以下の重合条件４で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とモノマー３に由来する構成単位３とのモル比が１：１：２である、ジアリルアミン塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
　重合条件４：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、ジアリルアミン塩酸塩 (固形分濃度６５．４０質量％)を２０．４３ｇ（０．１モル相当）、蒸留水を１１０．９ｇ仕込み、６５℃に昇温した。水溶液中の過硫酸アンモニウムの量がモノマー全量に対して２．０モル％となる量、２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を添加後、３０分経過してからアクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を７．１１ｇ (０．１モル相当)、アクリル酸(固形分濃度９９質量％)を１４．５６ｇ (０．２モル相当)、蒸留水を２１．１５ｇ混合した溶液を３時間かけて滴下し、一晩反応を継続した。
　図７に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図８に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図７に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３８．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、６７．６８℃となり、２９．２８℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図８に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３１．６４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、５３．３９℃となり、２１．７５℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸と相補鎖間と、変異鎖と相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、７．５３℃の差が認められた。
［比較例１］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量（Ｍｗ）が３０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－０３、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　図９に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１０に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図９および１０に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
［比較例２］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが８０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－０８、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　図１１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１１および１２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
［比較例３］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１５０００である、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－１５Ｃ、ニットーボーメディカル製）を用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　図１３に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１４に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１３および１４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
［比較例４］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、アリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー２）とを以下の重合条件５で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１０００００である、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
　重合条件５：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５７．２２質量％のアリルアミン塩酸塩２４５．２４ｇ（１．５０モル）と６５．２２質量％のジアリルアミン塩酸塩３０７．３１ｇ（１．５０モル）を仕込み、６０℃に昇温した。３０質量％のＶ－５０（２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）懸濁液を、当該懸濁液中のＶ－５０の量がモノマー全量に対して０．５０質量％となる量だけ添加し重合を開始させた。３時間後に０．５０質量％、２４、２７、４８、５１、５４時間後に０．２５質量％添加し、さらに一晩反応させた。
　図１５に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１６に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１５および１６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
［比較例５］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、アリルアミン塩酸塩（モノマー１）と、ジアリルアミン塩酸塩（モノマー２）とを以下の重合条件６で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が４：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが２００００である、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体を用いた以外は、オリゴ－オリゴ二本鎖融解試験を実施した。
　重合条件６：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５７．２２質量％のアリルアミン塩酸塩４９０．４８ｇ（３．００モル）と６５．２２質量％のジアリルアミン塩酸塩１５３．６６ｇ（０．７５モル）を仕込み、６０℃に昇温した。３０質量％のＶ－５０（２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）懸濁液を、当該懸濁液中のＶ－５０量がモノマー全量に対して１．００質量％となる量だけ添加し、重合を開始させた。２４時間後に１．００質量％、４８時間後に０．５０質量％添加し、さらに一晩反応させた。
　図１７に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図１８に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１７および１８に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
［比較例６］
　以下の反応条件１により得られた、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが１５０００である、５０モル％アセチル化ポリアリルアミンを用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　図１９に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２０に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図１９および２０に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、明確なピークが検出されず、Ｔｍ値の決定が困難であった。
　反応条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた２０Ｌの四つ口フラスコに１５．１５質量％のアリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－１５Ｃ、ニットーボーメディカル製）１７．００ｋｇ（４５．１１モル）を仕込んだ。その後、冷却しながら無水酢酸２．３７ｋｇ（２２．５５モル）を滴下し、室温で一晩反応させた。
［比較例７］
　ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍｗが２００００であり、以下の重合条件７で重合してなる、ポリアクリルアミドを用いた以外は、実施例１と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸および相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖および相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　重合条件７：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに、蒸留水を１８６．５９ｇ仕込み、６０℃に昇温した。過硫酸アンモニウムを０．７５ｇ添加した後、アクリルアミド(固形分濃度９７質量％)を２５．６５ｇ(０．３５モル相当)、蒸留水を３６．５５ｇ混合した溶液を５時間かけて滴下し、一晩反応を継続した。
　図２１に、反応液１、２および５から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２２に、反応液３、４および６から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２１に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、３８．４となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸と相補鎖間のＴｍ値は、４９．８１℃となり、１１．４１℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図２２に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、３１．６４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖と上記相補鎖間のＴｍ値は、４２．１４℃となり、１０．５０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸と相補鎖との間と、変異鎖と相補鎖との間では、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇について、僅か０．９１℃の差しか認められなかった。
　以下に試験結果を纏めて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
［実施例５］
　基準核酸に対する相補鎖として、一部がＢＮＡで構成されている非天然オリゴＤＮＡを用いて、実施例１と同様にして、ミスマッチの検出についてジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を評価した。
１．ポリマー水溶液（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、実施例１で用いたジメチルアミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩・アクリルアミド・アクリル酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を調製した。
２．基準核酸、相補的な配列からなる核酸および変異を有する核酸
　基準核酸のヌクレオチド配列に対して１塩基の変異を検出可能か評価するために、以下のオリゴＤＮＡを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
３．反応液の調製
　以下の反応液１乃至４を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
４．二本鎖融解曲線の作成
　調製した各反応液を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にセットし、９５℃で１５秒間加熱した後、１０℃で１分間保温し、次いで、０．３秒毎に蛍光計測を実施しながら、９５℃まで昇温させて二本鎖融解曲線を得、その後、９５℃で１５秒間保持した。
[試験結果]
　図２３に、反応液１および２から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２４に、反応液３および４から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２３に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６３．７４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、９２．９５℃となり、２９．２１℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図２４に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６２．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、７９．９２℃となり、１７．５２℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１１．６９℃の差が認められた。
［実施例６］
　二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤として、実施例２で用いたジアリルアミン塩酸塩・マレイン酸共重合体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液を用いた以外は、実施例５と同様にして各反応液から二本鎖融解曲線を得、それからポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在による、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ上昇幅（基準ΔＴｍ）と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ上昇幅（試料ΔＴｍ）を決定し、両者の差（ΔΔＴｍ）を算出した。
　図２５に、それぞれ反応液１および２から得られた二本鎖融解曲線を示し、図２６に、反応液３および４から得られた二本鎖融解曲線を示す。図２５に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６３．７４℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、９２．９５℃となり、２９．２１℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　また、図２６に示す通り、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の非存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、６２．４０℃となった。他方、上記ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下では、変異鎖および上記ＢＮＡ相補鎖間のＴｍ値は、８１．１０℃となり、１８．６０℃のＴｍ値の上昇が認められた。
　この結果、基準核酸およびＢＮＡ相補鎖間と、変異鎖およびＢＮＡ相補鎖間とでは、ポリマー（二本鎖核酸のＴｍ上昇化剤）の存在下でのＴｍ値の上昇に、１０．６１℃の差が認められた。
　実施例５および６の試験の結果を纏めて以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050

Claims (9)

  1. 　二本鎖核酸の融解温度上昇化剤であって、
    一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－１）、
    一般式（Ｉ－ｃ）若しくは一般式（Ｉ－ｄ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（１－２）、
    一般式（１－ｅ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－３）、並びに
    一般式（１－ｆ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中Ｒ６は水素原子又はメチル基、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に炭素数１～４のアルキル基を示し、ｎは２～４の整数である。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（１－４）、
    からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性構成単位（１）と、
    一般式（ＩＩ－ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式中Ｒ９は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－１）、
    一般式（ＩＩ－ｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－２）、
    一般式（ＩＩ－ｃ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    （式中Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－３）、並びに、
    一般式（ＩＩ－ｄ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    （式中Ｒ１０は、水素又はメチル基、Ｙは結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。）で表される構造を有する構成単位（２－４）、
    　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のアニオン性構成単位（２）と、を含む両性共重合体を含むことを特徴とする、二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
  2. 　前記カチオン性構成単位（１）が、構成単位（１－１）及び構成単位（１－４）からなる群から選ばれ、
    　前記アニオン性構成単位（２）が、構成単位（２－１）及び構成単位（２－４）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
  3. 　前記両性共重合体が、さらにノニオン性構成単位（３）を含む、請求項１又は２に記載の二本鎖核酸の融解温度上昇化剤。
  4. 　試料核酸とプローブ核酸との間の核酸ミスマッチの検出方法であって、
    　（１）請求項１～３の何れか１項に記載する二本鎖核酸の融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記プローブ核酸と前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記プローブ核酸と、前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
    　（２）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記試料核酸と前記プローブ核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を決定する工程と、
    　（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、核酸ミスマッチの有無を判定する工程と
    を含むことを特徴とする、核酸ミスマッチの検出方法。
  5. 　前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、核酸ミスマッチが存在すると判定する、請求項４に記載の核酸ミスマッチの検出方法。
  6. 　試料核酸と、プローブ核酸との間の核酸ミスマッチ検出キットであって、
    　前記プローブ核酸と、
    　前記プローブ核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
    　請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
    を含む、核酸ミスマッチ検出キット。
  7. 　試料核酸の基準核酸に対する変異を検出する方法であって、
    　（１）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在による、前記基準核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（基準ΔＴｍ）を決定する工程と、
    　（２）請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤を添加してまたは添加せずに前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度を測定し、前記両性共重合体の存在下による、前記試料核酸と前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸との二本鎖核酸の融解温度の上昇値（試料ΔＴｍ）を測定する工程と、
    　（３）前記基準ΔＴｍから前記試料ΔＴｍを引いた値（ΔΔＴｍ）に基づいて、変異の有無を判定する工程と
    を含む、変異の検出方法。
  8. 　前記ΔΔＴｍが５．０℃以上の場合に、変異が存在すると判定する、請求項７に記載の変異の検出方法。
  9. 　試料核酸と、基準核酸との間の変異検出キットであって、
    　前記基準核酸と、
    　前記基準核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、
    　請求項１～３の何れか１項に記載する融解温度上昇化剤と
    を含む、変異検出キット。
     
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