JP5180453B2 - 核酸結合性物質の評価法 - Google Patents
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様々な抗菌、抗ウィルス剤、又は、高感度核酸検出試薬を開発するには、より特定の塩基配列や特定の構造の核酸を認識して結合する低分子化合物や、核酸に対して低い結合定数の化合物が求められており、これを実現する為の評価方法・スクリーニング方法が必要とされている。
(1) 二重鎖部分を有する核酸と他の核酸との鎖交換反応を測定することを含む、核酸結合性物質の評価法。
(ii)他の核酸を添加する工程;及び
(iii)二重鎖部分を有する核酸を構成する核酸の少なくとも一部と、他の核酸を構成する核酸の少なくとも一部とが、鎖交換する速度または率を測定することによって、鎖交換反応を測定する工程:
を含む、(1)記載の方法。
(ii)二重鎖部分を有する核酸を添加する工程;及び
(iii)二重鎖部分を有する核酸を構成する核酸の少なくとも一部と、他の核酸を構成する核酸の少なくとも一部とが、鎖交換する速度または率を測定することによって、鎖交換反応を測定する工程:
を含む、(1)記載の方法。
(5) 他の核酸が単鎖の核酸である、(1)から(3)に記載の方法。
(6) 二重鎖部分を有する核酸の末端が単鎖であり、他の核酸が単鎖の核酸である(1)から(3)に記載の方法。
(7) 二重鎖部分を有する核酸が蛍光標識した核酸であり、鎖交換反応を蛍光測定によって測定する、(1)から(6)の何れかに記載の方法。
本発明において核酸とは、DNA、RNAのいずれでもよく、核酸誘導体や修飾塩基の非天然型ヌクレオチドやPNA(Nature Biotechnolpgy,14.1700−1704(1996))と呼ばれる非天然型ヌクレオチド結合を含んでもよい。
また核酸は、限定しないかぎり単鎖核酸でも、二重鎖核酸、三重鎖核酸でもよい。
二重鎖核酸とは、相補的な塩基対、例えば、DNAでは、アデニン(A)とチミン(T)およびグアニン(G)とシトシン(C)、RNAでは、Aとウラシル(U)およびGとCとの対合により形成される高次構造体を意味する。DNA単鎖/DNA単鎖の二重鎖DNA、RNA単鎖/RNA単鎖の二重鎖RNAのほか、DNA単鎖/RNA単鎖のハイブリッド二重鎖核酸も挙げられる。また二重鎖部分を有する核酸として、単鎖核酸の自己分子内にて相補的な配列同士がアニーリングを起こして形成される二重鎖構造であってもよい。
二重鎖DNAに結合する低分子化合物2種、Distamycin (以下Dst)とHoechst33258(以下Hoechst)とは、シグマ−アルドリッチ社より購入した。これらはATリッチな二重鎖DNAの副溝に沿って結合することが知られている。これら化合物が結合する二重鎖DNAを調製するため、AT塩基対の5回繰り返し配列(A5配列)と、これをスクランブル配列(SCR配列)とした二種類の部分二重鎖プローブを設計し(表1)、各オリゴヌクレオチドの合成を(株)ファスマック社に依頼した。それぞれ、5’末端を消光基DABCYL、3’末端を蛍光基TAMRAで二重ラベルしており、これら相補的なオリゴヌクレオチドを適当な条件下でアニーリングさせ二重鎖DNAを調製する。調製された二重鎖DNAの末端の蛍光標識は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)により消光した状態とする。A5およびSCRの二重鎖プローブを10mMリン酸緩衝液(NaCl 150mM, pH7.2)中に終濃度12nMで調製し、各化合物を120nM添加して室温で30分間インキュベートした。その後、二重鎖に対して5倍量の相補的単鎖オリゴヌクレオチドA5−tまたはSCR−tを添加して蛍光強度変化を日本分光FP6500にて測定した。
実施例1と同様にして行った。A5およびSCRの二重鎖プローブを10mMリン酸緩衝液(NaCl 150mM, pH7.2)中に終濃度12nMで調製し、0〜120nM濃度の各化合物を添加して室温で30分間インキュベートした。その後、二重鎖プローブに対して5倍量の相補的単鎖オリゴヌクレオチドA5−tまたはSCR−tを添加して蛍光強度の変化を日本分光FP6500にて測定した。その結果を図2に示す。
各低分子化合物の添加濃度を変化させ、それに伴う二重鎖DNAの融解温度曲線変化を評価した。融解温度の測定は島津製作所製の紫外可視分光高度計UV−1650PCにて行った。その結果を、図3に示す。
Claims (4)
- 二重鎖DNAの副溝に沿って結合する核酸結合性低分子化合物による二重鎖部分を有する核酸と該二重鎖部分を有する核酸に対する相補的単鎖オリゴヌクレオチドとの鎖交換反応の阻害の程度を測定することを含む、該核酸結合性低分子化合物と該二重鎖部分を有する核酸の該二重鎖部分との結合性能評価法。
- (i)前記二重鎖部分を有する核酸と前記核酸結合性低分子化合物とを混合して結合させる工程;
(ii)前記相補的単鎖オリゴヌクレオチドを添加する工程;及び
(iii)該二重鎖部分を有する核酸を構成する核酸の少なくとも一部と、該相補的単鎖オリゴヌクレオチドを構成する核酸の少なくとも一部とが、鎖交換する速度または率を測定することによって、鎖交換反応を測定する工程:
を含む、請求項1記載の方法。 - 前記二重鎖部分を有する核酸の末端あるいは一部が単鎖である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記二重鎖部分を有する核酸が蛍光標識した核酸であり、鎖交換反応を蛍光測定によって測定する、請求項1から3の何れかに記載の方法。
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