JP7209469B2 - 蛍光を定量化する顕微鏡検査システムおよび顕微鏡検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、１つまたは複数の蛍光が検出され、蛍光の強度または組織における蛍光物質の濃度が定量化されるべきである、顕微鏡検査システムおよび顕微鏡検査方法に関する。特に、顕微鏡検査システムは、外科的介入の範囲内で使用される手術用顕微鏡として具現化することができ、それは、２つの接眼レンズまたは１つもしくは２つのカメラと、対象物領域の画像を観察するための２つの電子ディスプレイとを有する。

本出願人による（特許文献１）から、１つの蛍光または複数の蛍光を同時に検出する従来の顕微鏡検査システムが既知であり、その出願の開示内容全体が本明細書に組み込まれる。複数の蛍光は、たとえば、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、フルオレセインおよびインンドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含む。これらの蛍光色素は、医療分野において、特に、生体物質、血球、腫瘍または他の組織を着色するために、たとえば研究室においても、使用される。

プロトポルフィリンＩＸおよびその前駆体、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）は、いくつかの組織タイプに対して非常に有効なマーカである。したがって、蛍光色素が蓄積した組織における蛍光の強度、またはそれが蓄積した組織における蛍光色素の濃度を求めるために、プロトポルフィリンＩＸの蛍光を検出するだけでなく定量化することも望ましい。上述した従来の顕微鏡検査システムを用いることにより、使用者が完全に満足できるようにすることはまだ不可能である。

独国特許出願第１０２０１５０１１４４１．７号明細書

したがって、本発明の目的は、蛍光を定量化し、定量化すべき蛍光が複数の検出された蛍光のうちの１つであり得る、顕微鏡検査システムおよび顕微鏡検査方法を提案することである。

本発明の実施形態によれば、蛍光を定量化する顕微鏡検査方法は、各々が多数のピクセルを有する第１検出器フィールドおよび第２検出器フィールドに、対象物領域を結像するステップを含む。第１検出器フィールドおよび第２検出器フィールドにおけるピクセルの数は、互いに異なる場合があり、互いに異なる寸法を有する場合がある。例として、検出器フィールドはＣＣＤ検出器であり得る。

第１検出器フィールドおよび第２検出器フィールドに対象物領域を結像する目的で、顕微鏡検査光学ユニットを利用することができ、それは、対象物領域から第１検出器フィールドまでの第１ビーム経路と、対象物領域から第２検出器フィールドまでの第２ビーム経路とを提供する。顕微鏡検査光学ユニットは、第１ビーム経路および第２ビーム経路に配置される対物レンズを備えることができる。顕微鏡検査光学ユニットは、対象物領域と２つの検出器フィールドとの間のビーム経路を第１ビーム経路および第２ビーム経路に分割するビームスプリッタをさらに備えることができる。特に、対象物領域とビームスプリッタとの間のビーム経路に、対物レンズを配置することができる。しかしながら、ビームスプリッタとそれぞれの検出器フィールドとの間の第１ビーム経路および第２ビーム経路に、それぞれ１つの対物レンズを配置することも可能である。対物レンズ自体は、１つまたは複数のレンズ素子から構成することができる。対物レンズは光学部品であって、場合によってはさらなる光学部品とともに、対象物領域から第１検出器フィールドおよび第２検出器フィールドそれぞれへの光学結像を可能にする光学部品である。

対象物領域と第１検出器フィールドとの間の第１ビーム経路に、波長依存透過特性を備える少なくとも１つの第１光学フィルタが配置される。対象物領域と第２検出器フィールドとの間の第２ビーム経路に、第１波長依存透過特性とは異なる波長依存透過特性を備えた少なくとも１つの第２光学フィルタが配置される。

顕微鏡検査光学ユニットがビームスプリッタを備える場合、第１光学フィルタおよび第２光学フィルタはビームスプリッタを備えることができる。この目的で、ビームスプリッタは、第１ビーム経路および第２ビーム経路に対して異なる波長依存透過特性を有するように二色性を有することができる。第１光学フィルタおよび第２光学フィルタは、いずれの場合もさらなるフィルタ素子をさらに備えることができ、これらは、第１ビーム経路または第２ビーム経路の任意の箇所に配置することができる。これらのフィルタ素子は、第１ビーム経路または第２ビーム経路の断面全体にわたって延在する同種の大面積フィルタ素子であり得る。さらに、フィルタ素子は、相互に隣接するピクセルの上流のビーム経路に異なる光学フィルタが配置されるように、第１検出器フィールドまたは第２検出器フィールドのすぐ正面に配置される、光学フィルタのフィールドを備えることができ、前記異なる光学フィルタは、互いに異なる分光透過率を有する。

顕微鏡検査方法は、対象物領域において少なくとも２つの蛍光を励起するステップをさらに含み、２つの蛍光のうちの第１蛍光はプロトポルフィリンＩＸの蛍光であり得る。２つの蛍光のうちの第２蛍光は、第１蛍光をもたらす蛍光色素が蓄積した組織の自家蛍光であり得る。

本方法は、対象物領域において第１蛍光の空間的に依存する蛍光強度を求めるステップをさらに含む。この目的で、第１検出器フィールドにおいて複数のピクセルまたは複数のピクセル群に対していずれの場合も１つの値が求められ、前記値は、それぞれのピクセルまたはピクセル群の上に結像された対象物領域の位置における蛍光強度を表す。この値が求められる複数のピクセルは、特に、第１検出器フィールドのすべてのピクセルである場合があり、そのため、第１検出器フィールドの各ピクセルに対する値が求められる。しかしながら、複数のピクセルはまた、第１検出器フィールドのピクセルのサブセットである場合もあり、そのため、たとえば、検出器フィールドの２つおきまたは３つおきのピクセルに対してのみ値が求められる。さらに、ピクセル群に対してそれぞれ１つの値が求められることが可能であり、前記値は、ピクセル群の上に結合される（拡大した）位置における蛍光強度を表す。例として、こうしたピクセル群は、４つまたは９つまたは１６の相互に隣接するピクセルを含むことができる。

第１検出器フィールドのそれぞれのピクセルまたはそれぞれのピクセル群に対して求められるこの値は、少なくとも以下の変数に基づいて求められる。
－第１検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群によって検出される放射線強度、
－第２検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群によって検出される放射線強度、対象物領域における同じ位置が、第１検出器フィールドの上述したピクセルまたは上述したピクセル群にも結像されるように、このピクセルまたはこのピクセル群の上に結像される、
－第１検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率、
－第２検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率、
－第１蛍光の蛍光スペクトル、および
－第２蛍光の蛍光スペクトル。

ピクセルによって検出される放射線強度は、コントローラによって検出器フィールドのピクセルから読み取られる値によって表される。例として、検出器フィールドがＣＣＤ検出器として具現化される場合、この値は、露出時間中、ピクセルに蓄積された電荷を表す。その値は、たとえば、７つのビットを含む数によって表される場合がある。ピクセル群の場合、その群のピクセルによって検出される放射線強度は、結合され、たとえば、加算または平均等が行われる。

この波長依存検出効率は、対象物フィールドの位置から放射される所与の波長を備える光量子が、この位置が結像されるピクセルまたはピクセル群によって検出される可能性を記述する。この可能性は、波長によって決まる。検出効率の波長依存性は、対象物領域とそれぞれのピクセルとの間のビーム経路に配置された少なくとも１つの光学フィルタの波長依存透過特性によって実質的に決まる。さらに、たとえばレンズ等、ビーム経路における他の光学素子の波長依存透過特性は、ピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率に影響を与える。ピクセルの波長依存検出効率は、たとえば、放射線が検出器フィールドの異なる位置に配置されたピクセルに入射する角度が異なるために、またはたとえばピクセルの半導体材料の製造によって引き起こされたばらつきのために、検出器フィールドの相互に隣接するピクセルの間で異なる可能性がある。

第１蛍光または第２蛍光の蛍光スペクトルは、測定によりまたは計算により求められている可能性がある。

例示的な実施形態によれば、対象物領域の位置における蛍光強度を表す値は、以下の公式によって求められる。

式中、
Ｃ_Ｆ（ｘ，ｙ）は、対象物平面の位置（ｘ，ｙ）におけるプロトポルフィリンＩＸの蛍光強度を表す値であり、
Ｓ_１（ｉ，ｊ）は、第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）によって検出される放射線強度を表し、位置（ｘ，ｙ）は、第１ビーム経路によってピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）にマッピングされ、
Ｓ_２（ｋ，ｌ）は、第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）によって検出される放射線強度を表し、位置（ｘ，ｙ）は、第２ビーム経路によってピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）にマッピングされ、
Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、ピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率によって決まる変数である。

第１検出器フィールドおよび第２検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群は、ここでは、それぞれ、異なる指数（ｉ，ｊ）および（ｋ，ｌ）で示され、それは、２つの検出器フィールドが異なる数のピクセルおよび異なる寸法を有することができ、ピクセルは、異なるように大きい、異なるように設計された群に結合することができるためである。対象物領域における各位置は、一方の検出器のピクセルまたはピクセル群（ｉ，ｊ）の上に、かつ他方の検出器のピクセルまたはピクセル群（ｋ，ｌ）の上に結像され、その結果、１つのピクセルまたは１つのピクセル群（ｉ，ｊ）および（ｋ，ｌ）が互いに連結される。

変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、種々の方法で求めることができる。たとえば、これらの変数のうちのいくつかは、少なくとも２つの蛍光のうちの一方が励起されないと想定される対象物の領域において、測定が実行されることにより、実験的に求めることができる。例として、この目的で、健康な組織がある領域の画像を、この領域ではプロトポルフィリンＩＸが著しい濃度では存在しないと想定して、記録することができる。そのため、測定された蛍光は、組織の自家蛍光のみであり、それは、組織のタイプとは無関係であると想定することができる。

さらに、変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａのうちのすべてまたはいくつかは、以下の式のうちの１つを用いる計算によって求めることができる。

式中、
Ｓ_Ｆ（λ）は、第１蛍光の蛍光スペクトルを表し、
Ｓ_Ａ（λ）は、第２蛍光の蛍光スペクトルを表し、
Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、波長λによって決まる、第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）の検出効率を表し、
Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、波長λによって決まる、さらなる検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）の検出効率を表す。

ここで、第１検出器フィールドのすべてのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）に対して、Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、ピクセル位置とは無関係である波長依存検出効率Ｄ_１（λ）に等しく設定され得る。これは、第１検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群が、それらの検出効率に関して互いに異ならないかまたはわずかにしか異ならないということが想定されることを意味する。同様に、第２検出器フィールドのすべてのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）に対して、Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、ピクセル位置とは無関係である波長依存検出効率Ｄ_２（λ）に等しく設定され得る。

さらに、Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）および／またはＤ_{２，ｉ，ｌ}（λ）に対する値を、たとえば、対象物領域に配置された白色物品が、所与の強度とλｍｉｎ～λｍａｘの波長範囲からの異なる波長とを有する光により連続的に照明され、ピクセルまたはピクセル群によって検出される放射線強度が記録されることにより、実験的に求めることができる。検出される波長依存放射線強度は、Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）またはＤ_{２，ｉ，ｌ}（λ）の関数として直接用いることができ、または、たとえば、正規化係数との乗算の後にそうした関数として用いることができる。

例示的な実施形態によれば、Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、Ｔ_{１，ｉ，ｊ}（λ）に等しく設定され、Ｔ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、対象物領域と第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）との間の第１ビーム経路に配置された少なくとも１つの第１光学フィルタの波長依存透過特性であり、かつ／またはＤ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）に等しく設定され、Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、対象物領域と第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）との間のさらなるビーム経路に配置された少なくとも１つの第２光学フィルタの波長依存透過特性である。

ここで、検出効率は、フィルタの波長依存透過特性によって実質的に決まると想定する。フィルタの波長依存透過特性はさらに、測定によりまたは計算により確かめることができる。波長依存透過特性をもたらすフィルタが、第１ビーム経路および第２ビーム経路それぞれの断面全体にわたって実質的に均一に延在する場合、Ｔ_{１，ｉ，ｊ}（λ）はＴ_１（λ）に等しく設定することができる。同様に、Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）はＴ_２（λ）に等しく設定することができる。これは、検出効率が検出器フィールドのピクセルまたはピクセル群の間で変化しないと想定されることを意味する。

第１波長依存透過特性は、第２波長依存透過特性とは異なる。例示的な実施形態によれば、これは、第１波長および第２波長が、対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と位置（ｘ，ｙ）が結像される第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）との間に配置された少なくとも１つの第１フィルタの第１波長における透過率が、対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と位置（ｘ，ｙ）が結像される第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）との間に配置された少なくとも１つの第２フィルタの第１波長における透過率より少なくとも１．５倍、特に少なくとも５倍、特に少なくとも２０倍大きく、かつ、対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）との間に配置された少なくとも１つの第１フィルタの第２波長における透過率が、対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）との間に配置された少なくとも１つの第２フィルタの第２波長における透過率より少なくとも１．５倍、特に少なくとも５倍、特に少なくとも２０倍小さいように存在することによって、実現することができる。

本発明の実施形態について、図に基づいて以下より詳細に説明する。

実施形態による顕微鏡検査方法を実行する、実施形態による顕微鏡検査システムの概略図を示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第１例による図１の顕微鏡検査システムのビームスプリッタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第２例による図１の顕微鏡検査システムのビームスプリッタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第３例による図１の顕微鏡検査システムのフィルタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第４例による図１の顕微鏡検査システムのフィルタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第５例による図１の顕微鏡検査システムのフィルタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第６例による図１の顕微鏡検査システムのフィルタの透過率をプロットしたグラフを示す。 組織の自家蛍光、プロトポルフィリンＩＸの発光、および第７例による図１の顕微鏡検査システムのフィルタの透過率をプロットしたグラフを示す。

図１は、蛍光を定量化する顕微鏡検査方法を実行する顕微鏡検査システム１の例示的な実施形態を示す。顕微鏡検査システム１は、光ビーム５を対象物領域７に向けるために光を生成する、少なくとも１つの光源３を備える。対象物領域７には対象物９が配置され、それは、少なくとも１つの蛍光色素を含み、対応する励起の場合に少なくとも２つの蛍光を生成する。本明細書で説明する例では、少なくとも１つの蛍光色素はプロトポルフィリンＩＸであり、少なくとも２つの蛍光のうちの１つは、プロトポルフィリンＩＸの蛍光である。本明細書で説明する例では、少なくとも２つの蛍光の第２蛍光は、対象物９の自家蛍光であり、それは、プロトポルフィリンＩＸの蛍光が励起されるときに同様に励起される。自家蛍光は、対象物９内にプロトポルフィリンＩＸが含まれるか否かとは無関係に生成される。例として、対象物９は、細胞培養物に維持されるかまたは身体組織に組み込まれる、ヒトまたは動物の細胞を含むことができる。細胞では、プロトポルフィリンＩＸは、５－ＡＬＡからの代謝産物として生成される。

顕微鏡検査システム１は、光源３に加えて、対象物領域７に向けられる光ビーム５を生成するために、１つまたは複数のレンズから構成された照明光学ユニット１１を備える。光源３と対象物領域７との間のビーム経路に、光学フィルタ１５が配置可能である。コントローラ４３により、制御ライン４５を介して光源３が操作される。さらに、たとえばモータ等を設けることができ、それは、選択的に、光源３と対象物領域７との間のビーム経路に光学フィルタ１５を配置するか、または前記ビーム経路から光学フィルタ１５を取り除く。このアクチュエータも同様に、コントローラ４３によって制御することができる。例として、光源３は、対象物領域７における対象物９を照明するために白色光を生成することができ、この白色光により、眼で対象物９を直接観察することができるか、または、自然色の印象で対象物９を示す対象物領域７からの画像を記録することができる。光学フィルタ１５は、光源３と対象物領域７との間のビーム経路に配置されている場合、実質的に、蛍光を励起する役割を果たす波長範囲からの光のみが、対象物領域に達することができるように、ビーム５における照明光のスペクトルを成形することができる。プロトポルフィリンＩＸの蛍光が励起されるべきである場合、この励起光は、たとえば、３５０ｎｍ～４７０ｎｍの波長範囲にある。

顕微鏡検査システム１は、複数のレンズ２７、２９および３１を有する対物レンズ１７を更に備える。対物レンズ１７は、２つの検出器フィールド２１および２３の上に対象物領域７を結像するために、対象物領域７から放射されるビーム経路２５を提供する役割を果たす。この目的で、対象物１７の下流のビーム経路２５にビームスプリッタ３２が配置され、前記ビームスプリッタは、ビーム経路２５を第１ビーム経路および第２ビーム経路に分割し、第１ビーム経路は、対象物領域７から第１検出器フィールド２１まで延在し、第２ビーム経路は、対象物領域７から第２検出器フィールド２３まで延在する。

図１に示す例では、ビームスプリッタ３２は、対物レンズ１７と２つの検出器フィールド２１および２３それぞれとの間のビーム経路に配置されている。その代わりとして、ビームスプリッタは、対物レンズの下流のビーム経路ではなく、対物レンズの上流のビーム経路に配置されることが可能である。そして、ビームスプリッタは、対象物領域から放射されるビーム経路を２つの部分ビーム経路に分割し、第１対物レンズおよび第１検出器フィールドは第１ビーム経路に配置され、第２対物レンズおよび第２検出器フィールドは第２ビーム経路に配置される。

第１光学フィルタ３３が第１ビーム経路および第２ビーム経路に配置され、第２光学フィルタ３４が第１ビーム経路にのみ配置され、第３光学フィルタ３５が第２ビーム経路にのみ配置されている。光学フィルタ３３、３４および３５は、各々、ビーム経路に固定して配置される場合があり、または任意選択的にビーム経路に配置されかつそこから取り除かれる場合があり、この場合もまたこの目的でアクチュエータを設けることが可能であり、前記アクチュエータはコントローラ４３によって制御される。

ビームスプリッタ３２は、ダイクロイック（二色性）ビームスプリッタとすることができ、それは、第１ビーム経路および第２ビーム経路に対して異なる波長依存透過特性を提供することを意味する。

検出器フィールド２１および２３は、各々、多数のピクセルを有する。各ピクセルは、そのピクセルに入射する光強度を表す信号を出力するように構成されている。ピクセルによって検出される光強度は、信号線４７を介してコントローラ４３によって読み取られる。

本明細書で説明される例では、検出器フィールド２１は、赤外線カメラの検出器フィールドである。これは、検出器フィールド２１のピクセルが赤外光を検出することができることを意味する。光学フィルタ３４は、赤外光のみが通過するのを可能にするように構成され得る。

本明細書で説明される例では、検出器フィールド２３は、チップまたは検出器フィールドを備えたカラーカメラの検出器フィールドである。これは、図１には示さない光学フィルタのフィールドが、検出器フィールドの上流のビーム経路に規則的配置パターンで配置され、相互に隣接するピクセルの上流に配置された光学フィルタが異なる波長依存透過特性を有することを意味する。こうした光学フィルタのフィールドは、ベイヤーマトリックスまたはベイヤーパターンとも呼ばれる。

その代わりとして、カラーカメラはまた、カラーチャネルを選択する目的で異なる波長依存透過特性またはベイヤーパターンを備えた光学フィルタのフィールドが上流に配置されている単一の検出器フィールドの代わりに、カラーチャネルを選択する目的でダイクロイックビームスプリッタを介して光が供給される複数の検出器フィールドを利用することによっても、具現化することができる。そして、対象物領域の所与の位置（ｘ，ｙ）が結像されるピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル（ｋ，ｌ）群が、検出器フィールドの各々に含まれる。

蛍光色素の蛍光を観察するべきである場合、第２ビーム経路に光学フィルタ３５を導入することができ、検出器フィールド２３を用いて通常のカラー画像を記録するべきである場合、第２ビーム経路から光学フィルタ３５を除去することができる。

光学フィルタ３３、ビームスプリッタ３２および光学フィルタ３４は、合せて、波長依存透過特性Ｔ_１（λ）を提供し、それは、対象物領域７から放射される、ある波長λを有する光量子が検出器フィールド２１のピクセルによって検出される効率を決定する。さらに、検出効率はまた、たとえば、検出器フィールド２１のピクセルの半導体材料の特性によっても決まり、そのため、各ピクセルに波長依存検出効率Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）を割り当てることができる。

同様に、光学フィルタ３３、ビームスプリッタ３２および光学フィルタ３５は、検出器フィールド２３のピクセルに対する第２ビーム経路における波長依存透過特性を決定し、そこでは、検出器フィールド２３の上流の光学フィルタのフィールドにより、各ピクセルに対して、第２ビーム経路における光学フィルタの別個の波長依存透過特性Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）を割り当てることができる。そして、ピクセルの検出特性を考慮することにより、各ピクセルに対して波長依存検出効率Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）を割り当てることができる。

図２は、任意の単位でのプロトポルフィリンＩＸの蛍光と、任意の単位での自家蛍光の発光スペクトルと、第１ビーム経路から第１検出器フィールド２１までのビームスプリッタ３２の波長依存透過率とをプロットしたグラフを示す。

プロトポルフィリンＩＸの蛍光と自家蛍光とが互いに重なっていることが分かる。ここで、問題は、検出器フィールド２１および２３によって検出された信号から対象物９のさまざまな位置におけるプロトポルフィリンＩＸの蛍光を定量化することからなると仮定する。この目的で、プロトポルフィリンＩＸの蛍光を自家蛍光から分離しなければならない。これが可能であるのは、２つのビーム経路が、図２に示すビームスプリッタ３２の透過率により、検出器フィールド２１および２３に異なる波長依存透過特性を提供するためである。図２に示すビームスプリッタ３２の設計の場合、図１に示す光学フィルタ３３、３４および３５は、プロトポルフィリンＩＸの蛍光を定量化するためにビーム経路に配置される必要はない。しかしながら、実際には、蛍光を観察しているときにビーム経路に位置するフィルタとさらなる光学部品とが、蛍光を励起するために使用される波長範囲からの光が検出器フィールドに到達するのを可能にしないように設計されている場合、それは、結果の質に寄与する。

プロトポルフィリンＩＸの蛍光の空間的に依存する蛍光強度は、コントローラ４３により、検出器フィールド２１または検出器フィールド２３における複数のピクセルまたは複数のピクセル群に対していずれの場合においても１つの値を求めることによって、求めることができ、前記値は、それぞれのピクセルまたはそれぞれのピクセル群の上に結像される対象物領域の位置における蛍光強度を表す。この値は、検出器フィールド２１のこのピクセルまたはこのピクセル群によって検出される放射線強度と、このピクセルまたはこのピクセル群の波長依存検出効率と、対象物領域の位置が結像される検出器フィールド２３のピクセルまたはピクセル群によって検出される放射線強度と、このピクセルまたはこのピクセル群の波長依存検出効率と、プロトポルフィリンＩＸの蛍光スペクトルと、自家蛍光の蛍光スペクトルとに基づいて、求めることができる。

特に、この値は、以下の公式に従って求めることができる。

式中、
Ｃ_Ｆ（ｘ，ｙ）は、対象物平面の位置ｘ，ｙにおけるプロトポルフィリンＩＸの蛍光強度を表す値であり、
Ｓ_１（ｉ，ｊ）は、第１検出器フィールド２１のピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）によって検出される放射線強度を表し、位置（ｘ，ｙ）は、第１ビーム経路によってピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）にマッピングされ、
Ｓ_２（ｋ，ｌ）は、第２検出器フィールド２３のピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）によって検出される放射線強度を表し、位置（ｘ，ｙ）は、第２ビーム経路によってピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）にマッピングされ、
Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、ピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率によって決まる変数である。

変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、少なくとも一部には、実験により、たとえば、プロトポルフィリンＩＸが著しく集中して存在はしていないと想定される対象物の領域において測定を行うことによって求めることができる。

さらに、変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、少なくとも一部には、以下の式のうちの１つを用いる計算によって求めることができる。

式中、
Ｓ_Ｆ（λ）は、第１蛍光の蛍光スペクトルを表し、
Ｓ_Ａ（λ）は、第２蛍光の蛍光スペクトルを表し、
Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、波長λによって決まる、第１検出器フィールド２１のピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）の検出効率を表し、
Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、波長λによって決まる、さらなる検出器フィールド２３のピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）の検出効率を表す。

空間的に依存する蛍光強度Ｃ_Ｆ（ｘ，ｙ）は、コントローラ４３によって、表示装置４９（図１を参照）における画像として表すことができる。

図２に示す第１ビーム経路に対する波長依存透過特性のグラフにより、２つの検出器フィールドによって異なるスペクトル成分が異なる効率で検出されることになる。これは、第１検出器フィールドの検出効率に対する積分によって求められるＵ_１ＦおよびＵ_１Ａ変数が、第２検出器フィールドの検出効率に対する積分によって求められる、変数Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａのように、互いに異なる値を有するためである。これらの４つの異なる変数は、値Ｃ_Ｆ（ｘ，ｙ）を求める上記式に含まれ、したがって、計算による２つの蛍光の成分の互いからの分離、特にプロトポルフィリンＩＸの蛍光の定量化を容易にする。

波長依存透過特性が、変数Ｕ_１ＦおよびＵ_１ＡならびにＵ_２ＦおよびＵ_２Ａのこうした異なる値を異なる方法で具現化する、顕微鏡検査光学ユニットのさらなる例示的な実施形態については後に説明する。

図３は、ビームスプリッタ３２の変更された透過率を有する、図２に対応するグラフを示し、上で説明した方法をそこで同様に実行することができる。ここでは、２つの検出器フィールドの波長依存検出効率は、実質的にビームスプリッタによって決まる可能性がある。それにも関わらず、実際には、ビーム経路にフィルタが設けられ、前記フィルタは、蛍光励起光が検出器フィールドによって検出されるのを阻止する。しかしながら、図１～図８にはこうしたフィルタの効果は例示されていない。

図４、図５および図６は、図２および図３に対応するグラフを示し、前記グラフはいずれの場合も、この場合もまた、プロトポルフィリンＩＸおよび自家蛍光の発光スペクトルを示し、さらに、前記グラフは、光学フィルタ３４の波長依存透過特性をプロットしている。これらの実施形態では、第１ビーム経路において赤外線カメラ２１の上流にのみ配置されたフィルタ３４により、変数Ｕ_１ＦおよびＵ_１ＡならびにＵ_２ＦおよびＵ_２Ａが著しく異なる値を有することになる。これらの実施形態では、ビームスプリッタ３２は、強力に二色性の実施形態を有する必要はない。

図７は、図２～図６に対応するグラフを示し、前記グラフは、この場合もまた、プロトポルフィリンＩＸおよび自家蛍光の発光スペクトルを示し、さらに、前記グラフは、光学フィルタ３４および３５の波長依存透過特性をプロットしている。これらの実施形態では、異なるビーム経路にそれぞれ配置されている２つのフィルタ３４および３５により、変数Ｕ_１ＦおよびＵ_１ＡならびにＵ_２ＦおよびＵ_２Ａが著しく異なる値を有することになる。これらの実施形態では、ビームスプリッタ３２は、強力に二色性の実施形態を有する必要はない。

図８は、図２～図７に対応するグラフを示し、前記グラフは、この場合もまた、プロトポルフィリンＩＸおよび自家蛍光の発光スペクトルを示し、さらに、前記グラフは、光学フィルタ３３の波長依存透過特性をプロットしている。光学フィルタ３３の波長依存透過特性のグラフは、図７の２つのフィルタ３４および３５のグラフと同様であるが、フィルタ３３は、両ビーム経路に配置されており、したがって、自然に、変数Ｕ_１ＦおよびＵ_１ＡならびにＵ_２ＦおよびＵ_２Ａが著しく異なる値を有するようにすることはできない。しかしながら、それにも関わらず、これは、たとえば、赤外線カメラ２１が、５９０ｎｍ未満の波長で感度が低く、かつ／またはカラーカメラ２３が６００ｎｍを超える波長で感度が低く、かつ／またはビームスプリッタが、たとえば図２および図３に示すような二色性を有するため、達成される。

１ 顕微鏡検査システム
３ 光源
５ 光ビーム
７ 対象物領域
９ 対象物
１１ 照明光学ユニット
１５ 光学フィルタ
１７ 対物レンズ
２１ 検出器フィールド
２３ 検出器フィールド
２５ ビーム経路
２７ レンズ
２９ レンズ
３１ レンズ
３２ ビームスプリッタ
３３ 光学フィルタ
３４ 光学フィルタ
３５ 光学フィルタ
４３ コントローラ
４５ 制御ライン
４７ 信号線
４９ 表示装置

Claims (20)

1. 顕微鏡システムの作動方法であって、該方法は、
   多数のピクセルを有する第１検出器フィールドの上に対象物領域を結像するステップであって、第１波長依存透過特性を有する少なくとも１つの第１光学フィルタが、前記対象物領域と前記第１検出器フィールドの前記ピクセルの各々との間の第１ビーム経路に配置される、ステップと、
   多数のピクセルを有する第２検出器フィールドの上に前記対象物領域を結像するステップであって、前記第１波長依存透過特性とは異なる第２波長依存透過特性を有する少なくとも１つの第２光学フィルタが、前記対象物領域と前記第２検出器フィールドの前記ピクセルの各々との間の第２ビーム経路に配置される、ステップと、
   前記対象物領域における少なくとも第１蛍光および第２蛍光を励起するステップであって、前記第１蛍光がプロトポルフィリンＩＸの蛍光である、ステップと、
   前記第１検出器フィールドを使用して前記結像された対象物領域の第１画像を記録するステップと、
   前記第２検出器フィールドを使用して前記結像された対象物領域の第２画像を記録するステップと、
   前記第１検出器フィールドにおける複数のピクセルまたは複数のピクセル群に対していずれの場合も１つの値が求められることにより、前記対象物領域における前記第１蛍光の空間的に依存する蛍光強度を求めるステップであって、前記値が、前記第１検出器フィールドのそれぞれのピクセルまたはそれぞれのピクセル群の上に結像される前記対象物領域のそれぞれの位置における蛍光強度を表す、ステップと、
   を含み、
   前記値が、前記第１検出器フィールドの前記それぞれのピクセルまたは前記それぞれのピクセル群によって検出される放射線強度と、前記第１検出器フィールドの前記それぞれのピクセルまたは前記それぞれのピクセル群の波長依存検出効率と、前記対象物領域の前記それぞれの位置が結像される前記第２検出器フィールドのそれぞれのピクセルまたはそれぞれのピクセル群によって検出される放射線強度と、前記第２検出器フィールドの前記それぞれのピクセルまたは前記それぞれのピクセル群の波長依存検出効率と、前記第１蛍光の蛍光スペクトルと、前記第２蛍光の蛍光スペクトルとに基づいて求められる、方法。
2. 前記値が、以下の公式に従って求めることができ、
   

   

   式中、
   Ｃ_Ｆ（ｘ，ｙ）は、対象物平面の位置（ｘ，ｙ）におけるプロトポルフィリンＩＸの蛍光強度を表す値であり、
   Ｓ_１（ｉ，ｊ）は、前記第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）によって検出される放射線強度を表し、前記位置（ｘ，ｙ）は、前記第１ビーム経路によって前記ピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）にマッピングされ、
   Ｓ_２（ｋ，ｌ）は、前記第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）によって検出される放射線強度を表し、前記位置（ｘ，ｙ）は、前記第２ビーム経路によって前記ピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）にマッピングされ、
   Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａは、前記ピクセルまたはピクセル群の波長依存検出効率によって決まる変数である、請求項１に記載の方法。
3. 基準測定において、プロトポルフィリンＩＸの濃度が実質的にゼロである、前記対象物領域の位置において、変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａのうちの少なくともいくつかに対する値を求めるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 以下からの関連する式を用いる計算により、変数Ｕ_１Ｆ、Ｕ_１Ａ、Ｕ_２ＦおよびＵ_２Ａのうちの少なくともいくつかの値を求めるステップであって、
   

   

   式中、
   Ｓ_Ｆ（λ）は、前記第１蛍光の蛍光スペクトルを表し、
   Ｓ_Ａ（λ）は、前記第２蛍光の蛍光スペクトルを表し、
   Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）は、波長λによって決まる、前記第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）の検出効率を表し、
   Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）は、波長λによって決まる、第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）の検出効率を表す、ステップをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
5. λｍｉｎが４００ｎｍ～６００ｎｍにあり、λｍａｘが７５０ｎｍ～８５０ｎｍにある、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１検出器フィールドのすべてのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）に対して、Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）が、Ｄ_１（λ）に等しく設定され、かつ／または第２検出器フィールドのすべてのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）に対して、Ｄ_{２，ｋ，ｌ}（λ）がＤ_２（λ）に等しく設定される、請求項４または５に記載の方法。
7. Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）が、Ｔ_{１，ｉ，ｊ}（λ）に等しく設定され、Ｔ_{１，ｉ，ｊ}（λ）が、前記対象物領域と前記第１検出器フィールドのピクセル（ｉ，ｊ）またはピクセル群（ｉ，ｊ）との間の前記第１ビーム経路に配置された前記少なくとも１つの第１光学フィルタの前記波長依存透過特性であり、かつ／またはＤ_{２，ｋ，ｌ}（λ）が、Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）に等しく設定され、Ｔ_{２，ｋ，ｌ}（λ）が、前記対象物領域と前記第２検出器フィールドのピクセル（ｋ，ｌ）またはピクセル群（ｋ，ｌ）との間のさらなるビーム経路に配置された前記少なくとも１つの第２光学フィルタの前記波長依存透過特性である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
8. Ｄ_{１，ｉ，ｊ}（λ）が実験的に求められ、かつ／またはＤ_{２，ｋ，ｌ}（λ）が実験的に求められる、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 第１波長および第２波長が、前記対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と前記位置（ｘ，ｙ）が結像される前記第１検出器フィールドの前記ピクセル（ｉ，ｊ）または前記ピクセル群（ｉ，ｊ）との間に配置された前記少なくとも１つの第１光学フィルタの前記第１波長における透過率が、前記対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と前記位置（ｘ，ｙ）が結像される前記第２検出器フィールドの前記ピクセル（ｋ，ｌ）または前記ピクセル群（ｋ，ｌ）との間に配置された前記少なくとも１つの第２光学フィルタの前記第１波長における透過率より少なくとも１．５倍大きく、かつ、前記対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と前記第１検出器フィールドの前記ピクセル（ｉ，ｊ）または前記ピクセル群（ｉ，ｊ）との間に配置された前記少なくとも１つの第１光学フィルタの前記第２波長における透過率が、前記対象物領域の位置（ｘ，ｙ）と前記第２検出器フィールドの前記ピクセル（ｋ，ｌ）または前記ピクセル群（ｋ，ｌ）との間に配置された前記少なくとも１つの第２光学フィルタの前記第２波長における透過率より少なくとも１．５倍小さい、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１波長が６１０ｎｍより長くかつ７５０ｎｍより短い、請求項９に記載の方法。
11. 前記第２波長が６１０ｎｍより短いかまたは７５０ｎｍより長い、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記第１波長が６１０ｎｍより長くかつ６７０ｎｍより短く、前記第２波長が６１０ｎｍより短いかまたは６７０ｎｍより長い、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１波長が６７０ｎｍより長くかつ７５０ｎｍより短く、前記第２波長が６７０ｎｍより短いかまたは７５０ｎｍより長い、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第１ビーム経路および前記第２ビーム経路において、少なくとも前記第１蛍光と前記第２蛍光を励起するように使用された光を含む波長の光を遮断するステップをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成された顕微鏡検査システム。
16. 前記対象物領域と前記第１検出器フィールドおよび前記第２検出器フィールドそれぞれとの間の前記第１ビーム経路および前記第２ビーム経路に配置された対物レンズと、
    前記対象物領域と前記第１検出器フィールドおよび前記第２検出器フィールドそれぞれとの間の前記第１ビーム経路および前記第２ビーム経路に配置されたビームスプリッタと、
    をさらに備える、請求項１５に記載の顕微鏡検査システム。
17. 前記第１光学フィルタおよび前記第２光学フィルタが前記ビームスプリッタを備え、前記ビームスプリッタがダイクロイックビームスプリッタである、請求項１６に記載の顕微鏡検査システム。
18. 光学フィルタのフィールドが、前記第１検出器フィールドの上流の前記第１ビーム経路および／または前記第２検出器フィールドの上流の前記第２ビーム経路に配置され、そして、光学フィルタの前記フィールドにおいて、異なる光学フィルタが、相互に隣接するピクセルの上流の前記ビーム経路に配置され、前記異なる光学フィルタが、相互に異なるスペクトル透過特性を有する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の顕微鏡検査システム。
19. 前記第１検出器フィールドおよび前記第２検出器フィールドの検出信号を読み取り、前記第１蛍光の前記空間的に独立した蛍光強度を表す値を求めるように構成されているコントローラをさらに備える、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の顕微鏡検査システム。
20. 表示装置をさらに備え、前記コントローラが、前記値を前記表示装置により画像として提示するようにさらに構成される、請求項１９に記載の顕微鏡検査システム。
    

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