DE102017203448B9

DE102017203448B9 - Mikroskopiesystem und Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz

Info

Publication number: DE102017203448B9
Application number: DE102017203448.3A
Authority: DE
Inventors: Alois Regensburger; Christoph Hauger; Susanne Kohlhammer; Jonathan Essig
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2021-12-23
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: DE102017203448A1; JP7209469B2; US11079587B2; US20180252909A1; DE102017203448B4; JP2018146578A

Abstract

Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz von Protoporphyrin IX, wobei das Verfahren umfasst:Abbilden eines Objektbereichs auf ein erstes Detektorenfeld mit einer Vielzahl von Pixeln, wobei in einem ersten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und einem jeden der Pixel des ersten Detektorenfeldes wenigstens ein erster optischer Filter mit einer ersten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik angeordnet ist;Abbilden des Objektbereichs auf ein zweites Detektorenfeld mit einer Vielzahl von Pixeln, wobei in einem zweiten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und einem jeden der Pixel des zweiten Detektorenfeldes wenigstens ein zweiter optischer Filter mit einer zweiten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik angeordnet ist, die von der ersten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik verschieden ist;Anregen wenigstens einer ersten und einer zweiten Fluoreszenz in dem Objektbereich, wobei die erste Fluoreszenz die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX ist;Aufnehmen eines ersten Bildes des abgebildeten Objektbereichs mit dem ersten Detektorenfeld;Aufnehmen eines zweiten Bildes des abgebildeten Objektbereichs mit dem zweiten Detektorenfeld;Bestimmen einer ortsabhängigen Fluoreszenzstärke der ersten Fluoreszenz in dem Objektbereich, indem für mehrere Pixel oder mehrere Gruppen von Pixeln des ersten Detektorenfeldes jeweils ein Wert bestimmt wird, der eine Fluoreszenzstärke an einem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, der auf das jeweilige Pixel bzw. die jeweilige Gruppe von Pixeln abgebildet wird,wobei der Wert basierend auf der von diesem Pixel bzw. dieser Gruppe von Pixeln des ersten Detektorenfeldes detektierten Strahlungsintensität, auf einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf einer von einem Pixel bzw. einer Gruppe von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes, auf welche der Ort in dem Objektbereich abgebildet wird,detektierten Strahlungsintensität, auf einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf einem Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz und auf einem Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz bestimmt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroskopiesysteme und Mikroskopieverfahren, bei welchen ein oder mehrere Fluoreszenzen detektiert werden und wobei die Stärke einer Fluoreszenz oder die Konzentration eines Fluoreszenzstoffs in einem Gewebe quantifiziert werden soll. Das Mikroskopiesystem kann insbesondere als ein Operationsmikroskop ausgeführt sein, welches im Rahmen von chirurgischen Eingriffen eingesetzt wird und zwei Okulare oder ein oder zwei Kameras und zwei elektronische Anzeigen aufweist, um ein Abbild eines Objektbereichs zu betrachten.
Ein herkömmliches Mikroskopiesystem zur Detektion von einer Fluoreszenz oder gleichzeitig mehreren Fluoreszenzen ist aus der DE 10 2015 011 441 A1 der Anmelderin bekannt, deren Offenbarung vollumfänglich in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Die mehreren Fluoreszenzen umfassen beispielsweise Protoporphyrin IX (PpIX), Fluorescein und Indocyaningrün (ICG). Diese Fluoreszenzfarbstoffe werden im medizinischen Bereich, insbesondere zur Einfärbung von biologischem Material, Blutzellen, Tumoren oder anderen Geweben beispielsweise auch im Labor verwendet.
Protoporphyrin IX bzw. dessen Vorläufer 5-Aminolävolinsäure (5-ALA) sind hochwirksame Marker für bestimmte Gewebearten. Deshalb ist es wünschenswert, die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX nicht nur zu detektieren sondern auch zu quantifizieren, um die Intensität der Fluoreszenz in dem Gewebe, in dem der Fluoreszenzfarbstoff angereichert ist, oder die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Gewebe, in dem er angereichert ist, zu bestimmen. Mit dem vorangehend erläuterten herkömmlichen Mikroskopiesystem ist dies noch nicht zur vollen Zufriedenheit der Anwender möglich.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskopiesystem und ein Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz vorzuschlagen, wobei die zu quantifizierende Fluoreszenz eine von mehreren detektierten Fluoreszenzen sein kann.
Gemäß Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz ein Abbilden eines Objektbereichs auf ein erstes Detektorenfeld und ein zweites Detektorenfeld, welche jeweils eine Vielzahl von Pixeln aufweisen. Die Pixelzahlen des ersten und des zweiten Detektorenfeldes können voneinander verschieden sein und voneinander verschiedene Größen aufweisen. Das Detektorenfeld kann beispielsweise ein CCD-Detektor sein.
Zum Abbilden des Objektbereichs auf das erste und das zweite Detektorenfeld kann eine Mikroskopieoptik verwendet werden, welche einen ersten Strahlengang von dem Objektbereich zu dem ersten Detektorenfeld und einen zweiten Strahlengang von dem Objektbereich zu dem zweiten Detektorenfeld bereitstellt. Die Mikroskopieoptik kann eine Objektivlinse umfassen, welche in dem ersten und dem zweiten Strahlengang angeordnet ist. Die Mikroskopieoptik kann ferner einen Strahlteiler umfassen, um den Strahlengang zwischen dem Objektbereich und den beiden Detektorenfeldern in den ersten und den zweiten Strahlengang aufzuteilen. Insbesondere kann eine Objektivlinse in den Strahlengängen zwischen dem Objektbereich und dem Strahlteiler angeordnet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass je eine Objektivlinse in dem ersten und dem zweiten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem jeweiligen Detektorenfeld angeordnet ist. Die Objektivlinse kann selbst aus ein oder mehreren Linsenelementen aufgebaut sein. Die Objektivlinse ist eine optische Komponente, welche gegebenenfalls zusammen mit weiteren optischen Komponenten eine optische Abbildung von dem Objektbereich auf das erste bzw. zweite Detektorenfeld bereitstellt.
In dem ersten Strahlengang ist zwischen dem Objektbereich und dem ersten Detektorenfeld wenigstens ein erster optischer Filter angeordnet, welcher eine wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik aufweist. In dem zweiten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und dem zweiten Detektorenfeld ist wenigstens ein zweiter optischer Filter angeordnet, welcher eine wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik aufweist, die von der ersten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik verschieden ist.
Falls die Mikroskopieoptik einen Strahlteiler aufweist, können der erste optische Filter und der zweite optische Filter den Strahlteiler umfassen. Hierzu kann der Strahlteiler dichroitische Eigenschaften aufweisen, so dass der Strahlteiler für den ersten und den zweiten Strahlengang verschiedene wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken aufweist. Der erste und der zweite optische Filter kann ferner jeweils weitere Filterelemente umfassen, welche an einer beliebigen Stelle in dem ersten bzw. zweiten Strahlengang angeordnet sein können. Diese Filterelemente können homogene großflächige Filterelemente sein, welche sich über den gesamten Querschnitt des ersten bzw. zweiten Strahlengangs erstrecken. Die Filterelemente können ferner ein Feld von optischen Filtern umfassen, welches unmittelbar vor dem ersten bzw. zweiten Detektorenfeld derart angeordnet ist, dass im Strahlengang vor einander benachbarten Pixeln verschiedene optische Filter angeordnet sind, welche voneinander verschiedene spektrale Durchlässigkeiten aufweisen.
Das Mikroskopieverfahren umfasst ferner ein Anregen von wenigstens zwei Fluoreszenzen in dem Objektbereich, wobei eine erste der zwei Fluoreszenzen die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX sein kann. Eine zweite der zwei Fluoreszenzen kann eine Autofluoreszenz eines Gewebes sein, in welchem der die erste Fluoreszenz erzeugende Fluoreszenzfarbstoff angereichert ist.
Das Verfahren umfasst ferner ein Bestimmen einer ortsabhängigen Fluoreszenzstärke der ersten Fluoreszenz in dem Objektbereich. Hierzu wird für mehrere Pixel oder mehrere Gruppen von Pixeln des ersten Detektorfeldes jeweils ein Wert bestimmt, der eine Fluoreszenzstärke an dem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, der auf das jeweilige Pixel bzw. die Gruppe von Pixeln abgebildet wird. Die mehreren Pixel, für die dieser Wert bestimmt wird, können insbesondere sämtliche Pixel des ersten Detektorfeldes sein, so dass der Wert für jedes Pixel des ersten Detektorfeldes bestimmt wird. Die mehreren Pixel können jedoch auch eine Untermenge von Pixeln des ersten Detektorfeldes sein, so dass der Wert beispielsweise nur für jedes dritte oder jedes vierte Pixel des Detektorfeldes bestimmt wird. Ferner ist es möglich, dass für Gruppen von Pixeln jeweils ein Wert bestimmt wird, der die Fluoreszenzstärke an dem (ausgedehnten) Ort repräsentiert, der auf die Gruppe von Pixeln abgebildet wird. Derartige Gruppen von Pixeln können beispielsweise vier oder neun oder 16 einander benachbarte Pixel umfassen.
Dieser für ein jeweiliges Pixel oder eine jeweilige Gruppe von Pixeln des ersten Detektorfeldes bestimmte Wert wird auf der Grundlage wenigstens der folgenden Größen bestimmt:

- der durch das Pixel bzw. die Gruppe von Pixeln des ersten Detektorenfeldes detektierte Strahlungsintensität;
- der von einem Pixel bzw. einer Gruppe von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes detektierten Strahlungsintensität, wobei auf dieses Pixel bzw. diese Gruppe von Pixeln der gleiche Ort in dem Objektbereich abgebildet wird, der auch auf das vorangehend beschriebene Pixel bzw. die vorangehend beschriebene Gruppe von Pixeln des ersten Detektorenfeldes abgebildet wird;
- einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz des Pixels bzw. der Gruppe von Pixeln des ersten Detektorenfeldes;
- einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz des Pixels bzw. der Gruppe von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes;
- dem Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz; und
- dem Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz.

Die von einem Pixel detektierte Strahlungsintensität ist durch einen Wert repräsentiert, der aus dem Pixel des Detektorfeldes von einer Steuerung ausgelesen wird. Beispielsweise repräsentiert dieser Wert, wenn das Detektorenfeld als CCD-Detektor ausgebildet ist, eine Ladung, welche während einer Belichtungszeit in dem Pixel akkumuliert wurde. Der Wert kann durch eine Zahl repräsentiert sein, welche beispielsweise sieben Bit umfasst. Bei einer Gruppe von Pixeln werden die von den Pixeln der Gruppe detektierten Strahlungsintensitäten zusammengefasst, wie beispielsweise addiert oder gemittelt oder dergleichen.
Diese wellenlängenabhängige Detektionseffizienz beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit der ein an einem Ort des Objektfelds ausgehendes Lichtquant mit einer gegebenen Wellenlänge von dem Pixel bzw. der Gruppe von Pixeln, auf die dieser Ort abgebildet wird, detektiert wird. Diese Wahrscheinlichkeit ist von der Wellenlänge abhängig. Die Wellenlängenabhängigkeit der Detektionseffizienz ist im Wesentlichen durch die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik des wenigstens einen optischen Filters gegeben, der im Strahlengang zwischen dem Objektbereich und dem jeweiligen Pixel angeordnet ist. Ferner beeinflussen auch wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken anderer optischer Elemente im Strahlengang, wie beispielsweise von Linsen, die wellenlängenabhängige Detektionseffizienz eines Pixels bzw. einer Gruppe von Pixeln. Die wellenlängenabhängige Detektionseffizienz der Pixel kann zwischen einander benachbarten Pixeln des Detektorenfeldes variieren, beispielsweise aufgrund von unterschiedlichen Winkeln, unter denen Strahlung auf Pixel trifft, welche an verschiedenen Orten in dem Detektorenfeld angeordnet sind oder aufgrund von fertigungsbedingten Variationen, beispielsweise des Halbleitermaterials der Pixel.
Das Fluoreszenzspektrum der ersten oder der zweiten Fluoreszenz kann durch Messung oder durch Berechnung bestimmt worden sein.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen wird der Wert, der die Fluoreszenzstärke an dem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, nach folgender Formel bestimmt: $C_{F} (x, y) = \frac{U_{1 A} \cdot S_{2} (k, l) - U_{2 A} \cdot S_{1} (i, j)}{U_{2 F} \cdot U_{1 A} - U_{2 A} \cdot U_{1 F}}$
wobei

CF(x,y): der Wert ist, der die Fluoreszenzstärke Protoporphyrin IX an dem Ort (x,y) in der Objektebene repräsentiert,
S1(i,j): die mit dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem ersten Strahlengang auf das Pixel (i,j) bzw. die Gruppe (i,j) von Pixeln abgebildet wird,
S2(k,l): die mit dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem zweiten Strahlengang auf das Pixel (k,l) bzw. die Gruppe (k,l) von Pixeln abgebildet wird, und
U1F, U1A, U2F und U2A: Größen sind, die von den wellenlängenabhängigen Detektionseffizienzen der Pixel bzw. Gruppe von Pixeln abhängen.

Die Pixel bzw. Gruppen von Pixeln des ersten und des zweiten Detektorenfeldes werden hier mit unterschiedlichen Indizes (i,j) bzw. (k,l) bezeichnet, da die beiden Detektorenfelder unterschiedliche Anzahlen von Pixeln und unterschiedliche Größen aufweisen können und die Pixel zu unterschiedlich großen und unterschiedlich gestalteten Gruppen zusammengefasst werden können. Ein jeder Ort auf dem Objektbereich wird auf ein Pixel bzw. eine Gruppe von Pixeln (i,j) des einen Detektors und auf ein Pixel bzw. eine Gruppe von Pixeln (k,l) des anderen Detektors abgebildet, wodurch die ein Pixel bzw. eine Gruppe von Pixeln (i,j) und (k,l) miteinander verknüpft sind.
Die Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A können auf unterschiedliche Weisen bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Teil dieser Größen experimentell bestimmt werden, indem eine Messung in einem Bereich des Objekts ausgeführt wird, von dem angenommen wird, dass eine der wenigstens zwei Fluoreszenzen dort nicht angeregt wird. Beispielsweise kann hierzu eine Bild eines Bereichs mit gesundem Gewebe aufgenommen werden, wobei angenommen wird, dass Protoporphyrin IX in diesem Bereich mit keiner signifikanten Konzentration vorhanden ist. Dann ist die gemessene Fluoreszenz nur die Autofluoreszenz des Gewebes, von der angenommen werden kann, dass sie unabhängig von der Art des Gewebes ist.
Ferner können alle oder ein Teil der Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A durch Berechnung mit einer der nachfolgenden Gleichungen bestimmt werden: $U_{1 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{2 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{1 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist, und$
$U_{2 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
wobei

SF(λ): Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz repräsentiert,
SA(λ): Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz repräsentiert,
D1,i,j(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes repräsentiert, und
D2,k,l(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes repräsentiert.

Hierbei kann D_1,i,j(λ) für alle Pixel (i,j) bzw. Gruppen (i,j) von Pixeln des ersten Detektorfeldes gleich einer von dem Pixelort unabhängigen wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz D₁(λ) gesetzt werden. Dies bedeutet, dass angenommen wird, dass sich die Pixel bzw. Gruppen von Pixeln des ersten Detektorfeldes hinsichtlich ihrer Detektionseffizienz nicht oder nur geringfügig voneinander unterscheiden. Ebenso kann D_2,k,l(λ) für sämtliche Pixel (k,l) bzw. Gruppen T_2,k,l(λ) von Pixeln des zweiten Detektorfeldes gleich einer von dem Pixelort unabhängigen wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz D₂(λ) gesetzt werden.
Ferner ist es möglich, Werte für D_1,i,j(λ) und/oder D_2,k,l(λ) experimentell zu bestimmen, indem beispielsweise ein in dem Objektbereich angeordneter weißer Gegenstand nacheinander mit Licht einer gegebenen Intensität und mit verschiedenen Wellenlängen aus dem Wellenlängenbereich zwischen λmin und λmax beleuchtet wird und die durch das Pixel bzw. die Gruppe von Pixeln detektierte Strahlungsintensität aufgezeichnet wird. Die detektierte wellenlängenabhängige Strahlungsintensität kann direkt als die Funktion D_1,i,j(λ) bzw. D_2,k,l(λ) verwendet werden oder beispielsweise nach Multiplikation mit einem Normierungsfaktor als diese verwendet werden.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen wird D_1,i,j(λ) gleich T_1,i,j(λ) gesetzt, wobei T_1,i,j(λ) die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik des zwischen dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes im ersten Strahlengang angeordneten wenigstens einen ersten optischen Filters ist, und/oder wobei D_2,k,l(λ) gleich T_2,k,l(λ) gesetzt wird, wobei T_2,k,l(λ) die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik des zwischen dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes im zweiten Strahlengang angeordneten wenigstens einen zweiten optischen Filters ist.
Hierbei wird angenommen, dass die Detektionseffizienz im Wesentlichen durch die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik der Filter bestimmt ist. Diese wiederum kann durch Messung oder durch Rechnung ermittelt werden. Wenn die die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik erzeugenden Filter sich ausreichend homogen über den gesamten Querschnitt des ersten bzw. zweiten Strahlengangs erstrecken, kann T_1,i,j(λ) gleich T₁(λ) gesetzt werden. Ebenso kann T_2,k,l(λ) gleich T₂(λ) gesetzt werden. Dies bedeutet, dass angenommen wird, dass die Detektionseffizienz nicht zwischen den Pixeln bzw. Gruppen von Pixeln eines Detektorfeldes variiert.
Die erste wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik ist von der zweiten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik verschieden. Gemäß beispielhaften Ausführungsformen kann dies dadurch realisiert sein, dass eine erste Wellenlänge und eine zweite Wellenlänge derart existieren und dass die Transmission des zwischen einem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes, auf das der Ort (x,y) abgebildet wird, angeordneten wenigstens einen ersten Filters bei der ersten Wellenlänge wenigstens 1,5 mal, insbesondere wenigstens 5 mal, und insbesondere wenigstens 20 mal, größer ist als die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes, auf das der Ort (x,y) abgebildet wird, angeordneten wenigstens einen zweiten Filters bei der ersten Wellenlänge, und dass die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes angeordneten wenigstens einen ersten Filters bei der zweiten Wellenlänge wenigstens 1,5 mal, insbesondere wenigstens 5 mal, und insbesondere wenigstens 20 mal, kleiner ist als die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes angeordneten wenigstens einen zweiten Filters bei der zweiten Wellenlänge.
Nachfolgend werden Ausführungsformen der Erfindung anhand von Figuren näher erläutert. Hierbei zeigt

1 eine schematische Darstellung eines Mikroskopiesystems gemäß einer Ausführungsform zur Ausführung eines Mikroskopieverfahrens gemäß einer Ausführungsform;
2 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Strahlteilers des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem ersten Beispiel zeigt;
3 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Strahlteilers des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem zweiten Beispiel zeigt;
4 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Filters des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem dritten Beispiel zeigt;
5 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Filters des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem vierten Beispiel zeigt;
6 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Filters des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem fünften Beispiel zeigt;
7 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Filters des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem sechsten Beispiel zeigt; und
8 einen Graphen, der eine Autofluoreszenz eines Gewebes, die Emission von Protoporphyrin IX und eine Transmission eines Filters des Mikroskopiesystems der 1 gemäß einem siebten Beispiel zeigt.

1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform eines Mikroskopiesystems 1 zur Ausführung eines Mikroskopieverfahrens zum Quantifizieren einer Fluoreszenz. Das Mikroskopiesystem 1 umfasst wenigstens eine Lichtquelle 3, welche Licht erzeugt, um einen Lichtstrahl 5 auf einen Objektbereich 7 zu richten. In dem Objektbereich 7 ist ein Objekt 9 angeordnet, welches wenigstens einen Fluoreszenzfarbstoff enthält und, bei entsprechender Anregung, wenigstens zwei Fluoreszenzen erzeugt. In dem hier erläuterten Beispiel ist der wenigstens eine Fluoreszenzfarbstoff Protoporphyrin IX, und die eine der wenigstens zwei Fluoreszenzen ist die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX. In dem hier erläuterten Beispiel ist die zweite Fluoreszenz der wenigstens zwei Fluoreszenzen eine Autofluoreszenz des Objekts 9, welche ebenfalls angeregt wird, wenn die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX angeregt wird. Die Autofluoreszenz wird unabhängig davon erzeugt, ob Protoporphyrin IX in dem Objekt 9 enthalten ist oder nicht. Das Objekt 9 kann beispielsweise menschliche oder tierische Zellen umfassen, welche in einer Zellkultur gehalten werden oder in einem Körpergewebe integriert sind. Das Protoporphyrin IX wird in den Zellen als ein Stoffwechselprodukt aus 5-ALA erzeugt.
Neben der Lichtquelle 3 umfasst das Mikroskopiesystem 1 eine Beleuchtungsoptik 11 aus einer oder mehreren Linsen, um einen auf den Objektbereich 7 gerichteten Lichtstrahl 5 zu erzeugen. In dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 ist ein optischer Filter 15 anordenbar. Die Lichtquelle 3 wird von einer Steuerung 43 über eine Steuerleitung 45 betrieben. Es kann ferner ein Aktuator, wie beispielsweise ein Motor, vorgesehen sein, der den optischen Filter 15 wahlweise in dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 anordnet oder den optischen Filter 15 aus diesem Strahlengang entfernt. Dieser Aktuator kann ebenfalls von der Steuerung 43 kontrolliert sein. Beispielsweise kann die Lichtquelle 3 weißes Licht erzeugen, um das Objekt 9 in dem Objektbereich 7 mit diesem weißen Licht zu beleuchten, so dass das Objekt 9 mit dem Auge direkt betrachtet werden kann oder Bilder von dem Objektbereich 7 aufgenommen werden können, welche das Objekt 9 mit einem natürlichen Farbeindruck zeigen. Ist der optische Filter 15 in dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 angeordnet, so kann er das Spektrum des Beleuchtungslichts in dem Strahl 5 so formen, dass im Wesentlichen nur Licht aus einem Wellenlängenbereich zu dem Objektbereich gelangt, welches der Anregung der Fluoreszenzen dient. Soll die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX angeregt werden, so liegt dieses Anregungslicht beispielsweise in einem Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 470 nm.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner ein Objektiv 17, welches mehrere Linsen 27, 29 und 31 aufweist. Das Objektiv 17 dient dazu, einen von dem Objektbereich 7 ausgehenden Strahlengang 25 bereitzustellen, um den Objektbereich 7 auf zwei Detektorenfelder 21 und 23 abzubilden. Hierzu ist in dem Strahlengang 25 hinter dem Objektiv 17 ein Strahlteiler 32 angeordnet, der den Strahlengang 25 in einen ersten Strahlengang und einen zweiten Strahlengang aufteilt, wobei der erste Strahlengang von dem Objektbereich 7 zu dem ersten Detektorfeld 21 verläuft und der zweite Strahlengang von dem Objektbereich 7 zu dem zweiten Detektorenfeld 23 verläuft.
In dem in 1 gezeigten Beispiel ist der Strahlteiler 32 in den Strahlengängen zwischen dem Objektiv 17 und den beiden Detektorenfeldern 21 bzw. 23 angeordnet. Alternativ hierzu ist es möglich, dass der Strahlteiler nicht im Strahlengang hinter einem Objektiv angeordnet ist, sondern vor einem solchen. Dann teilt der Strahlteiler den von dem Objektbereich ausgehenden Strahlengang in zwei Teilstrahlengänge auf, wobei in einem ersten Strahlengang ein erstes Objektiv und das erste Detektorenfeld angeordnet ist und in dem zweiten Strahlengang ein zweites Objektiv und das zweite Detektorenfeld angeordnet ist.
Ein erster optischer Filter 33 ist in dem ersten und dem zweiten Strahlengang angeordnet, ein zweiter optischer Filter 34 ist lediglich in dem ersten Strahlengang angeordnet, und ein dritter optischer Filter 35 ist lediglich in dem zweiten Strahlengang angeordnet. Die optischen Filter 33, 34 und 35 können jeweils fest in den Strahlengängen angeordnet sein oder wahlweise in den Strahlengängen angeordnet werden und aus diesen entfernt werden, wobei hierzu wiederum Aktuatoren vorgesehen sein können, welche von der Steuerung 43 kontrolliert werden.
Der Strahlteiler 32 kann ein dichroitischer Strahlteiler sein, was bedeutet, dass er für den ersten und den zweiten Strahlengang verschiedene wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken bereitstellt.
Die Detektorenfelder 21 und 23 weisen jeweils eine Vielzahl von Pixeln auf. Jedes Pixel ist dazu konfiguriert, ein Signal auszugeben, welches eine auf das Pixel treffende Lichtintensität repräsentiert. Die durch die Pixel detektierten Lichtintensitäten werden von der Steuerung 43 über eine Signalleitung 47 ausgelesen.
In dem hier erläuterten Beispiel ist das Detektorenfeld 21 das Detektorenfeld einer Infrarotkamera. Dies bedeutet, dass die Pixel des Detektorenfeldes 21 infrarotes Licht detektieren können. Der optische Filter 34 kann so konfiguriert sein, dass er lediglich infrarotes Licht hindurchtreten lässt.
In dem hier erläuterten Beispiel ist das Detektorenfeld 23 das Detektorenfeld einer Farbkamera mit einem Chip bzw. einem Detektorenfeld. Dies bedeutet, dass im Strahlengang vor dem Detektorenfeld ein in 1 nicht dargestelltes Feld von optischen Filtern in einem regelmäßigen Anordnungsmuster angeordnet ist, wobei die vor einander benachbarten Pixel angeordneten optischen Filter verschiedene wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken aufweisen. Ein solches Feld von optischen Filtern wird auch als Bayer-Matrix oder Bayer-Pattern bezeichnet.
Alternativ hierzu kann eine Farbkamera auch dadurch realisiert sein, dass anstatt eines einzigen Detektorenfeldes, vor dem zur Selektion von Farbkanälen ein Feld von optischen Filtern mit unterschiedlichen wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristiken bzw. ein Bayer-Pattern angeordnet ist, eine Mehrzahl von Detektorenfeldern verwendet wird, denen zur Selektion von Farbkanälen Licht über dichroitische Strahlteiler zugeführt wird. In jedem der Detektorenfelder ist dann ein Pixel (k,l) bzw. eine Gruppe von Pixeln (k,l) enthalten, auf welches ein gegebener Ort (x,y) des Objektbereichs abgebildet wird.
Der optische Filter 35 kann in den zweiten Strahlengang eingeführt werden, wenn die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs beobachtet werden soll, und er kann aus dem zweiten Strahlengang entfernt werden, wenn mit dem Detektorenfeld 23 ein normales Farbbild aufgenommen werden soll.
Der optische Filter 33, der Strahlteiler 32 und der optische Filter 34 stellen gemeinsam eine wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik T₁(λ) bereit, welche bestimmt, mit welcher Effizienz ein von dem Objektbereich 7 ausgehendes Lichtquant einer bestimmten Wellenlänge λ von den Pixeln des Detektorenfeldes 21 detektiert wird. Diese Detektionseffizienz wird ferner noch durch die Eigenschaften beispielsweise des Halbleitermaterials der Pixel des Detektorenfeldes 21 bestimmt, so dass einem jeden Pixel eine wellenlängenabhängige Detektionseffizienz D_1,i,j(λ) zugeordnet werden kann.
Ähnlich bestimmt der optische Filter 33, der Strahlteiler 32 und der optische Filter 35 die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik im zweiten Strahlengang hin zu den Pixeln des Detektorenfeldes 23, wobei aufgrund des Feldes von optischen Filtern vor dem Detektorenfeld 23 einem jeden Pixel eine separate wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik T_2,k,l(λ) der optischen Filter im zweiten Strahlengang zugeordnet werden kann. Unter Berücksichtigung der Detektionseigenschaften der Pixel kann dann jedem Pixel eine wellenlängenabhängige Detektionseffizienz D_2,k,l(λ) zugeordnet werden.
2 zeigt einen Graphen, in welchen das Emissionsspektrum der Fluoreszenz von Protoporphyrin IX in beliebigen Einheiten, das Emissionsspektrum der Autofluoreszenz in beliebigen Einheiten und die wellenlängenabhängige Transmission des Strahlteilers 32 für den ersten Strahlengang hin zu dem ersten Detektorenfeld 21 eingetragen sind.
Es ist ersichtlich, dass die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX und die Autofluoreszenz einander überlagert sind. Es sei nun angenommen, dass die Aufgabe darin besteht, aus den durch die Detektorenfelder 21 und 23 detektierten Signalen die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX an den verschiedenen Orten des Objekts 9 zu quantifizieren. Hierzu muss die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX von der Autofluoreszenz getrennt werden. Dies ist möglich, da die beiden Strahlengänge aufgrund der in 2 gezeigten Transmission des Strahlteilers 32 verschiedene wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken hin zu den Detektorenfeldern 21 und 23 bereitstellen. Bei der in 2 gezeigten Auslegung des Strahlteilers 32 müssen die in 1 gezeigten optischen Filter 33, 34 und 35 nicht in den Strahlengängen angeordnet sein, um die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX zu quantifizieren. Allerdings ist es in der Praxis der Qualität des Ergebnisses zuträglich, wenn die bei der Beobachtung der Fluoreszenz in den Strahlengängen befindlichen Filter und weiteren optischen Komponenten so ausgelegt sind, dass sie Licht aus dem Wellenlängenbereich, der zur Anregung der Fluoreszenz verwendet wird, nicht zu den Detektorenfeldern gelangen lassen.
Die ortsabhängige Fluoreszenzstärke der Fluoreszenz von Protoporphyrin IX kann von der Steuerung 43 bestimmt werden, indem sie für mehrere Pixel oder mehrere Gruppen von Pixeln des Detektorenfeldes 21 bzw. des Detektorenfeldes 23 jeweils einen Wert bestimmt, der eine Fluoreszenzstärke an einem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, der auf das jeweilige Pixel bzw. die jeweilige Gruppe von Pixeln abgebildet wird. Dieser Wert kann bestimmt werden auf Basis von (1) der von diesem Pixel bzw. dieser Gruppe von Pixeln des Detektorenfeldes 21 detektierten Strahlungsintensität, (2) der wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, (3) der Strahlungsintensität, die von einem Pixel bzw. einer Gruppe von Pixeln des Detektorenfeldes 23 detektiert wird, auf welches bzw. welche der Ort in dem Objektbereich abgebildet wird, (4) der wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, (5) dem Fluoreszenzspektrum von Protoporphyrin IX und (6) dem Fluoreszenzspektrum der Autofluoreszenz.
Insbesondere kann dieser Wert nach folgender Formel bestimmt werden: $C_{F} (x, y) = \frac{U_{1 A} \cdot S_{2} (k, l) - U_{2 A} \cdot S_{1} (i, j)}{U_{2 F} \cdot U_{1 A} - U_{2 A} \cdot U_{1 F}}$
wobei

CF(x,y): der Wert ist, der die Fluoreszenzstärke Protoporphyrin IX an dem Ort x, y in der Objektebene repräsentiert,
S1(i,j): die mit dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes 21 detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem ersten Strahlengang auf das Pixel (i,j) bzw. die Gruppe (i,j) von Pixeln abgebildet wird,
S2(k,l): die mit dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes 23 detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem zweiten Strahlengang auf das Pixel (k,l) bzw. die Gruppe (k,l) von Pixeln abgebildet wird, und
U1F, U1A, U2F und U2A: Größen sind, die von den wellenlängenabhängigen Detektionseffizienzen der Pixel bzw. Gruppe von Pixeln abhängen.

Die Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A können wenigstens zum Teil experimentell bestimmt werden, indem eine Messung in einem Bereich des Objekts ausgeführt wird, von dem angenommen wird, dass beispielsweise Protoporphyrin IX in diesem Bereich mit keiner signifikanten Konzentration vorhanden ist.
Ferner können die Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A wenigstens zum Teil durch Berechnung mit einer der nachfolgenden Gleichungen bestimmt werden: $U_{1 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{2 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{1 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist, und$
$U_{2 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
wobei

SF(λ): Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz repräsentiert,
SA (λ): Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz repräsentiert,
D1,i,j(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes 21 repräsentiert, und
D2,k,l(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes 23 repräsentiert.

Die ortsabhängige Fluoreszenzstärke C_F(x,y) kann durch die Steuerung 43 auf einer Anzeigevorrichtung 49 (siehe 1) als Bild dargestellt werden.
Der in 2 gezeigte Verlauf der wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik für den ersten Strahlengang führt dazu, dass verschiedene spektrale Anteile von den beiden Detektorenfeldern mit unterschiedlicher Effizienz detektiert werden. Deshalb weisen die Größen U_1F, und U_1A, die durch Integration über die Detektionseffizienzen des ersten Detektorenfeldes bestimmt werden, voneinander verschiedene Werte auf, ebenso wie die Größen U_2F und U_2A, die durch Integration über die Detektionseffizienzen des zweiten Detektorenfeldes bestimmt werden. Diese vier unterschiedlichen Größen gehen in die obige Gleichung zur Bestimmung der Werte C_F(x,y) ein und ermöglichen es deshalb, die Anteile der beiden Fluoreszenzen voneinander durch Rechnung zu separieren und insbesondere die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX zu quantifizieren.
Nachfolgend werden weitere Ausführungsbeispiele von Mikroskopieoptiken erläutert, deren wellenlängenabhängige Transmissionscharakteristiken derartige unterschiedliche Werte der Größen U_1F, und U_1A bzw. U_2F und U_2A auf unterschiedliche Weisen realisieren.
Die 3 zeigt einen der 2 entsprechenden Graphen mit einer veränderten Transmission des Strahlteilers 32, mit welchem das vorangehend erläuterte Verfahren ebenfalls ausgeführt werden kann. Hierbei kann die wellenlängenabhängige Detektionseffizienz der beiden Detektorenfelder im Wesentlichen durch den Strahlteiler bestimmt sein. Dennoch werden in der Praxis Filter in den Strahlengängen vorgesehen sein, die verhindern, dass Fluoreszenzanregungslicht von den Detektorenfeldern detektiert wird. Die Wirkungen derartiger Filter sind in den 1 bis 8 allerdings nicht dargestellt.
Die 4, 5 und 6 zeigen den 2 und 3 entsprechende Graphen, welche jeweils wiederum die Emissionsspektren von Protoporphyrin IX und der Autofluoreszenz zeigen und in die ferner die wellenlängenabhängigen Transmissionscharakteristiken des optischen Filters 34 eingetragen sind. Bei diesen Ausführungsformen führt der lediglich in dem ersten Strahlengang vor der Infrarotkamera 21 angeordnete Filter 34 dazu, dass die Größen U_1F, und U_1A bzw. U_2F und U_2A die deutlich unterschiedlichen Werte aufweisen. Der Strahlteiler 32 muss bei diesen Ausführungsformen nicht stark dichroitisch ausgeführt sein.
Die 7 zeigt einen den 2 bis 6 entsprechenden Graphen, welcher wiederum die Emissionsspektren von Protoporphyrin IX und der Autofluoreszenz zeigt und in den ferner die wellenlängenabhängigen Transmissionscharakteristiken der optischen Filter 34 und 35 eingetragen sind. Bei diesen Ausführungsformen führen die beiden Filter 34 und 35, welche in jeweils verschiedenen Strahlengängen angeordnet sind, dazu, dass die Größen U_1F , und U_1A bzw. U_2F und U_2A die deutlich unterschiedlichen Werte aufweisen. Der Strahlteiler 32 muss bei diesen Ausführungsformen nicht stark dichroitisch ausgeführt sein.
Die 8 zeigt einen den 2 bis 7 entsprechenden Graphen, welcher wiederum die Emissionsspektren von Protoporphyrin IX und der Autofluoreszenz zeigt und in den ferner die wellenlängenabhängige Transmissionscharakteristik des optischen Filters 33 eingetragen ist. Der Verlauf der wellenlängenabhängigen Transmissionscharakteristik des optischen Filters 33 ist denen der beiden Filter 34 und 35 der 7 ähnlich, wobei der Filter 33 allerdings in beiden Strahlengängen angeordnet ist und deshalb alleine nicht dazu führen kann, dass die Größen U_1F und U_1A bzw. U_2F und U_2A die deutlich unterschiedlichen Werte aufweisen. Dies wird allerdings dennoch erreicht, da beispielsweise die Infrarotkamera 21 bei Wellenlängen unterhalb von 590 nm nicht empfindlich ist und/oder die Farbkamera 23 bei Wellenlängen oberhalb von 600 nm nicht empfindlich ist und/oder der Strahlteiler dichroitische Eigenschaften aufweist, wie sie beispielsweise in den 2 und 3 gezeigt sind.

Claims

Mikroskopieverfahren zum Quantifizieren einer Fluoreszenz von Protoporphyrin IX, wobei das Verfahren umfasst: Abbilden eines Objektbereichs auf ein erstes Detektorenfeld mit einer Vielzahl von Pixeln, wobei in einem ersten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und einem jeden der Pixel des ersten Detektorenfeldes wenigstens ein erster optischer Filter mit einer ersten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik angeordnet ist; Abbilden des Objektbereichs auf ein zweites Detektorenfeld mit einer Vielzahl von Pixeln, wobei in einem zweiten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und einem jeden der Pixel des zweiten Detektorenfeldes wenigstens ein zweiter optischer Filter mit einer zweiten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik angeordnet ist, die von der ersten wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik verschieden ist; Anregen wenigstens einer ersten und einer zweiten Fluoreszenz in dem Objektbereich, wobei die erste Fluoreszenz die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX ist; Aufnehmen eines ersten Bildes des abgebildeten Objektbereichs mit dem ersten Detektorenfeld; Aufnehmen eines zweiten Bildes des abgebildeten Objektbereichs mit dem zweiten Detektorenfeld; Bestimmen einer ortsabhängigen Fluoreszenzstärke der ersten Fluoreszenz in dem Objektbereich, indem für mehrere Pixel oder mehrere Gruppen von Pixeln des ersten Detektorenfeldes jeweils ein Wert bestimmt wird, der eine Fluoreszenzstärke an einem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, der auf das jeweilige Pixel bzw. die jeweilige Gruppe von Pixeln abgebildet wird, wobei der Wert basierend auf der von diesem Pixel bzw. dieser Gruppe von Pixeln des ersten Detektorenfeldes detektierten Strahlungsintensität, auf einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf einer von einem Pixel bzw. einer Gruppe von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes, auf welche der Ort in dem Objektbereich abgebildet wird, detektierten Strahlungsintensität, auf einer wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf einem Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz und auf einem Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz bestimmt wird.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 1, wobei der jeweils bestimmte Wert nach folgender Formel bestimmbar ist: $C_{F} (x, y) = \frac{U_{1 A} \cdot S_{2} (k, l) - U_{2 A} \cdot S_{1} (i, j)}{U_{2 F} \cdot U_{1 A} - U_{2 A} \cdot U_{1 F}}$
wobei C_F(x,y) der Wert ist, der die Fluoreszenzstärke von Protoporphyrin IX an dem Ort (x,y) in der Objektebene repräsentiert, S₁(i,j) die mit dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem ersten Strahlengang auf das Pixel (i,j) bzw. die Gruppe (i,j) von Pixeln abgebildet wird, S₂(k,l) die mit dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x,y) mit dem zweiten Strahlengang auf das Pixel (k,l) bzw. die Gruppe (k,l) von Pixeln abgebildet wird, und U_1F, U_1A, U_2F und U_2A Größen sind, die von den wellenlängenabhängigen Detektionseffizienzen der Pixel bzw. Gruppe von Pixeln abhängen.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend Bestimmen von Werten wenigstens eines Teils der Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A in einer Referenzmessung an einem Ort in dem Objektbereich, an dem die Konzentration an Protoporphyrin IX im Wesentlichen Null ist.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 2 oder 3, ferner umfassend Bestimmen von Werten wenigstens eines Teils der Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A durch Berechnung mit einer Zugehörigen der nachfolgenden Gleichungen: $U_{1 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{2 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{1 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist, und$
$U_{2 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
wobei S_F(λ) das Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz repräsentiert, S_A(λ) das Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz repräsentiert, D_1,i,j(λ) die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes repräsentiert, und D_2,k,l(λ) die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes repräsentiert.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 4, wobei λmin zwischen 400 nm und 600 nm liegt und λmax zwischen 750 nm und 850 nm liegt.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei D_1,i,j(λ) für sämtliche Pixel (i,j) bzw. Gruppen (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes gleich D₁(λ) gesetzt wird und/oder D_2,k,l(λ) für sämtliche Pixel (k,l) bzw. Gruppen (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes gleich D₂(λ) gesetzt wird.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei D_1,i,j(λ) gleich T_1,i,j(λ) gesetzt wird, wobei T_1,i,j(λ) die wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristik des zwischen dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes im ersten Strahlengang angeordneten wenigstens einen ersten optischen Filters ist, und/oder wobei D_2,k,l(λ) gleich T_2,k,l(λ) gesetzt wird, wobei T_2,k,l(λ) die wellenlängenabhängige Durclasscharakteristik des zwischen dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes im zweiten Strahlengang angeordneten wenigstens einen zweiten optischen Filters ist.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei D_1,i,j(λ) experimentell bestimmt wird und/oder wobei D_2,k,l(λ) experimentell bestimmt wird.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei eine erste Wellenlänge und eine zweite Wellenlänge derart existieren, dass die Transmission des zwischen einem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes, auf das der Ort (x,y) abgebildet wird, angeordneten wenigstens einen ersten Filters bei der ersten Wellenlänge wenigstens 1,5 mal größer ist als die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes, auf das der Ort (x,y) abgebildet wird, angeordneten wenigstens einen zweiten Filters bei der ersten Wellenlänge, und die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes angeordneten wenigstens einen ersten Filters bei der zweiten Wellenlänge wenigstens 1,5 mal kleiner ist als die Transmission des zwischen dem Ort (x,y) in dem Objektbereich und dem Pixel (k,l) bzw. der Gruppe (k,l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes angeordneten wenigstens einen zweiten Filters bei der zweiten Wellenlänge.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9, wobei die erste Wellenlänge größer als 610 nm und kleiner als 750 nm ist.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die zweite Wellenlänge kleiner als 610 nm oder größer als 750 nm ist.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die erste Wellenlänge größer als 610 nm und kleiner als 670 nm ist und die zweite Wellenlänge kleiner als 610 nm oder größer als 670 nm ist.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die erste Wellenlänge größer als 670 nm und kleiner als 750 nm ist und die zweite Wellenlänge kleiner als 670 nm oder größer als 750 nm ist.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, ferner umfassend Blockieren von Licht mit Wellenlängen, welche das zum Anregen der wenigstens zwei Fluoreszenzen verwendete Licht enthält, in dem ersten und dem zweiten Strahlengang.
Mikroskopiesystem, welches dazu konfiguriert ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 auszuführen.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 15, ferner umfassend: eine Objektivlinse, welche in dem ersten und dem zweiten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und dem ersten bzw. dem zweiten Detektorenfeld angeordnet ist, und einen Strahlteiler, welcher in dem ersten und dem zweiten Strahlengang zwischen dem Objektbereich und dem ersten bzw. dem zweiten Detektorenfeld angeordnet ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 16, wobei der erste und der zweite optische Filter den Strahlteiler umfassen und der Strahlteiler ein dichroitischer Strahlteiler ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei in dem ersten oder/und dem zweiten Strahlengang vor dem ersten bzw. zweiten Detektorenfeld ein Feld von optischen Filtern angeordnet ist, so dass im Strahlengang vor einander benachbarten Pixeln verschiedene optische Filter angeordnet sind, welche voneinander verschiedene spektrale Durchlasscharakteristiken aufweisen.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 15 bis 18, ferner umfassend eine Steuerung, welche Detektionssignale des ersten und des zweiten Detektorenfeldes einliest und dazu konfiguriert ist, die Werte zu bestimmen, welche die ortsabhängige Fluoreszenzstärke der ersten Fluoreszenz repräsentieren.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 19, ferner umfassend eine Anzeigevorrichtung, wobei die Steuerung ferner dazu konfiguriert ist, die Werte als ein Bild durch die Anzeigevorrichtung darzustellen.