CN111208106A - 显微镜***和用显微镜***检测从样本发射的荧光的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了显微镜***和用显微镜***检测从样本发射的荧光的方法。具体公开了用于检测从用至少四种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法，其中，至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，第一荧光染料和第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱。根据本发明，通过以下来实现对来自至少四种预定荧光染料的荧光的检测：选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；以及选择第一荧光染料的发射波长范围以使得对来自第二荧光染料的光发射的渗漏减少。
Description
本申请是申请日为2014年12月11日、申请号为201480068794.3(PCT国际申请号为PCT/SE2014/051484)、发明名称为“用于荧光显微镜以检测来自多种荧光染料的光发射的***和方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明总体上涉及荧光显微镜，更具体地，涉及改进用于显微镜***的方法和相应的荧光显微镜***，其用于允许分离检测来自用多种不同的荧光染料标记的样本的光发射。
背景技术
荧光显微镜是用于通过对来自位于样本上或位于样本中的目标物质(诸如有机分子或无机化合物)的荧光或磷光发射进行成像来研究样本的结构或性质的光学显微镜技术。例如，可以用一种或多种不同的荧光染料(也被称为荧光团)来标记样本，当分子吸收光时通过各种方式随后处置其增大的能量，这些方式之一是发射具有更长波长的光。
当用紫外光、可见光、远红光、近红外光或红外光照射这样的分子时，这样的分子会经历分子吸收一定量的能量的电子跃迁，并且电子从其在基态下占据的轨道被激发至另一较高能量的轨道。被照射的分子吸收光的波长光谱被称为吸收光谱或激发光谱。大多数激发状态是短暂的，并且所吸收的能量的主要去向是重新发射如磷光或荧光那样的光。被照射的分子发射光的波长光谱被称为发射光谱。有机染料和无机染料的荧光特性为许多分析方法提供了基础，这些分析方法之一是荧光免疫检验法(immunofluorescence)，其使用荧光染料缀合的抗体来检测蛋白质和其他分子。
通常用于这样的分析的示例性荧光显微镜包括：光源；用于将光传送至激发光路中的光学器件；激发滤光器，用于选择要被传送至对象的一种或多种激发波长带；分色镜(dichroic mirror)，被配置成将激发波长带反射至样本、同时将来自样本的荧光发射波长透射至发射光路；发射滤光器，用于阻挡被透射至发射光路中的任何杂散激发光波长；以及用于将荧光发射波长传送至眼部或者传送至诸如摄像装置的图像捕获装置的光学器件。
通常，所有的现代显微镜都设置有多种可快速切换的“滤光块(filter cube)”，每个滤光块专用于特定荧光染料(或一组相似的荧光染料)并且包括一组匹配的激发滤光器、分色镜以及发射滤光器。可以通过连续地、一次一个地通过匹配的滤光器组进行切换来容易地实现对不同荧光染料的分离且连续的可视化。
对均具有分离的激发/发射波长光谱的不同荧光染料的这样依次的可视化可以例如用于通过使用荧光蛋白(例如，GFP)或荧光染料标记的抗体(所谓的荧光免疫检验法)来展现在组织内的两种(或更多种)蛋白质的空间位置，或者通过使用荧光染料标记的核酸(探针)来检测细胞中的两种(或更多种)DNA突变。
在这样的研究中，通常存在组合许多通道以获得信息的期望。例如，在生物学研究中，通常通过使用标记有不同荧光染料的细胞特有的抗体来使组织样本内的若干不同的细胞类型可视化。然而，因为从不同的荧光染料渗漏的光发射，因此当今在同一样本内允许明显地分离仅有限数量的荧光团。可以通过补偿(即，对来自部分交叠的荧光染料光谱的信号的添加进行补偿的基于计算机的计算)来解决渗漏的问题(还被称为溢出伪影(spill-overartifact))。然而，这在研究或实验室医学中是不常规使用的复杂处理。
因此，会期望提供一种被配置用于对来自多于四种不同的荧光染料的光发射进行简化分离并且对来自多于四种不同的荧光染料的光发射进行改进的检测的方法和显微镜***。
发明内容
根据本发明的第一方面，以上问题是通过用于使用包括光源装置的显微镜***来检测从用多种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法来至少部分地减轻的，其中，该方法包括以下步骤：选择被配置成发射在可见光谱内的光的至少四种不同的荧光染料，至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料；选择针对至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；将显微镜***的滤光器装置配置成选择性地允许在与至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射；顺序地发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及检测从样本发射的透过滤光器装置的光，其中，荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，或者荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料。还可以通过使用具有不同斯托克位移的两种荧光染料来形成荧光染料对。斯托克位移是激发波长间隔与发射波长间隔之间的位移。以这种方式，两种荧光染料可以利用相同的激发波长间隔来激活，并且通过两种不同的发射滤光器来分离，这两种不同的发射滤光器被配置成使得选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射，以及选择针对第二荧光染料的发射波长间隔以减少从第一荧光染料渗漏的光发射。由于一个发光二极管(下文进一步讨论的LED)可以用于激活两种荧光染料，因此这会例如当使用LED来替代激发滤光器来激活荧光染料时是有益的。在优选实施例中，可以在荧光染料对之上添加斯托克位移大的荧光染料，从而形成荧光染料三联体(triplet)。这可以例如利用与425/488对组合的PerCP来实现。
本发明基于以下理解：通过解决分离从用第一荧光染料和第二荧光染料标记的样本发射的荧光信号的主要问题，优点将如下，即减小了还使得能够分离出自第三荧光染料和第四(不同的)荧光染料的另外的荧光信号的复杂度，这限于以下情况：荧光染料发射在可见光谱内(例如，通常在400nm至640nm的范围内)的光并且第一荧光染料和第二荧光染料分别是为Cy3类荧光染料和594类荧光染料的荧光染料组合/对，或者第一荧光染料和第二荧光染料分别是为425类荧光染料和488类荧光染料的荧光染料组合/对。根据本发明，这是通过以下获得的：选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；以及选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以使得从第二荧光染料渗漏的光发射减少。
在本发明的范围内，可以允许对至少四种荧光染料的信号分离。然而，每个样本不必一定在任何给定时间处用至少四种荧光染料来标记。因此，借助于本发明使可以分离的至少四种荧光染料可用，但是这至少四种荧光染料不一定“同时”全部顺序地被激发，例如，在一些实施例中，可以激发至少四种荧光染料中的仅一种、两种或三种荧光染料，但是显微镜具有分离来自至少四种荧光染料中的任何荧光染料的信号的能力。
关于以上所讨论的荧光染料对之一，术语“Cy3类荧光染料”和“594类荧光染料”应当在其最广泛的意义上被解释(参见图6，例如关于具有类似激发光谱和发射光谱的荧光染料)，包括具有类似的激发/发射光谱的任何有机或无机化合物。应当注意，列表是非排他性的，并且目前和将来的另外的等同荧光染料可以被预期并且在本发明的范围内。
关于以上所讨论的荧光染料对中的另一个，术语“425类荧光染料”和“488类荧光染料”应当在其最广泛的意义上被解释(参见图6，例如关于具有相似激发光谱和发射光谱的荧光染料),包括具有类似激发/发射光谱的任何有机或无机化合物。
此外，基于分子复杂性和合成方法，通用术语“荧光染料”应当被广泛地解释，包括基于蛋白质和肽、少量有机化合物、合成的低聚物和聚合物或者多组分体系、本领域公知的表达的任何类型的荧光染料。基于应用，所使用的荧光染料的类型可以不同。也就是说，在非活体样本(non-live sample)中，通常期望选择耐光的荧光染料，而关于例如“活体成像”应用(包括活体样本(live sample))，通常需要选择具有例如无毒的特征的荧光染料。与本发明方法有关的任何应用会是可行的。
分离来自至少四种荧光染料的荧光信号在荧光显微镜领域内具有非常大的优点，具体是因为其允许“筛查”少量组织样本中的一大组蛋白质。此外，其实现了先进的共存分析，其中，可以在同一样本内可视化若干蛋白质(例如，对于多色分析)。此外，这大大简化了用户对荧光显微镜的使用，因为他们可以选择用滤光器组可以分离的荧光染料中的任何荧光染料来标记样本，而无需考虑关于潜在的渗漏假象。对荧光信号的分离还可以在除显微镜之外的其他荧光读取***中具有很大的进步，其他荧光读取***为例如用于免疫印迹(western blot)、PCR和ELISA的分光光度计。
该方法优选地还包括用至少四种不同的荧光染料标记样本的步骤。目前存在可用的多种不同的标记样本的方法，标记方法取决于样本的类型以及期望标记样本的哪个部分。相应地以及如技术人员所理解的那样，可以例如用荧光染料标记的抗体、细胞膜染料、DNA结合的荧光染料、荧光染料标记的核酸探针、以及荧光蛋白质来标记样本，以收集关于来自人、动物、植物和微生物的蛋白质、DNA、细胞和组织的生物学和病理学的信息。
在本发明的优选实施例中，选择了五种不同的荧光染料并且相应地修改本方法。因此，在这样的实施例中，一个荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，以及另一荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料。
另外，还可以包括发射在远红光光谱内(例如，通常在640nm至680nm的范围内)的光的至少一种另外附加的荧光染料，从而使得能够分离一个另外的荧光信号。更进一步地，还可以包括发射在近红外光谱内(例如，通常大于680nm)的光的至少一种另外的荧光染料。这些附加的荧光染料也可以单独地包括或者替代地分离以上所讨论的两种“可见”光谱荧光染料对。
在优选实施例中，其余的荧光染料还选自：DAPI类荧光染料或BV421类荧光染料、425类荧光染料、488类荧光染料、Cy3类荧光染料、594类荧光染料、647/660/680类荧光染料或PerCP类荧光染料以及750/790类荧光染料。
选择具有在远红光/近红外光谱内的发射的另外的荧光染料会使得可以仍使用紫外光和可见光的照明光源(诸如，汞灯或金属卤化物灯(可能在添加用于在红外光谱内进行激发的光源的情况下))来将多达五种、六种或甚至七种荧光信号彼此分离(即，在不包括如上文所讨论的进一步基于计算机的处理的情况下)。在图6中示出了针对647/660/680/700/750和790的远红光/近红外以及红外类荧光染料的示例。
使用发射具有高能量的、还大于620nm的光的光源(诸如氙灯或LED)使得能够形成发射在远红光/近红外光谱中的光的荧光染料对，该荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的647类荧光染料和形成第二荧光染料的700类荧光染料。如以上针对可见光荧光染料对所讨论的那样，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少，以及选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射。优点将如下：减小了还使得能够分离出自第三荧光染料和第四荧光染料的另外的荧光信号的复杂度，这限于荧光染料发射在通常大于750nm的上红外光谱处的光的情况。
在优选实施例中，使用发射在紫外、可见光、远红光、近红外和红外光谱处具有高能量的光的(多个)照明源，其余的荧光染料还选自：DAPI类荧光染料或BV421类荧光染料、425类荧光染料、488类荧光染料、Cy3类荧光染料、594类荧光染料、647类荧光染料、700类荧光染料以及790类荧光染料。在这之上可以添加具有很大的斯托克位移的荧光染料。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于分离从用多种预定荧光染料标记的样本发射的荧光信号的显微镜***，该显微镜***包括：光源装置，被配置成发射光；导光装置，用于将光从光源装置引导至样本以激发多种预定荧光染料；滤光器装置，被配置成允许分离由标记样本的多种预定荧光染料发射的荧光；以及检测装置，被配置用于接收透过滤光器装置的光，其中，显微镜滤光器组可以分离来自发射在可见光谱内的光的至少四种不同的荧光染料的信号，这至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，光源装置被配置成顺序地发射在至少四种不同的激发波长间隔内的光，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以减少对第一荧光染料的激发，滤光器装置包括至少四个匹配的滤光器，该至少四个匹配的滤光器被配置成允许在至少四种不同的发射波长间隔内的光通过，选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射，以及荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，或者荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料。
在本发明的优选实施例中，检测装置包括图像捕获装置，该图像捕获装置被配置成捕捉样本的荧光的图像。这样的图像捕获装置可以是连接至计算机的摄像装置。在顺序地捕获并存储与由每种荧光染料发射的光相关的多个图像时，可以将图像“重叠”在彼此“之上”，例如以提供对样本的多色分析。应当注意，显微镜***/摄像装置/连接的计算机可以被配置用于“活体成像”，其中，捕获样本的连续的(顺序的)图像流(例如，视频流)，即，通过“随着时间的推移”获取针对每种荧光染料的不止一个图像。
优选地，光源装置包括紫外光和可见光源以及被配置成允许在至少四种不同的激发波长间隔内的光通过的至少四种匹配的滤光器。光源可以例如是汞灯、金属卤化物灯或氙弧灯。其他合适的光源自然是可行的并且在本发明的范围内。在典型应用中，至少四种匹配的滤光器(“激发滤光器”)被配置成允许在至少四种不同的激发波长间隔内的光通过，并且滤光器装置包括被配置成允许在至少四种不同的发射波长间隔(“发射间隔”)内的光通过的至少四种匹配的滤光器，至少四种匹配的滤光器被分别布置在四个分离的“滤光块”中，还包括分色镜。如果使用斯托克位移大的荧光染料，则两种不同的荧光染料可以共享激发间隔(或发射滤光器间隔)。因此，在这样的实现方式中，滤光器装置可以被看作包括特别适于使得能够以上文讨论的方式分离至少四种荧光染料的四种不同的滤光块。此外，在这样的实现方式中，发明构思可用作“改造”应用，其中，发明构思被选择用于修改可用的显微镜***，其中，设置了使得能够执行本发明构思的新的“一组”滤光块。
然而，在替选实施例中，光源装置可以包括多个发光二极管(LED)。在这样的实施例中，由于LED可以被选择为是窄带的并且被配置成固有地发射在每个具体选择的激发波长内的光，因此可不一定必需包括特定激发滤光器。如果使用了LED，则其可以有益于形成基于不同的斯托克位移的荧光染料对，其中，由一个LED激活在该对中的两种荧光染料。这会减小激活一组荧光染料所需的LED的数量。
当研究所附权利要求和以下描述时，本发明的进一步特征和优点将变得明显。技术人员认识到，在不背离本发明的范围的情况下，可以组合本发明的不同的特征，以产生与下文中所描述的实施例不同的实施例。
附图说明
根据以下详细描述以及附图，将容易理解本发明的各个方面，包括本发明的特定特征和优点，在附图中：
图1示出了根据本发明的示例性显微镜***；
图2a至图2c图示了用于显微镜***的替选滤光器配置；
图3a示出了根据本发明的针对所应用的多种不同的荧光染料的激发/发射图，以及图3b至图3d示意性地图示了根据本发明的荧光染料类似物设置的一些变型；
图4a至图4c示出了具体滤光器配置的不同示例；
图5是示出了根据本发明的用于检测来自被标记的样本的荧光的方法步骤的流程图，以及
图6是示出具有类似的激发光谱或发射光谱的荧光染料(荧光染料类似物)的示例的表。
具体实施方式
现在，在下文中将参照附图更全面地描述本发明，在附图中，示出了本发明的当前优选实施例。然而，本发明可以以许多不同的形式实现并且不应解释为限于本文中所阐述的实施例；而是这些实施例是为了透彻性和完整性而提供的，并且将本发明的范围充分地传达给技术人员。贯穿全文相同附图标记指代相同元件。
现在参照附图并且具体地参照图1，描绘了根据本发明的优选实施例的显微镜***100。显微镜***100在操作中用于对布置在显微镜台104上的样本102进行成像。样本104被标记有多种不同的荧光染料，这多种不同的荧光染料吸收在激发波长处的光并且响应于该光而发荧光，从而发射在比激发波长长的发射波长处的光。
发射在紫外光谱和可见光谱内的光(即，通常在350nm至620nm的范围的强发射)的光源106(诸如汞灯或金属卤化物灯)生成在荧光染料的激发波长处的光，并且光源106耦合至光纤108，该光纤108将激发光束110从光源106传导至滤光块112。在一些实施例中，从光源106发射的光直接传递至滤光块112而不由光纤传导。在其他实施例中，激发光束110在到达滤光块112之前通过光学元件，诸如透镜和光圈。激发光束110进入被布置在显微镜***100的转台(未示出)中的滤光块112。转台被设置用于使多个不同的滤光块能够顺序地定位在光源106与样本102之间的光轴中。
滤光块112包括带通激发滤光器114，该带通激发滤光器114接收来自光纤108的激发光束110并且仅传送激发光束110的具有在用于标记样本102的荧光染料之一的激发波长间隔内的波长间隔的一部分。激发光束110透过激发滤光器114并且由分色镜116接收，该分色镜116反射在荧光染料的激发波长处的光并且透射在荧光染料的发射波长处的光。从而，激发光束110被分色镜114反射。分色镜114通常对角地定向在滤光块112内，通常以相对于激发光束110的方向的45度角定向在滤光块112内，以使得激发光束110朝向样本102反射。
此外，激发光束110通过物镜116并且撞击到样本102上，其中，激发光束110激发存在于样本102中的荧光染料。荧光染料发荧光，从而发射在荧光染料的发射波长处的荧光118。荧光118被物镜117收集并且形成发射光束120，该发射光束120进入滤光块112。然后，发射光束120透过分色镜116并且击中滤光块112还包括的发射滤光器122。发射滤光器122也是带通滤光器(或者在一些情况下是长通滤光器)，该带通滤光器透射在荧光染料的发射波长附近的光并且反射其他光(诸如，例如来自激发光束的杂散光以及来自样本102中的其他荧光染料的发射光)。从而，发射光束120透过发射滤光器122并且从显微镜***100引导到与其连接的检测装置124。检测装置124可以例如是传感器、分光光度计、CCD或CMOS摄像装置、或者目镜。在一些实施例中，诸如透镜或分束器的光学元件存在于发射滤光器122与检测装置124之间，以便适当地引导发射光束120。在包括诸如CCD或CMOS摄像装置的数字摄像装置的检测装置124的情况下，通常包括用于对所收集的图像进行曝光控制的自动快门(如上文所讨论的那样，也可以捕获视频流)。当使用多个不同的滤光块112时，通常使用黑白相机来分别捕获来自每种荧光染料的发射，数字地应用假彩色并且重叠它们，以获得最终图像。
显微镜***100还(通常地)包括控制单元126，该控制单元126用于控制显微镜***100的操作，包括转台的位置、检测单元124以及光源106。控制单元126可以包括通用处理器、专用处理器、包含处理部件的电路、一组分布式处理部件、被配置用于处理的一组分布式计算机等。处理器可以是或者包括用于进行数据或信号处理或者用于执行存储在存储器中的计算机代码的任何数量的硬件部件。存储器可以是用于存储用于完成或促进本描述中所描述的各种方法的数据和/或计算机代码的一个或多个装置。存储器可以包括易失性存储器或非易失性存储器。存储器可以包括数据库组件、目标代码组件、脚本组件、或用于支持本描述的各种活动的任何其他类型的信息结构。根据示例性实施例，任何分布式存储器装置或本地存储器装置都可以与该描述的***和方法一起使用。根据示例性实施例，存储器(例如，经由电路或任何其他有线连接、无线连接或网络连接)可通信地连接至处理器，并且包括用于执行本文所描述的一种或多种处理的计算机代码。
如上所述，转台允许对多个滤光块112的可移除***和位置控制。也就是说，由于每种类型的荧光染料具有其自身独特的激发光谱和发射光谱，因此针对每种类型的荧光染料使用激发滤光器114、分色镜116和发射滤光器122的不同组合。从而，具有滤光器与反射镜的特定组合的滤光块被组装以与特定类型的荧光染料一起使用。根据存在于样本102中的荧光染料的类型，将具有滤光器与反射镜的适当组合的滤光块112相应地***转台中。类似地，选择滤光块112中的滤光器和反射镜以与特定光源一起使用。
上文所描述的标准光学配置使用显微镜光学元件以在摄像装置传感器上直接产生标本的放大图像以捕获标本的高分辨率图像。该光学***通常被称为“宽场”显微镜。显微镜领域的技术人员会认识到，可以通过各种其他光学***来产生标本的高分辨率图像。
暂时转到图2a至图2c，图2a至图2c示出了用于实现根据本发明的构思的滤光器和光源装置的替选实现方式。在图2a中，以与图1中的方式相似的方式示例化了发明构思，然而，替代设置单个光源(诸如汞灯(或类似物))，设置了多个LED 106’，其中，LED 106’中的每一个均是通常发射仅在有限的波长范围内(例如，具有大约20nm至50nm的带宽)的光的窄带LED。因此，在使用这样的布置时，可以不包括滤光块112’的激发滤光器。相应地，必须调整LED 106’中的每一个以仅透射激发光束110的具有在用于标记样本102的荧光染料之一的激发波长间隔内的波长间隔的成分(如上文所讨论的那样)。
替选地，可以根据所谓的“Pinkel”配置(图2b)或“Sedat”(图2c)配置来实现发明构思。Pinkel配置和Sedat配置两者都包括多频带分色镜；然而，不同之处在于所使用的激发滤光器与发射滤光器的组合。Sedat滤光器配置使用单频带激发器和单频带发射器，而Pinkel配置使用单频带激发滤光器和多频带发射器。虽然当与多频带滤光器组相比时，在大多数情况下，Sedat配置将给出最高的信噪比，但是当使用Pinkel配置时获得的S/N比可能高于当使用整个多频带配置时获得的S/N比。与图1中所示的滤光块实现方式相比，Pinkel和/或Sedat配置可以允许对引入不同的滤光器配置的非常快速的切换。
此外，图1和图2a至图2c中所示的所有不同的实现方式被示为实现“光反射策略”，即，光撞击到样本102上、然后朝向检测装置124反射回去。然而，应当理解的是，发明构思还可以通过使光透射“通过”样本102来实现，例如，从而使检测装置124能够布置在样本102“后面”或以任何其他角度布置检测装置124。
现在转到图3a，图3a示出了根据本发明的所应用的多种不同的荧光染料的激发/发射图。在图3a的图示中，已用七种不同的荧光染料标记样本102，从而形成被提供给检测装置124的七种不同的荧光信号。
如上文所讨论的那样，本发明所解决的大体问题是分离来自用第一荧光染料标记并且同时用形成荧光染料对的第二荧光染料标记的样本的信号。如上文所讨论的那样，第一荧光染料和第二荧光染料选自发射在可见光谱内(例如，通常在400nm至640nm的范围内)的光的荧光染料，以及第一荧光染料和第二荧光染料分别是为Cy3类荧光染料和594类荧光染料的荧光染料组合/对，或者第一荧光染料和第二荧光染料分别是为425类荧光染料和488类荧光染料的荧光染料组合/对。
通常，这些荧光染料是亮的并且具有光谱重叠(425与488相比，以及Cy3与594相比)。在本发明的示例性实施例中，594激发滤光器已被移位大于590nm(例如，594/8nm或602/13nm)，这相应地使得可以激发594而不激发Cy3。此外，通过将Cy3的发射滤光器移位小于580nm(例如，568/10nm或572/10nm)，意外的是可以收集Cy3发射信号而未收集594发射信号。在这些优化的情况下，Cy3滤光器装置(光部件和滤光器部件)以及594滤光器装置使得可以分离来自每种荧光染料的信号。重要地，在优化的滤光器组的情况下，荧光信号保持足够强。在另一示例中，可以针对425荧光染料和488类荧光染料的组合以及针对647类荧光染料和700类荧光染料的组合来进行类似的调适。
接下来，已通过减少来自组织的自发荧光来优化488/FITC(异硫氰酸荧光素)通道的信噪比，这是488/FITC检测的普遍问题。组织中的许多分子被蓝光光谱内的光激活，例如线粒体蛋白质、胶原蛋白和弹性蛋白，这引起自发荧光并且发射跨宽波长间隔的光。通过将激发滤光器移位大于490nm(500/20nm)，自发荧光的主要部分消失并且显著地改善了信噪比。必须注意选择不收集任何Cy3发射信号的488/FITC发射滤光器(525/15nm)。488/FITC发射滤光器的移位为在DAPI和FITC之间的附加通道给出了空间(激发大于420nm以及发射小于495nm)。关于高的组织自发荧光，该间隔是有问题的，并且荧光染料需要足够亮以给出可接受的信噪比。在该间隔处仅少量荧光染料可用，并且它们中的大部分是黯淡的和/或受到光致漂白影响。然而，发现Atto425是耐光的且足够亮以覆盖组织自发荧光。此外，核染色剂SytoxBlue满足了该间隔处的标准。
最后，选择/引入/使用近红外荧光染料来标记样本102。由于汞灯或金属卤化物灯在大于620nm的波长处是弱的，因此在获得足够的光能以适当地激发近红外荧光染料时存在困难。在测试许多染料之后，证实了PerCP及其类似物(例如，PerCP-Cy5.5)更优良。PerCP具有较大(相比之下)斯托克位移并因而可以用高能量蓝光来激活，并且通过与425类荧光染料和488类荧光染料形成荧光染料三联体，可以容易地将PerCP的信号与设置中的其他荧光染料分离。在所测试的具有较小(相比之下)斯托克位移的所有红外染料中，已发现647类荧光染料以及一些660类荧光染料(诸如CF660R)即使当在波长间隔>620nm下被激活时也给出了合理的良好信号。从而，PerCP类荧光染料或647类荧光染料以及一些660类荧光染料可以用于多色设置中并且由汞灯或金属卤化物灯来激活。
因此，借助于本发明，可以分别检测来自发射可见光谱内的光的四种或更多种不同的荧光染料的信号。此外，通过选择发射在远红光光谱内的光的荧光染料(通常发射在640nm与700nm之间的光)、发射在近红外光谱内的光的荧光染料(通常发射在700nm与750nm之间的光)或发射在红外光谱内的光(通常发射大于750nm的光)的荧光染料，可以分离多达七种不同的荧光信号。此外，也就是说，在与在远红光/近红外/红外光谱内是活性的荧光染料结合使用发射在可见光谱以及可见光谱以上(远红光/近红外/红外)的光谱两者内的光的光源(例如，例如与另外的LED结合的“常用”光源)的情况下，可以分离多于七种不同的荧光信号。对于紫外光谱以及针对其他光源组合而言，相同的构思自然也是可行的。
图3b至图3d示出了可以如何将荧光染料对与其他荧光染料对和其他单一荧光染料组合以获得根据本发明的多色设置的替选配置。例如，图3b示出了可以由汞灯激活的多色设置。类似地，图3c和图3d示出了可以由还发射在远红光/近红外/红外光谱内的强光的光源装置激活的多色设置。
以下给出了具有在其内放置激发滤光器和发射滤光器的适当间隔的示例性荧光染料(或任何类似类型)的可能组合。可以用汞灯或金属卤化物灯来进行该设置。
替选地，在本发明的另一实施例中，以下组合是可行的。在该示例中，已用由紫外光激活的荧光染料对(与DY-360XL或BV421组合的DY-350XL)替代DAPI通道，并且添加了远红光/近红外荧光染料对(与700组合的647)。该设置优选地需要发射在远红光和近红外光谱处具有高能量的光的照明源以恰当地激活700荧光染料和790荧光染料。
图4a至图4c示出了激发滤光器和发射滤光器设置及其对应的波长/带宽的三个具体示例。
最后转至图5，图5示出了图示用于操作根据本发明的显微镜***100的方法步骤的示例性流程图。该过程开始于选择包括Cy3类荧光染料和594类荧光染料的至少四种不同的荧光染料(S1)。然后，将至少四种不同的荧光染料用于标记样本102，样本具有上文所讨论的类型中的任一类型。
基于被选择用于标记样本102的荧光染料，选择相应数量(通常与所选择的荧光染料的数量一样多)的激发波长间隔(S2)，其中，根据以上讨论具体选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少。然后，选择滤光器装置(例如，(一个或多个)滤光块112的(一个或多个)发射滤光器(或替选地，根据Pinkel配置或Sedat配置))(S3)，以允许在与至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的不同发射波长间隔内的光通过。此外，此处应当满足一般标准，其中，选择针对第一荧光染料的发射波长以减小从第二荧光染料渗漏的光发射，其中，Cy3类荧光染料形成第一荧光染料而594类荧光染料形成第二荧光染料，或者425类荧光染料形成第一荧光染料而488类荧光染料形成第二荧光染料。
与光源106、转台和滤光块112结合地使用例如控制单元126，显微镜***100用于顺序地发射在所选择的激发波长间隔内的光(S4)。基于反射光配置或者通过允许光通过样本102，从用于标记样本102的荧光染料发出的荧光例如在与数字摄像装置(检测装置124)结合的控制单元126的控制下，一旦光已通过滤光器装置(通常至少包括发射滤光器)就被检测到。
如上文所讨论的那样，可以分别捕获图像，可以数字地应用伪彩色，然后，可以将图像重叠在彼此之上，以允许形成多色图像。还如上文所讨论的那样，可以对随后收集的图像执行实时收集。
总之，本发明涉及一种用于使用包括光源装置的显微镜***来检测从用多种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法，其中，该方法包括以下步骤：选择被配置成发射在可见光谱内的光的至少四种不同的荧光染料，这至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料；选择针对至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；将显微镜***的滤光器装置配置成选择性地允许在与至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射；顺序地发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及检测从样本发射的透过滤光器装置的光，其中，荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，或者荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料。
本发明还涉及一种用于使用包括光源装置的显微镜***来检测从用多种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法，其中，该方法包括以下步骤：选择被配置成发射在可见光、远红光以及近红外光光谱内的光的至少六种不同的荧光染料，至少六种不同的荧光染料包括发射在可见光谱内的光的形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料、以及发射在远红光/近红外光谱内的光的形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料；选择针对至少六种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；将显微镜***的滤光器装置配置成选择性地允许在与至少六种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射；顺序地发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及检测从样本发射的透过滤光器装置的光，其中，“可见”荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，或者荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料，以及“不可见”荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的647类荧光染料和形成第二荧光染料的700类荧光染料。
本发明基于以下理解：通过解决分离从用第一荧光染料和第二荧光染料标记的样本发射的荧光信号的主要问题，优点将如下，即减小了还使得能够分离出自第三荧光染料和第四(不同的)荧光染料的在可见光谱内的另外的荧光信号的复杂度，限于荧光染料发射在可见光谱内(例如，通常在400nm至640nm的范围内)的光的情况。此外，如果还添加在远红光/近红外光谱内(通常在640nm至750nm的范围内)的荧光染料对，则优点将如下：减小还使得能够分离出自荧光染料的在红外光谱(通常大于750nm)内的另外的荧光信号的复杂度。第一荧光染料和第二荧光染料分别是为Cy3类荧光染料和594类荧光染料的荧光染料组合/对，或者第一荧光染料和第二荧光染料分别是为425类荧光染料和488类荧光染料的荧光染料组合/对，或者第一荧光染料和第二荧光染料分别是为647类荧光染料和700类荧光染料的荧光染料组合/对。根据本发明，这是通过以下获得的：选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；以及选择针对第一荧光染料的发射波长以使得从第二荧光染料渗漏的光发射减少。
此外，本公开提供的技术可配置如下：
方案1.一种方法，用于使用包括光源装置的显微镜***来检测从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光，其中，所述方法包括以下步骤：
-选择至少四种不同的荧光染料，所述至少四种不同的荧光染料被配置成发射在可见光光谱内的光，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料；
-选择针对所述至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以使得所述第一荧光染料的激发减少；
-将所述显微镜***的滤光器装置配置成选择性地允许在与所述至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以减少从所述第二荧光染料渗漏的光发射；
-顺序地发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及
-检测从所述样本发射的透过所述滤光器装置的光，
其中，所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料。
方案2.根据方案1所述的方法，还包括如下步骤：分离来自所述至少四种不同的荧光染料的荧光信号。
方案3.根据前述方案中任一项所述的方法，还包括选择至少五种不同的荧光染料，其中，针对所述至少五种不同的荧光染料选择激发波长间隔并且针对所述至少五种不同的荧光染料配置所述滤光器装置，所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述594类荧光染料，以及另外的荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述488类荧光染料。
方案4.根据前述方案中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在远红光/近红外光谱内的光。
方案5.根据前述方案中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在红外光谱内的光。
方案6.根据前述方案中任一项所述的方法，其中，其余的荧光染料选自：DAPI类荧光染料或BV421类荧光染料、425类荧光染料、488类荧光染料、Cy3类荧光染料、594类荧光染料、PerCP类荧光染料或647/660/680/700类荧光染料以及725/750/790类荧光染料。
方案7.一种显微镜***，用于分离从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光信号，所述显微镜***包括：
-光源装置，被配置成发射光；
-导光装置，用于将光从所述光源装置引导至所述样本以激发所述多种预定的荧光染料；
-滤光器装置，被配置成允许分离由标记所述样本的所述多种预定的荧光染料发射的荧光，以及
-检测装置，被配置用于接收透过所述滤光器装置的光，
其中，
-显微镜滤光器设置能够分离来自发射在可见光光谱内的光的至少四种不同的荧光染料的信号，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，
-所述光源装置被配置成顺序地发射在至少四种不同的激发波长间隔内的光，
-选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以减少对所述第一荧光染料的激发，
-所述滤光器装置包括至少四个匹配的滤光器，所述至少四个匹配的滤光器被配置成允许在至少四种不同的发射波长间隔内的光通过，
-选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以减少从所述第二荧光染料渗漏的光发射，以及
-所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料。
方案8.根据方案7所述的显微镜***，其中，所述检测装置包括图像捕获装置，所述图像捕获装置被配置成捕捉所述样本的荧光的图像。
方案9.根据方案7至8中任一项所述的显微镜***，其中，所述光源装置包括多个窄带发光二极管。
方案10.根据方案7至9中任一项所述的显微镜***，其中，所述光源装置包括发射在紫外光谱和可见波长光谱内的光的光源与发射在远红光光谱、近红外光谱或红外光谱中的至少一个内的光的多个发光二极管的组合。
虽然附图示出了方法步骤的具体顺序，但是这些步骤的顺序可以与所描绘的顺序不同。也可以同时执行两个或更多个步骤或者部分地同时执行两个或更多个步骤。这样的变型将取决于设计者的选择。所有这样的变型都在本公开内容的范围内。此外，即使已参照本发明的具体示例性实施例描述了本发明，对于本领域的技术人员而言，许多不同的替选、修改等也将变得明显。根据对附图、本公开内容以及所附权利要求的学习，技术人员可以在实践要求保护的发明时理解并实现对所公开的实施例的变型。此外，在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，以及不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”不排除复数。
Claims (10)
1.一种方法，用于使用包括控制单元和光源装置的显微镜***来检测从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光，所述控制单元被配置成控制所述光源装置的操作，所述光源装置被配置成包括发射在可见光谱内的光的多个发光二极管，其中，所述方法包括以下步骤：
-选择至少四种不同的荧光染料，所述至少四种不同的荧光染料被配置成发射在可见光光谱内的光，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱；
-选择针对所述至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以使得所述第一荧光染料的激发减少；
-将所述显微镜***的滤光器装置配置成选择性地允许在与所述至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以不激发所述第二荧光染料；
-使用所述控制单元来顺序地激活所述多个发光二极管中的每一个以发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及
-检测从所述样本发射的透过所述滤光器装置的光，
其中，
-所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料，
-针对所述Cy3类荧光染料的激发波长间隔为535-555nm，
-针对所述Cy3类荧光染料的发射波长间隔为555-590nm，
-针对所述594类荧光染料的激发波长间隔为585-615nm，以及
-针对所述594类荧光染料的发射波长间隔为605-655nm。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括如下步骤：分离来自所述至少四种不同的荧光染料的荧光信号。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括选择至少五种不同的荧光染料，其中，针对所述至少五种不同的荧光染料选择激发波长间隔并且针对所述至少五种不同的荧光染料配置所述滤光器装置，所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述594类荧光染料，以及另外的荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述488类荧光染料。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在远红光/近红外光谱内的光。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在红外光谱内的光。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，其余的荧光染料选自：DAPI类荧光染料或BV421类荧光染料、425类荧光染料、488类荧光染料、Cy3类荧光染料、594类荧光染料、PerCP类荧光染料或647/660/680/700类荧光染料以及725/750/790类荧光染料。
7.一种显微镜***，用于分离从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光信号，所述显微镜***包括：
-光源装置，被配置成发射光，所述光源装置被配置成包括发射在可见光谱内的光的多个发光二极管；
-控制单元，所述控制单元被配置成控制所述光源装置的操作；
-导光装置，用于将光从所述光源装置引导至所述样本以激发所述多种预定的荧光染料；
-滤光器装置，被配置成允许分离由标记所述样本的所述多种预定的荧光染料发射的荧光，以及
-检测装置，被配置用于接收透过所述滤光器装置的光，
其中，
-所述滤波器装置能够分离来自发射在可见光光谱内的光的至少四种不同的荧光染料的信号，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱，
-所述光源装置被配置成顺序地发射在至少四种不同的激发波长间隔内的光，
-选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以减少对所述第一荧光染料的激发，
-所述滤光器装置包括至少四个匹配的滤光器，所述至少四个匹配的滤光器被配置成允许在至少四种不同的发射波长间隔内的光通过，
-选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以不激发所述第二荧光染料，
-所述控制单元顺序地激活所述光源装置的所述多个发光二极管中的每一个以发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光，
-所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料，
-针对所述Cy3类荧光染料的激发波长间隔为535-555nm或415-450nm，
-针对所述Cy3类荧光染料的发射波长间隔为555-590nm，
-针对所述594类荧光染料的激发波长间隔为585-615nm，以及
-针对所述594类荧光染料的发射波长间隔为605-655nm。
8.根据权利要求7所述的显微镜***，其中，所述检测装置包括图像捕获装置，所述图像捕获装置被配置成捕捉所述样本的荧光的图像。
9.根据权利要求7或8所述的显微镜***，其中，所述光源装置包括多个窄带发光二极管。
10.根据权利要求7或8所述的显微镜***，其中，所述光源装置包括发射在紫外光谱和可见波长光谱内的光的光源与发射在远红光光谱、近红外光谱或红外光谱中的至少一个内的光的多个发光二极管的组合。
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