JP7194104B2 - 抗tl1aモノクローナル抗体の中和 - Google Patents
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Description
本出願は、本明細書において参照により全体が組み込まれる、2016年10月26日出願の米国仮特許出願第62/413,188号の優先権を主張するものである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。2017年10月23日に作成された上記のASCIIコピーは、52388-702_601_SL.txtと命名され、33,920バイトのサイズである。
様々な実施形態は、TL1Aに特異的に結合する抗体を提供する。幾つかの実施形態において、抗体は可溶性TL1Aに特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体は膜結合TL1Aに特異的に結合する。TL1A抗体「5C3D11」に対する完全長のアミノ酸(aa)配列は:表1に示されるようなSEQ ID NO:5(重鎖)及びSEQ ID NO:13(軽鎖)を含む。様々な実施形態において、TL1A抗体はSEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:13を含む。単量体TL1A抗体は、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:13の2つの例を含む。様々な実施形態において、TL1A抗体は、表1に示されるように、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及びSEQ ID NO:16を含む。幾つかの実施形態において、TL1A抗体は、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及びSEQ ID NO:16の少なくとも1つ又はあらゆる組み合わせを含む。
様々な実施形態では、ポリペプチド又はヌクレオチド配列を使用して生成される抗体が提供される。幾つかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。幾つかの実施形態において、抗体は抗体フラグメントである。例えば、抗体はFabである。幾つかの実施形態において、抗体はキメラ抗体である。
様々な実施形態では、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、及びSEQ ID NO:32から成る群から選択された1つ以上の相補性決定領域を含む、ポリペプチドが提供される。様々な実施形態において、ポリペプチドは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12のこれら相補性決定領域を含む。
提供される抗TL1Aの抗体は、IBDの処置などの治療処置方法を含むがこれに限定されない様々な用途に有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボの方法であり得る。特定の実施形態において、抗TL1A抗体はTL1A受容体に対するアンタゴニストである。
様々な実施形態では、必要とする被験体に本明細書に記載される抗TL1A抗体を投与する工程を含む、炎症性腸疾患(IBD)を処置する方法が提供される。幾つかの実施形態において、被験体は1つ以上のリスク変異体を含む。
更に、IBD(例えばCD、UC及び/又はMR-UC)を処置するためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載される方法を行うために使用可能な、本明細書に記載される抗体を含む。キットは、抗TL1Aの抗体の投与によるIBD、CD、UC及び/又はMR-UC患者の処置を提供する進歩性のある方法を実施するのに有用である。キットは、進歩性のある組成物の少なくとも1つを含む物質又は構成要素の集合である。故に、幾つかの実施形態において、キットは、上述のように、IBD、CD、UC及び/又はMR-UCの処置のための抗TL1A抗体を含む組成物を含んでいる。他の実施形態において、キットは、全ての制御、アッセイを行うための指示、及び分析と結果の提示に必要なソフトウェアを含む、TL1Aに対する検出アッセイを実行するのに必要及び/又は十分な構成要素の全てを含む。
免疫原の生成及びハイブリドーマ生成の免疫化プロトコル
(完全長のタンパク質における主要なメチオニンから集計されたように)点突然変異C66Sを持っており、主要な57のアミノ酸を欠く組み換え型TL1Aタンパク質を、大腸菌において発現させた。組み換え型TL1A配列をSEQ ID NO:33(QLRAQGEASVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL)によって表わす。
全RNAを冷凍したハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNAをRNAから合成した。その後、PCRを行い、抗体の可変領域(多額及び軽鎖)を増幅させ、その後にこれを標準クローニングベクターへと別個にクローン化し、配列決定した。
使用する物質は、ハイブリドーマ細胞、TRIzol(登録商標)試薬(Ambion, Cat. No. : 15596-026)、及びPrimeScript(商標)1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Cat. No.: 6110A)を含む。
TRIzol(登録商標)試薬の技術マニュアルに従い全RNAをハイブリドーマ細胞から単離した。全RNAをアガロースゲル電気泳動によって分析した。
増幅した抗体フラグメントを、標準分子クローニング手順を使用して、標準クローニングベクターへと別個にクローン化した。
サンプルの単離された全RNAを、図1に示されるように、1.5%のアガロース/GelRed(商標)ゲル上でDNAマーカー、即ちマーカーIII(TIANGEN, Cat. No. : MD103))と並行して実行した(run)。
正確なVH及びVLの挿入サイズを持つ5つの単一コロニーを、配列決定のために送った。5つの異なるクローンのVH及びVLの遺伝子を、ほぼ同一と見出した。重鎖、軽鎖及びCDR領域のためのDNA及びアミノ酸配列を、抗TL1A抗体5C3D11に対応するSEQ ID NO:1-16(表2を参照)で図示する。
全RNAを冷凍したハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNAをRNAから合成した。その後、PCRを行い、抗体の可変領域(多額及び軽鎖)を増幅させ、その後にこれを標準クローニングベクターへと別個にクローン化し、配列決定した。
使用する物質は、ハイブリドーマ細胞;TRIzol(登録商標)試薬(Ambion, Cat. No. : 15596-026);及びPrimeScript(商標)1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Cat. No.: 6110A)を含む。
TRIzol(登録商標)試薬の技術マニュアルに従い全RNAをハイブリドーマ細胞から単離した。全RNAをアガロースゲル電気泳動によって分析した。
増幅した抗体フラグメントを、標準分子クローニング手順を使用して、標準クローニングベクターへと別個にクローン化した。
サンプルの単離された全RNAを、図3に示されるように、1.5%のアガロース/GelRed(商標)ゲル上でDNAマーカー、即ちマーカーIII(TIANGEN, Cat. No. : MD103))と並行して実行した。
正確なVH及びVLの挿入サイズを持つ5つの単一コロニーを、配列決定のために送った。5つの異なるクローンのVH及びVLの遺伝子を、ほぼ同一と見出した。重鎖、軽鎖及びCDR領域のためのDNA及びアミノ酸配列を、抗TL1A抗体9E12E5に対応するSEQ ID NO:17-32(表3を参照)で図示する。
重鎖可変領域(表4)及び軽鎖可変領域(表5)に対するBLASTP 2.2.32+を使用した2つの抗体配列のアライメント比較。
抗ヒトTL1Aモノクローナル抗体9E12E5及び5C3D11は、インビトロでヒトTL1Aの活性を中和する。IFN-γ産生に対するTL1A抗体の効果を評価し、両方のTL1A抗体は、図5に示されるようにTL1Aの阻害がIFN-γ産生を引き起こしたことを実証する。図6に示されるように、MSDプレートをマウスTL1Aで覆い、様々な濃度の5C3D11又は9E12E5でインキュベートして、抗体がマウスTL1Aを認識する能力を評価した。ヒトTL1Aを陽性対照としてインキュベートした。5C3D11は、濃度依存の方式でマウスTL1Aを認識する。5C3D11及び9E12E5の両抗体の結合プロファイルを、TL1AでトランスフェクトしたHEK293細胞株を使用して評価し、トランスフェクトされていない親のHEK293細胞株と比較した。図7に示されるように、HEK293細胞を発現するTL1Aにおける抗TL1Aの抗体の蛍光染色を、トランスフェクトされていない親のHEK293細胞と比較する。抗TL1Aの抗体の結合親和性を、表6に示される解離定数を用いて、Biacoreによって測定した。
大腸炎の動物モデルにおける抗TL1A抗体の効果を実行する。
第1相臨床試験を行い、クローン病を抱える被験体における本明細書に提供された抗TL1Aの抗体の安全性、耐用性、薬物動態学、及び薬動力学を評価する。
第1b相の非盲検臨床試験を行い、クローン病に関連付けられるリスク変異体を持つ患者に対する本明細書に提供される抗TL1Aの抗体の効果を評価する。
第2a相臨床試験を行い、クローン病を抱える被験体における本明細書に提供された抗TL1Aの抗体の効果を評価する。
ヒト化抗TL1A抗体を生成した。簡単に、5C3D11及びヒト生殖細胞系列抗体からのフレームワーク領域のCDRを含む抗体のライブラリを作成した。ヒトTL1A(hTL1A)抗原への親和性を持つ抗体を同定するためのファージディスプレイを使用してライブラリをスクリーニングした。表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して60のクローンの親和性をランク付けした。5つの抗体を、フレームワーク配列の親和性データ及び評価に基づいて選択した:AS12816、AS12819、AS12823、AS12824、及びAS12825。選択されたクローンの配列データを表7(VH)及び表8(VL)に示す。5つの選択されたクローンの親和性データを表9に示す。5つの選択されたクローン(AS12816、AS12819、AS12823、及びAS12824)のうち4つは複数回の親和性測定のために選択され、対応するデータを表10に示す。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用する結合競合アッセイを行い、試験抗TL1A抗体が、本明細書に記載されるあらゆる抗TL1A抗体としてTL1A上で同じ領域に結合するかどうかを評価する。この実施例において、基準抗体は、SEQ ID NO:6-8の重鎖CDR及びSEQ ID NO:14-16の軽鎖CDRを含む。
SPRを使用する別の結合競合アッセイを行い、試験抗TL1A抗体が、本明細書に記載されるあらゆる抗TL1A抗体としてTL1A上で同じ領域に結合するかどうかを評価する。この実施例において、基準抗体は、SEQ ID NO:6-8の重鎖CDR及びSEQ ID NO:14-16の軽鎖CDRを含む。
Claims (12)
- ヒト腫瘍壊死因子様タンパク質1A(TL1A)に結合するヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントであって、ここで、ヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントは、
a)重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、重鎖相補性決定領域2(HCDR2)、および重鎖相補性決定領域3(HCDR3)を含む重鎖可変領域を含み、ここで、
i)HCDR1は、配列番号6のDTYMHである第1アミノ酸配列を含み、
ii)HCDR2は、配列番号7のPASGHである第2アミノ酸配列を含み、及び
iii)HCDR3は、配列番号8のSGGLPDである第3アミノ酸配列を含み、ならびに
b)軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LCDR2)、および軽鎖相補性決定領域3(LCDR3)を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、
i)LCDR1は、配列番号14のASSSVSYMYである第4アミノ酸配列を含み、
ii)LCDR2は、配列番号15のATSNLASである第5アミノ酸配列を含み、及び
iii)LCDR3は、配列番号16のGNPRTである第6アミノ酸配列を含む、ヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントは配列番号5を含む重鎖可変領域及び配列番号13を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- ヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントは、
(i)配列番号35を含む重鎖可変領域及び配列番号40を含む軽鎖可変領域、
(ii)配列番号36を含む重鎖可変領域及び配列番号41を含む軽鎖可変領域、
(iii)配列番号37を含む重鎖可変領域及び配列番号42を含む軽鎖可変領域、
(iv)配列番号38を含む重鎖可変領域及び配列番号43を含む軽鎖可変領域、あるいは、
(v)配列番号39を含む重鎖可変領域及び配列番号44を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項1に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。 - ヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体(dual specific antibody)、二重特異性抗体(bispecific antibody)、又はそれらの組み合わせである、請求項1乃至3の何れか1つに記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 請求項1乃至4の何れか1つに記載の治療上有効な量のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 請求項1乃至4の何れか1つに記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメントをコードする核酸。
- 被験体の炎症性腸疾患の処置に使用するための、請求項1乃至4の何れか1つに記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 炎症性腸疾患はクローン病、潰瘍性大腸炎、あるいは医学的に難治性の潰瘍性大腸炎、又はそれらの組み合わせを含む、請求項7に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 被験体はTL1Aを過剰発現する、請求項7又は8に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 被験体は炎症性腸疾患に関連付けられるリスク変異体を含む、請求項7又は8に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 被験体は、以前に第2の治療薬による処置を受けたことがある、請求項7乃至10の何れか1つに記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
- 第2の治療薬は抗腫瘍壊死因子(TNF)α抗体を含む、請求項11に記載のヒト化抗体又はヒト化抗原結合フラグメント。
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