KR20190105024A - 항-cd47 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD47 및 이의 항체 단편에 대한 신규 항체 및 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 핵산 및 숙주 세포가 이를 포함하고, 그에 관련된 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 치료 및 진단에서 이들 항체 및 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

Description

항-CD47 항체 및 그 용도
본 발명은 인테그린-관련 단백질(IAP)에 특이적으로 결합하는 신규 항체에 관한 것이고, (또한 CD47로 명명됨) 이의 항체 단편 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 추가로 상기 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 핵산 및 숙주 세포는 이를 포함하며, 뿐만 아니라 이에 관련된 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 치료 및 진단에서 이들 항체 및 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
암 면역 요법은 최근 몇년 동안 생물학 분야의 하이라이트이며 CTLA4 항체, PD-1 항체, PD-L1 항체 등의 T 세포 기반 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 치료법이다. 또한, CAR-T, TCR-T 등의 세포 치료제는 최근 몇 년 동안 매우 인기있는 면역 요법이다. 이러한 면역 요법은 T 세포의 기능을 복원하는 방법, 다시 말해 획득 면역 시스템의 역량을 향상시키는 방법에 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나 면역관문억제제를 표적으로 하고 T-세포의 기능을 활성화시킴으로써 획득된 면역 체계의 역량을 향상시킴으로써 암을 정복하기 위한 경로가 여전히 불명확하다. 그럼에도 불구하고, 종양 면역 요법에서 내인성 면역계의 역할은 오랫동안 지속되지 못했다. 실제로, 대식세포는 전체 종양 침윤 영역에 걸쳐 종양 조직에서 약 50%를 나타낸다. 대식세포의 수가 암세포의 예후와 반비례 관계가 있다는 것이 더 중요하며, 이는 종양에서 대 식세포의 매우 중요한 역할을 추가로 입증한다.
두 가지 신호가 대식세포의 식세포(phagocytic) 효과에 필요하다: 하나의 신호는 세포 표면을 목표로 하는 “나를 먹어라” 신호의 활성화이고, 다른 하나는 동일한 표면을 목표로 하는 “나를 먹지마” 신호의 비활성화이다. 신호 중 하나가 없으면 식균 효과의 시작을 유발하기에 충분하지 않다. 증가하는 증거는 CD47이 “나를 먹지마” 신호의 종류에 속하며 대식세포의 표면에서 신호 조절 단백질 α (SIRP α)와 상호 작용하여 대식세포 식세포작용을 억제한다는 것을 보여준다. 종양 세포는 또한 CD47을 발현함으로써 대식세포 식세포작용을 회피할 수 있다(예, EP2242512 및 이 문헌에 인용된 관련 문헌 참조).
CD47은 인테그린 관련 단백질 (IAP)이라고도 하며 면역 글로불린 수퍼 패밀리 구성원이다. CD47은 세포 표면에 광범위하게 발현되며 SIRPα, 트롬보스폰딘-1(TSP1) 및 인테그린과 상호 작용하여 세포 사멸, 증식, 면역 등과 같은 일련의 반응을 매개한다. TSP1은 세포 증식, 성장 및 분화와 관련이 있다. TSP1에 결합하는 CD47은 세포 이동, 세포 증식 및 세포 사멸을 조절하는데 중요한 역할을 하며 혈관 신생 및 염증 반응을 촉진한다. 또한, CD47은 세포 표면에서 자기-인식을 위한 중요한 마커이다. CD47은 대식세포 표면의 SIRP 알파 단백질에 결합하여 단백질의 면역 수용체 티로신 저해 모티프(ITIM)를 인산화시키고, 이어서 SHP-1 단백질을 모집하여 대식세포 식균 작용을 억제하는 일련의 캐스케이드 반응을 일으킨다(예, US9382320 및 그 문헌에 인용된 관련 문헌 참조).
다른 연구 조사에 따르면 거의 모든 종양 세포와 조직이 CD47을 고도로 발현한다. 종양 세포 표면에 많이 발현되는 CD47은 대식세포 표면의 SIRP 알파에 결합함으로써 "나를 먹지마" 라는 신호를 보내줌으로써 종양 조직 침윤 부위의 대식세포가 종양 세포와 조화를 이룰 뿐만 아니라, 또한 종양 내에서 혈관의 증식을 촉진하고, 작동(effector) T 세포의 역할을 억제하여 종양 세포의 증식 및 성장을 촉진한다.
CD47의 활성화 및 손실은 증식을 증가시킬 수 있기 때문에 세포 증식을 촉진하는 데있어 CD47의 역할은 세포 유형에 크게 의존한다. TSP-1에 의한 CD47의 활성화는 인간 U87 및 U373 별아교세포종세포의 증식을 증가시킬 수 있지만, 정상적인 별아교세포는 증가시키지 못한다. 또한, CD47은 자극받지 않은 별아교세포종세포의 증식에 대한 항체의 저해 효과를 차단하지만 정상적인 별아교세포를 억제하지는 않는다. 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았지만 CD47은 PI3K/Akt 경로를 통한 암세포의 증식을 촉진할 수 있지만 정상 세포의 증식을 촉진하지는 못한다(Sick E., Boukhari A., Deramaudt T., Rond
Figure pct00001
P., Bucher B., Andr
Figure pct00002
P., Gies J. P., Takeda K., Activation of CD47 receptors causes proliferation of human astrocytoma but not normal astrocytes via an Akt-dependent pathway, Glia. 2011 Feb, 59 (2): 308-19: 308-19).
CD47 부착은 세포자살(apoptosis) 또는 자가포식(autophagy)을 통해서 많은 정상 및 종양 세포 선의 세포 죽음으로 귀착된다. CD47의 활성화는 T 세포의 빠른 세포자살을 유도한다. Jurkat 세포와 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단클론 항체 Ad22와의 배양은 3시간 이내에 세포 자살을 초래한다. 그럼에도 불구하고 다른 항 CD47 항체와 함께 항온 처리 한 후에 세포 자살은 관찰되지 않았다. 세포 자살을 유도하는 CD47의 기능은 세포 외 도메인상의 특정 에피토프에서의 활성화에 의존하는 것으로 보인다(Pettersen R. D., Hestdal K., Olafsen M. K., Lie S. O., Lindberg F. P. (June, 1999), CD47 signals T cell death, J. Immunol. 162 (12): 7031-40. PMID 10358145).
현재, 다수의 항-CD47 항체가 보고되어 있다. 예를 들어, B6H12 유래의 IgG1 클래스의 인간 키메라 단일 클론 항체 및 CDR-이식에 의해 생성된 인간화 B6H12 항체는 미국 특허 US2015/0183874 A1에 보고되어 있으며, 공지된 항체와 비교하여 낮은 면역원성을 갖는다. 명백한 혈장 응집 반응을 일으키지 않는 항-CD47 항체가 미국 특허 US 9045541호에 보고되어 있고, 공지된 항체와 비교하여 종양 모델에서 상당히 효과적이며, 예를 들어 종양 세포를 탐식하는 대식세포의 능력을 증가시키는데 유용할 수 있다.
SIRPα 에의 CD47 결합을 차단하는 선행 기술에서 알려진 대부분의 항체는 적혈구의 응집을 일으키고 대식세포 식세포 작용을 촉진시키며, 이는 상응하는 항체의 치료 효과를 상당히 약화시킨다.
따라서, 종양 및/또는 암에 대한 다양한 치료법에서, 표적 부위에 대한 특이성이 우수하고 우수한 치료 효능(예를 들어, 대식세포 식세포 작용을 개선시키고, 종양 성장을 억제하며, 심지어 종양의 완전한 소실을 가능하게 한다)을 갖고, 부작용이 적은 항-CD47 항체를 개발할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 측면에서의 요구를 만족시킨다.
본 발명은 항-CD47 항체, 항-CD47 항체와 관련된 조성물, 키트, 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명에서 개발된 항체가 현저한 항-종양 활성을 갖고, 현저히 종양의 성장을 억제할 수 있으며 심지어 종양의 완전한 소멸을 가능하게 한다는 놀라운 발견을 하였다.
일부 실시예에서, 본 발명은 CD47 또는 그의 단편(바람직하게는 인간 CD47 단백질), 또는 그의 항체 단편(바람직하게는 그의 항원 결합 단편)에 결합하는 항-CD47 항체를 제공한다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 중 1 내지 3 개를 포함하거나 그 서열로 구성된다: (i) 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, (ii) 서열 번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 100 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, (iii) 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 102 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 및 (iv) 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (i), (ii) 및 (iii)의 HCDR이고, 변형된 CDR을 포함하는 상기 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 다음의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 중 1 내지 3 개의 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된다: (i) 서열 번호: 23 및 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, (ii) 서열 번호: 25 및 26의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, (iii) 서열 번호: 27, 28, 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3, 및 (iv) 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)의 LCDR이고, 변형된 CDR을 포함하는 상기 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 A) 다음의 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3 개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)이고: (i) 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (ii) 서열 번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 100 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (iii) 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 102 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (iv) 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (i), (ii) 및 (iii)의 HCDR; 및 B) 다음 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR): (i) 서열 번호: 23 및 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, (ii) 서열 번호: 25 및 26의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, (iii) 서열 번호: 27, 28, 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3, 및 (iv) 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)의 LCDR이고, 변형된 CDR을 포함하는 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고; HCDR2는 서열 번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 100 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고; HCDR3은 서열 번호; 17, 18, 19, 20, 21, 22, 102 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 LCDR1은 서열 번호: 23 및 24에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고; LCDR2는 서열 번호: 25 및 26에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 27, 28, 29 및 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, HCDR1은 서열 번호: 98 또는 99로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 100 또는 101에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 102 또는 103에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23 및 24에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25 및 26에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 27, 28, 29 및 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 18에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 20에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 20에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 21에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR2는 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; HCDR3은 서열 번호: 22에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR1은 서열 번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR2는 서열 번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지며; LCDR3은 서열 번호: 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 중쇄 가변 영역 HCVR을 포함한다. 일부 실시예에서, 항-CD47 항체의 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환(예, 보존적 치환), 삽입 또는 결실된 아미노산 서열을 포함하며, 그러나, 상기 HCVR을 포함하는 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 54, 55, 57 및 58에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 경쇄 가변 영역 LCVR을 포함한다. 일부 실시예에서, 항-CD47 항체의 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 54, 55, 57 및 58에 나타낸 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환(예, 보존적 치환), 삽입 또는 결실된 아미노산 서열을 포함하며, 그러나, 상기 LCVR을 포함하는 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 54, 55, 57 및 58에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 44에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 54에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 45에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 54에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 46에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 54에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 47에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 55에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 48에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 55에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 49에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 55에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 50에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 57에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 57에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 52에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 58에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열 번호: 53에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열 번호: 58에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 서열 번호: 74, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시예에서, 상기 항-CD47의 중쇄는 서열 번호: 74, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환(예, 보존적 치환), 삽입 또는 결실된 아미노산 서열을 포함하며, 그러나, 상기 중쇄를 포함하는 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 서열 번호: 75, 79, 83 및 86에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시예에서, 상기 항-CD47의 경쇄는 서열 번호: 75, 79, 83 및 86로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환(예, 보존적 치환), 삽입 또는 결실된 아미노산 서열을 포함하며, 그러나, 상기 중쇄를 포함하는 항-CD47 항체는 여전히 CD47에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 74, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75, 79, 83 및 86에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 74에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 76에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 77에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 80에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 81에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 84에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 85에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 86에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 87에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 86에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 89에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 90에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 91에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 92에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 93에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 94에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 95에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 96에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 86에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 97에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 86에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 또한 항-CD47 항체의 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, CD47에의 결합에 대해 상기 기재된 항체 중 임의의 항체와 경쟁하는 항체, 및 상기 항체 중 임의의 것과 동일한 CD47 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
일 실시예에서, 항-CD47 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시예에서, 항-CD47 항체는 인간화된다. 일부 실시예에서, 항-CD47 항체는 인간 항체이다. 일부 실시예에서, 항-CD47 항체의 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다. 한 실시예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 또한 이의 항체 단편을 포함하고, 바람직하게는 다음의 항체 단편: Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab’)2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 SIRPα에 대한 CD47 결합을 차단하는 차단 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시예에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 한 실시예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 한 실시예에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 실시예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 효모 세포, 포유 동물 세포 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기에 적합한 다른 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 원핵 세포였다.
일 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 그의 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 항체 또는 그의 단편(바람직하게는 상기 항원-결합 단편)을 코딩하는 핵산을 발현시키는데 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 상기 항체 또는 그의 단편(바람직하게는 상기 항원-결합 단편)을 단리하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 항-CD47 항체 또는 그의 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 항-CD47 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편 (바람직하게는 이의 항원-결합 단편)을 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 약학적 조성물로서 작용하는 조성물이다. 한 실시예에서, 조성물은 또한 약제학적 담체를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 환자에서 SIRPα에 대한 CD47 결합을 억제하는 방법에 관한 것으로, 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 본원에서 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로, 환자에서 SIRPα에 대한 CD47 결합을 억제하기 위한 조성물 또는 약물의 제조에 있어서, 본 발명에 개시된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 환자에서 대식세포 식세포작용을 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 본 명세서의 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 환자에서 대식세포 식세포작용을 촉진하기 위한 조성물 또는 약물을 제조하는데 있어서 본원에 개시된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다. 일 실시예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 대조군과 비교하여 대식세포의 식세포작용을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 이상 증강시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 CD47-관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 본원에서 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로, 환자에서 CD47-관련 장애를 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서, 본원에 개시된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
일부 실시예에서, CD47-관련 장애는 다양한 혈액학적 질환 및 고형 종양이며, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 림프종, 유방암, 위암, 폐암, 식도암, 장암, 난소 암종, 자궁 경부암, 신장암, 췌장암, 방광암, 신경교종, 흑색 종 및 기타 고형 종양을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 CD47이 표적이 되는 종양에 대한 면역 요법 방법에 관한 것으로, 본원에 개시된 유효량의 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서 본원에 개시된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 CD47 활성을 제거, 억제 또는 감소시킴으로써 개선, 지연, 억제 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 또한 병용 요법으로 종양을 치료하는 방법에 관한 것으로, 본원에 기재된 유효량의 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편 및 하나 이상의 다른 약제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 방법은 환자에게 유효량의 제2 의약을 동시 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 본원에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 단편은 제1 약물이다. 일 실시예에서, 제2 약물은 관련된 질병을 치료하기 위한 화학 요법제, 방사선 요법제 또는 생체 고분자 약물이다. 일 실시예에서, 생체 고분자 약물은 예를 들어, 리툭시맙, 세툭시맙 및 트라스투주맙과 같은 T 세포에 의한 인식을 통해 종양 세포를 공격하는 다양한 모노클로날 항체 약제이다. 본원에서 사용된 "제2 약물"이라는 표현은 제1 약물 이외의 한 종류의 의약으로 해석될 수 없다. 따라서, 제2 의약은 하나의 의약일 필요는 없지만, 그러한 의약을 하나 이상 구성하거나 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 환자 또는 개체는 포유 동물, 바람직하게는 인간이다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 대식세포 식세포작용을 촉진하는데 효과적일 수 있다.
하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 놀랍게도 대조 항체와 비교하여 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
보다 바람직한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 종양의 완전한 퇴행을 가능하게 하는데, 이는 완전히 예상하지 못했고, 당해 기술 수준에서 결코 보고된 적이 없다.
일 측면에서, 본 발명은 샘플에서 CD47 단백질을 검출하는 방법에 관한 것으로, (a) 샘플을 본원에 기재된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CD47 단백질 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, CD47은 인간 CD47이다. 일 실시예에서, 검출 방법은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 방법일 수 있다. 일 실시예에서, 항-CD47 항체는 항-CD47 항체로 치료하기에 적합한 환자를 선별하는데 사용된다. 일 실시예에서, 항-CD47 항체는 검출 가능하게 표지된다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양 치료의 효능을 결정하는 방법에 관한 것으로, 치료 전후의 환자로부터의 샘플에서 CD47-발현 암세포의 수를 측정하는 단계를 포함하고, CD47-발현 암 세포 수가 감소한 것은 치료가 효과적이라는 것을 나타낸다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 실시예의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 실시예 또는 이의 임의의 조합은 본원에 기술된 본 발명의 각각의 항-CD47 항체 또는 그의 단편, 방법 및 용도에 적용 가능하다.
본원에 개시된 항체는 혈액 세포의 응집을 현저히 감소시키고, 결과적으로 임상 치료 패러다임에서 유의하게 감소된 부작용을 초래할 수 있고 다양한 암의 치료에 광범위하게 사용될 수 있다.
도 1은 세포 수준에서 효모에서 생산된 IgG1 형태에서 항-CD47 항체에 대한 유동 세포 계측법을 이용한 친화도 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 유동 세포 계측법으로 분석된 바와 같이 효모 세포에서 생성된 IgG1 형태의 본 항체에 의한 CHO 세포에 발현된 CD47에 대한 SIRPα 결합의 차단을 나타낸 것이다.
도 3은 유동 세포 계측법으로 분석한 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체에 의한 CHO 세포에 발현된 CD47에 대한 SIRPα 결합의 차단을 나타낸 것이다.
도 4는 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 효모 세포에서 생산된 IgG1 형태에서의 본 항체능 검출을 나타낸 것이며, 항체는 효모 세포에서 생산된 IgG1 형태의 항체-친화도-성숙 항체 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341 및 ADI-29349를 포함한다.
도 5는 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 효모 세포에서 생성된 본 IgG1 항체능 검출을 나타낸 것이다.
도 6은 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태에서의 본 항체의 능력 검출을 나타낸 것이다.
도 7은 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체능 검출을 나타낸 것이며, ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341 및 ADI-29349 및 ADI-29371를 포함한다.
도 8은 마우스 모델(NOD/SCID Raji 종양 모델)의 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체 ADI-26630의 항-종양 활성에 대한 연구를 나타낸 것이다. 도 8b는 도 8a의 부분 확대도이다.
도 9는 마우스 모델(NOD/SCID Raji 종양 모델)에서 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체 ADI-26624의 항-종양 활성에 대한 연구를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 모델(NOD/SCID Raji 종양 모델)에서 0.5 mg/kg의 투여량으로 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체 ADI-26630, ADI29340 및 ADI29341의 항-종양 활성에 대한 연구를 나타낸 것이다.
도 11은 마우스 모델(NOD/SCID Raji 종양 모델)에서 5 mg/kg의 투여량으로 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 본 항체 ADI-26630, ADI29340 및 ADI29341의 항-종양 활성에 대한 연구를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 항-CD47 항체의 활성을 검출하여 RBC 응집 활성을 촉진시킨 결과를 나타낸 것이다.
1.1 정의
본 발명이 하기에 상세히 설명되기 전에, 본 발명은 다양 할 수 있기 때문에, 본원에 기술 된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예 만을 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
명세서의 해석을 위해 다음과 같은 정의가 적용되며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 복수형을 포함할 수 있으며 그 반대의 경우도 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며 단지 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
수치의 조합에 사용된 용어 "약"은 특정 수치보다 5% 낮은 하한에서 지정된 수치보다 큰 상한까지 5% 범위의 수치를 포함하는 것으로 의도된다.
"보존 치환"이라는 용어는 동일한 부류의 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환, 예를 들어 다른 산성 아미노산에 의한 산성 아미노산의 치환, 다른 염기성 아미노산에 의한 염기성 아미노산의 치환 및 다른 중성 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환. 예시적인 치환체를 하기 표에 나타내었다:
원래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포함한다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 특정 환경에서는 보다 적은 사슬, 예를 들어, 낙타의 자연 발생 항체는 중쇄만을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 잔기"는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 잔기를 나타낸다. 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 기타 천연 분자(예: 수용체, 리간드) 또는 합성 분자(예: DARPin)를 말한다. 하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 잔기는 항체 단편이다.
본원에서 용어 "전장 항체", "온전한 항체"및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환하여, 본래의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조를 말하며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되지 않아야한다. 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어 CDR 이식, 또는 당 업계에 공지된 그러한 기술 또는 다른 기술의 조합에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합" 및 "특이적으로 결합하는"은 시험관 내 분석에서, 바람직하게는 정제된 야생형 항원을 사용하는 바이오 광 간섭계(ForteBio)에서 항원 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원-결합 잔기이다. 특정 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 잔기는 단백질 및/또는 거대 분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM과 같은 "클래스"로 분류되며, 이들 클래스 중 몇 개는 하위 클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 분류된다. 다른 종류의 항체에 해당하는 중쇄 불변 영역을 α, δ, ε, γ 및 μ라고 칭한다. 5개의 모든 클래스의 항체에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)은 카파(kappa) 및 람다(lambda)로 지칭된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 전형적으로 약 12개 이상의 아미노산의 "J"영역에 의해 결합되고 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산의 "D"영역을 포함한다. 예를 들어, 기초 면역학 Ch.7(Paul, W. Ed., 2nd Edition, Raven Press, N.Y.(1989))을 참고한다(이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원-결합 부위를 형성한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 결합하는 항체에 포함되는 항체의 도메인을 나타낸다. 본래 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역을 포함한다.(Kindt 등, Kuby 면역학, 6th Edition, W.H. Freeman and Co., p.91 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하여 각각, 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano, et al., J. Immunol. 150 : 880-887 (1993); Clarkson, et al., Nature 352 : 624-628 (1991)을 참고한다.
가변 영역은 전형적으로 3개의 과가변(hypervariable) 영역에 의해 결합된 상대적으로 보존 된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타내고, 후자는 또한 상보성 결정 영역 또는 CDR을 칭한다. 일반적으로, 각 쌍으로부터의 2개의 쇄의 CDR은 프레임 워크 영역에 의해 정렬되고, CDR은 에피토프에 대한 특이적 결합을 가능하게 한다. N 말단에서 C 말단까지, 2개의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR" 또는 "과 가변 영역"(과 가변 영역 "HVR"과 상호 교환하여 사용될 수 있음)은 주로 항체 가변 영역의 아미노산 영역이며, 항원의 에피토프에 결합한다. 중쇄 및 중쇄 CDR은 전형적으로 N 말단으로부터 순차적으로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 불린다. 항체의 중쇄 가변 도메인에 위치한 CDR을 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라 하고, 항체의 경쇄 가변 도메인에 위치한 CDR을 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라 한다.
주어진 VH 또는 VL의 CDR 서열을 동정하기 위한 방법 및 기술은 당 업계에 공지되어 있다: 카밧(Kabat) 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 변이성에 기초하여 확인되며, 가장 일반적으로 사용되고(Kabat 등, Immunological Interest의 단백질 서열, 공중 보건 서비스, 국립 보건원, 베데스다, 메릴랜드 (1991)),
Chothia 정의는 구조 루프(Chothia, 등 (1987) J. Mol. Biol., 196 : 901-917, Chothia, et al. (1989) Nature 342 : 877-883), AbM HVR Kabat HVRs와 Chothia 구조 루프 사이의 절충안이며 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용되는 "접촉"(Contact) HVR은 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석에 기초한다. CDR을 확인하기 위한 다른 협약에 따르면, 이들 HVR의 HVR/CDR 잔기 각각은 다음과 같이 기술된다.
CDR Kabat 정의 AbM 정의 Chothia 정의 접촉 정의
LCDR1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
LCDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
LCDR3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
HCDR1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat 번호 매기기 시스템)
HCDR1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia 번호 매기기 시스템)
HCDR2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
HCDR3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
(Kabat 번호 매기기 시스템)
일 실시예에서, 본 발명의 항체의 CDR은 Kabat 번호 매기기 시스템에 따라 아래의 카밧 (Kabat) 잔기 위치에 위치하는 CDR 서열을 갖는다:
VL에서 위치 24-34(LCDR1), 위치 50-56(LCDR2) 및 위치 89-97(LCDR3), VH에서 위치 27-35(HCDR1), 위치 50-65(HCDR2) 및 위치 93-102(HCDR3).
CDR은 또한 기준 CDR 서열(예를 들어, 본 발명의 예시적인 CDR 중 하나)과 동일한 카밧 번호를 갖는 위치에 기초하여 동정될 수 있다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예: 항체)와 그의 결합 파트너(예: 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용될 때, "결합 친화력"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1 : 1 상호 작용을 반영하는 내재적 결합 친화력을 나타낸다. 분자 X의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 것들을 포함하여 당 업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다.
동일한 항원 결정기와 경쟁하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 중화 항원-결합 단백질 또는 중화 항체)과 관련하여 사용될 때 "경쟁"이라는 용어는 아래의 분석에 의해 결정되는 항원-결합 단백질 간의 경쟁을 의미한다: 분석에서 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 그의 면역학적 기능)은 표준 항원-결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 기준 항체)의 공통적인 결합에 대한 특이적인 결합을 방지 또는 저해(예를 들어, 감소시킴) 항원(예: CD47 또는 그 단편). 항원 결합 단백질이 다른 단백질과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 다수의 경쟁적 결합 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 분석은 고체상 직접 또는 간접 방사 면역 분석법(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역 분석법(EIA), 샌드위치 경쟁 분석법(Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253 ). 전형적으로, 분석은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 시험될 표지되지 않은 항원-결합 단백질 및 표지된 항원-결합 단백질 중 하나가 로딩된 세포의 사용을 포함한다. 경쟁적 저해는 시험하고자 하는 항원-결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로 시험할 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석(경쟁 항원-결합 단백질)에 의해 동정된 항원-결합 단백질은 다음을 포함한다: 기준 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질; 2개의 에피토프의 상호 입체 장애를 야기하기 위해 기준 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가 세부 사항은 본 명세서의 실시예에 제공된다. 일반적으로, 초과하여 존재할 때, 경쟁하는 항원-결합 단백질은 공통 항원에 대한 기준 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상 저해(예를 들어, 감소)시킬 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% 또는 97% 이상 저해된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩하는 서열을 이용하는 비-인간 원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명시적으로 배제한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역 글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크를 의미한다. 일반적으로, 인간 면역 글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브 타입으로부터의 선택이다. 일반적으로 서열의 아형은 Kabat 등의 Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols 1-3에 있는 것이다. 일 실시예에서, VL에 대해, 아형은 Kabat et al.에서와 같이 아형 카파(kappa) I이다(위 참조). 일 실시예에서, VH에 대해, 아형은 Kabat et al.에서와 같이 아형 카파 III이다(위 참조).
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 일부 실시예에서, 인간화 항체는 HVRs (예: CDRs)의 전부 또는 실질적으로 모두가 비-인간 항체의 그것과 상응하는 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것들과 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. "인간화된 형태"의 항체, 예를 들어, 비인간 항체는 인간화된 항체를 말한다.
용어 "디아바디(diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 매우 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬의 두 도메인 간에 쌍을 형성할 수 있게 함으로써 이 도메인은 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 두 개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson, et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); 및 Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에 더 자세하게 기재되어있다. Tribodies 및 Terabody는 또한 Hudson, et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003)에 기재되어 있다.
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하고 항체 아이소타입에 따라 변하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체의 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포 독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B-세포 활성화.
용어 "유효량"및 "치료학적 유효량"은 단일 또는 다중 투여량으로 환자에게 투여된 후 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양 또는 투여량을 지칭하며, 환자의 장애의 개선(예를 들어, 하나 이상의 증상의 개선) 및/또는 증상의 지연된 진행을 포함하여, 치료된 환자에서 예상되는 효과를 생성한다. "유효량"및 "치료학적 유효량"은 또한 CD47 신호를 감소시키기에 충분한 양을 의미 할 수 있고(예: Yamauchi, et al., 2013 Blood, Jan 4; Soto-Pantoja, et al., 2013 Expert Opin Ther Targets, 17 : 89-103, Irandoust, et al., 2013 PLoS One, Epub Jan 8, Chao, et al., 2012 Curr Opin Immunol, 24 : 225-32, Theocharides, et al., 2012 J Exp Med, 209 10) : 1883-99를 참고한다), 예를 들어, 대식세포에서 CD47/SIRPα 신호 전달 축상의 CD47/SIRPα 사이의 상호 작용으로부터 생성된 식세포작용을 저해하기 위한 신호를 감소시키기에 충분한 항체의 양, 즉 본 발명의 항체는 CD47-발현 세포의 대식세포-식세포작용을 촉진한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항-CD47 항체의 유효량은 대조군에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 대식 세포 식세포작용을 증진/증가시킬 수 있다.
치료학적 유효량은 다음의 다양한 요인을 고려하여 당업자가 담당 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다: 포유 동물의 종; 크기, 연령 및 일반적 건강 상태; 관련된 질환; 질환의 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여된 특정 항체; 투여 방식; 투여된 제제의 생체 이용률 프로파일; 선택된 용량 요법; 및 병행 요법 등의 사용.
전술한 바와 같이, 특정 상황에서, 항체와 그의 표적 항원 사이의 상호 작용은 표적의 기능성을 간섭할 것이다. 또한, 요구되는 투여량은 항원의 그것의 특정 항원에 대한 결합 친화도에 의존할 뿐만 아니라, 투여 환자에 주어진 항체의 제거율에 의존한다. 비-제한적인 예로서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량은 전형적으로 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중의 범위이다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 항체는 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg, 100mg/kg 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 일반적인 투여 빈도는 예를 들어 하루 2회에서 1 주일에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월마다 1회, 1년에 1회 등의 범위이다.
본원에서 사용된 용어 "차단"은 본 발명의 항체의 존재 하에 감소된 CD47 신호 전달을 나타낸다. CD47-매개 신호 전달의 차단은 본 발명의 항-CD47 항체의 존재 하에 CD47 신호 전달 수준이 대조 CD47 신호 전달 수준(즉, 본 발명의 항체가 없는 CD47 신호 전달 수준)보다 낮다는 것을 의미하며, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%과 같거나 큰 감소된 범위이다. CD47 신호 전달 수준은 하류 유전자의 활성화 및/또는 CD47에 반응하는 활성화를 측정하는 루시퍼라제 리포터 (luciferase reporter) 분석과 같은 많은 표준 기술로 측정할 수 있다. 당업자라면 CD47 신호 전달 수준이 많은 테스트를 통해 측정될 수 있다는 것을 이해할 수 있고, 예를 들어 시중에서 구입할 수 있는 키트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주"및 "숙주 세포 배양"은 상호 교환하여 사용되며, 이 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질 전환된 세포"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질 전환된 세포 및 그로부터 파생된 자손이 계대의 수에 관계없이 포함된다. 자손은 핵산이 부모 세포와 완전히 동일하지는 않지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래 형질 전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
용어 "세포 독성제"는 본원에서 세포 기능을 억제 또는 방지하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 용어는 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"면역 접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이며, 이에 한정되는 것은 아니지만 세포 독성제를 포함한다.
"개체" 또는 "환자"에는 포유류가 포함된다. 포유류는 가축(예: 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예: 인간 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시예에서, 개체 또는 환자는 인간이다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 항체이다. 일부 실시예에서, 항체는 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제되며, 예를 들어, 전기 영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기 영동(IEF), 모세관 전기 영동) 또는 크로마토그래피(예: 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해, 예를 들어, Flatman et al., J. Chromatogr. B848 : 79-87 (2007)를 참조한다.
"단리된" 핵산은 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 포함하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함하며, 핵산 분자는 염색체 외 위치 또는 자연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재한다.
"항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산"은 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하며, 단일 벡터 또는 개별 벡터에 존재하는 그러한 핵산 분자 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 그러한 핵산 분자를 포함한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 기준 폴리 펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율은 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당 업계의 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있으며, 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한다.
본원에서 서열 동일성의 백분율을 언급할 때, 특히 백분율을 달리 지정하지 않는 한, 이 백분율은 보다 긴 서열의 완전 길이에 대해 계산된다. 보다 긴 서열의 완전한 길이에 대한 계산은 핵산 및 폴리펩티드 서열 모두에 적용 가능하다.
용어 "적혈구"와 "RBC"는 동의어이며 서로 바꿔서 사용할 수 있다.
용어 "응집"은 세포 덩어리를 의미하며, "혈구 응집 반응(hemagglutinating reaction)"이란 세포의 특정 부분(즉, 적혈구)의 응집을 의미한다. 결과적으로, 혈구 응집 반응은 응집 반응의 한 형태이다.
1.2 본 발명의 항-CD47 항체
용어 "인테그린-관련 단백질(IAP)"및 "CD47"은 본원에서 사용될 때 임의의 척추 동물 공급원으로부터의 임의의 본래의 CD47을 지칭하며, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)와 같은 포유 동물을 포함하는 다른 동물을 의미한다. 상기 용어는 "전장(full-length)", 미처리된 CD47 및 임의의 형태의 CD47 또는 세포에서의 처리로 인한 임의의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 CD47의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립 변이체를 포함한다.
용어 "항-CD47 항체", "항-CD47", "CD47 항체" 및 "CD47에 결합하는 항체"는 충분한 친화도를 갖는 CD47 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 항체를 지칭하며, 항체는 CD47을 표적화하는 진단 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 비-관련 CD47 단백질에 대한 항-CD47 항체의 결합 범위는, 예를 들어, 방사 면역 측정법(RIA)에 의해 측정된 항체의 CD47에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공되는 항-CD47 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, or ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8M 또는 10-8M이하, 예를 들어, 10-8M부터 10-13M까지, 10-9M부터 10-13M까지)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(예를 들어, FR에서) 발생한다. 다르게는, 본 발명의 항-CD47 항체는 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 또는 중쇄상의 번역 후 변형을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 저해 활성을 나타내며, 예를 들어, CD47 발현 억제(예를 들어, 세포 표면에서 CD47 발현을 억제), 활동 및/또는 신호 전달, 또는 CD47과 SIRPα 사이의 상호 작용을 방해한다. 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 CD47에 결합하거나 CD47과 상호 작용한 후(예: 인간 CD47) 완전 또는 부분적으로 감소되거나 조절된 CD47 발현 또는 활성을 초래한다. CD47의 생물학적 기능은 항체와 인간 CD47 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 간의 상호 작용 후에 완전히, 상당히 또는 부분적으로 감소되거나 조절된다. 본원에 기재된 항체의 존재 하에 CD47 발현 또는 활성 수준이 항체와의 상호 작용(예: 결합)이 없는 상태에서의 CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여 적어도 95%(예를 들어, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 만큼) 감소될 때, 항체는 CD47 발현 또는 활성을 완전히 저해할 수 있다고 여겨진다. 본원에 기술된 항-CD47 항체의 존재 하에 CD47 발현 또는 활성의 수준은 수준의 항-CD47 항체에 대한 결합이 없는 상태에서의 CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여 적어도 50%(예를 들어, 55%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90%만큼) 감소되면, 항-CD47 항체는 CD47 발현 또는 활성을 현저하게 억제할 수 있는 것으로 간주된다. 본원에 기술된 항체의 존재 하에 CD47 발현 또는 활성 수준은 항체와의 상호 작용이 없는(예: 결합) CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여 95% 미만(예를 들어, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75% 80%, 85% 또는 90% 만큼) 감소되면, 항체는 CD47 발현 또는 활성을 부분적으로 저해할 수 있다고 간주된다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예: 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예: 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 시스테인 조작된 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "thioMAbs,"를 포함한다.
특정 실시예에서, 본원에서 제공된 항체는 당 업계에 공지되어 있고 용이하게 입수할 수 있는 기타 비-단백질성 잔기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리 아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리 프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예: 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명은 항-CD47 항체의 단편을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예: scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 단일 항원-결합 부위 및 잔류 "Fc"단편을 가지며, 그의 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 F(ab') 2단편을 생성하고, 여전히 항원을 교차-결합시킬 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당 업계에 공지 된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol 20: 450-459 (2008)에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이들 라이브러리에서 스크리닝하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 Hoogenboom, et al., in: Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O′ Brien, et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), 및 McCafferty, et al., Nature 348 :552-554; Clackso, et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks, et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in: Methods in Molecular Biology 248: 161-175(Lo, Ed., Human Press, Totowa, N J, 2003); Sidhu, et al., J. Mol. Biol.338 (2): 299-310 (2004); Lee, et al., J. Mol. Biol 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); and Lee et al, J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004)에 추가적으로 기술되어 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중특이성, 이종으로 접합된, 다중특이성, 재조합, 이종의, 이종으로 혼성된, 키메라, 인간화(특히 CDR 이식), 탈 면역화된, 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리로부터 생산된 단편, Fd, Fv, 디설파이드-결합된 Fvs (dsFvs), 단일 쇄 항체(예: scFv), 디바디(dibodies) 또는 테라바디(terabodies) (Holliger P., et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (14), 6444-6448), 나노 바디(단일 도메인 항체라고도 함), 항-이디오 타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함) 및 상기 언급된 임의의 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 모노클로날 항체는 표적 폴리펩타이드상의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147: 60-69을 참조한다. 모노클로날 항-CD47 항체는 다른 기능성 분자(예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합되거나 공동 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 다른 분자에 기능적으로(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로) 결합될 수 있으며, 이중- 또는 다중-특이적 항체를 생성하는 것은 둘 이상의 결합 특이성을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 인간 CD47 단백질에 결합한다.
1.3 본 발명의 핵산 및 이를 포함하는 숙주 세포
한 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열, 또는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
일 실시예에서, 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다. 일 실시예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
일 실시예에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 박테리아에서, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523; 및 또한 Charlton, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, N J (2003), p. 245-254, 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기술함)를 참고한다. 발현 후, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
일 실시예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 실시 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포, 포유 동물 세포 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기에 적합한 다른 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코 실화 경로가 "인간화"된 곰팡이 및 효모 균주를 포함하여 항체-인코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 부분적으로 또는 완전히 인간의 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래한다. Gerngross, Nat. 생명 공학 22 : 1409-1414 (2004)] 및 [Li, et al., Nat. 생명 공학 24 : 210-215 (2006)를 참고한다. 발현 글리코실화 항체에 적합한 숙주 세포도 다세포 생물(무척추 동물과 척추 동물)에서 파생된다. 척추 세포도 숙주로 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주를 사용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, Graham 등, J. Gen Virol., 36 : 59 (1977)에 기술된 것과 같은 293 또는 293T 세포)이다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 예는 중국 햄스터 난소(CHO)를 포함하고; DHFR-CHO 세포(Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 216 (1980))를 포함하고; 및 Y0, NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주이다. 항체 생산에 적합한 특정 포유 동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, Yazaki and Wu, In : Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, (Ed.), Humana Press, Totowa, NJ), p. 255-268 (2003)를 참고한다.
일 실시예에서, 항-CD47 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계 및 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 항-CD47 항체의 재조합 생산을 위해, 항체, 예를 들어 상기 기술된 항체를 코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 단리되고 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이 적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써)를 사용하여 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다.
1.4 약학적 조성물 및 약학적 제제
본 발명은 추가로 CD47 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편에 결합하는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 약학적 조성물은 담체, 부형제 및 병용-투여를 위한 제제에 적합한 다른 제제로 제형 화되어 이전, 전달, 내성 등이 개선될 수 있음을 이해해야 한다.
용어 "약학적 조성물"은 제제에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하는 제제를 의미하며, 제제가 투여될 환자에게 받아들일 수 없을 만큼 독성이 있는 부가적인 성분을 포함하지 않는 제형이다.
용어 "약제학적 담체"는 희석제, 보조제(예, 프로인드 보조제(완전한 또는 불완전한)), 부형제 또는 치료제가 투여되는 운반체를 의미한다.
본원에서 사용되는 "치료"는 기존의 증상, 장애, 상태 또는 질병의 진행 또는 중증도를 경감, 중단, 지연, 완화, 중지, 감소 또는 회복시키고 해당 질병의 재발을 피하는 것을 의미한다.
일부 실시예에서, 본 발명은 세포 독성제 또는 면역억제제("면역 접합체")와 같은 치료용 모듈에 접합된 항-CD47 모노클로날 항체를 포함한다. 세포 독성 물질에는 세포에 해로운 임의의 치료법이 포함된다. 면역 접합체(예를 들어, 화학 요법제)의 형성에 적합한 세포 독성 제의 예는 당 분야에 공지되어 있다. 예로, WO05/103081을 참고한다. 예를 들어, 세포 독성제는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 방사성 동위 원소(예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, pb212 및 Lu의 방사성 동위 원소); 화학 요법제(예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 마이토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 끼어들기 약물); 성장 억제제; 핵산 분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소 (이들의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 다양한 항종양 또는 항암제가 알려져 있다.
본 발명은 항-CD47 항체(약학적 조성물 또는 약학적 제제 포함) 및 항-CD47 항체를 코딩하는 폴리 핵산을 포함하는 조성물을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 조성물은 CD47에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 CD47에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리 핵산을 포함한다. 이러한 조성물은 완충제를 비롯한 당 분야에 공지된 약학 부형제와 같은 적합한 약제학적 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 이들 약학적 조성물은 진단 키트와 같은 키트에 포함될 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 약제학적 담체는 땅콩 유, 대두유, 광유, 참깨 유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 것들을 포함하는 물 및 오일과 같은 무균 액체일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 염분 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 분필, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 부형제의 용법 및 그의 용도에 대해서는, “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 5th Edition, R.C.Rowe; P.J.Seskey and S.C.Owen, Pharmaceutical Press,London, Chicago을 참고한다. 조성물은, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할수 있다. 구강 제형은 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트 및 당류의 약학 등급과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 항-CD47 항체를 포함하는 약제 학적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 본 발명의 항-CD47 항체를 하나 이상의 임의의 약제학적 담체와 혼합함으로써 제조 될 수 있고(Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th, Osol, A. Ed. (1980)), 바람직하게는 동결 건조 제제 또는 수용액의 형태로 존재할 수 있다.
예시적인 동결 건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586호 및 WO 2006/044908에 기술된 것을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 제형은 치료되는 특정 징후에 필요한 만큼의 하나 이상의 활성 성분을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상호 작용에 악영향을 미치지 않는 보완적인 활성을 갖는 것들이다. 예를 들어, 스타틴 또한 이상적으로 제공된다. 활성 성분은 관심사의 사용에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형된 물품이며, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐이다.
1.5 항체를 이용한 치료 방법 및 그 용도
일 측면에서, 본 발명은 환자의 SIRPα에 대한 CD47 결합을 억제 및/또는 길항( antagonizing)하는 방법에 관한 것으로, 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 식세포의 식세포작용을 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 CD47이 치료 표적인 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 단편을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 SIRPα에 대한 CD47 결합을 제거, 억제 또는 감소시킴으로써 개선, 지연, 억제 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 장애의 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 암 또는 종양의 증상을 경감시키고, 환자의 암 또는 종양의 재발을 피하기 위해, 치료를 필요로 하는 개체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 환자에게 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 환자에서 비정상적인 CD47 발현, 활성 및/또는 신호 전달과 관련된 질환 및 장애의 진단, 예후, 모니터링, 치료, 완화 및/또는 예방을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 표준 분석을 사용하여 환자에서 비정상적인 CD47 발현, 활성 및/또는 신호 전달과 관련된 질병 및 장애의 존재를 확인하는 경우, 본원에 개시된 항-CD47 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 투여해야 한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 관련 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약물을 제조 또는 제조하는데 있어서의 항-CD47 항체의 용도를 제공한다.
특정 실시예에서, 본원에 기술된 방법 및 용도는 유효량의 적어도 하나의 부가적인 치료제, 예를 들어 화학 요법제, 방사선 요법제 또는 생체 고분자 약물을 상기 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시예에서, 생체 고분자 약물은 예를 들어 리툭시맙, 세툭시맙 및 트라스투주맙과 같은 T 세포에 의한 인식을 통해 종양 세포를 공격하는 다양한 모노클로날 항체 약제이다.
상기 언급된 병용 요법은 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 개별 제형에 포함됨) 및 별도의 투여를 포함하고, 본 발명의 항-CD47 항체의 투여가 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 투여 후에 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 항체(및 부가적인 치료제 중 임의의 것)는 비경구, 폐내 및 비강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료를 위해 필요하다면 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 투여의 단기간 또는 장기간의 특성에 따라 적절한 경로, 예컨대 주사를 통한 정맥 내 또는 피하 주사를 통해 이루어질 수 있다. 다양한 시간-지점에서의 단일 또는 다중 투여, 볼러스(bolus) 투여 및 맥박 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 투여 스케쥴이 본 명세서에서 고려된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 환자의 임상 기록 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 달려있다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체는 생체 내 또는 시험 관내에서 CD47-관련 질환에 대한 치료 과정을 검출하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 질병 치료 또는 증상 경감을 위한 특정 요법이 효과적인지 여부는 CD47-발현 세포(예를 들어, 암세포)의 증가 또는 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다.
대부분의 항-CD47 항체는 인간 적혈구의 혈장 응집 반응을 유도하는 것으로 보고되었다. 혈구 응집은 동형의(homotypic) 상호 작용의 한 예이며, 2가 CD47 결합 실체를 이용한 처리는 2개의 CD47-발현 세포의 응집 또는 응집을 유도한다. 예를 들면, 전체 IgG 또는 F (ab')2로서의 항-CD47 항체 MABL은 적혈구의 적혈구 응집 반응을 가능하게 하고, MABL이 scFv 또는 2가의 scFv로 변형된 경우에만 약화되었다(예: Uno S, Kinoshita Y, Azuma Y, et al., Antitumor activity of a monoclonal antibody against CD47 in xenograft models of human leukemia, Oncol Rep 2007; 17:1189-94; Kikuchi Y, Uno S, Yoshimura Y, et al., A bivalent single-chain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells, Biochem Biophys Res Commun 2004; 315: 912-8). 다른 알려진 항-CD47 항체(B6H12, BRC126 및 CC2C6 포함)는 또한 적혈구의 응집 반응을 일으킬 수 있다. 결과적으로, 세포의 응집은 치료적으로 기존의 전체 IgG 항체로 CD47을 표적으로 하는 것에 대한 주요 제한이다.
CD47과 SIPRα의 상호 작용을 차단하여 식세포작용을 촉진시키는 당해 기술 분야에 개시된 대부분의 항체가 세포의 명백한 응집을 유도한다는 것을 고려할 때, 효과적으로 대식세포 식세포작용을 촉진할 뿐만 아니라 세포의 응집을 일으키지 않는 신규한 항-CD47 항체에 대한 여전히 큰 필요성이 존재한다. 이러한 관점에서의 필요성은 본원에 개시된 항-CD47 항체에 의해 충족되며, 이는 식세포작용을 촉진하는데 효과적일 뿐만 아니라 항-종양 성장 및 종양 제거의 우수한 효과를 발휘할 뿐만 아니라, 치료 효과를 발휘하면서 명백한 세포 응집을 일으키지 않으므로 부작용이 현저히 감소된다.
당업자는 예를 들어, RBC의 혈구 응집 반응과 같은 통상적인 실험으로 응집 수준을 정량화 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD47 항체의 존재 하에 혈장 응집 시험을 당업자가 수행할 수 있고, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 적혈구 반점(spot)의 면적을 측정하여 응집 반응의 수준을 결정하였다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항-CD47 항체의 존재 하에 및 본 발명의 항-CD47 항체의 부재하에(즉, 혈구 응집 반응이 없는 조건하에) RBC 반점의 영역 사이에서 비교가 수행되었고, 알려진 다른 항-CD47 항체의 존재 하에서도 검출될 수 있다. 이러한 방식으로, 혈구 응집 반응을 베이스 라인 대조군에 대하여 정량화하였다. RBC 반점의 면적이 클수록 응집 반응의 수준이 높아진다. 또는 적혈구 응집 반응은 RBC 반점의 밀도 분석으로 정량화할 수 있다.
1.6 진단과 검출을 위한 방법과 구성
특정 실시예에서, 본원에서 제공된 임의의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생물학적 샘플에서 CD47의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 원천의 혈액, 혈청 또는 다른 액체 샘플이다. 특정 실시예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
특정 실시예에서, 표지된 항-CD47 항체가 제공된다. 표지는 제한되지는 않지만, 직접 검출되는 표지 또는 부분(예: 형광, 발색성, 전자-밀도, 화학적발광 및 방사성 표지)이 포함된다. 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 잔기를 포함하고, 예시적인 표지에는 방사성 동위 원소 32P, 14C,125I,3H, 및 131I, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인과 같은 형광 물질 및 이의 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실(dansyl), 엄벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 플루오레세인, 2,3-디히드로프탈라진디온, 홍당무과산화효소(HR), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 글루코스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다아제, 글루코스-6-인산 탈수소 효소 등의 당 옥시다제, 요산 산화효소, 잔틴산화효소 등의 헤테로사이클릭 옥시다제, HR, 락토페록시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 과산화수소를 이용하여 염료 전구체를 산화하는 효소; 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
본 발명은 하기 실시예로 추가로 설명된다. 그러나, 본 발명은 제한적인 것이 아닌 예시적인 방식으로 실시예와 함께 설명되고 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
1.7 본 발명의 예시적인 항-CD47 항체의 서열
본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR의 서열
ADI 이름 VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
카밧 번호 매김에 의한 위치 H27-35 H50-65 H93-102 L24-34 L50-56 L89-97
ADI-26624 GSISSYYWS
(서열번호: 1)		 YIYYSGSTNYNPSLKS
(서열번호: 9)		 ARGKSAFDP
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(서열번호: 2)		 TIYYSGSTRYNPSLKS
(서열번호: 10)		 ARGKSAFNP
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(서열번호: 4)		 YIYYSGSTNYNPSLKS
(서열번호: 9)		 ARGKTGSAA
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(서열번호: 5)		 YIYYSGSTEYNPSLKS
(서열번호: 12)		 ARGKTGSAA
(서열번호: 19)		 RASQGISRWLA
(서열번호: 23)		 AASSLQS
(서열번호: 25)		 QQTVSFPIT (서열번호: 28)
GSIX1X2YYWS
(X1은 S,D 또는 E로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 S, N, Y 또는 H로 이루어진 군으로부터 선택된다)
(서열번호: 98)		 X1IYYSGSTX2YNPSLKS,
X1은 Y 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 N, R, G 또는 E로 이루어진 군으로부터 선택된다
(서열번호: 100)		 ARGKX1X2X3X4X5,
X1은 S 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 A 또는 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 F 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D, N 또는 A로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 P 또는 A로 이루어진 군으로부터 선택된다
(서열번호: 102)
ADI-26591 FTFSSYAMS (SEQ ID NO: 6) AISGSGGSTYYADSVKG
(서열번호: 13)		 AKTPIYYGFDL
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(서열번호: 24)		 GASSLQS
(서열번호: 26)		 QQKNPFPPT
(서열번호: 29)
ADI-30793 FTFDSYAMT
(서열번호: 8)		 VISGSGGKTYYADSVKG
(서열번호: 15)		 AKTHLYYGFDL
(서열번호: 21)		 RASQGISSWLA
(서열번호: 24)		 GASSLQS
(서열번호: 26)		 QQKNPFPPF
(서열번호: 30)
ADI-30794 FTFGNYAMS
(서열번호: 7)		 AISGSGGKTYYADSVKG
(서열번호: 16)		 AKTAIYYGFDL
(서열번호: 22)		 RASQGISSWLA
(서열번호: 24)		 GASSLQS
(서열번호: 26)		 QQKNPFPPF
(서열번호: 30)
FTFX1X2YAMX3
(X1은 S, G 또는 D로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 S 또는 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 S 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택된다
(서열번호: 99)		 X1ISGX2GGX3TYYADSVKG,
X1은 A, M 또는 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 S 또는 결실로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 S 또는 K로 이루어진 군으로부터 선택된다
(서열번호: 101)		 AKTX1X2YYGFDL,
X1은 P, H 또는 A로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 I 또는 L로 이루어진 군으로부터 선택된다
(서열번호: 103)
본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열
이름 VH DNA VH 단백질 VL DNA VL 단백질
ADI-26624 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGAGTGCATTCGACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 59) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSS
(서열번호: 44)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGGCAGACCTCCACCCTCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO: 69) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIK
(서열번호: 54)
ADI-29336 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGACGATCTATTACAGTGGGAGCACCCGTTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGAGTGCATTCAACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 60)		 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGTIYYSGSTRYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFNPWGQGTLVTVSS
(서열번호: 45)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGGCAGACCTCCACCCTCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 69)		 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIK
(서열번호: 54)
ADI-29340 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCGATTATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACTCGGGGAGCACCGGTTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGAGTGCATTCGACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 61)		 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDYYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTGYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSS
(서열번호: 46)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGGCAGACCTCCACCCTCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 69)		 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIK
(서열번호: 54)
ADI-26630 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGACGGGATCTGCCGCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 62)		 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS
(서열번호: 47)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACAGTCTCCTTCCCTATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 70)		 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK
(서열번호: 55)
ADI-29341 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCGAGCATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGACGGGATCTGCCGCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 63)		 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS
(서열번호: 48)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAGACAGTCTCCTTCCCTATCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
(서열번호: 71)		 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK
(서열번호: 55)
ADI-29349 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCGATCATTACTACTGGAGTTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACTCTGGGAGCACCGAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGGTAAGACGGGATCTGCCGCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 64)		 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTEYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS
(서열번호: 49)		 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACAGTCTCCTTCCCTATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 70)		 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK
(서열번호: 55)
ADI-26591 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGACGCCTATATACTACGGCTTCGACCTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호: 65) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSS
(서열번호: 50)		 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAAAAATCCCTTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 72)		 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIK
(서열번호: 57)
ADI-29371 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGGAATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAATGATTAGTGGGGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGACGCCTATATACTACGGCTTCGACCTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 66)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSMISGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSS
(서열번호: 51)		 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAAAAATCCCTTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 72)		 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIK
(서열번호: 57)
ADI-30793 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATAGCTATGCCATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTAGTGGAAGTGGTGGTAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGACGCATCTTTACTACGGCTTCGACCTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 67)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTHLYYGFDLWGRGTLVTVSS
(서열번호: 52)		 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAAAAATCCCTTCCCTCCTTTTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 73)		 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIK
(서열번호: 58)
ADI-30794 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGGAATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGAAGTGGTGGTAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGACGGCTATATACTACGGCTTCGACCTATGGGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA
(서열번호: 68)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTAIYYGFDLWGRGTLVTVSS
(서열번호: 53)		 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAAAAATCCCTTCCCTCCTTTTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
(서열번호: 73)		 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIK
(서열번호: 58)
본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 FR의 서열
ADI
이름 		VH
FR1 		VH
FR2 		VH
FR3 		VH
FR4 		VL
FR1 		VL
FR2 		VL
FR3 		VL
FR4
ADI-26624, ADI-29336, ADI-29340, ADI-26630, ADI-29341, ADI-29349 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG
(서열번호: 31) 		WIRQPPGKGLEWIG (서열번호: 33) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
(서열번호: 35) 		WGQGTLVTVSS
(서열번호: 37) 		DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC
(서열번호: 39) 		WYQQKPGKAPKLLIY
(서열번호: 41)		 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
(서열번호: 42)		 FGGGTKVEIK
(서열번호: 43)
ADI-26591, ADI-29371, ADI-30793, ADI-30794 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
(서열번호: 32) 		WVRQAPGKGLEWVS
(서열번호: 34) 		RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
(서열번호: 36) 		WGRGTLVTVSS
(서열번호: 38) 		DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITC
(서열번호: 40) 		WYQQKPGKAPKLLIY
(서열번호: 41)		 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
(서열번호: 42)		 FGGGTKVEIK
(서열번호: 43)
현재 서열 목록에서 서열 일부의 번호 매김.
ADI
이름 		중쇄에 대한 서열번호 경쇄에 대한 서열번호 IgG4 IgG1
중쇄 가변 영역 VH 경쇄 가변 영역
VH
FR1 		VH CDR1 VH FR2 VH CDR2 VH FR3 VH CDR3 VH FR4 VH DNA VH Pro. VL FR1 VL CDR1 VL FR2 VL CDR2 VL FR3 VL CDR3 VL FR4 VL DNA VL Pro. 중쇄 HC 경쇄 LC 중쇄 HC 경쇄 LC
ADI-26624 31 1 33 9 35 17 37 59 44 39 23 41 25 42 27 43 69 54 74 75 88 75
ADI-29336 31 2 33 10 35 18 37 60 45 39 23 41 25 42 27 43 69 54 76 75 89 75
ADI-29340 31 3 33 11 35 17 37 61 46 39 23 41 25 42 27 43 69 54 77 75 90 75
ADI-26630 31 1 33 9 35 19 37 62 47 39 23 41 25 42 28 43 70 55 78 79 91 79
ADI-29341 31 4 33 9 35 19 37 63 48 39 23 41 25 42 28 43 71 55 80 79 92 79
ADI-29349 31 5 33 12 35 19 37 64 49 39 23 41 25 42 28 43 70 55 81 79 93 79
ADI-26591 32 6 34 13 36 20 38 65 50 40 24 41 26 42 29 43 72 56 82 83 94 83
ADI-29371 32 7 34 14 36 20 38 66 51 40 24 41 26 42 29 43 72 57 84 83 95 83
ADI-30793 32 8 34 15 36 21 38 67 52 40 24 41 26 42 30 43 73 58 85 86 96 86
ADI-30794 32 7 34 16 36 22 38 68 53 40 24 41 26 42 30 43 73 58 87 86 97 86
본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄의 전장 아미노산 서열
ADI26624-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 74)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ADI29336-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 76)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGTIYYSGSTRYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFNPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
ADI29340-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 77)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDYYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTGYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
ADI26630-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 78)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 79)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ADI29341-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 80)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 79)
ADI 29349-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 81)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTEYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 79)
ADI 26591-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 82)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC의 아미노산 서열 (서열번호: 83)
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ADI 29371-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 84)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 83)
ADI 30793-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 85)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 86)
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ADI 30794-IgG4
HC의 아미노산 서열 (서열번호: 87)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 75)
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HC의 아미노산 서열 (서열번호: 91)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 79)
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 79)
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ADI 30793-IgG1
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 86)
ADI 30794-IgG1
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LC의 아미노산 서열 (서열번호: 86)
CD47 단백질의 아미노산 서열 (서열번호: 56)
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE
첨부된 도면에 제시된 음성 대조군의 서열은 다음과 같다:
IgG1 HC:
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVRLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTTSRDDSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPGWYAADVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1 LC
MDFQVQIISFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLPAFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
IgG4 HC:
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVRLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTTSRDDSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPGWYAADVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
IgG4 LC:
MDFQVQIISFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLPAFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
IgG1 클래스의 음성 대조군은 IgG1 클래스의 시험 항체를 사용할 때 사용하고; IgG4 클래스의 시험 항체를 사용하는 경우에는 IgG4 클래스의 음성 대조군을 사용한다.
실시예
실시예 1. 항-CD47 항체 및 대조군 항체의 생산 및 정제
본 출원의 "서열 목록" 섹션에는 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR 영역, 경쇄 및 중쇄의 가변 부위, 본 발명에 예시된 10개의 항체의 경쇄 및 중쇄(ADI-26624, ADI-29336, ADI-29340, ADI-26630, ADI-29341, ADI-29349, ADI-26591, ADI-29371, ADI-30793, ADI-30794)의 아미노산 서열뿐만 아니라 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또한, 본 발명에서 언급된 예시적인 항체의 경쇄 및 중쇄, 중쇄, 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 서열 번호는 표 7에 제시되어 있다.
본 발명의 항체는 효모 세포 및 CHO-S 세포에서 발현되어 정제되었다.
효모 세포에서의 발현 및 정제
효모-기질 항체 제시 라이브러리(Adimab)는 기존의 절차 (WO2009036379; WO 2010105256; WO2012009568)에 따라 증폭되었고, 각 라이브러리의 다양성은 1 × 109이다. 간단히 말하자면, 자기(magnetic) 활성 세포 선별은 Miltenyi Company의 MACS 시스템을 사용하여 처음 두 번의 선별 검사에서 수행되었다. 먼저, 100 nM의 비오틴-표지된 CD47 항원(Acro Biosystems, 카탈로그 번호 CD7-H5227-1 mg)을 포함하는 FACS 세척 완충액(0.1% 소 혈청 단백질을 포함하는 인산 완충액)에서 라이브러리(~1×1010 세포/라이브러리)의 효모 세포를 실온에서 15분 동안 별도로 배양하였다. 세포를 미리 냉각시킨 FACS 세척 완충액 50ml로 씻은 다음 동일한 세척 완충액 40ml에 재현탁하고 500μl의 Streptinomycin microbead (Miltenyi LS)를 첨가한 후 4℃에서 15분간 배양했다. 상등액을 1000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 버린 후, 세포 펠렛을 5 ml의 FACS 세척 완충액에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 Miltenyi LS 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완료 후, 칼럼을 FACS 세척 완충액으로 3회 세척할 때마다 3 ㎖로 세척하였다. Miltenyi LS 칼럼을 자성 영역에서 꺼내어 5ml의 성장 배지로 용출시켰다. 용출된 효모 세포를 수집하고 37℃에서 밤새 성장시켰다.
유동 세포 계측법(flow cytometer)은 다음 라운드 정렬에 사용되었다: MACS 시스템 스크리닝으로 얻은 약 1×108 개의 효모 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 실온에서 저농도 (100-1nM)의 비오틴 표지된 CD47 항원을 포함하는 배양 배지에서 배양하였다. 배양액을 버리고 세포를 FACS 세척 완충액으로 2회 세척한 후 LC-FITC (인간 면역 글로불린 F(ab') 카파 사슬에 대한 FITC 표지된 염소 항체, Southern Biotech) (1:100 희석) 시약 및 SA-633(streptavidin-633, Molecular Probes) (1:500 희석) 또는 SA-PE (streptavidin-phycoerythrin, 시그마) (1:50 희석) 시약으로 4℃에서 15분간 배양하였다. 미리 냉각시킨 FACS 세정 완충액으로 2회 세포를 용출시키고, 원심 분리하고, 완충액 0.4㎖에 재현탁시키고, 필터로 분리관에 옮겼다. 세포를 FACS ARIA(BD Biosciences)로 분류하였다.
항 CD47 항체를 발현하는 스크리닝을 통해 얻은 효모 세포를 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양한 후, CD47에 대한 항체를 발현시켰다. 유도 완료 후, 1300 rpm에서 10분간 원심 분리하여 효모 세포를 제거하고 상등액을 수확하였다. 상청액 중의 항-CD47 항체를 단백질 A 칼럼상에서 정제하고, pH 2.0의 아세테이트 용액으로 용출시켰다. 항 CD47 항체는 항체 순도 > 95%로 수확되었다. 상응하는 Fab 단편은 파파인 분해 및 KappaSelect (GE Healthcare Life Sciences)로 정제함으로써 얻을 수 있다.
CHO-S 세포에서의 발현 및 정제
항체를 발현하는 CHO-S 세포주는 제조사의 지침에 따라 Freedom® CHO-S® 키트 (Invitrogen)를 사용하여 확립되었다. 먼저, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄에 대한 DNA 서열을 동일한 pCHO1.0 플라스미드에 삽입하고, 중쇄는 경쇄의 상류에 위치시켰다. 구축된 pCHO1.0 플라스미드를 화학적 형질 감염 및 전기 천공으로 CHO 세포주로 옮겼다. 항체 수율은 형질주입 효율을 결정하기 위해 형질주입 후 48시간 후에 ForteBio를 사용하여 검출되었다. 형질주입된 세포가 2회 선택적 스크리닝을 받은 후에 높은 항체 발현을 갖는 세포 풀이 수득되었다. 이어서, 세포 풀을 풍부하게 항체를 발현시키기 위해 증식시키고, 세포 상등액을 순도 95% 이상의 단백질 A 칼럼에서 수집하고 정제하였다.
본 발명에서 수득한 10개의 예시적인 항체의 경쇄 및 중쇄, 중쇄, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 번호 부여
항체 이름 VH VL HC LC
ADI-26624 44 54 74/88 75
ADI-29336 45 54 76/89 75
ADI-29340 46 54 77/90 75
ADI-26630 47 55 78/91 79
ADI-29341 48 55 80/92 79
ADI-29349 49 55 81/93 79
ADI-26591 50 57 82/94 83
ADI-29371 51 57 84/95 83
ADI-30793 52 58 85/96 86
ADI-30794 53 58 87/97 86
실시예에서 사용된 하기의 대조군 항체는 293HEK 세포에서 발현되고 정제되었다:
대조군 항체
Hu5F9
AB6.12
Hu5F9는 미국 특허 US2015/0183874 A1에서 항체 "5F9"와 동일한 서열을 갖는 293 HEK 세포에서 일시적으로 발현되는 인간 항-CD47 항체이다. AB6.12는 미국 특허 US9045541의 항체 "AB6.12"와 동일한 서열을 갖는 293 HEK 세포에서 일시적으로 발현되는 인간화 항-CD47 항체이다. 미국 특허 US9045541에 개시된 항체 "AB6.12"는 세포의 명백한 응집을 유발하지 않는 항-CD47 항체이다.
293HEK 세포에서 항체를 일시적으로 발현시키기 위해, 벡터 pTT5를 사용하였다. 먼저, 항체의 중쇄 및 경쇄가 단일 pTT5 벡터에 클로닝되었다. 항체의 중쇄 및 경쇄를 갖는 pTT5 벡터를 293HEK 세포에 화학적 형질주입시켜 형질주입시켰다. 사용된 화학적 형질주입 시약은 PEI(Polysciences로부터 구입)이고, 일시적으로 형질주입시키는 293HEK 세포는 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다. 먼저, 플라스미드 DNA 및 형질주입 시약을 클린 벤치에서 제조하고, F17 배양액 (Gibco) (부피는 형질주입 부피의 1/5임)의 절반을 여과된 플라스미드 (130μg/100ml)를 보충한 반과 50ml 원심 분리 튜브에 각각 가하고 나머지 절반 여과한 PEI (1g/L, Polysciences) (질량비 (플라스미드 : PEI) = 1:3)를 첨가하고, 각각 5분간 잘 혼합하였다. 그런 다음 두 반쪽을 완만하게 20시간 혼합한 후 15분에서 30분 동안 그대로 두었다가 30분보다 길게 두었다. DNA/PEI 혼합물을 293HEK 세포에 완만하게 붓고 잘 섞는다. 세포는 37℃, 8% CO2 조건 하에서 7일 동안 배양되었고, 48시간마다 새로운 배지가 첨가되었다. 7일 후 또는 세포 생존율이 60% 이하가 되도록 연속 배양한 후 원심 분리를 13000 rpm에서 20분 동안 수행하였다. 상등액을 수집하여 항체 순도> 95%로 Protein A 컬럼에서 정제하였다.
실시예 2 : 본 발명의 항-CD47 항체의 친화도 측정
인간 CD47(hCD47) (Fc 단편에 의한 잠재적 충격을 배제하기 위한 1가 시험에서 사용된 Fab 단편)에 대해 본 발명에서 앞서 언급한 10개의 예시적인 항체의 평형 해리 상수(KD)는 생체 광간섭법(ForteBio) 분석으로 결정되었다.
ForteBio 친화도 분석은 이전에 기술된 대로(Estep, P., et al., 항체-항원 친화성 및 에피토프 비닝의 높은 처리량 기반 측정, MAbs, 2013, 5 (2) : 270-8 페이지) 일반적으로 수행되었다. 요약하면 센서를 분석 버퍼에서 30분 동안 오프라인 상태로 평형시킨 다음 60초 동안 온라인으로 테스트하여 기준선을 확립했다. 상기에서 얻은 정제 항체를 AHQ 센서 (ForteBio)에 온라인으로 장착하여 ForteBio 친화도 측정을 수행하였다. 이어서, 항체가 담긴 센서를 100nM의 CD47 항원에 5분 동안 노출시킨 다음, 센서를 분석 완충액으로 5분 동안 옮겨 해리율을 측정하였다. 동역학 분석은 1 : 1 결합 모델을 사용하여 수행되었다.
상기 분석에 기재된 바와 같이 수행된 시험에서, ADI-26624, ADI-26630, ADI-26591, ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341, ADI-29349, ADI-29371, ADI- ADI-30794는 표 9에 나타냈다.
생체 광 간섭계에 의해 측정 된 IgG1 형태에서의 본 발명의 항체의 결합
항체 ForteBio 이미지: AHQ의 팁에서 인간 CD47-Fc, 용액(100 nM)에서 Fab 형태의 항체 [1가] ForteBio 이미지: AHQ의 끝에있는 IgG1 형태의 항체, 용액(100 nM)에서 인간 CD47-Fc [2가] ForteBio 이미지: AHQ의 팁에서 IgG1 형태의 항체, 용액(100 nM)에서 시노몰구스 원숭이(cynomolgus) CD47-Fc [2가] ForteBio 이미지: AHQ의 팁에서 IgG1 형태의 항체, 용액(100 nM)에서 마우스 CD47-Fc [2가]
ADI-26591 N.B. 5.38E-09 3.39E-09 N.B.
ADI-29371 2.18E-07 1.95E-09 1.41E-09 N.B.
ADI-30793 9.34E-09 6.32E-10 5.84E-10 4.57E-09
ADI-30794 3.13E-09 5.62E-10 7.84E-10 N.B.
ADI-26624 6.578E-08 1.054E-09 7.827E-10 N.B.
ADI-29336 1.325E-09 4.768E-10 5.43626E-10 N.B.
ADI-29340 5.484E-09 4.885E-10 6.12182E-10 2.12E-08
ADI-26630 3.567E-08 8.37E-10 7.27E-10 N.B.
ADI-29341 4.623E-09 5.006E-10 5.30363E-10 N.B.
ADI-29349 4.511E-09 5.552E-10 5.67054E-10 1.72E-08
Hu5F9 1.66E-08 4.20E-10 6.41E-10 1.266E-08
참고 : N.B. 바인딩이 없음을 나타냄.
본 발명에서 상기 언급된 10개의 예시적인 항체 모두는 당 업계에 공지되고 인식된 항-CD47 항체인 Hu5F9의 친화도와 비교하여 매우 높은 친화도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: 인간 CD47에 결합하는 본 발명의 항-CD47 항체
유동 세포 계측법에 기초한 분석에서, 본 발명에서 상기 언급된 10개의 예시적인 항체의 인간 CD47에 대한 결합을 측정하였다.
CHO 세포를 과다 발현하는 사람 CD47 (CHO-hCD47 세포)은 CHO 세포를 다중 클로닝 사이트 (MCS)에 클로닝 된 인간 CD47 cDNA (Sino Biological)를 갖는 pCHO1.0 벡터 (Invitrogen)로 형질 감염시킴으로써 생성되었다. CHO-hCD47 세포 (0.2×106 세포)를 시험 항체와 상이한 농도(본 발명에서 상기 언급한 10개의 예시적인 항체 및 Hu5F9, 900 nM의 최대 농도, 3배 희석, 11가지 농도로 완전히 시험함)와 PBS 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 처리하고 얼음에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 2회 이상 세정하고, 2차 항체(PE 표지된 염소 항 인간 IgG 항체, Southern Biotech, 최종 농도 5 ㎍/ml)와 얼음 속에서 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중 30분간 (어두운 곳에서) 배양하였다. 세포를 적어도 2회 세척하고 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 유동세포 계측법을 Accuri C6 System(BD Biosciences)에서 수행하였고 농도-의존성 그래프는 세포의 MFI에 따라 GraphPad를 장착하였다.
각각 3.77 nM, 2.254 nM 및 3.895 nM의 EC50 값을 갖는 CHO 세포(서열 번호 56) 상에 과발현된 hCD47에 결합하는 ADI-26591, ADI-26624 및 ADI-26630(효모로 표시되는 IgG1 형태)는 CHO 세포(대조 항체 Hu5F9의 EC50 값은 3.726 nM임) 상에 과발현된 hCD47에 대한 대조군 항체 Hu5F9의 결합 능력과 일치한다(도 1 참조).
상기 분석에서 설명한 바와 같이, CHO 세포 상에 과발현된 hCD47에 결합하는 효모 세포에서 생산된 IgG1 형태의 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341, ADI-29349, ADI-29371, ADI-30793 및 ADI-30794는 각각 6.725nM, 3.529nM, 3.344nM, 3.13nM, 2.132nM, 2.921nM 및 3.697nM7의 EC50 값을 갖고 CHO 세포 상에 과발현된 CD47에 대한 대조군 항체 Hu5F9의 결합 능력과 본질적으로 일치한다(EC50 값은 3.726 nM).
CHO 세포 상에 과발현된 hCD47에 결합하는 CHO 세포에서 생성된 IgG4 형태의 항체 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341, ADI-29349 및 ADI-29371은 각각 EC50 값이 2.475 nM, 2.194 nM, 1.892 nM, 2.043 nM 및 2.31 nM이며, 세포 수준에서 hCD47에 대한 이들 항체의 친화도는 모두 대조 항체 Hu5F9(EC50 값 3.726)의 것보다 높다.
실시예 4. 인간 CD47 리간드 SIRPα와 CD47의 상호 작용을 차단하는 본 발명의 항-CD47 항체
SIRPα에 대한 인간 CD47의 결합을 차단하는 10가지 예시적 항체의 능력을 유동 세포 계측법으로 측정하였다.
실시예 3에서 이전에 기술된 바와 같이 제조된 0.2x106 개의 인간 CD47-발현 CHO 세포를 시험 항체(ADI-29336, ADI-29341, ADI-29341, ADI-29349 및 Hu5F9, 최대 농도 900nM, 3배 희석, 11 가지 농도에서 완전히 시험됨)와 공동-배양하였고, 그리고 200nM의 마우스 Fc-표지된 SIRPα 단백질(Acro Biosystems)을 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 얼음상에 30분간 처리하였다. 그런 다음 세포를 3번 세척한 후 0.1% BSA가 함유된 PBS에 2차 항체인 염소-항-마우스 IgG-APC(Allephycocyanin) (Biolegend)를 얼음 상에서 30분간 (어두운 곳에서) 배양했다. 세포를 3번 세척하였다. 유동 계측 분석은 Accuri C6 System (BD Biosciences)에서 수행되었으며 MFI는 C6 소프트웨어로 계산되었다.
CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하기 위해 효모 세포에서 생산된 IgG1 형태의 ADI-26624, ADI-29336, ADI-29340, ADI-29371, ADI-26630, ADI-29341 및 ADI-29349의 능력은 대조군 항체 AB6.12와 일치하였다.
구체적으로, CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하기 위한 ADI-26624, ADI-29336 및 ADI-29340의 능력에 대한 IC50 값은 각각 11.2 nM, 8.548 nM 및 5.081 nM이다. CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하는 ADI-26630, ADI-29341 및 ADI-29349의 능력에 대한 IC50 값은 각각 2.986 nM, 2.476 nM 및 3.097 nM이다.
CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하는 대조군 항체 AB6.12의 능력에 대한 IC50 값은 3.385nM이다(도 2 참조).
CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하기 위해 CHO 세포에서 생산된 IgG4 형태의 항체 ADI-26624, ADI-26630, ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341 및 ADI-29349의 능력은 모두 대조군 항체 AB6.12 및 Hu5F9보다 약간 높다.
구체적으로, CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하기 위한 ADI-26624, ADI-29336 및 ADI-29340의 능력에 대한 IC50 값은 각각 1.043 nM, 1.389 nM 및 1.223 nM이다. CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하는 ADI-26630, ADI-29341 및 ADI-29349의 능력에 대한 IC50 값은 각각 1.123 nM, 0.6042 nM 및 0.7355 nM이다. CD47에 대한 인간 SIRPα-APC 결합을 차단하는 대조군 항체 AB6.12 및 Hu5F9의 능력에 대한 IC50 값은 각각 1.768 nM 및 1.843 nM이다(도 3 참조).
실시예 5. 본 발명의 항-CD47 항체가 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 능력의 검출
유동 세포 계측법에 기초한 분석에서, 대식세포에 의한 종양의 식세포작용을 촉진하기 위한 본 발명의 항체(ADI-26624, ADI-29336, ADI-29340, ADI-26630, ADI-29341, ADI-29349, ADI-29371, ADI-30793 및 ADI-30794)의 능력을 측정하였다.
기증자로부터 채취한 신선한 혈액은 밀도 구배 원심 분리를 거쳐 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 채취하였다. 분리된 PBMC로부터 키트 (EasySepTM Human CD14 양성 선별 키트, Steam Cell)의 지시에 따라 CD14 양성 단구를 수득하고 정제 하였고, 10 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF, R&D Systems)를 첨가하여 7 일간 접착성 배양한 후, 인터페론-γ(IFN-γ, Acro Biosystem) 20 ng/ml 5일에 1시간 동안 자극을 위해 첨가하고, 그후 100 ng/mL 지질 다당류(LPS, Sigma)를 첨가하여 48시간 추가 자극시켰다. 따라서, 단구가 대식세포로 유도되었다. 표적 종양 세포인 CCRF-CEM (ATCC로부터 구입)을 CellTraceTM CFSE 키트의 지시에 따라 형광 표지하였다. 분류된 종양 세포를 상기 언급된 분화된 대식세포와 4 : 1의 비율로 공동-배양하고, 시험 항체를 상이한 농도로 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 적어도 2회 세척한 후 알로피코시아닌 (APC)-표지 항-CD14 항체(BD로부터 구입함)를 첨가하고 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 얼음 상에서 30분간 (어두운 곳에서) 배양하였다. 세포를 적어도 2회 세척하고 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 식세포화된 세포 집단은 CD14와 형광 염료 CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)에 양성인 살아있는 세포의 것이다.
효모 세포에서 생성된 IgG1 형태의 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341, ADI-29349, ADI-30793 및 ADI-30794는 모두 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 매우 강한 능력을 갖는다. 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 ADI-29340의 능력은 대조군 항체 Hu5F9 및 AB6.12보다 강력하며, 대식세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 촉진시키는 ADI-30793 및 ADI-30794의 능력은 대조 항체 AB6.12와 유사하다(도 4 및 도 5 참조).
CHO 세포에서 생산된 IgG4 형태의 ADI-26624 및 ADI-26630은 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 효과적으로 촉진할 수 있다. 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 ADI-26624 및 ADI-26630의 능력은 대조군 항체 Hu5F9의 그것과 일치한다 (도 6 참조).
CHO 세포에서 생산된 IgG4 형태의 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341, ADI-29349 및 ADI-29371은 모두 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 매우 강한 능력을 갖는다. 결과로부터, 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 ADI-29336, ADI-29340, ADI-29341 및 ADI-29349의 능력이 대조군 항체 Hu5F9의 것보다 유의하게 높다는 것을 알 수 있다. 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시키는 ADI-29371의 능력은 대조군 항체 Hu5F9와 유사하다(도 7 참조).
실시예 6. 본 발명의 항-CD47 항체의 항-종양 활성
본 발명의 항-CD47 항체 (ADI-26624, ADI-26630, ADI-29340 및 ADI29341)의 항-종양 효능을 NOD/SCID 마우스 모델에서 연구한다.
절차는 다음과 같다:
인간 버킷 림프종 Raji 세포(ATCC # CCL-86)는 ATCC에서 구입하여 후속 생체 내 실험에 대한 ATCC 요건에 따라 엄격하게 계대 배양하였다. 세포를 원심 분리에 의해 수집하고, 멸균 PBS에 재현탁시키고 107 세포/ml의 세포 밀도로 조정하였다. 0.1ml의 세포 현탁액을 1 : 1의 마트리겔(Matrigel)과 함께 섞어 NOD/SCID 마우스(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)의 오른쪽 측면에 피하 접종하였다. 종양과 체중을 연구 기간 동안 매주 두 번 측정했다. 종양 종점이 충족되거나 마우스의 체중이 20% 이상 감소하면 마우스를 안락사 시켰다. 접종 10일 후, 실험에 적합한 마우스를 그룹당 8마리의 동물을 무작위 추출하였다. 생쥐의 종양 체적은 다음 공식을 가진 캘리퍼(caliper)로 측정되었다: 각 그룹에서 (폭) 2 × 길이/2, 각 그룹의 최대 종양 부피는 110 mm3이었다.
첫째, 본 출원인은 종양을 억제하기 위해 본 발명의 항체 ADI-26624 및 ADI-26630의 효능을 연구하였다.
상기 언급된 방법에 의해 수득된 마우스는 무작위화 되었고 다른 처리를 하였다: 복막 내 투여는 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 PBS, 대조 IgG 항체(IgG4), 벤치마크(Hu5F9), 및 본 발명의 항체 ADI-26624 및 ADI-26630을 2주 연속으로 1일 간격으로 투여한다. 상세한 그룹화 및 투여 방식을 표 10에 나타내었다 :
그룹 접종된 세포 처리 양식
1 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) PBS
2 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) IgG 대조군 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
3 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) Hu5F9 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
4 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) Hu5F9 (1 mg/kg) 2주 연속 격일로
5 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126624 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
6 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126624 (1 mg/kg) 2주 연속 격일로
7 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126630 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
8 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126630 (1 mg/kg) 2주 연속 격일로
실험 종결시, 종양 성장 억제율은 하기 식으로 계산되었다:
TGI%= 100% × ((TvolPBS 처리 후-Tvol항체 처리 후)/(TvolPBS 처리 후-TvolPBS 처리 전)),
TvolPBS 처리 후는 블랭크 대조군 PBS 그룹에서 실험 완료 후의 종양 부피이며, Tvol항체 처리 후는 항체 그룹(IgG, Hu5F9 및 본 발명의 항체)에서의 실험 완료 후의 종양 부피이며, TvolPBS 처리 전는 블랭크(blank) 대조군 PBS 그룹의 초기 종양 부피이다.
실험 결과는 도 8, 9 및 표 11을 참조한다. CHO 세포에서 발현되는 본 출원의 IgG4 형태의 항-CD47 모노클로날 항체 ADI-26624 및 ADI-26630은 대조군 IgG(equitech-Bio) 및 대조군 항체 Hu5F9와 비교하여 종양의 성장을 현저하게 억제하였다.
ADI-26630 1mg/kg, ADI-26630 5mg/kg, ADI-26624 1mg/kg 및 ADI-26624 5mg/kg의 팔(in Arms)에서의 종양 성장 억제율은 각각 100%, 104% 79%, 94%였다. 종양은 5 mg/kg의 ADI-26630에서 5/8 마리의 마우스의 팔에서(in Arms) 완전히 사라졌으며, 1 mg/kg의 Arm ADI-26630에서 2/8 마리의 마우스의 팔에서 완전히 사라졌으며, 두 팔에서의 종양이 완전히 사라진 동물의 수는 대조군 항체 Hu5F9 팔에서 동일한 투여량(5mg/kg에서의 2마리의 팔 및 5mg/kg에서의 1마리의 팔)보다 높았다(표 11). 이 연구에서 모든 팔의 마우스는 접종 후 32일째 체중이 유의한 변화가 없었다.
따라서, 본 발명의 항체는 대조군 항체 Hu5F9의 치료 효과보다 종양에 대하여 매우 우수한 치료 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
CHO 세포에서 발현되는 IgG4 형태의 본 항체에 대한 연구에서 종양 크기 및 종양 성장 억제율에 대한 통계표.
그룹 초기 종양 부피(mm3) 실험 종료시의 종양 부피 (mm3) 성장 억제 비율(%) 종양이 완전히 사라진 동물의 수 종양이 완전히 사라진 동물의 비율(%)
PBS
(블랭크 대조군)		 111 1711 0/8 0
인간 IgG
(음성 대조군),
5 mg/kg		 110 1496 13 0/8 0
Hu5F9, 1 mg/kg 110 207 94 1/8 12
Hu5F9, 5 mg/kg 111 119 100 2/8 25
ADI-26630, 1 mg/kg 110 113 100 2/8 25
ADI-26630, 5 mg/kg 109 48 104 5/8 63
ADI-26624, 1 mg/kg 110 445 79 0/8 0
ADI-26624, 5 mg/kg 110 215 94 0/8 0
다음으로, 본 발명자들은 종양에 대한 항체 ADI-29340 및 ADI29341의 억제 효과를 검출하는 것으로 진행한다.
상기 방법에 의해 얻은 마우스를 무작위화하여 상이한 처리, 즉, 대조군 IgG 항체(IgG4) 및 본 발명의 항체 ADI-26630, ADI-29340 및 ADI29341의 복강 내 주사를 연속 2주 동안 1일 간격으로 2회 실시하였다. 상세한 그룹화 및 투여 방식을 하기 표 12에 나타내었다:
그룹 접종된 세포 처리 양식
1 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) PBS
2 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) 인간 IgG 대조군(5 mg/kg) 2주 연속 격일로
3 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126630 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
4 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD126630 (0.5 mg/kg) 2주 연속 격일로
5 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD1269340 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
6 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD129340 (0.5 mg/kg) 2주 연속 격일로
7 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD1269341 (5 mg/kg) 2주 연속 격일로
8 Raji 세포: 마트리겔 (1:1) AD129341 (0.5 mg/kg) 2주 연속 격일로
실험 종료시, 종양 성장 억제율은 상기 언급된 식을 사용하여 계산하였다. CHO 세포에서 발현되는 본 출원의 IgG4 형태의 항-CD47 모노클로날 항체 ADI-26630, ADI-29340 및 ADI-29341은 종양의 현저한 성장을 억제할 수 있음이 밝혀졌다(표 13, 도 10 및 도 11 참조).
0.5 mg/kg의 ADI-26630, 5 mg/kg의 ADI-26630, 0.5 mg/kg의 ADI-29340, 5 mg/kg의 ADI-29340, 0.5 mg/kg의 ADI-29341 및 5mg/kg의 ADI-29341의 팔에서 종양 성장 억제율은, 각각, 99%, 110%, 103%, 109%, 104% 및 109% 이다. 종양은 0.5 mg/kg의 팔 ADI-29340의 5/8 마우스, 0.5 mg/kg의 팔 ADI-29341의 4/8 마우스 및 5mg/kg의 팔 ADI-26630 및 8/8 마우스에서 완전히 사라졌다(표 13). 이 연구에서 모든 팔의 쥐는 접종 30일 후에 체중의 유의한 변화가 없었다.
따라서, 본 발명의 항체는 종양에 대하여 매우 우수한 치료 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
CHO 세포에서 발현되는 IgG4 형태의 본 항체에 대한 연구에서 종양 크기 및 종양 성장 억제율에 대한 통계표.
그룹 초기 종양 부피(mm3) 실험 종료시의 종양 부피 (mm3) 성장 억제 비율(%) 종양이 완전히 사라진 동물의 수 종양이 완전히 사라진 동물의 비율(%)
PBS
(블랭크 대조군)		 101 1047 0/8 0
h-IgG,
5 mg/kg		 100 1089 0/8 0
ADI26630,
0.5 mg/kg		 99 113 99 1/8 12.5
ADI26630,
5 mg/kg		 99 0 110 8/8 100
ADI29340,
0.5 mg/kg		 98 69 103 5/8 62.5
ADI29340,
5 mg/kg		 99 8 109 8/8 100
ADI29341,
0.5 mg/kg		 99 60 104 4/8 50
ADI29341,
5 mg/kg		 99 12 109 7/8 87.5
실시예 7. RBC 응집을 촉진시키기 위한 본 발명의 항-CD47 항체의 활성의 검출
대부분의 항-CD47 항체가 RBC 응집을 촉진시키는 부작용을 가지며, 이로써 이들 항체의 치료적 적용을 제한한다는 것이 당 업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 본원에 개시된 항체의 적혈구 응집을 조사하였다.
시험 절차는 다음과 같다:
신선한 인체 혈액을 수집하고 PBS로 3회 세척하여 10%의 인간 RBC 현탁액을 제조한다. 인간 RBC는 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 2-6시간 동안 37℃에서 시험 항체(최대 농도 60ug/ml, 3배 희석, 총 11가지 농도)와 함께 배양한다. 반응이 끝나면 사진이 찍히고 결과를 판단한다. 결과 판정의 기준은 적혈구가 웰 바닥의 망상에 침착되어 퍼지면서 헤이즈로 나타나는 경우 RBC 응집 반응이 발생한다는 것이고(그림 12의 Hu5F9 결과 참조), RBC가 웰 바닥에 빨간색 점이 찍히면 RBC 응집 반응이 일어나지 않는다(도 12의 대조군 참조).
상기 분석에 기재된 시험에서, 응집 반응의 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12로부터 RBC 응집에서의 ADI26630, ADI29340 및 ADI29341의 활성이 매우 약하고, 적혈구 응집을 촉진시키는 동일한 활성이 대조군 Hu5F9의 활성보다 유의하게 낮으며, 대조군 AB6.12와 유사하다. 본원에 개시된 항체는 혈액 세포의 응집을 현저히 감소시키고, 결과적으로 임상 치료 패러다임에서 유의하게 감소된 부작용을 초래할 수 있고 다양한 암의 치료에 광범위하게 사용될 수 있다.
<110> INNOVENT BIOLOGICS (SUZHOU) CO., LTD. <120> Anti-CD47 Antibodies and Uses Thereof <130> PI-19K1045CN <150> CN 201710759828.9 <151> 2017-08-29 <160> 107 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Gly Ser Ile Asp Tyr Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Gly Ser Ile Glu His Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Gly Ser Ile Asp His Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Phe Thr 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Thr Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be Ala, Met, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be Ser or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be Ser or Lys <400> 101 Xaa Ile Ser Gly Xaa Gly Gly Xaa Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa can be Ala,or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be Phe,or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be Asp, Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa can be Pro or Ala <400> 102 Ala Arg Gly Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be Pro, His or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa can be Ile, or Leu <400> 103 Ala Lys Thr Xaa Xaa Tyr Tyr Gly Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 104 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 104 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn 85 90 95 Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Gly Trp Tyr Ala Ala Asp Val Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly 465 <210> 105 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 105 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Ala Asp Leu Pro Ala Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 106 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 106 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn 85 90 95 Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Gly Trp Tyr Ala Ala Asp Val Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 107 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (23)

  1. (i) 서열 번호: 44, 45 또는 46에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 HCDR 및 서열 번호: 54로 나타낸 경쇄의 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 LCDR;
    (ii) 서열 번호: 47, 48 또는 49에 나타낸 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 HCDR 및 서열 번호: 55로 나타낸 경쇄의 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 LCDR;
    (iii) 서열 번호: 50 또는 51에 나타낸 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 HCDR 및 서열 번호: 57에 나타낸 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 LCDR; 또는
    (iv) 서열 번호: 52 또는 53에 나타낸 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 HCDR 및 서열 번호: 58에 나타낸 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 LCDR을 포함하는 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 HCDR 및 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 LCDR을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 98 또는 99로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 100 또는 101에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 102 또는 103에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열 번호: 23 또는 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 25 또는 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호: 27, 28, 29 또는 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은:
    (i) 표 B에 열거된 임의의 항체 중 하나의 VH에 포함된 3개의 상보성 결정 영역 (HCDR);
    (ii) 표 A에 나타낸 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 조합;
    (iii) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 98 또는 99에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 100 또는 101로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 102 또는 103; 또는
    (iv) 3개의 CDR 영역에서 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예: 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (i) 내지 (iii)의 HCDR의 변이체이고;
    및/또는
    경쇄 가변 영역은:
    (i) 표 4에 열거된 임의의 항체의 VL에 포함된 3개의 상보성 결정 영역 (LCDR);
    (ii) 표 3에 나타낸 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 조합;
    (iii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 LCDR1은 서열 번호: 23 또는 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 25 또는 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호: 27, 28, 29 또는 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고; 또는
    (iv) 3개의 CDR 영역에서 적어도 하나의 아미노산 및 5개 이하의 아미노산의 아미노산 치환(예: 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 (i) 내지 (iii)의 LCDR의 변이체를 포함하는 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서
    (i) 서열 번호: 44, 45 또는 46에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호: 54에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    (ii) 서열 번호: 47, 48 또는 49에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는서열 번호: 55에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    (iii) 서열 번호: 50 또는 51에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호: 57에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    (iv) 서열 번호: 52 또는 53에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호: 58에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열 번호: 74, 76, 77, 88, 89 또는 90에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 아미노 서열 번호 75로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    (ii) 서열 번호: 78, 80, 81, 91, 92 또는 93에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호: 79에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    (iii) 서열 번호: 82, 84, 94 또는 95에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호: 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    (iv) 서열 번호: 85, 87, 96 또는 97에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호: 86에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체인 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 프레임 워크 서열의 적어도 일부분은 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. CD47 결합을 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하거나, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체에 대한 CD47 결합을 길항 및/또는 차단하는 항-CD47 모노클로 날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 발현 벡터인 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포 또는 진핵 세포이고; 더욱 바람직하게는 효모 세포, 포유 동물 세포 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기에 적합한 다른 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 CHO 세포 및 293 세포인 숙주 세포.
  13. 제12항의 숙주 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-CD47 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 임의적으로 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하고, 임의적으로 상기 숙주 세포로부터 항-CD47 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 항-CD47 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  14. 제13항의 방법에 의해 제조된 항-CD47 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 임의적으로 약제학적 담체를 포함하는 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항의 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자의 대식세포 식세포 작용을 촉진시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항의 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자의 암 또는 종양을 치료하는 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 또는 종양의 증상을 경감시키는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 다양한 혈액학적 신생물 및 고형 종양으로, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 림프종, 유방암, 두경부암, 위암, 폐암, 식도암, 장암, 난소암, 자궁 경부암, 간암, 신장 암, 췌장암, 방광암, 결장 직장암, 신경 교종, 흑색종 및 기타 고형 종양인 방법.
  21. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 약물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 다른 약물은 예를 들어, 리툭시맙, 세툭시맙 및 트라스투 주맙과 같은 T 세포에 의한 인식을 통해 종양 세포를 공격하는 다양한 모노클로날 항체 약제인 방법.
  22. (a) 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CD47 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 샘플에서 CD47 단백질의 존재를 검출하는 방법.
  23. 치료 전후의 환자로부터의 샘플에서 CD47-발현 암세포의 수를 측정하고, 치료 후 CD47-발현 암 세포 수가 감소한 것은 치료가 효과적이라는 것을 나타내는 것을 포함하는 종양 치료의 효능을 측정하는 방법.
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