TWI686474B - 強毒性腸病毒71之穩定生產及其利用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種宿主細胞，其係用以使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖者，並且上述宿主細胞未表現硫酸乙醯肝素，且過度表現靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)。又，本發明提供一種使用穩定地增殖之強毒性之手足口病致病病毒的抗手足口病致病病毒疫苗或抗手足口病致病病毒藥之篩選方法。

Description

強毒性腸病毒71之穩定生產及其利用
本發明係關於一種強毒性之手足口病致病病毒之穩定生產、及使用強毒性之手足口病致病病毒之疫苗或抗病毒藥之篩選。
手足口病係小核糖核酸病毒科腸病毒屬內之主要由被分類為人類腸病毒A群(HEV-A)之病毒引發之病毒性疾病。手足口病係以出現於口腔黏膜及四肢末端之水疱疹為主症狀，以幼兒為中心於夏季流行，但通常為輕症，即便不進行特別之治療亦會於數日內自然治癒。但是，有報告稱腸病毒71(EV71)會罕見地引起無菌性腦膜炎或腦炎等嚴重之中樞神經系統之併發症，且於東亞地區，自1990年代後半起報告有由EV71之大規模流行引起之大量死亡例。認為其原因之一為以EV71為代表之腸病毒為RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)病毒，與其他RNA病毒(例如流行性感冒病毒等)同樣地變異頻度極高，於病毒大規模流行之期間產生強毒性變異株。因此，腸病毒被認為係公眾衛生上危險之病毒，而期待開發出疫苗或抗病毒藥。 為了開發出針對腸病毒之疫苗或抗病毒藥，需要腸病毒之感染動物模型。本發明者等人已明確作為細胞表面受體之清道夫受體B類成員2(SCARB2)為EV71之感染所必須之分子，作為EV71感染模型小鼠，業界製作有表現人類SCARB2之基因轉殖小鼠(非專利文獻1)。另一方面，用以使上述模型小鼠感染之EV71係使用RD(rhabdomyoma，橫紋肌瘤)細胞等病毒敏感性細胞使之增殖而製備。但是，對於使用病毒敏感性細胞使之增殖而成之EV71，屢次確認到其病原性顯著降低，該情況於進行EV71之疫苗或抗病毒藥之開發之方面成為較大障礙。 [先前技術文獻] [非專利文獻] [非專利文獻1]Fujii, K., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758 (2013)
[發明所欲解決之問題] 已知於以EV71為代表之被分類為HEV-A之腸病毒所結合之細胞膜表面受體中，除SCARB2以外，亦存在硫酸乙醯肝素或PSGL(P-selectin glycoprotein ligand，P-選擇素糖蛋白配體)-1等若干分子。但是，關於該等細胞膜表面受體之功能性差異、或與腸病毒之病原性之相關、針對變異腸病毒之選擇壓等尚未明確。 本發明之目的在於明確以EV71為代表之被分類為HEV-A之腸病毒之感染機制，並且提供強毒性之手足口病致病病毒之穩定生產。 [解決問題之技術手段] 本發明者等人經過努力研究，結果明確，藉由使經由硫酸乙醯肝素所取入之弱毒性EV71超過經由SCARB2感染之強毒性EV71進行增殖，會引起EV71之弱毒化。本發明者等人基於該新發現，確立了用以使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖之宿主細胞及方法。 即，根據一實施形態，本發明提供一種宿主細胞，其係用以使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖者，並且上述宿主細胞未表現硫酸乙醯肝素，且過度表現靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)。 上述強毒性之手足口病致病病毒較佳為被分類為人類腸病毒A群之病毒。 上述強毒性之手足口病致病病毒較佳為腸病毒71、柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒A14或柯薩奇病毒A7。 上述宿主細胞較佳為未表現EXT1基因及/或EXT2基因。 上述SCARB2較佳為人類SCARB2。 上述細胞較佳為RD細胞。 又，根據一實施形態，本發明提供一種穩定地生產強毒性之手足口病致病病毒之方法，其包括如下步驟：(1)為了獲得產生強毒性之手足口病致病病毒之細胞，向上述中所記載之宿主細胞中導入強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA之步驟；(2)為了使強毒性之手足口病致病病毒增殖，而培養藉由上述步驟(1)所獲得之細胞之步驟；及(3)回收藉由上述步驟(2)所增殖之強毒性之手足口病致病病毒之步驟。 上述強毒性之手足口病致病病毒較佳為被分類為人類腸病毒A群之病毒。 上述強毒性之手足口病致病病毒較佳為腸病毒71、柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒A14或柯薩奇病毒A7。 又，根據一實施形態，本發明提供一種強毒性之手足口病致病病毒株，其係藉由上述方法而製備。 又，根據一實施形態，本發明提供一種抗手足口病致病病毒疫苗之篩選方法，其包括如下步驟：(1)準備表現有靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)之基因轉殖小鼠之步驟；(2)對上述基因轉殖小鼠接種候選疫苗之步驟；(3)利用上述中所記載之強毒性之手足口病致病病毒株攻擊上述步驟(2)之基因轉殖小鼠之步驟；及(4)對上述步驟(3)之基因轉殖小鼠進行解析之步驟。 又，根據一實施形態，本發明提供一種抗手足口病致病病毒藥之篩選方法，其包括如下步驟：(1)準備表現有靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)之基因轉殖小鼠之步驟；(2)使上述基因轉殖小鼠感染上述中所記載之強毒性之手足口病致病病毒株之步驟；(3)向上述步驟(2)之基因轉殖小鼠投予抗手足口病致病病毒藥之候選化合物之步驟；及(4)對上述步驟(3)之基因轉殖小鼠進行解析之步驟。 上述SCARB2較佳為人類SCARB2。 上述基因轉殖小鼠較佳為4週齡以上。 [發明之效果] 本發明之用以使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖之宿主細胞及方法由於可於不使手足口病致病病毒發生弱毒化之情況下使之增殖，故而可穩定且有效率地提供強毒性之手足口病致病病毒株。 又，本發明之強毒性之手足口病致病病毒株及使用其之抗手足口病致病病毒疫苗或抗手足口病致病病毒藥之篩選方法穩定地具有較高之再現性。因此，對於疫苗及抗病毒藥之開發以及品質管理有用。
以下，詳細地說明本發明，但本發明並不限定於本說明書中所說明之實施形態。 根據第一實施形態，本發明係一種宿主細胞，其係用以使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖者，並且上述宿主細胞未表現硫酸乙醯肝素，且過度表現靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)。 所謂「手足口病致病病毒」係指腸病毒中感染人類而引起手足口病者。又，本實施形態中所謂「強毒性之手足口病致病病毒」係指手足口病致病病毒中具有神經病原性且引起致死感染者。 腸病毒係被分類為小核糖核酸病毒科(family Picornaviridae)腸病毒屬(genus Enterovirus)之病毒，不具有包膜，且於由VP1～VP4之4種蛋白質所構成之正十二面體之蛋白衣(capsid)中包含單鏈正鏈RNA。腸病毒屬包括小兒麻痹症病毒、柯薩奇A群病毒(CAV)、柯薩奇B群病毒(CBV)、人類腸道細胞致病性病毒(ECHO virus)、腸病毒。其中，感染人類之腸病毒基於分子系統解析而被分類為4個種(species)：人類腸病毒A群(HEV-A)、人類腸病毒B群(HEV-B)、人類腸病毒C群(HEV-C)、及人類腸病毒D群(HEV-D)，進而根據因抗體引起之中和反應性之差異被分類為多種血清型。 關於本實施形態之手足口病致病病毒，只要為強毒性者，則可使用任意血清型之腸病毒。目前，決定手足口病致病病毒之毒性之嚴重化的基因變異尚未充分地特定。但是，本發明係部分地基於如下見解：關於自EV71感染患者單離之EV71，多數情形時VP1蛋白衣蛋白之第145號之胺基酸為麩胺酸(E)(VP1-145E)，相對於此，關於利用培養細胞反覆進行繼代而獲得之EV71，該胺基酸為甘胺酸(G)(VP1-145G)或麩醯胺(Q)(VP1-145Q)，該等EV71為弱毒性。雖然不希望被特定理論所束縛，但推測VP1蛋白衣蛋白之第145號之胺基酸之上述變異會改變病毒粒子表面之電荷分佈，結果EV71對硫酸乙醯肝素之結合親和性發生變化之情況會引起EV71之毒性變化。因此，若為與VP1-145E同樣地不顯示出對硫酸乙醯肝素之結合親和性，經由SCARB2感染之手足口病致病病毒，則與VP1-145E同樣地為強毒性之可能性較高。此處，所謂「感染」係指至病毒粒子與宿主細胞之表面結合，被引入至宿主細胞內並進行脫殼，子代病毒進行增殖為止之一系列過程。 即，本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒較佳為被分類為HEV-A之病毒，尤佳為腸病毒71(EV71)、柯薩奇病毒A16(CVA16)、柯薩奇病毒A14(CVA14)或柯薩奇病毒A7(CVA7)，最佳為EV71。 腸病毒71(EV71)基於VP1基因之分子系統解析，被進而分類為A、B1～B5、及C1～C5之基因型(亞型(subgenogroup))。本實施形態之EV71可為任一種基因型之EV71，例如可列舉：Y90-3896株(C1型)、伊勢原(Isehara)株(C2型)、N772-仙台(Sendai).H-06株(C4型)、2716-山形(Yamagata)-03株(B5型)等，但並不限定於該等。再者，自EV71感染患者單離之上述株均為VP1-145E。各基因型之EV71之鹼基序列資訊可自特定之資料庫獲取。 又，本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒可利用表現人類SCARB2之腸病毒感染模型小鼠(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758)之50%致死量(LD50 )而加以定義。關於本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒，上述LD50 較佳為106 TCID50 以下，尤佳為105 TCID50 以下。 本實施形態之所謂「宿主細胞」係指感染手足口病致病病毒之靶細胞。所謂「感染」係如上文所定義。本實施形態之宿主細胞可使用通常用於增殖病毒之任意哺乳動物細胞而製備。用以製備本實施形態之宿主細胞的細胞例如可列舉：RD細胞、Vero細胞、人類宮頸癌(HeLa)細胞、MDCK(Madin-Darby canine kidney，馬丁達比犬腎)細胞、COS-7細胞、HEK293T細胞、BHK(baby hamster kidney，幼倉鼠腎)細胞等，但並不限定於該等。用以製備實施形態之宿主細胞的細胞較佳為RD細胞。 本實施形態之宿主細胞不表現硫酸乙醯肝素。所謂「硫酸乙醯肝素」係將葡糖胺及糖醛酸作為構成成分之糖鏈，以與核蛋白結合之蛋白多糖之形態廣泛地存在於細胞表面或細胞外基質。又，所謂「未表現」係指藉由通常進行之檢測方法(例如免疫化學方法等)，其產生量缺損或降低至無法檢測到硫酸乙醯肝素之程度。 本實施形態之宿主細胞因參與硫酸乙醯肝素之生物合成之酵素發生變異而不活化或不表現編碼該酵素之基因，而不表現硫酸乙醯肝素。本實施形態之宿主細胞較佳為藉由不表現編碼參與硫酸乙醯肝素之生物合成之酵素之基因，而不表現硫酸乙醯肝素。已知EXT基因家族參與硫酸乙醯肝素之生物合成，該家族包括EXT1、EXT2、EXTL1、EXTL2及EXTL3。EXT1及EXT2分別編碼具有α1,4-GlcNAc轉移酵素及β1,4-GlcA轉移酵素之兩活性的酵素，EXTL1、EXTL2及EXTL3亦分別編碼GlcNAc轉移酵素。即，本實施形態之宿主細胞較佳為未表現EXT1、EXT2、EXTL1、EXTL2及/或EXTL3，尤佳為未表現EXT1及EXT2中之任一者或兩者。 參與硫酸乙醯肝素之生物合成之基因之表現可藉由該領域中公知之方法而消除。例如可藉由使用CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇規律間隔短回文重複序列)/Cas9等之基因組編輯技術而破壞(剔除)基因本身，亦可藉由使用siRNA(Small Interfering Ribonucleic Acid，小干擾核糖核酸)等之基因沉默而抑制(減弱)基因之表現。又，參與硫酸乙醯肝素之生物合成之上述基因已經選殖，其鹼基序列資訊可自特定之資料庫獲取。例如人類EXT1可利用基因庫(Genbank)寄存編號NM＿000127，人類EXT2可利用基因庫寄存編號NM＿000401、NM＿207122、NM＿1178083。 本實施形態之宿主細胞進而過度表現靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)。所謂「清道夫受體B類成員2(SCARB2)」(以下，僅記載為「SCARB2」)係具有2個跨膜區之細胞表面受體蛋白，且係被分類為HEV-A之一部分病毒之感染所必須之分子。又，所謂「過度表現」SCARB2係指未導入編碼SCARB2之外來基因的宿主細胞超出原本表現之量而表現SCARB2之狀態。 於本實施形態中，SCARB2可藉由將編碼SCARB2之外來基因導入至宿主細胞中而進行過度表現。於本實施形態中可使用之編碼SCARB2之基因可為源自任意靈長類者，較佳為源自人類。編碼SCARB2之基因已進行選殖，其鹼基序列資訊可自特定之資料庫獲取。例如人類SCARB2可利用基因庫寄存編號BCO21892.1。 編碼SCARB2之外來基因向宿主細胞中之導入可藉由該領域中公知之方法而進行。例如藉由利用組入有編碼SCARB2之外來基因之表現載體對宿主細胞進行轉形，可向宿主細胞中導入編碼SCARB2之外來基因。作為表現載體，例如可使用pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)等質體、或反轉錄病毒載體等。轉形可藉由磷酸鈣共沈澱法、電穿孔法、顯微注射法、脂質體轉染法等公知方法而進行。 本實施形態之宿主細胞對於使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖而言有用。此處，所謂「穩定地」係指於進行增殖而獲得之病毒株中，維持進行增殖前之種病毒所具有之毒性。手足口病致病病毒與其他RNA病毒同樣地，增殖之變異頻度極高。因此，於使該領域中通常使用之宿主細胞感染手足口病致病病毒之情形時，隨著重複培養天數或繼代次數，因變異產生弱毒性之手足口病致病病毒，其主導性地使宿主細胞反覆感染，因此手足口病致病病毒株弱毒化。相對於此，於本實施形態之宿主細胞中，因變異產生之弱毒性之手足口病致病病毒之選擇性感染被抑制為最低限度，故而可獲得維持與進行增殖前相同之毒性之強毒性手足口病致病病毒株。 根據第二實施形態，本發明係一種穩定地生產強毒性手足口病致病病毒之方法，其包括如下步驟：(1)為了獲得產生強毒性之手足口病致病病毒之細胞，向上述中所記載之宿主細胞中導入強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA之步驟；(2)為了使強毒性之手足口病致病病毒增殖，而培養藉由上述步驟(1)所獲得之細胞之步驟；及(3)回收藉由上述步驟(2)所增殖之強毒性之手足口病致病病毒之步驟。 本實施形態之「宿主細胞」、「強毒性之手足口病致病病毒」及「穩定地」係與第一實施形態中所定義者相同。 於本實施形態之方法中，藉由向第一實施形態之宿主細胞導入強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA，而製備產生強毒性之手足口病致病病毒之細胞(以下，僅表述為「病毒產生細胞」)。強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA向宿主細胞中之導入可藉由感染強毒性之手足口病致病病毒而進行，亦可藉由製備強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA並進行轉染而進行。 強毒性之手足口病致病病毒對宿主細胞之感染可依據先前公知之條件進行。例如可藉由在以104 ～105 /cm2 之濃度接種宿主細胞後，以MOI(multiple of infection，多重感染)＝0.01～10添加強毒性之手足口病致病病毒而進行感染。用以使宿主細胞感染之強毒性手足口病致病病毒可自患有中樞神經疾病之手足口病致病病毒感染動物、或手足口病患者之咽部拭液、直腸拭液、大便等分離，或可自國立感染症研究所或者日本全國之地方衛生研究所獲取。 強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA之製備可藉由選殖強毒性之手足口病致病病毒之cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補去氧核糖核酸)，並將其體外轉錄而進行。又，強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA對宿主細胞之轉染可藉由脂質體轉染法、電穿孔法、顯微注射法等公知方法而進行。強毒性之手足口病致病病毒之cDNA可利用與上述同樣地分離或獲取之強毒性之手足口病致病病毒，藉由公知方法而製備。 繼而，培養藉由上述方式獲得之病毒產生細胞，使強毒性之手足口病致病病毒增殖。病毒產生細胞之培養條件可依據先前公知之條件而進行。例如可將病毒產生細胞培養3～7天左右直至觀察到細胞病變效應(CPE)為止。所謂CPE係因所增殖之病毒累積於細胞內而產生之病毒產生細胞之形態變化，可藉由利用光學顯微鏡進行觀察而容易地確認。 繼而，回收所增殖之強毒性之手足口病致病病毒。所增殖之強毒性之手足口病致病病毒釋出至培養液中或累積於產生細胞之內部，可藉先前由公知之方法加以回收。例如，對包含病毒產生細胞之培養液進行超音波粉碎或冷凍溶脂之重複處理，破壞病毒產生細胞，其後藉由離心分離去除細胞殘渣，藉此可回收所增殖之強毒性之手足口病致病病毒。視需要亦可藉由聚乙二醇沈澱或密度梯度超離心等，進而對所回收之強毒性之手足口病致病病毒進行純化。 本實施形態之方法藉由使用可使強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖之宿主細胞，可將弱毒性之手足口病致病病毒之增殖抑制為最低限度，而容易且穩定地生產強毒性之手足口病致病病毒。因此，根據本實施形態之方法，可容易地製備強毒性之手足口病致病病毒株。 即，根據第三實施形態，本發明係一種強毒性之手足口病致病病毒株，其係藉由上述方法而製備。 於本實施形態中，所謂「強毒性之手足口病致病病毒株」為複數個手足口病致病病毒粒子之集合，係指作為集合整體而顯示出強毒性者。本實施形態中所謂「強毒性」係與第一實施形態中所定義者相同。本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒株可實質上由單一血清型或基因型之強毒性之手足口病致病病毒所構成，亦可實質上由複數種血清型或基因型之強毒性之手足口病致病病毒所構成。此處，所謂「實質上構成」係指因變異而弱毒化之手足口病致病病毒之混入不會影響所製備之手足口病致病病毒株之神經病原性之程度。本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒株較佳為實質上由EV71之VP1-145E變異株、或具有與其相同之對SCARB2之結合親和性且經由SCARB2進行感染之EV71、CVA16、CVA14或者CVA7之變異株所構成。 本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒株具有神經病原性，可引起致死性感染。因此，對於開發出強毒性之手足口病致病病毒株之疫苗或抗病毒藥有用。 根據第四實施形態，本發明係一種抗手足口病致病病毒疫苗之篩選方法，其包括如下步驟：(1)準備表現有靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)之基因轉殖小鼠之步驟；(2)對上述基因轉殖小鼠接種候選疫苗之步驟；(3)利用上述中所記載之強毒性之手足口病致病病毒株攻擊上述步驟(2)之基因轉殖小鼠之步驟；及(4)對上述步驟(3)之基因轉殖小鼠進行解析之步驟。 本實施形態之「SCARB2」及「強毒性之手足口病致病病毒」係與第一實施形態中所定義者相同，「強毒性之手足口病致病病毒株」係與第三實施形態中所定義者相同。 於本實施形態之方法中，使用表現有靈長類之SCARB2之基因轉殖小鼠。本實施形態之基因轉殖小鼠可藉由該領域中公知之方法而製作。例如藉由向小鼠之受精卵中藉由顯微注射等導入將編碼靈長類之SCARB2之基因配置於適當之啟動子序列之下游而成之表現載體，可製作表現靈長類之SCARB2之基因轉殖小鼠。本實施形態之基因轉殖小鼠較佳為導入BAC(Bacterial Artificial Chromosome，細菌人工染色體)等人工染色體而製作，該等係選殖包含轉錄調節區域之全長之靈長類之SCARB2基因座而成。於本實施形態中可使用之編碼SCARB2之基因可為源自任意靈長類者，較佳為源自人類。編碼靈長類之SCARB2之基因的鹼基序列資訊如第一實施形態中所記載，可自特定之資料庫獲取。 又，作為表現靈長類之SCARB2之基因轉殖小鼠，可使用已存在之系統，例如可使用作為表現人類SCARB2之基因轉殖小鼠的hSCARB2-Tg10(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758)等。 本實施形態中所使用之基因轉殖小鼠較佳為確立了免疫應答之成體小鼠。關於未達4週齡之幼鼠，由於免疫應答為發展中，故而存在無法充分地評價疫苗之效果之情形。因此，於本實施形態中所使用之基因轉殖小鼠較佳為4週齡以上，尤佳為4～12週齡。 繼而，對上述基因轉殖小鼠接種候選疫苗。候選疫苗除開發階段之疫苗以外，亦包括出貨前為了品質管理而進行檢驗之經製品化之疫苗。候選疫苗例如可列舉：不活化疫苗、病毒類中空粒子疫苗、活(弱毒化)疫苗、肽疫苗、DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)疫苗等。候選疫苗之接種量根據候選疫苗之種類而有所不同，例如可於0.01～10 μg/體重kg之範圍內適當選擇。 又，於本實施形態中，候選疫苗可與佐劑混合而投予。所謂佐劑係非特異性地增強宿主動物之免疫應答之物質，各種佐劑於本技術領域為公知。作為於本實施形態中可使用之佐劑，並不限定於以下，例如可列舉：氫氧化鋁、磷酸鈣、磷酸鋁、明礬、PEPES、羧基乙烯基聚合物等。 於本實施形態中，候選疫苗之接種可單次進行或重複複數次進行，較佳為重複複數次進行。於重複複數次接種候選疫苗之情形時，較佳為以2～4週為間隔重複接種。候選疫苗之投予途徑並無特別限定，例如可列舉：腹腔內投予、靜脈內投予、皮下投予等。 繼而，利用上述強毒性之手足口病致病病毒株攻擊接種有候選疫苗之上述基因轉殖小鼠。於向未投予候選疫苗之上述基因轉殖小鼠投予之情形時，攻擊可藉由投予90%以上之小鼠死亡之量之強毒性之手足口病致病病毒株而進行。即，本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒株之攻擊投予量較佳為未投予候選疫苗之上述基因轉殖小鼠之LD50 之10～100倍量。本實施形態之強毒性之手足口病致病病毒株之投予途徑並無特別限定，例如可列舉：腹腔內投予、靜脈內投予、皮下投予等。 本實施形態之利用強毒性之手足口病致病病毒株所進行之攻擊較佳為於接種上述候選疫苗1～20週後進行。又，為了決定攻擊之時期，可自接種有候選疫苗之上述基因轉殖小鼠採集血清，並預先確認血清中之抗體力價。 繼而，藉由對上述攻擊後之基因轉殖小鼠進行解析，並評價候選疫苗之有效性。基因轉殖小鼠之解析可藉由該領域中公知之方法，例如藉由觀察生死狀態或有無麻痹症狀等而進行。 於本實施形態之篩選方法中，於藉由投予候選疫苗，與未投予候選疫苗之基因轉殖小鼠相比，死亡率及麻痹症狀顯著地減少之情形時，該候選疫苗可評價為有望作為抗手足口病致病病毒疫苗。另一方面，於藉由投予候選疫苗，與未投予候選疫苗之基因轉殖小鼠相比，死亡率及麻痹症狀未見變化或增加之情形時，該候選疫苗可評價為無望作為抗手足口病致病病毒疫苗或無效。 根據第五實施形態，本發明係一種抗手足口病致病病毒藥之篩選方法，其包括如下步驟：(1)準備表現有靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)之基因轉殖小鼠之步驟；(2)使上述基因轉殖小鼠感染上述中所記載之強毒性之手足口病致病病毒株之步驟；(3)向上述步驟(2)之基因轉殖小鼠投予抗手足口病致病病毒藥之候選化合物之步驟；及(4)對上述步驟(3)之基因轉殖小鼠進行解析之步驟。 本實施形態之「SCARB2」、「強毒性之手足口病致病病毒」及「感染」係與第一實施形態中所定義者相同，「強毒性之手足口病致病病毒株」係與第三實施形態中所定義者相同。 於本實施形態之方法中，使用表現靈長類之SCARB2之基因轉殖小鼠。本實施形態之基因轉殖小鼠係與第四實施形態中者相同。於本實施形態中所使用之基因轉殖小鼠較佳為4週齡以上，尤佳為4～12週齡。 繼而，向上述基因轉殖小鼠投予強毒性之手足口病致病病毒株，並使之感染。強毒性之手足口病致病病毒株之投予量較佳為該基因轉殖小鼠之LD50 之10～100倍量。本實施形態中之強毒性之手足口病致病病毒株之投予途徑並無特別限定，例如可列舉：腹腔內投予、靜脈內投予、皮下投予等。 繼而，對感染強毒性之手足口病致病病毒之上述基因轉殖小鼠投予抗手足口病致病病毒藥之候選化合物。候選化合物可列舉合成化合物、肽性化合物、核酸、抗體等，該等候選化合物可為新穎者，亦可為公知者。所投予之候選化合物之濃度根據化合物之種類而有所不同，例如可於1 nM～10 μM之範圍內適當選擇。又，候選化合物之投予例如可歷時1天～2週進行。候選化合物之投予途徑並無特別限定，例如可列舉經口投予、腹腔內投予、靜脈內投予、皮下投予等。 繼而，對投予了候選化合物之上述基因轉殖小鼠進行解析，並評價作為候選化合物之抗手足口病致病病毒藥之有效性。基因轉殖小鼠之解析係與第四實施形態中者同樣地，可藉由該領域中公知之方法而進行。 於本實施形態之篩選方法中，於藉由投予候選化合物，與未投予候選化合物之基因轉殖小鼠相比，死亡率及麻痹症狀顯著地減少之情形時，該候選化合物可評價為有望作為抗手足口病致病病毒藥。另一方面，於藉由投予候選化合物，與未投予候選化合物之基因轉殖小鼠相比，死亡率及麻痹症狀未見變化或增加之情形時，該候選化合物可評價為無望作為抗手足口病致病病毒藥。 [實施例] 以下，列舉實施例進一步說明本發明。再者，該等並非對本發明進行任何限定者。 ＜1.硫酸乙醯肝素(HS)缺失細胞之製作＞ 藉由使用CRISPR/Cas9系統之基因組編輯，製作不表現硫酸乙醯肝素(HS)之RD細胞。設計將EXT1基因(基因庫寄存編號NM＿000127)及EXT2基因(基因庫寄存編號NM＿000401、NM＿207122、NM＿1178083)之各者作為靶之嚮導RNA(sgRNA(small guide RNA，小嚮導RNA))之序列，並將編碼sgRNA之以下之DNA片段***至pSpCas9(BB)-2A-GFP質體(addgene公司製造)之BbsI切斷部位。 (i)用於EXT1-sgRNA之DNA序列 [化1] 正義(Sense): caccacccacaacacatc(序列編號1) 反義(Antisense): aaaccatttcctccttc(序列編號2) (ii)用於EXT2-sgRNA之DNA序列 [化2] 正義: cacccttcaattcaccaatcca(序列編號3) 反義: aaacctatttacattaac(序列編號4) 將所獲得之質體轉染至RD細胞，並培養3天。其後，將細胞供於FACSAria(Becton Dickinson公司製造)，分取GFP(Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白)陽性細胞。對所分取之細胞實施利用極限稀釋法之選殖，而獲得單一純系。 對所獲得之單一純系，藉由以下之順序解析細胞表面之HS之表現量。利用胰蛋白酶剝離細胞進行回收，並使之懸浮於含2%胎牛血清之PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸鹽緩衝液)中。分取2×105 細胞，使用小鼠抗HS單株抗體F58-10E4(amsbio公司製造)(1：50稀釋)或同型對照抗體小鼠IgM(Immunoglobulin M，免疫球蛋白M) MM-30(Biolegend公司製造)(1：50稀釋)作為一次抗體，使用Cy3標記抗小鼠IgM抗體(Jackson ImmunoResearch公司製造)(1：200稀釋)作為二次抗體，分別使之於冰上反應30分鐘。其後，藉由離心分離自反應溶液去除未反應之抗體，而製成解析用樣品。藉由將解析用樣品供於BD LSRFortessa X-20(Becton Dickinson公司製造)，而對細胞表面之Cy3結合量進行解析。又，將除使用野生型RD細胞代替所獲得之單一純系以外藉由相同順序所製備之樣品設為陰性對照。 將結果示於圖1。於野生型RD細胞中，與和同型對照抗體進行反應而成之對照樣品之螢光強度波峰相比，確認到與抗HS抗體進行反應而成之樣品之螢光強度波峰顯著地偏移，HS大量地表現(圖1左)。另一方面，於剔除了EXT1基因之RD細胞選殖(RD-ΔEXT1)及剔除了EXT2基因之RD細胞選殖(RD-ΔEXT2)中，確認到與抗HS抗體進行反應而成之樣品之螢光強度波峰與和同型對照抗體進行反應而成之對照樣品之螢光強度波峰大致重疊，HS實質上未表現(圖1中央、右)。 ＜2.HS缺失/SCARB2過度表現細胞之製作＞ 對上述1中所獲得之RD-ΔEXT1及RD-ΔEXT2，藉由以下之順序導入人類SCARB2基因(基因庫寄存編號NM＿001204255、NM＿005506)，而製作過度表現人類SCARB2之HS缺失RD細胞(RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2)。將組入有人類SCARB2基因之反轉錄病毒載體(pQCXIP-hSCARB2)與pVSV-G轉染至GP2-293包裝細胞，2天後回收上清液，而獲得人類SCARB2表現反轉錄病毒。於使RD-ΔEXT1及RD-ΔEXT2感染所獲得之反轉錄病毒後，於1 μg/ml之嘌呤黴素之存在下進行選擇培養，而獲得RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2。又，藉由相同之順序，製作於野生型RD細胞中過度表現SCARB2基因之細胞(RD-SCARB2)。 ＜3.使用HS缺失/SCARB2過度表現細胞之EV71之增殖＞ 首先，藉由以下順序製備繼代次數P0之EV71。自EV71伊勢原株(自國立感染症研究所獲取)萃取基因組RNA，並使用SuperScript(註冊商標)III逆轉錄酵素(Thermo Fisher Scientific公司製造)而製備cDNA。藉由使用以下之引子組之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)而擴增針對全長基因組RNA之cDNA(序列編號7)。 5'引子(NotI切斷序列＋T7啟動子序列＋病毒基因組5'末端之20個鹼基) [化3] cggcggccgcgtaatacgactcactataggttaaaacagcctgggttg(序列編號5) 3'引子(SalI切斷序列＋poly(A)序列(25鹼基)＋病毒基因組3'末端之10個鹼基) [化4] tactcactttttttttttttttttttttttttctattct(序列編號6) 表1.EV71伊勢原株 全長cDNA序列(序列編號7) [表1A]
Figure 02_image001
[表1B]
Figure 02_image003
[表1C]
Figure 02_image005
將所獲得之全長cDNA***至pSAV14載體之NotI/SalI切斷部位而進行選殖。將其作為模板，使用MEGAscript(註冊商標)T7套組(Ambion公司製造)進行體外轉錄，而獲得全長基因組RNA。使用Lipofectamine(註冊商標)2000將4 μg之全長基因組RNA轉染至2×106 之RD-SCARB2細胞，並於次日或第三天，於對90%以上之細胞觀察到細胞病變效應(CPE)之時刻回收細胞。對所回收之細胞進行3次冷凍溶脂，進而供於超音波粉碎機，藉此將細胞完全粉碎，使病毒游離。其後，藉由離心分離去除細胞殘渣，並回收上清液作為病毒液。 以MOI＝0.01使RD-SCARB2細胞(1×106 )感染所回收之病毒，並歷時5天觀察細胞病變效應(CPE)，於觀察到顯著之CPE後回收細胞。藉由與上述相同之順序，回收所增殖之病毒。將其設為繼代次數P0之EV71。藉由與上述相同之順序使RD-SCARB2細胞感染繼代次數P0之EV71，而獲得繼代次數P1之EV71。使用繼代次數P1之EV71，並重複相同之順序而獲得繼代次數P2之EV71(RD-SCARB2(P2))。其後，使用上述1及2中所獲得之各細胞代替RD-SCARB2細胞，進而藉由相同之順序使RD-SCARB2(P2)連續繼代，而獲得繼代次數P3～P5之EV71。 藉由以下之順序對所獲得之繼代次數P2～P5之EV71之蛋白衣蛋白VP1之胺基酸序列進行解析。自繼代次數P0～P3之EV71萃取RNA，藉由逆轉錄合成cDNA。使用以下之序列之引子，擴增VP1基因(基因庫寄存編號AB177816)之部分區域(與PV1之第58～297號之胺基酸相對應)。藉由定序對所擴增之DNA片段之鹼基序列進行解析。 [化5] 前置(Forward): CNAYAYAATATATTA(序列編號8) 反置(Reverse): ANACNARRTTNCCCATCA(序列編號9) 將結果示於表2。利用野生型RD細胞進行繼代而成之EV71中，VP1之第145號之麩胺酸(E)因1次之繼代而變異為麩醯胺(Q)。相對於此，確認到利用RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2進行繼代而成之EV71即便重複3次之繼代，VP1之第145號之麩胺酸亦未變異而維持。根據該結果顯示，藉由使用未表現HS且過度表現SCARB2之宿主細胞，可使VP1之第145號之胺基酸為麩胺酸(E)之強毒性EV71穩定地增殖。 表2.VP1之第145號之胺基酸 [表2]
Figure 107111261-A0304-0001
 ＜4.因繼代增殖引起之EV71之毒性變化(1)＞ 將利用RD-SCARB2細胞對2716-山形-03株(自山形縣衛生研究所獲取)進行1代繼代增殖而成者設為繼代次數P0之EV71，除此以外，藉由與上述3相同之順序，使用上述1及2中所獲得之各細胞進行連續繼代，藉此製備繼代次數P1～P3之EV71，並藉由以下之順序解析該等之病原性。使用hSCARB2-Tg10(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758)作為人類SCARB2表現基因轉殖小鼠。向0.5 ml、6～7週齡之hSCARB2-Tg10(各10隻)腹腔內投予106 TCID50 /ml之上述各種EV71。投予後，歷時2週每天觀察生死狀態、麻痹症狀、及體重變化。麻痹率係表示歷時2天以上於四肢中之任一者中確認到完全或不完全麻痹之症狀之小鼠之比率。體重變化率係將投予前之體重設為100%而算出。 將結果示於表3～5。利用RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2進行繼代而成之EV71即便重複3次之繼代，亦維持與P0同等或其以上之病原性。根據該結果顯示，藉由使用未表現HS且過度表現SCARB2之宿主細胞，可使強毒性EV71穩定地增殖。 表3.自投予EV71起2週後之麻痹率(%) [表3]
Figure 107111261-A0304-0002
 表4.自投予EV71起2週後之致死率(%) [表4]
Figure 107111261-A0304-0003
 表5.自投予EV71起6天後之體重變化(%) [表5]
Figure 107111261-A0304-0004
 將根據以上之結果假定之EV71之弱毒化機制示於圖2。VP1蛋白衣蛋白之第145號之胺基酸為麩胺酸(E)之強毒性EV71(VP1-145E)、與該胺基酸為甘胺酸(G)或麩醯胺(Q)之弱毒性EV71(VP1-145G或VP1-145Q)均經由SCARB2而感染宿主細胞(黑箭頭)。但是，於HS表現於細胞表面之情形時，弱毒性EV71被HS吸引而接近細胞表面，與強毒性EV71相比，變得更容易經由SCARB2而感染宿主細胞，進而與HS結合而被取入至細胞內之弱毒性EV71亦與經由SCARB2之感染途徑合流而進行增殖(白箭頭)。其結果為，認為弱毒性EV71主導性地進行增殖，隨著反覆進行繼代，產生EV71之弱毒化。 ＜5.因繼代增殖引起之EV71之毒性變化(2)＞ 使用RD-ΔEXT1-SCARB2代替RD-SCARB2作為宿主細胞，除此以外，藉由與上述3相同之順序，將全長基因組RNA轉染至細胞，並回收所增殖之病毒。分別向10週齡之hSCARB2-Tg10(各10隻)靜脈內投予使所回收之病毒進行1代繼代增殖而獲得之病毒(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))、及於上述3中使用RD-SCARB2製備之繼代次數P0之EV71(RD-SCARB2(P2))，並對投予2週後之存活率進行比較。 將結果示於表6。RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)顯示出與RD-SCARB2(P2)相比高1000倍以上之毒性。 表6.RD-SCARB2(P2)與RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)之毒性比較 [表6]
Figure 107111261-A0304-0005
 ＜6.使用強毒性EV71之疫苗檢驗(1)＞ 將SK-EV006(VP1-145G)株(自國立感染症研究所獲取)作為EV71之活疫苗，使用經福馬林固定之相同株作為不活化疫苗，分別藉由以下之順序使hSCARB2-Tg10基因轉殖小鼠免疫。 (利用活疫苗所進行之免疫) 向4週齡之hSCARB2-Tg10基因轉殖小鼠腹腔內投予106 TCID50 之SK-EV006(VP-145G)株(初次免疫)。其後，於8週齡時亦進行相同之投予(追加免疫)。向對照群投予PBS。 (利用不活化疫苗所進行之免疫) 使100 μl之福馬林固定SK-EV006(VP-145G)與等量之Alhydrogel(註冊商標)(Invivogen公司製造)混合，而製成不活化疫苗製備物。向4週齡之hSCARB2-Tg10基因轉殖小鼠皮下投予0.3 μg之不活化疫苗製備物(初次免疫)。其後，於8週齡時亦進行相同之投予(追加免疫)。向對照群中投予相同量之Alhydrogel/PBS。 於各小鼠之10週齡時進行採血，而獲得血清。藉由標準之噬菌斑減少中和試驗(PRNT)評價血清之中和抗體力價。若需要則分階段稀釋所獲得之血清，與攻擊病毒(500 pfu)混合後，使用RD細胞及SK-EV006(VP-145G)株進行噬菌斑解析，將達成噬菌斑數減少80%的血清之最大稀釋之倒數記錄為中和抗體力價。 於上述採血之次日，向各小鼠靜脈內投予攻擊病毒。攻擊病毒係使用伊勢原株(上述3中所製備之RD-SCARB2(P2))。攻擊病毒之投予量係設為使10週齡小鼠感染上述攻擊病毒而預先決定之LD50 之10～100倍量。攻擊後，歷時2週每天觀察生死狀態及麻痹症狀。麻痹率係與上述5中所記載者同樣地算出。 將結果示於表7及8。於投予活疫苗與不活化疫苗中之任一者之情形時亦確認到中和抗體力價上升、死亡率及麻痹率之顯著降低，且利用強毒性EV71之攻擊被防禦。根據該結果確認到，可進行使用hSCARB2-Tg10之成體小鼠之抗EV71疫苗之篩選。 表7.利用活疫苗之防禦效果(攻擊：伊勢原RD-SCARB2(P2) 107 TCID50 ) [表7]
Figure 107111261-A0304-0006
 表8.利用不活化疫苗之防禦效果(攻擊：伊勢原RD-SCARB2(P2) 107 TCID50 ) [表8]
Figure 107111261-A0304-0007
 ＜7.使用強毒性EV71之疫苗檢驗(2)＞ 以與上述6相同之方式，利用不活化疫苗使hSCARB2-Tg10基因轉殖小鼠免疫。於各小鼠之21週齡時進行採血，除此以外，藉由與上述6相同之順序進行噬菌斑解析。於上述採血之次日，使用上述3中所製備之RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)(LD50 ＝103.5 )作為攻擊病毒，除此以外，藉由與上述6相同之順序進行攻擊感染，並算出死亡率及麻痹率。 將結果示於表9。於使用RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)作為攻擊病毒之情形時，因其較高之毒性，確認到利用與RD-SCARB2(P2)相比更少量之病毒便能夠進行充分之攻擊。根據該結果顯示，利用未表現HS且過度表現SCARB2之宿主細胞進行繼代增殖而成之EV71作為用於疫苗檢驗之攻擊病毒有用。 表9.利用不活化疫苗之防禦效果(攻擊：伊勢原RD-ΔEXT1-SCARB2(P1) 2×105 TCID50 ) [表9]
Figure 107111261-A0304-0008
 ＜8.使用強毒性EV71之疫苗檢驗(3)＞ 除上述伊勢原株(C2型)以外，將基因型不同之強毒性EV71(Y90-3896株(C1型)(自仙台醫療中心病毒中心獲取)、N772株(C4型)(自仙台醫療中心病毒中心獲取)、C7/大阪株(B4型)(自國立感染症研究所獲取)、及2716-山形-03株(B5型)(自山形縣衛生研究所獲取))製備為用於疫苗檢驗之攻擊病毒。將上述強毒性EV71之全長cDNA序列與用於cDNA之擴增之引子組示於以下。 表10.Y90-3896株(C1型)(序列編號10) [表10A]
Figure 02_image007
[表10B]
Figure 02_image009
[表10C]
Figure 02_image011
表11.N772株(C4型)(序列編號11) [表11A]
Figure 02_image013
[表11B]
Figure 02_image015
[表11C]
Figure 02_image017
表12.C7/大阪株(B4型)(序列編號12) [表12A]
Figure 02_image019
[表12B]
Figure 02_image021
[表12C]
Figure 02_image023
表13.2716-山形-03株(B5型)(序列編號13) [表13A]
Figure 02_image025
[表13B]
Figure 02_image027
[表13C]
Figure 02_image029
表14.PCR中所使用之引子組(序列編號14～21) [表14]
Figure 107111261-A0304-0009
 使用RD-ΔEXT1-SCARB2代替RD-SCARB2作為宿主細胞，除此以外，藉由與上述3相同之順序，製備繼代次數P0之EV71。使RD-ΔEXT1-SCARB2細胞感染所獲得之繼代次數P0之EV71，而獲得繼代次數P1之EV71。使用所獲得之繼代次數P1之EV71作為攻擊病毒(接種量：1×106 TCID50 )，除此以外，藉由與上述6相同之順序，利用不活化疫苗攻擊免疫之hSCARB2-Tg10基因轉殖小鼠，並算出死亡率及麻痹率。 將結果示於表15。使用RD-ΔEXT1-SCARB2細胞進行繼代增殖而成之EV71均具有較高之毒性，確認到可用作攻擊病毒。又，上述6中所製備之不活化疫苗不僅對伊勢原株有效，對基因型不同之各種強毒性EV71株亦有效。 表15.不活化疫苗對於利用強毒性EV71(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))之攻擊感染的防禦效果 [表15]
Figure 107111261-A0304-0010
 ＜9.使用強毒性EV71之疫苗檢驗(4)＞ 使用上述8中所製備之N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)、106 TCID50 )作為攻擊病毒，除此以外，藉由與上述6相同之順序，對成體hSCARB2-Tg10小鼠進行免疫及攻擊，算出血清之中和抗體力價、體重變化、死亡率及麻痹率，並評價不活化疫苗之有效性。 將結果示於圖3及4、以及表16。未接種不活化疫苗之hSCARB2-Tg10小鼠明顯體重減少，且死亡率及麻痹率均為100%，隨著不活化疫苗之接種量之增加，確認到中和抗體力價上升、死亡率及麻痹率之顯著之降低，且確認到利用強毒性EV71之攻擊被防禦。根據該結果顯示，藉由使用成體hSCARB2-Tg10小鼠、及於缺失HS且過度表現SCARB2之宿主細胞中進行繼代增殖而成之EV71株，可評價抗EV71疫苗之有效性，而可進行抗EV71疫苗之篩選。 表16.不活化疫苗對於利用N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))之攻擊感染的防禦效果 [表16]
Figure 107111261-A0304-0011
 進而，藉由算出脊髄中之EV71之力價，而評價利用不活化疫苗之接種之強毒性EV71之增殖抑制效果。藉由與上述6相同之順序，利用不活化疫苗使成體hSCARB2-Tg10小鼠免疫，並利用上述8中所製備之N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)、106 TCID50 )進行攻擊。自攻擊1天後、2天後、3天後之小鼠(各6隻)摘取脊髄(～0.1 g)，並添加10倍量之DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，杜貝可改良伊格爾營養基)(日水製藥股份有限公司製造)而進行均質化。於15000 rpm、4℃下將所獲得之均質物離心20分鐘，並回收上清液。使用RD-SCARB2細胞對上清液之病毒力價(TCID50 )進行測定。 將結果示於圖5。於未接種不活化疫苗之hSCARB2-Tg10小鼠之脊髄中，EV71不斷進行增殖，相對於此，於接種有不活化疫苗之hSCARB2-Tg10小鼠之脊髄中，幾乎未觀察到EV71之增殖。根據該結果亦顯示，藉由使用成體hSCARB2-Tg10小鼠、及於缺失HS且過度表現SCARB2之宿主細胞中進行繼代增殖而成之EV71株，可評價抗EV71疫苗之有效性，而可進行抗EV71疫苗之篩選。
圖1係確認到剔除了EXT1基因或EXT2基因之RD細胞之硫酸乙醯肝素表現量的圖。 圖2係表示經由硫酸乙醯肝素或SCARB2之EV71之感染機制的模式圖。 圖3(a)～(d)係表示利用強毒性EV71(N772株)進行攻擊之小鼠(疫苗接種(-)或(+))之體重變化的圖表。 圖4係表示利用強毒性EV71(N772株)進行攻擊之小鼠(疫苗接種(-)或(+))之中和抗體力價及生死的圖。 圖5係表示利用強毒性EV71(N772株)進行攻擊之小鼠(疫苗接種(-)或(+))之脊髄之病毒力價(TCID50 )的圖表。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0012
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Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028

Claims (7)

  1. 一種哺乳動物宿主細胞，其係用以使被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒穩定地增殖者，並且上述哺乳動物宿主細胞未表現硫酸乙醯肝素，且過度表現靈長類之清道夫受體B類成員2(SCARB2)。
  2. 如請求項1之哺乳動物宿主細胞，其中上述被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒為腸病毒71、柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒A14或柯薩奇病毒A7。
  3. 如請求項1或2之哺乳動物宿主細胞，其未表現EXT1基因及/或EXT2基因。
  4. 如請求項1或2之哺乳動物宿主細胞，其中上述靈長類之SCARB2為人類SCARB2。
  5. 如請求項1或2之哺乳動物宿主細胞，其中上述細胞為RD細胞。
  6. 一種穩定地生產被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒之方法，其包括如下步驟：(1)為了獲得產生被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒之細胞，向如請求項1至5中任一項之哺乳動物宿主細胞中導入被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒之基因組RNA之步驟； (2)為了使被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒增殖，而培養藉由上述步驟(1)所獲得之細胞之步驟；及(3)回收藉由上述步驟(2)所增殖之被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒之步驟。
  7. 如請求項6之方法，其中上述被分類為人類腸病毒A群之強毒性之手足口病致病病毒為腸病毒71、柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒A14或柯薩奇病毒A7。
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