CN110462030B - 强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞,所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素,并且过表达灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)。另外,本发明还提供一种使用稳定地增殖的强毒性的手足口病致病病毒的抗手足口病致病病毒疫苗、或抗手足口病致病病毒药物的筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种强毒性的手足口病致病病毒的稳定生产以及使用强毒性的手足口病致病病毒的疫苗或者抗病毒药物的筛选。
背景技术
手足口病是一种病毒性疾病,是由小核糖核酸病毒科肠道病毒属内的主要被归类为人类肠道病毒A组(HEV-A)的病毒引起的。手足口病以出现在口腔粘膜及四肢末端的水疱性的皮疹为主要症状,在主要在幼儿中流行于夏季,但通常症状较轻,即使不进行特别治疗也会在几天之内自然治愈。但是,有报道称肠道病毒71(EV71)会罕见地引起无菌性脑膜炎及脑炎等严重的中枢神经***的并发症,在东亚从1990年代末期开始报告了很多因EV71的大规模流行而导致的死亡病例。一般认为,导致该情况的一个原因在于,以EV71为主的肠道病毒为RNA病毒,与其它RNA病毒(例如,流感病毒等)一样,它的突变率非常高,在病毒的大规模流行期间产生了强毒性突变株。因此,一般认为,肠道病毒在公共卫生方面是一种很危险的病毒,需要开发疫苗或抗病毒药物。
为了开发针对肠道病毒的疫苗或抗病毒药物,需要肠道病毒的感染动物模型。本发明人等已经证明,作为细胞表面受体的清道夫受体B类成员2(SCARB2)是感染EV71所必需的分子,并制作了表达人SCARB2的转基因小鼠以作为EV71感染模型小鼠(非专利文献1)。另一方面,作为用于使上述模型小鼠受到感染的EV71通过使用RD细胞等病毒敏感细胞使其增殖来制备。但是,经常确认到,使用病毒敏感细胞使其增殖后的EV71的致病性显著降低,这成为开发EV71的疫苗或抗病毒药物方面的主要障碍。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Fujii,K.等人,《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),第110卷,第36期,第14753-14758页(2013)。
发明内容
发明想要解决的课题
目前已知,在以EV71为主的被归类为HEV-A的肠道病毒所结合的细胞膜表面受体上,除SCARB2以外,还存在硫酸乙酰肝素、PSGL-1等多个分子。但是,这些细胞膜表面受体的功能性差异以及与肠道病毒的致病性的关联性、对于变异肠道病毒的选择压力等尚不明确。
本发明是为了探明以EV71为主的被归类为HEV-A的肠道病毒的感染机理并稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒而完成的。
用于解决课题的手段
本发明人等进行了潜心研究,结果探明通过使经由硫酸乙酰肝素而获取的弱毒性EV71超过经由SCARB2感染的强毒性EV71从而增殖,由此发生EV71的减毒。本发明人等基于这些新发现而建立了用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞及方法。
即,根据一种实施方式,本发明提供一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞,所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素,并且过表达灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)。
优选地,所述强毒性的手足口病致病病毒是被归类为人类肠道病毒A组的病毒。
优选地,所述强毒性的手足口病致病病毒是肠道病毒71、柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒A14或柯萨奇病毒A7。
优选地,所述宿主细胞不表达EXT1基因和/或EXT2基因。
优选地,所述SCARB2是人SCARB2。
优选地,所述细胞是RD细胞。
另外,根据一种实施方式,本发明提供一种稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒的方法,其包括下列步骤:(1)向上述记载的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA,以获得产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞;(2)培养通过所述步骤(1)得到的细胞,以使强毒性的手足口病致病病毒增殖;以及(3)回收通过所述步骤(2)增殖的强毒性的手足口病致病病毒。
优选地,所述强毒性的手足口病致病病毒是被归类为人类肠道病毒A组的病毒。
优选地,所述强毒性的手足口病致病病毒是肠道病毒71、柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒A14或柯萨奇病毒A7。
另外,根据一种实施方式,本发明提供一种采用上述方法所制备的强毒性的手足口病致病病毒株。
另外,根据一种实施方式,本发明提供一种抗手足口病致病病毒疫苗的筛选方法,其包括下列步骤:(1)准备表达了灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)的转基因小鼠;(2)向所述转基因小鼠接种候选疫苗;(3)利用上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株攻击所述步骤(2)中的转基因小鼠;以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。
另外,根据一种实施方式,本发明提供一种抗手足口病致病病毒药物的筛选方法,其包括下列步骤:(1)准备表达了灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)的转基因小鼠;(2)使所述转基因小鼠感染上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株;(3)向所述步骤(2)中的转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物;以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。
优选地,所述SCARB2是人SCARB2。
优选地,所述转基因小鼠为4周龄以上。
发明效果
本发明的用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞及方法能够使手足口病致病病毒增殖而不减毒,因此,能够稳定且有效地提供强毒性的手足口病致病病毒株。
另外,本发明的强毒性的手足口病致病病毒株及使用其抗手足口病致病病毒疫苗或抗手足口病致病病毒药物的筛选方法具有稳定且较高的重复性。因此,能够用于疫苗及抗病毒药物的开发以及质量管理。
附图说明
图1为确认了敲除EXT1基因或EXT2基因的RD细胞的硫酸乙酰肝素表达量的图;
图2为表示经由硫酸乙酰肝素或SCARB2而感染EV71的机理的示意图;
图3为表示被强毒性EV71(N772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的体重变化的图表;
图4为表示被强毒性EV71(N772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的中和抗体滴度及生死的图;
图5为表示被强毒性EV71(N772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的脊髓中的病毒滴度(TCID50)的图表。
具体实施方式
下面,详细地说明本发明,但本发明并不限定于本说明书中所描述的实施方式。
根据第一实施方式,本发明提供了一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞,所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素,并且过表达灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)。
“手足口病致病病毒”表示肠道病毒中会感染人而引起手足口病的病毒。另外,本实施方式中的“强毒性的手足口病致病病毒”是指手足口病致病病毒中具有神经致病性并引起致命性感染的病毒。
肠道病毒是被归类为小核糖核酸病毒科(family Picornaviridae)肠道病毒属(genus Enterovirus)的病毒,它没有包膜,在由VP1~VP4四种蛋白构成的正十二面体的衣壳中包含单链正链RNA。肠道病毒属中包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A组病毒(CAV)、柯萨奇B组病毒(CBV)、埃可病毒、肠道病毒。其中,感染人的肠道病毒基于分子***发育分析而被归类为四个种(species):人类肠道病毒A组(HEV-A)、人类肠道病毒B组(HEV-B)、人类肠道病毒C组(HEV-C)、以及人类肠道病毒D组(HEV-D),而且,根据由抗体所产生的中和反应性的差异而被归类为很多血清型。
作为本实施方式中的手足口病致病病毒,只要是强毒性的病毒即可,能够使用任意的血清型的肠道病毒。目前,尚未充分确定用以决定手足口病致病病毒的毒性严重性的基因变异。但是,本发明的一部分基于下述发现:在从EV71感染患者所分离的EV71中,大多数情况下,VP1衣壳蛋白的第145个氨基酸为谷氨酸(E)(VP1-145E),而在通过培养细胞重复传代而得到的EV71中,该氨基酸为甘氨酸(G)(VP1-145G)或谷氨酰胺(Q)(VP1-145Q),这些EV71为弱毒性。虽然不限定于特定的理论,但推测VP1衣壳蛋白的第145个氨基酸的上述变异改变病毒粒子表面的电荷分布,其结果,EV71对于硫酸乙酰肝素的结合亲和性产生变化而导致EV71的毒性变化。因此,如果为与VP1-145E相同地不显示对于硫酸乙酰肝素的结合亲和性且经由SCARB2而感染的手足口病致病病毒,则与VP1-145E相同地成为强毒性的可能性高。在此,“感染”表示病毒粒子结合于宿主细胞的表面并被吸收入宿主细胞内而脱壳至后代病毒增殖为止的一系列过程。
即,本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒优选被分离为HEV-A的病毒,特别优选为肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A16(CVA16)、柯萨奇病毒A14(CVA14)或柯萨奇病毒A7(CVA7),最优选为EV71。
肠道病毒71(EV71)基于VP1基因的分子***发育分析而被进一步归类为A、B1~B5以及C1~C5这些基因型(subgenogroup)。本实施方式中的EV71可以是任意基因型的EV71,例如,可列举:Y90-3896株(C1型)、Isehara株(C2型)、N772-Sendai.H-06株(C4型)、2716-Yamagata-03株(B5型)等,但不限定于此,需要指出的是,从EV71感染患者中所分离的上述株均为VP1-145E。各基因型的EV71的碱基序列信息能够从规定的数据库中获得。
另外,本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒能够通过表达人SCARB2的肠道病毒感染模型小鼠(《美国科学院院刊》,第110卷,第36期,第14753-14758页)中的半数致死量(LD50)来定义。作为本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒,上述LD50优选为106TCID50以下,特别优选为105TCID50以下。
本实施方式中的“宿主细胞”是指手足口病致病病毒所感染的靶细胞。“感染”如上面所定义那样。本实施方式中的宿主细胞能够使用通常用于病毒增殖的任意的哺乳动物细胞来制备。作为能够用于制备本实施方式中的宿主细胞的细胞,例如,可列举:RD细胞、Vero细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、COS-7细胞、HEK293T细胞、BHK细胞等,但不限定于这些。能够用于制备本实施方式中的宿主细胞的细胞优选为RD细胞。
本实施方式中的宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素。“硫酸乙酰肝素”是以葡糖胺及糖醛酸为构成成分的糖链,以结合于核心蛋白的蛋白聚糖的形式而广泛存在于细胞表面或细胞外基质。另外,“不表达”表示硫酸乙酰肝素的产生量缺失、或者降低至凭借通常所用检测手段(例如免疫化学的手法等)无法检测到的程度。
本实施方式中的宿主细胞通过使参与硫酸乙酰肝素的生物合成的酶因变异而灭活或者不表达该酶的编码基因从而不表达硫酸乙酰肝素。优选地,本实施方式中的宿主细胞通过不表达参与硫酸乙酰肝素生物合成的酶的编码基因而不表达硫酸乙酰肝素。目前已知,EXT基因家族参与硫酸乙酰肝素的生物合成,该家族中包括EXT1、EXT2、EXTL1、EXTL2及EXTL3。EXT1及EXT2分别编码具有α1、4-GlcNAc转移酶及β1、4-GlcA转移酶的双活性的酶,EXTL1、EXTL2及EXTL3还分别编码GlcNAc转移酶。即,本实施方式中的宿主细胞优选不表达EXT1、EXT2、EXTL1、EXTL2和/或EXTL3,特别优选不表达EXT1及EXT2中任意一者或两者。
对于参与硫酸乙酰肝素的生物合成的基因的表达而言,能够通过该领域中众所知周的方法进行消除。例如,可以通过利用CRISPR/Cas9等的基因组编辑技术来破坏(敲除)基因自身,也可以通过利用siRNA等的基因沉默来抑制(敲减)基因表达。另外,参与硫酸乙酰肝素的生物合成的上述基因已经被克隆,其碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。例如,作为人EXT1,能够利用Genbank登录号NM_000127,作为人EXT2,能够利用Genbank登录号NM_000401、NM_207122、NM_1178083。
本实施方式中的宿主细胞进一步过表达灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)。“清道夫受体B类成员2(SCARB2)”(下面简称为“SCARB2”)为具有两个跨膜区的细胞表面受体蛋白,它是被归类为HEV-A的一部分病毒的感染所必需的分子。另外,“过表达”SCARB2是指未导入编码SCARB2的外源基因的宿主细胞表达了SCARB2且超过了原本所表达的量的状态。
在本实施方式中,能够通过将编码SCARB2的外源基因导入宿主细胞而使SCARB2过表达。能够在本实施方式中使用的编码SCARB2的基因可以来自任意的灵长类,但优选为来自人。编码SCARB2的基因已经被克隆,其碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。例如,作为人SCARB2,能够利用Genbank登录号BC021892.1。
通过本领域中众所知周的方法,能够将编码SCARB2的外源基因导入宿主细胞。例如,能够通过利用整合有编码SCARB2的外源基因的表达载体来转化宿主细胞,将编码SCARB2的外源基因导入宿主细胞。作为表达载体,例如,能够使用pcDNA3.1(Invitrogen公司制造)等质粒及逆转病毒载体等。转化能够通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、脂质转染法等众所周知的方法来进行。
本实施方式的宿主细胞能够用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖。在此,“稳定(地)”表示在增殖而得到的病毒株中,保持了增殖前的种子病毒所具有的毒性。与其它RNA病毒相同,手足口病致病病毒在增殖期间的突变率极高。因此,在使本领域中常用的宿主细胞感染了手足口病致病病毒的情况下,随着培养天数或传代数的增加,通过变异而产生弱毒性的手足口病致病病毒,该病毒优先重复感染宿主细胞,从而使手足口病致病病毒株减毒。而在本实施方式中的宿主细胞中,通过突变而引起的弱毒性的手足口病致病病毒的选择性感染被抑制为最小限度,因此,能够获得保持与增殖前相同的毒性的强毒性的手足口病致病病毒株。
根据第二实施方式,本发明提供一种稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒的方法,其包括下列步骤:(1)向上述记载的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA,以获得产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞;(2)培养通过所述步骤(1)得到的细胞,以使强毒性的手足口病致病病毒增殖;以及(3)回收通过所述步骤(2)增殖的强毒性的手足口病致病病毒。
本实施方式中的“宿主细胞”、“强毒性的手足口病致病病毒”及“稳定(地)”与第一实施方式中的定义相同。
在本实施方式的方法中,向第一实施方式中的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA,从而制备产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞(下面简称“产病毒细胞”)。可以通过感染强毒性的手足口病致病病毒来向宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA,也可以通过制备强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA并进行转染而导入。
能够根据现有公知的条件使宿主细胞感染强毒性的手足口病致病病毒。例如,能够以104~105/cm2的浓度接种宿主细胞之后,以MOI=0.01~10添加强毒性的手足口病致病病毒,从而感染病毒。用于使宿主细胞感染的强毒性的手足口病致病病毒能够从中枢神经疾病发病后的手足口病致病病毒感染动物或手足口病患者的咽喉拭子、直肠拭子、粪便等中分离,或者从日本国立传染病研究所或日本国内地方卫生研究所来获得。
强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA能够通过克隆强毒性的手足口病致病病毒的cDNA并对其进行体外转录来制备。另外,能够通过脂质转染法、电穿孔法、显微注射法等众所周知的方法来向宿主细胞转染强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA。强毒性的手足口病致病病毒的cDNA能够通过公知的方法从如上所述那样分离或获取的强毒性的手足口病致病病毒中来制备。
接着,培养由上述得到的产病毒细胞,从而使强毒性的手足口病致病病毒增殖。作为产病毒细胞的培养条件,能够根据现有公知的条件来进行。例如,能够培养产病毒细胞3~7天左右,直至观察到细胞病变效应(CPE)。CPE是指由于增殖后的病毒在细胞内积累而产生的产病毒细胞的形态变化,能够通过利用光学显微镜观察而容易地确认到。
接着,回收增殖的强毒性的手足口病致病病毒。增殖的强毒性的手足口病致病病毒释放至培养液中或在产生细胞的内部积累,能够通过现有公知的方法来回收。例如,对于包含产病毒细胞的培养液,反复进行超声波破碎或冻融,破坏产病毒细胞之后,通过离心分离去除细胞残渣,由此能够回收增殖的强毒性的手足口病致病病毒。也可以根据需要,通过聚乙二醇沉淀或密度梯度超速离心等来进一步提纯所回收的强毒性的手足口病致病病毒。
本实施方式的方法通过能够使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞而将将弱毒性的手足口病致病病毒的增殖限制为最小限度,由此,能够容易且稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒。因此,根据本实施方式的方法,能够容易地制备强毒性的手足口病致病病毒株。
即,根据第三实施方式,本发明提供一种采用上述方法所制备强毒性的手足口病致病病毒株。
在本实施方式中,“强毒性的手足口病致病病毒株”是多个手足口病致病病毒粒子的集合体,集合体整体显示出强毒性。本实施方式中的“强毒性”与第一实施方式中的定义相同。本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株可以实质上由单一的血清型或基因型的强毒性的手足口病致病病毒而构成,也可以实质上(基本上)由多种血清型或基因型的强毒性的手足口病致病病毒而构成。在此,“实质上(基本上)由~构成”表示通过突变而减毒后的手足口病致病病毒的混入达到不会影响所制备的手足口病致病病毒株的神经致病性的程度。优选地,本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株实质上由EV71的VP1-145E突变株、或具有与之相同的对于SCARB2的结合亲和性的并经由SCARB2而感染的EV71、CVA16、CVA14或CVA7的突变株而构成。
本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株具有神经致病性,能够引起致命性感染。因此,能够用于开发强毒性的手足口病致病病毒株的疫苗或抗病毒药物。
根据第四实施方式,本发明提供一种抗手足口病致病病毒疫苗的筛选方法,其包括下列步骤:(1)准备表达了灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)的转基因小鼠;(2)向所述转基因小鼠接种候选疫苗;(3)利用上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株来攻击所述步骤(2)中的转基因小鼠;以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。
本实施方式中的“SCARB2”及“强毒性的手足口病致病病毒”与第一实施方式中的定义相同,“强毒性的手足口病致病病毒株”与第三实施方式中的定义相同。
在本实施方式的方法中,使用表达了灵长类的SCARB2的转基因小鼠。本实施方式中的转基因小鼠能够通本领域中众所周知的方法来制作。例如,通过显微注射等向小鼠的受精卵中表达载体,该表达载体是导入将编码灵长类的SCARB2的基因配置于适当的启动子序列的下游而成的,由此,能够制作表达了灵长类的SCARB2的转基因小鼠。优选地,本实施方式中的转基因小鼠通过导入克隆了包含转录调控区的全长的灵长类的SCARB2基因座的BAC等人工染色体而制作。能够用于本实施方式的编码SCARB2的基因可以来自任意的灵长类但优选来自人。如第一实施方式中所记载那样,编码灵长类的SCARB2的基因的碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。
另外,作为表达了灵长类的SCARB2的转基因小鼠,可以使用已经存在的***,例如,能够使用表达了人SCARB2的转基因小鼠hSCARB2-Tg10(《美国科学院院刊》,第110卷,第36期,第14753-14758页)等。
优选地,本实施方式中所使用的转基因小鼠为建立了免疫反应的成年小鼠。不足4周龄的小鼠幼崽的免疫反应正在发育期间,因此,有时不能充分地评价疫苗的效果。因此,本实施方式中所使用的转基因小鼠优选为4周龄以上,特别优选为4~12周龄。
接着,向上述转基因小鼠接种候选疫苗。候选疫苗包含处于开发阶段的疫苗、以及出货前进行检验以实施质量管理的产品化疫苗。作为候选疫苗,例如,可列举灭活疫苗、病毒样空心颗粒疫苗、活疫苗(减毒疫苗)、肽疫苗、DNA疫苗等。候选疫苗的接种量根据候选疫苗的种类而不同,例如,能够在0.01~10μg/体重kg的范围内适当选择。
另外,在本实施方式中,候选疫苗可以与佐剂混合后给药。佐剂是指非特异性地增强宿主动物的免疫反应的物质,各种佐剂是本技术领域中所公知的。作为能够用于本实施方式的佐剂,例如,可列举:氢氧化铝、磷酸钙、磷酸铝、明矾、PEPES、羧基乙烯基聚合物等,但不限定于这些。
在本实施方式中,候选疫苗的接种能够进行一次或反复进行多次,但优选反复进行多次。在反复多次接种候选疫苗的情况下,优选以2~4周的间隔反复接种。对于候选疫苗的给药途径没有特别限定,例如,可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。
接着,利用上述强毒性的手足口病致病病毒株来攻击接种候选疫苗后的上述转基因小鼠。攻击通过给药强毒性的手足口病致病病毒株来进行,给药量是向未给药候选疫苗的上述转基因小鼠给药时将会导致90%以上的小鼠死亡的量。即,优选地,本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株的攻击给药量为未给药候选疫苗的上述转基因小鼠中的LD50的10~100倍量。本实施方式对于强毒性的手足口病致病病毒株的给药途径没有特别限定,例如,可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。
作为利用本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株所进行的攻击,优选在接种上述候选疫苗1~20周后进行。另外,为了确定攻击的时段,可以预先从接种了候选疫苗的上述转基因小鼠中采取血清,并确认血清中的抗体滴度。
接着,分析上述攻击后的转基因小鼠,由此评价候选疫苗的有效性。能够通过利用本领域中众所周知的方法来观察例如生死状态及有无瘫痪症状等而分析转基因小鼠。
在本实施方式的筛选方法中,在通过给药候选疫苗,死亡率及瘫痪症状与未给药候选疫苗的转基因小鼠相比显著减少的情况下,则能够评价该候选疫苗有望作为抗手足口病致病病毒疫苗。另一方面,在通过给药候选疫苗,死亡率及瘫痪症状与未给药候选疫苗的转基因小鼠相比未见变化或增加的情况,则能够评价该候选疫苗无望作为抗手足口病致病病毒疫苗或者作为抗手足口病致病病毒疫苗无效。
根据第五实施方式,本发明为一种抗手足口病致病病毒药物的筛选方法,其包括下列步骤:(1)准备表达了灵长类的清道夫受体B类成员2(SCARB2)的转基因小鼠;(2)使所述转基因小鼠感染上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株;(3)向所述步骤(2)中的转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物;以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。
本实施方式中的“SCARB2”,“强毒性的手足口病致病病毒”及“感染”与第一实施方式中定义相同,“强毒性的手足口病致病病毒株”与第三实施方式中的定义相同。
在本实施方式的方法中,使用表达了灵长类的SCARB2的转基因小鼠。本实施方式中的转基因小鼠与第四实施方式中的小鼠相同。本实施方式中所使用的转基因小鼠优选为4周龄以上,特别优选为4~12周龄。
接着,向上述转基因小鼠给药并感染强毒性的手足口病致病病毒株。优选地,强毒性的手足口病致病病毒株的给药量为该转基因小鼠中的LD50的10~100倍量。本实施方式对于强毒性的手足口病致病病毒株的给药途径没有特别限定,例如,可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。
接着,向感染了强毒性的手足口病致病病毒的上述转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物。作为候选化合物,可列举合成化合物、肽化合物、核酸、抗体等,这些候选化合物可以是新型化合物,也可以是公知的化合物。所给药的候选化合物的浓度根据化合物的种类而有所不同,例如,能够在1nM~10μM的范围内适当选择。另外,能够历时例如1天~2周来给药候选化合物。对于候选化合物的给药途径没有特别限定,例如,可列举口服给药、腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。
接着,分析已给药候选化合物的上述转基因小鼠,并评价候选化合物作为抗手足口病致病病毒药物的有效性。与第四实施方式相同地,转基因小鼠的分析能够通过本领域中众所周知的方法来进行。
在本实施方式的筛选方法中,在通过给药候选化合物,死亡率及瘫痪症状与未给药候选化合物的转基因小鼠相比而显著减少的情况下,则能够评价该候选化合物有望作为抗手足口病致病病毒药物。另一方面,在通过给药候选化合物,死亡率及瘫痪症状与未给药候选化合物的转基因小鼠相比未见变化或增加的情况下,则能够评价该候选化合物无望作为抗手足口病致病病毒药物。
实施例
下面,通过例举实施例对本发明进行进一步说明。需要指出的是这些实施例丝毫不限定本发明。
<1.硫酸乙酰肝素(HS)缺失细胞的制作>
通过利用CRISPR/Cas9***的基因组编辑,制作不表达硫酸乙酰肝素(HS)的RD细胞。设计分别以EXT1基因(Genbank登录号NM_000127)及EXT2基因(Genbank登录号NM_000401、NM_207122、NM_1178083)为标靶的指导RNA(sgRNA)的序列,并将下面的编码sgRNA的DNA片段***pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒(Addgene公司制造)的BbsI切割位点。
(i)用于EXT1-sgRNA的DNA序列
正义(Sense):caccacccacaacacatc(序列号1)
反义(Antisense):aaaccatttcctccttc(序列号2)
(ii)用于EXT2-sgRNA的DNA序列
正义(Sense):cacccttcaattcaccaatcca(序列号3)
反义(Antisense):aaacctatttacattaac(序列号4)
将得到的质粒转染至RD细胞,并培养3天。然后,将细胞提供给FACSAria(Becton,Dickinson公司制造),制备GFP阳性细胞。利用极限稀释法对所制备的细胞实施克隆,从而获得单克隆。
针对得到的单克隆,通过下面的流程分析细胞表面上的HS的表达量。利用胰蛋白酶剥离并回收细胞,将其悬浮于含有2%胎牛血清的PBS。制备2×105细胞,使用小鼠抗HS单克隆抗体F58-10E4(Amsbio公司制造)(1:50稀释)或同型对照抗体小鼠IgM MM-30(Biolegend公司制造)(1:50稀释)作为一抗,使用Cy3标记抗小鼠IgM抗体(JacksonImmunoResearch公司制造)(1:200稀释)作为二次抗体,分别在冰上使其反应30分钟。然后,通过离心分离从反应溶液中去除未反应的抗体,作为用于分析的样品。将用于分析的样品提供给BD LSRFortessa X-20(Becton,Dickinson公司制造),从而分析细胞表面的Cy3结合量。另外,使用野生型RD细胞来代替得到的单克隆,除此之外,按照同样的流程制备的样品,将其用作阴性对照。
将结果示于图1。在野生型RD细胞中,和与同型对照抗体反应的对照样品的荧光强度峰相比,与抗HS抗体反应的样品的荧光强度峰显著偏移,确认大量表达了HS(图1的左侧)。另一方面,在敲除了EXT1基因的RD细胞克隆(RD-ΔEXT1)以及敲除了EXT2基因的RD细胞克隆(RD-ΔEXT2)中,与抗HS抗体反应后的样品的荧光强度峰几乎和与同型对照抗体反应后的对照样品的荧光强度峰重叠,确认实质上未表达HS(图1的中央、右侧)。
<2.HS缺失/SCARB2过表达细胞的制作>
通过下面的流程,向上述1中得到的RD-ΔEXT1及RD-ΔEXT2导入人SCARB2基因(Genbank登录号NM_001204255、NM_005506),从而制作过表达人SCARB2的HS缺失RD细胞(RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2)。将整合有人SCARB2基因的逆转病毒载体(pQCXIP-hSCARB2)和pVSV-G转染至GP2-293包装细胞,并在2天后回收上清,从而得到人SCARB2表达逆转病毒。使得到的逆转病毒感染RD-ΔEXT1及RD-ΔEXT2之后,在1μg/ml嘌呤霉素存在下进行选择培养,从而得到RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2。另外,通过同样的流程,制作使野生型RD细胞过表达SCARB2基因而得到的细胞(RD-SCARB2)。
<3.使用HS缺失/SCARB2过表达细胞增殖EV71>
首先,通过下面的流程制备传代数P0的EV71。从EV71Isehara株(由日本国立传染病研究所获得)中提取基因组RNA,使用SuperScript(注册商标)III逆转录酶(ThermoFisher Scientific公司制造)制备cDNA。通过利用下面的引物组的PCR来扩增对于全长基因组RNA的cDNA(序列号7)。
5’引物(NotI切割序列+T7启动子序列+病毒基因组5’端的20个碱基)
cggcggccgcgtaatacgactcactataggttaaaacagcctgggttg(序列号5)
3’引物(SalI切割序列+poly(A)序列(25碱基)+病毒基因组3’端的10个碱基)
tactcactttttttttttttttttttttttttctattct(序列号6)
表1.EV71Isehara株全长cDNA序列(序列号7)
表1A
表1B
表1C
将得到的全长cDNA***pSAV14载体的NotI/SalI切割位点以进行克隆。以其为模板,使用MEGAscript(注册商标)T7kit(Ambion公司制造)进行体外转录,从而得到全长基因组RNA。使用Lipofectamine(注册商标)2000将4μg全长基因组RNA转染至2×106的RD-SCARB2细胞,第二天或第三天,在90%以上的细胞观察到细胞病变效应(CPE)使回收细胞。对所回收的细胞进行三次冻融,并提供给超声波破碎机,从而完全粉碎细胞,使病毒游离出来。然后,通过离心分离去除细胞残渣,并将上清作为病毒液而回收。
使所回收的病毒以MOI=0.01感染RD-SCARB2细胞(1×106),历时5天观察细胞病变效应(CPE),观察到显著的CPE后,回收细胞。通过与上述同样的流程,回收增殖后的病毒。并将其作为传代数P0的EV71。通过与上述同样的流程使传代数P0的EV71感染RD-SCARB2细胞,从而得到传代数P1的EV71。使用传代数P1的EV71反复进行同样的流程,从而得到传代数P2的EV71(RD-SCARB2(P2))。然后,使用上述1及2中得到的各细胞来代替RD-SCARB2细胞,并进一步通过同样的流程连续传代RD-SCARB2(P2),得到直至传代数为P3~P5的EV71。
通过下面的流程分析所得到的传代数P2~P5的EV71的衣壳蛋白VP1的氨基酸序列。从传代数P0~P3的EV71中提取RNA,通过逆转录合成cDNA。使用下面的序列的引物,扩增VP1基因(Genbank登录号AB177816)的部分区域(对应于PV1的第58~297个氨基酸)。通过测序来分析被扩增后的DNA片段的碱基序列。
正向(Forward):CNAYAYAATATATTA(序列号8)
反向(Reverse):ANACNARRTTNCCCATCA(序列号9)
将结果示于表2。确认到,在由野生型RD细胞传代而来的EV71中,VP1的第145个谷氨酸(E)通过一次传代而突变为谷氨酰胺(Q)。而由RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2传代而来的EV71仅是反复三次传代,仍然保持了VP1的第145个谷氨酸而没有突变。该结果表明,通过使用未表达HS且过表达SCARB2的宿主细胞,能够使VP1的第145个氨基酸为谷氨酸(E)的强毒性EV71稳定地增殖。
表2.VP1的第145个氨基酸
表2
宿主细胞 | P2 | P3 | P5 |
RD | - | Q | Q |
RD-ΔEXT1 | - | E | Q |
RD-ΔEXT2 | - | E | Q |
RD-SCARB2 | E | E | Q/E |
RD-ΔEXT1-SCARB2 | - | E | E |
RD-ΔEXT2-SCARB2 | - | E | E |
<4.由传代增殖而引起的EV71的毒性变化(1)>
将利用RD-SCARB2细胞使2716-Yamagata-03株(由日本山形县卫生研究所获得)1代传代增殖而得到的株作为传代数P0的EV71;除此之外,通过与上述3同样的流程,使用上述1及2中得到的各个细胞进行连续传代,由此制备传代数P1~P3的EV71,并通过下面的流程来分析它们的致病性。作为人SCARB2表达转基因小鼠,使用hSCARB2-Tg10(《美国科学院院刊》,第110卷,第36期,第14753-14758页)。向6~7周龄的hSCARB2-Tg10(各10只)腹腔给药106TCID50/ml上述各种EV71 0.5ml。给药之后,历时2周每天观察生死状态、瘫痪症状及体重变化。瘫痪率是表示在2天或更长的时间内四肢中的任意一个可见完全或不完全瘫痪的症状的小鼠的比例。体重变化率以给药前的体重为100%而算出。
将结果示于表3~5。这表明,由RD-ΔEXT1-SCARB2及RD-ΔEXT2-SCARB2传代而来的EV71即使反复三次传代,仍然保持了与P0相同或超过其致病性。由该结果表明,通过使用未表达HS且过表达了SCARB2的宿主细胞,能够使强毒性EV71稳定地增殖。
表3.给药EV712周后的瘫痪率(%)
表3
宿主细胞 | P0 | P1 | P3 |
RD | - | 10 | 0 |
RD-ΔEXT1 | - | - | 0 |
RD-ΔEXT2 | - | 0 | 0 |
RD-SCARB2 | 90 | 60 | 0 |
RD-ΔEXT1-SCARB2 | - | 100 | 100 |
RD-ΔEXT2-SCARB2 | - | 100 | 100 |
表4.给药EV71 2周后的致死率(%)
表4
宿主细胞 | P0 | P1 | P3 |
RD | - | 0 | 0 |
RD-ΔEXT1 | - | - | 0 |
RD-ΔEXT2 | - | 0 | 0 |
RD-SCARB2 | 50 | 30 | 0 |
RD-ΔEXT1-SCARB2 | - | 90 | 100 |
RD-ΔEXT2-SCARB2 | - | 60 | 70 |
表5.给药EV71 6天后的体重变化(%)
表5
宿主细胞 | P0 | P1 | P3 |
RD | - | 99.6 | 96.7 |
RD-ΔEXT1 | - | - | 96.1 |
RD-ΔEXT2 | - | 95.6 | 97.4 |
RD-SCARB2 | 83.3 | 91.0 | 96.9 |
RD-ΔEXT1-SCARB2 | - | 76.0 | 全部死亡 |
RD-ΔEXT2-SCARB2 | - | 72.7 | 73.0 |
将根据上面的结果所预测的EV71的减毒机理示于图2。VP1衣壳蛋白的第145个氨基酸为谷氨酸(E)的强毒性EV71(VP1-145E)、以及同氨基酸为甘氨酸(G)或谷氨酰胺(Q)的弱毒性EV71(VP1-145G或VP1-145Q)均经由SCARB2而感染宿主细胞(黑色箭头)。但是,在细胞表面上表达了HS的情况下,弱毒性EV71被HS吸引而靠近细胞表面,从而比强毒性EV71更容易经由SCARB2而感染宿主细胞,而且,与HS结合而整合入细胞内的弱毒性EV71也与经由SCARB2的感染路径进行汇合而增殖(白色箭头)。一般认为,其结果,弱毒性EV71优先增殖,随着传代的增加,发生EV71的减毒。
<5.由传代增殖而引起的EV71的毒性变化(2)>
使用RD-ΔEXT1-SCARB2来代替RD-SCARB2作为宿主细胞,除此之外,通过与上述3同样的流程,将全长基因组RNA转染至细胞,并回收增殖后的病毒。分别向10周龄的hSCARB2-Tg10(各10只)静脉给药对所回收的病毒进行1代传代增殖而得到的病毒(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))、以及上述3中使用RD-SCARB2而制备的传代数P0的EV71(RD-SCARB2(P2)),并比较给药2周后的存活率。
将结果示于表6。这表明,与RD-SCARB2(P2)相比,RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)经由高出1000倍以上的毒性。
表6.RD-SCARB2(P2)和RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)的毒性比较
表6
<6.使用强毒性EV71的疫苗的检验(1)>
将SK-EV006(VP1-145G)株(由日本国立传染病研究所获得)作为EV71的活疫苗,将用***固定后的相同株用作灭活疫苗,并分别通过下面的流程来免疫hSCARB2-Tg10转基因小鼠。
(利用活疫苗的免疫)
向4周龄的hSCARB2-Tg10转基因小鼠腹腔给药106TCID50的SK-EV006(VP-145G)株(基础免疫)。然后,在8周龄时,进行相同的给药(加强免疫)。向对照组给药PBS。
(利用灭活疫苗的免疫)
使100μl***固定SK-EV006(VP-145G)与等量的Alhydrogel(注册商标)(Invivogen公司制造)混合,制得灭活疫苗制备物。将0.3μg灭活疫苗制备物进行皮下给药至4周龄的hSCARB2-Tg10转基因小鼠(基础免疫)。然后,在8周龄时,进行相同的给药(加强免疫)。向对照组给药等量的Alhydrogel/PBS。
在每只小鼠10周龄时采血,从而获得血清。通过标准噬斑减少中和试验(PRNT)来评价血清的中和抗体滴度。简而言之,连续稀释得到的血清,与攻击病毒(500pfu)混合之后,使用RD细胞及SK-EV006(VP-145G)株进行噬斑检测,将实现噬斑数量减少80%的血清的最大稀释的倒数作为中和抗体滴度并记录。
上述采血后第二天,向每只各小鼠静脉给药攻击病毒。作为攻击病毒,使用Isehara株(上述3中所制备的RD-SCARB2(P2))。攻击病毒的给药量采用使10周龄小鼠感染上述攻击病毒而预先确定的LD50的10~100倍量。攻击之后,历时2周每天观察生死状态及瘫痪症状。瘫痪率与上述5中的记载同样地算出。
将结果示于表7及表8。在给药活疫苗和灭活疫苗中的任意一种的情况下,均可见中和抗体滴度升高、死亡率及瘫痪率显著降低,表示防御了强毒性EV71的攻击。由该结果确认到,能够使用hSCARB2-Tg10的成年小鼠来筛选抗EV71疫苗。
表7.活疫苗的防御效果(攻击:Isehara RD-SCARB2(P2)107TCID50)
表7
表8.灭活疫苗的防御效果(攻击:Isehara RD-SCARB2(P2)107TCID50)
表8
<7.使用强毒性EV71检验疫苗(2)>
与上述6同样地,通过灭活疫苗免疫hSCARB2-Tg10转基因小鼠。在每只小鼠的21周龄时采血,除此之外,通过与上述6同样的流程来进行噬斑检测。上述采血后第二天,使用上述3中所制备的RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)(LD50=103.5)作为攻击病毒,除此之外,通过与上述6同样的流程进行攻击感染,并算出死亡率及瘫痪率。
将结果示于表9。确认到,在使用RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)作为攻击病毒的情况下,由于其较高的毒性,可以通过比RD-SCARB2(P2)更少量的病毒充分地进行攻击。由该结果表明,使用为表达HS且过表达了SCARB2的宿主细胞传代增殖后的EV71可以用作用于疫苗检验的攻击病毒。
表9.灭活疫苗的防御效果(攻击:Isehara RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)2×105TCID50)
表9
疫苗接种量(μg/针) | 死亡率(%) | 瘫痪率(%) |
0 | 100 | 100 |
0.003 | 0 | 33 |
0.03 | 17 | 17 |
0.3 | 0 | 13 |
<8.使用强毒性EV71检验疫苗(3)>
除上述Isehara株(C2型)之外,制备基因型不同的强毒性EV71(Y90-3896株(C1型)(由日本仙台医疗中心病毒中心获得)、N772株(C4型)(由日本仙台医疗中心病毒中心获得)、C7/Osaka株(B4型)(由日本国立传染病研究所获得)、以及2716-Yamagata-03株(B5型)(由日本山形县卫生研究所获得))来作为用于疫苗检验的攻击病毒。将上述强毒性EV71的全长cDNA序列、以及用于cDNA扩增的引物组如下所示。
表10.Y90-3896株(C1型)(序列号10)
表10A
表10B
表10C
表11.N772株(C4型)(序列号11)
表11A
表11B
表11C
表12.C7/Osaka株(B4型)(序列号12)
表12A
表12B
表12C
表13.2716-Yamagata-03株(B5型)(序列号13)
表13A
表13B
表13C
表14.PCR使用的引物组(序列号14~21)
表14
将RD-ΔEXT1-SCARB2用作宿主细胞以代替RD-SCARB2,除此之外,通过与上述3同样的流程来制备传代数P0的EV71。使RD-ΔEXT1-SCARB2细胞感染得到的传代数P0的EV71,得到传代数P1的EV71。将得到的传代数P1的EV71用作攻击病毒(接种量:1×106TCID50),除此之外,通过与上述6同样的流程来攻击被灭活疫苗免疫后的hSCARB2-Tg10转基因小鼠,并算出死亡率及瘫痪率。
将结果示于表15。确认到,使用RD-ΔEXT1-SCARB2细胞传代增殖后的EV71均具有较高的毒性,能够用作攻击病毒。另外还表明,上述6中所制备的灭活疫苗不仅对于Isehara株有效,对于基因型不同的多种强毒性EV71株也有效。
表15.灭活疫苗对于强毒性EV71(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))的攻击感染的防御效果
表15
<9.使用强毒性EV71检验疫苗(4)>
使用上述8中所制备的N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)、106TCID50)作为攻击病毒,除此之外,通过与上述6同样的流程来免疫及攻击成年hSCARB2-Tg10小鼠,并算出血清的中和抗体滴度、体重变化、死亡率以及瘫痪率,从而评价灭活疫苗的有效性。
将结果示于图3及4、以及表16。未接种灭活疫苗的hSCARB2-Tg10小鼠体重显著减少,死亡率及瘫痪率均为100%,但随着灭活疫苗的接种量的增加,可见中和抗体滴度升高、死亡率及瘫痪率的显著降低,从而确认防御了强毒性EV71的攻击。由该结果表明,通过使用在成年hSCARB2-Tg10小鼠、以及缺失HS且过表达SCARB2的宿主细胞中传代增殖后的EV71株,能够评价抗EV71疫苗的有效性,可以筛选抗EV71疫苗。
表16.灭活疫苗对于N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1))的攻击感染的防御效果
表16
疫苗接种量(μg/针) | 死亡率(%) | 瘫痪率(%) |
0 | 100 | 100 |
0.003 | 80 | 90 |
0.03 | 30 | 50 |
0.3 | 0 | 0 |
而且,通过算出脊髓中的EV71的滴度来评价接种灭活疫苗对于强毒性EV71的增殖抑制效果。通过与上述6同样的流程来利用灭活疫苗免疫成年hSCARB2-Tg10小鼠,并利用上述8中所制备的N772株(RD-ΔEXT1-SCARB2(P1)、106TCID50)进行攻击。从攻击1天后、2天后、3天后的小鼠(各6只)中摘取脊髓(~0.1g),加入10倍量的DMEM(日水制药株式会社制造)并匀浆。以15000rpm、4℃进行分离得到的匀浆物20分钟,从而回收上清。使用RD-SCARB2细胞测定上清的病毒滴度(TCID50)。
将结果示于图5。在未接种灭活疫苗的hSCARB2-Tg10小鼠的脊髓中,EV71增殖,而在已接种过灭活疫苗的hSCARB2-Tg10小鼠的脊髓中,则几乎未见EV71增殖。由该结果表明,通过使用成年hSCARB2-Tg10小鼠、以及缺失HS且过表达SCARB2的宿主细胞中传代增殖后的EV71株,能够评价抗EV71疫苗的有效性,可以筛选抗EV71疫苗。
序列表
<110> 东京都医学综合研究所 (Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science)
<120> 强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用
<130> 2936-PCT
<150> JP 2017-072562
<151> 2017-03-31
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EXT1-sgRNA 正义
<400> 1
caccacccac aacacatc 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EXT1-sgRNA 反义
<400> 2
aaaccatttc ctccttc 17
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EXT2-sgRNA 正义
<400> 3
cacccttcaa ttcaccaatc ca 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EXT2-sgRNA 反义
<400> 4
aaacctattt acattaac 18
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 Isehara 5'-引物
<400> 5
cggcggccgc gtaatacgac tcactatagg ttaaaacagc ctgggttg 48
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 Isehara 3'-引物
<400> 6
tactcacttt tttttttttt tttttttttt ttctattct 39
<210> 7
<211> 7434
<212> DNA
<213> 肠道病毒71 Isehara株 (Enterovirus 71 Isehara strain)
<400> 7
ttaaaacagc ctgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgccag cactctggta 60
ctgaggtacc tttgtgcgcc tgtttttact tcccctcccc gaagtaactt agaagctgta 120
aatcaacgat caatagtagg tgtgacacac cagtcacact ttggtcaagc acttctgttt 180
ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc gcggctgaag gagaaaacgt tcgttacccg 240
accaactact tcgagaagct tagtaccacc atgaacgagg cagagtgttt cgttcagcac 300
aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca ctgcaacccc catgggcgac catggcagtg 360
gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat ccatgggacg ctctaattct gacatggtgc 420
gaagagccta ttgagctagt tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480
cggagcacat gctcacaaac cagtgggtgg tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540
ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt tattcttata ttggctgctt atggtgacaa 600
tcaaagaatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc agtgtgcaac agagcaattg 660
tttatctatt cattggtttc gtacctttat cactgaagtc tgtgatcact cttaaattca 720
ttttgaccct caatacaatt aaacatgggc tcacaggtgt ccacacagcg ctccggttcg 780
catgaaaatt ctaactcagc caccgagggt tccaccataa attatactac cattaattac 840
tataaagact cctatgccgc cacagcaggt aaacagagcc ttaagcagga cccagacaag 900
tttgcaaatc ctgtcaaaga catcttcact gaaatggcag cgccattaaa atctccatct 960
gctgaggcat gtggttacag cgatcgggta gcacagttaa ctattggcaa ctctaccatc 1020
actacgcaag aagcagcaaa catgatagtt ggctatggtg agtggccatc ctactgctcg 1080
gattctgacg ccacagcagt ggacaaacca acgcgcccag atgtttcagt gaataggttt 1140
tatacattgg acactaaatt gtgggagaaa tcatccaagg ggtggtactg gaaattcccg 1200
gatgtgttga ctgaaaccgg ggtcttcggt caaaatgcac aattccacta cctctatcgg 1260
tcgggattct gcattcacgt gcagtgcaat gctagtaagt tccaccaagg agcactccta 1320
gtcgctgtcc tcccagaata tgtcattggg acagtagcag gtggcacagg gacggaggat 1380
agtcaccccc cttacaagca gactcaaccc ggtgctgatg gctttgaatt gcaacacccg 1440
tacgtgcttg atgctggcat tccaatatca caattaacag tgtgcccaca ccagtggatt 1500
aatttgagga ctaacaattg tgccacaata atagtaccgt acataaacgc actacccttt 1560
gattctgcct tgaaccattg caactttggt ctgctggttg tgcctattag cccgttagat 1620
tatgaccaag gtgcgacgcc agtgatcccc attactatca cattggcccc aatgtgctct 1680
gaatttgcag gccttaggca agcagttacg caagggtttc ctactgagct gaaacccggc 1740
acaaaccaat ttttaaccac tgacgatggc gtctcagcac ccattctgcc aaactttcac 1800
cccaccccgt gtatccatat acccggtgaa gttagaaact tgctagagct atgccaggtg 1860
gagaccatct tagaggttaa caatgtaccc acgaatgcca ctagcttaat ggagaggctg 1920
cgcttcccgg tctcagccca agccgggaaa ggtgaactat gtgcagtgtt cagagctgac 1980
cctgggcgaa atggaccatg gcagtccacc ctgttgggtc agttgtgtgg gtattacacc 2040
caatggtcag gatcactgga agtcaccttc atgtttactg ggtcctttat ggctactggc 2100
aagatgctca tagcatacac accaccagga ggccccttac ccaaggaccg ggcgaccgcc 2160
atgttgggta cacacgtcat ctgggacttt gggttgcaat cgtctgtcac ccttgtaata 2220
ccatggatca gcaacactca ctacagagcg cacgctcgag atggtgtgtt cgattactac 2280
actacaggtt tggttagcat atggtaccag acgaattacg tggttccaat tggggcacct 2340
aatacagcct acataatagc attggcggca gcccagaaga atttcaccat gaagttgtgt 2400
aaggatgcta gtgatatcct acagacaggc actatccagg gagacagggt ggcagatgtg 2460
attgagagtt ctatagggga tagtgtgagc agagccctca cccaagcttt accggcacct 2520
acaggccaaa acacgcaggt aagcagccac cgattagaca ctggtaaagt tccagcactc 2580
caagccgctg aaattggagc atcatcaaat gccagcgatg agagtatgat tgagacacga 2640
tgtgttctta attcacacag cacagctgag accactcttg atagcttctt cagtagagcg 2700
ggattagttg gagagataga cctccctctt gaaggcacaa ccaacccgaa tgggtatgca 2760
aattgggaca tagacataac aggttacgcg caaatgcgta gaaaggtgga gctgtttacc 2820
tacatgcgtt ttgacgcaga gttcaccttc gtagcgtgca cgcctaccgg ggaagttgtc 2880
ccgcaattgc tccaatatat gtttgtacca cctggagccc ccaagccaga ctctagagaa 2940
tctcttgcat ggcaaactgc cactaatccc tcagtctttg tgaagctgtc agacccccca 3000
gcacaggttt cagttccatt catgtcacct gcaagcgcct accaatggtt ttatgacggg 3060
tatcccacat tcggtgaaca caagcaggaa aaagaccttg aatatggggc atgcccaaac 3120
aacatgatgg gtacgttctc ggtgcggact gtaggaacct cgaagtccaa gtacccattg 3180
gtgatcagga tttacatgag gatgaagcac gtcagggcgt ggatacctcg cccaatgcgt 3240
aaccaaaact acttatttaa agccaaccca aattatgctg gtaactccat taaaccaact 3300
ggtaccagtc gcacagcgat caccactctc gggaaatttg gacagcaatc cggggctatc 3360
tacgtgggca actttagagt ggttaaccgc caccttgcta ctcataatga ctgggcaaac 3420
cttgtttggg aagacagctc ccgcgacttg ctcgtatcat ctacctctgc ccaaggttgt 3480
gacacgattg ctcgttgcaa ctgtcagaca ggagtgtatt actgtaactc aatgagaaaa 3540
cactatccgg tcagtttctc gaagcccagt ttgatcttcg tagaggccag cgagtattac 3600
cctgctagat accagtcaca ccttatgctt gcagtgggtc actcggagcc aggggattgc 3660
ggtggcattc ttagatgcca acacggtgtc gtagggatag tttccaccgg gggaaacggc 3720
ctagtggggt tcgccgatgt gagggatctt ctgtggttgg atgatgaggc catggagcag 3780
ggcgtgactg attacattaa agggcttgga gatgcttttg gcatggggtt tacagacgca 3840
gtgtcaagag aagttgaagc attgaaaaat cacttgatcg gctcagaggg tgccgtggag 3900
aggatcctta agaacttagt taaactcatc tctgcgctcg tcattgtcat caggagtgat 3960
tatgacatgg tcacattgac ggcaacactt gccctgatcg ggtgtcacgg cagcccttgg 4020
gcctggatta agtcgaaaac agcgtcgatt ttgggcatac cgatggctca aaagcagagt 4080
gcctcttggt taaagaagtt caacgatgcg gcgagtgccg ccaaggggct tgagtggatc 4140
tccaacaaaa tcagcaaatt tatcgattgg ctcaaggaga aaattatccc ggctgctaaa 4200
gagaaagtcg agtttctaaa caatctaaag caactcccct tattggagaa ccaaatttct 4260
aatctcgaac agtcagcagc ttcccaggag gacctcgaag cgatgtttgg caacgtgtct 4320
tatctggccc acttctgccg caaattccaa cccctctatg ccacggaagc aaagagggtg 4380
tatgccctag aaaagagaat gaataattac atgcagttca agagcaaaca ccgtattgaa 4440
cctgtatgcc tgattatcag aggctcgcct ggcactggga agtccttggc aacagggatt 4500
attgctagag ctatagctga caagtaccac tccagtgtgt attccttacc tccggaccca 4560
gatcactttg atggatacaa gcaacagatc gttactgtta tggatgatct atgccaaaac 4620
ccggacggga aagacatgtc actattttgt cagatggtct ccacagtgga ttttataccg 4680
cctatggcat ctctggagga gaagggagtc tcattcacct ccaagtttgt gattgcctcc 4740
actaacgcca gtaacatcat agtgccaaca gtctcggatt cagatgccat ccgtcgtcgg 4800
ttcttcatgg actgcgatat tgaggtgacc gattcctata agacagagct gggtaggctt 4860
gatgcaggga gagcagctag gctgtgctct gagaacaaca ctgcaaactt taaacggtgc 4920
agcccattag tctgtgggaa agcaatccag cttagggata ggaagtctaa ggtgagatac 4980
agtgtggaca cggtggtgag tgagcttatc agggagtata acaacagatc agctattggg 5040
aataccatcg aagctctttt ccaaggaccc cctaaattta gaccgataag gattagccta 5100
gaggagaagc ccgcacctga tgctattagt gacctattag ctagtgtcga tagtgaagag 5160
gttcgccaat actgtagaga tcagggatgg attgtacctg attctcccac caacgttgag 5220
cgccacttga atagagctgt cttgatcatg caatctatag ccaccgtggt agcggttgtg 5280
tcccttgttt atgtcatcta caagttgttc gccggttttc aaggagcata ttccggcgcc 5340
cctaagcaag cactcaagaa accagtgttg cgtacggcaa ctgtgcaggg gccaagcttg 5400
gacttcgccc tatctctact taggaggaac atcaggcagg tccaaaccga ccagggccac 5460
tttacaatgt taggagtgcg agaccacttg gctgtgctcc ccagacactc ccaaccagga 5520
aagaccatct gggttgaaca caaattagtg aagatcgtgg atgctgtgga gctagtagat 5580
gagcaaggag ttaacctaga gctcacactg gtgacgcttg acaccaacga aaaatttaga 5640
gacatcacaa gattcatacc agaaacaatt agtcctgcta gtgatgccac tttagttata 5700
aatactgaac atatgcccaa tatgtttgtg ccagttggag atgtagtcca gtatggattt 5760
ttgaacctta gtggtaagcc cactcacagg actatgatgt acaatttccc aacaaaagca 5820
ggacagtgtg gtggtgtcgt gactgctgtg ggtaaagtga ttgggatcca cattggtggc 5880
aacggtaggc agggtttctg cgctgccctg aagagaggat acttttgcag cgaacaaggt 5940
gagatccaat ggatgaagcc caacaaagaa actggcaggt taaacatcaa cggacctact 6000
cgcactaaac ttgaaccaag tgtctttcat gatgtgttcg agggcactaa agagccagca 6060
gtgctgacta gtaaagaccc aaggctggag gttgactttg aacaggctct tttttcaaaa 6120
tacgtgggaa acacgcttca tgaacctgac gagtttgtca aggaggcggc cttacattat 6180
gccaaccaac tcaagcagtt agatattaag accaccaaga tgagcatgga ggatgcttgt 6240
tacggtacag agaacctgga agctatagac cttcacacaa gtgcaggata tccatacagt 6300
gcactgggca tcaagaaaag ggatattttg gacccaacaa ctcgcgatgt cagcaagatg 6360
aaattttaca tggacaagta tgggttagat ctaccgtact ccacttatgt taaagatgaa 6420
ctcagggcca tcgacaaggt caagaaaggg aagtctcgtc tcatagaagc gagcagtcta 6480
aatgactcag tgtacttgag aatgacattt gggcaccttt atgaaacttt tcatgccaat 6540
ccaggtacag tcactggttc agctgttgga tgcaatccag atgtgttctg gagtaagttg 6600
ccaattctac ttccaggatc gctttttgca tttgactact cggggtatga cgctagtctc 6660
agcccagtgt ggttcagggc gctggagata gtcctacggg aaattgggta ctccgaggac 6720
gcagtgtctc tcatagaagg gatcaatcac actcaccatg tgtaccgcaa taaaacttat 6780
tgtgttcttg ggggaatgcc ctcaggttgc tcaggcacct ccattttcaa ctcgatgatc 6840
aataacatca ttattaggac actcctgatt aaaacattca aagggataga tctagatgaa 6900
ttgaatatgg tggcctacgg ggatgatgtg ttggctagtt accccttccc aattgactgt 6960
ctggaattgg caagaacagg caaggagtat ggtttaacta tgacccctgc cgacaagtca 7020
ccttgcttta atgaagttac atgggagaat gccactttct tgaagagagg attcttgcct 7080
gatcatcaat tcccgttcct catccacccc acgatgccaa tgagggagat tcacgaatct 7140
attcgttgga ctaaagatgc acgaagtact caagatcacg tgcgctctct ctgcttatta 7200
gcatggcaca acgggaaaga ggagtatgaa aaatttgtga gtacaatcag atcagttcca 7260
attggaaagg cattggctat accgaatttt gagaatctga gaagaaattg gctcgaattg 7320
ttttaaattt acagtttgta actgaaccct accagtaatc tggtcgtgtt aatgactggt 7380
gggggtaaat ttgttataac cagaatagca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 7434
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 测序引物 (F)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n是a、c、g或t
<400> 8
cnayayaata tatta 15
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 测序引物 (R)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<400> 9
anacnarrtt ncccatca 18
<210> 10
<211> 7430
<212> DNA
<213> 肠道病毒71 Y90-3896株 (Enterovirus 71 Y90-3896 strain)
<400> 10
ttaaaacagc ctgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgccag cactctggta 60
cttaggtacc tttgtgcgcc tgttttatct cccttccccc gaagtaactt agaagctgtg 120
agctaacgat caacagtagg tgtgacatac cagtcatatc ttgatcaagc acttctgttt 180
ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc gcggctgaaa gagaaaacgt tcgtcacccg 240
gccaactact tcgagaagct tagtaccacc atgaacgagg cagagtgttt cgctcggcac 300
aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca ctgcaatccc catgggcgac catggcagtg 360
gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat ccatgggacg ctctaattct gacatggtgc 420
gaagagccta ttgagctagc tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480
cggagcacac acccacaagc cagtgggcag tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540
ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt tattcttgta ttggctgctt atggtgacaa 600
tcaaagagtt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgtgcaac agagcaatta 660
tttacctatt tattggtttt gtaccattga cactgaagtc tgtgattacc cttaatttta 720
ttttgaccct caacacagtc aaacatgggc tcacaggtgt ccacacaacg ctccggctca 780
catgaaaact ctaactcagc tactgagggc tccaccataa actacactac tattaattac 840
tacaaggact cctatgccgc tacagcaggc aaacagagcc tcaagcagga tccagataag 900
tttgcaaatc ctgtcaaaga tattttcact gaaatggcag cgccactaaa gtccccatcc 960
gctgaagcat gtggatacag cgaccgagta gcgcagttaa ctattggcaa ctctaccatc 1020
actacacaag aagcagcaaa cattatagtt ggctatggtg aatggccctc ctactgctcg 1080
gattctgacg ctacagcagt ggacaaacca acgcgcccag atgtttcggt gaacaggttt 1140
tacacattgg acaccaaatt atgggagaaa tcgtccaagg gatggtactg gaaattcccg 1200
gatgtgttaa cagaaaccgg ggtttttggc cagaatgcac aattccatta cctctatcgg 1260
tcagggttct gcattcacgt gcaatgcaat gctagcaaat tccatcaggg agcgctccta 1320
gtcgctgttc tcccggagta tgtcattggg acagtggcgg gtggcacagg gacggaggat 1380
agccaccccc cttacaagca gactcaaccc ggcgctgatg gttttgagtt acaacatccg 1440
tacgtgcttg acgctggcat tccaatatca caattaacag tgtgcccaca tcagtggatt 1500
aacttgagga ccaacaattg tgccacaata atagtgccat acattaatgc actgcccttt 1560
gattctgcct taaaccattg taactttggc ctactggttg tgcccattag cccgttggac 1620
ttcgaccaag gagcgacgcc agtgatcccc attactatca cattggcccc aatgtgttct 1680
gaatttgcag gtcttaggca agcggtcacg caaggatttc ctactgagct gaaacctggc 1740
acaaaccaat ttttaaccac tgacgatggc gtttcagcgc ccattctgcc aaactttcac 1800
cccaccccat gcatccatat acctggtgag gttagaaatt tgctagagct atgccaggtg 1860
gagactatct tagaggtcaa caatgtaccc acgaatgcca ctagtttaat ggagagactg 1920
cgctttccgg tctcagccca agcaggaaaa ggcgagttgt gtgcagtgtt cagagccgat 1980
cctgggcgaa atgggccttg gcaatctacc ttgttgggcc agttgtgcgg gtactacact 2040
caatggtcag gatcactgga agtcacgttc atgttcactg ggtcctttat ggccaccggc 2100
aagatgctta tagcttacac gccaccagga ggccctttgc ccaaggaccg ggcgaccgcc 2160
atgttgggta cgcatgtcat ctgggatttt gggctgcaat cgtctgtcac ccttgtaata 2220
ccatggatca gcaacactca ttacagagcg catgctcgag atggggtgtt cgactattac 2280
actacaggcc tggttagtat atggtatcag acgaactatg tggttcccat tggagcaccc 2340
aatacagcct atataatagc gttagcggca gcccagaaga attttaccat gaaattgtgt 2400
aaggatgcca gtgatatctt acagacaggc actattcagg gggatagggt ggcagatgtg 2460
attgagagtt ctatagggga tagtgtgagc agagctctca ctcaagctct accggcaccc 2520
acaggccagg acacgcaggt aagcagccat cgattggata ctggcaaagt tccagcactc 2580
caagccgctg agattggagc atcatcaaat gctagtgatg agagtatgat tgagacacga 2640
tgtgttctta attcgcacag cacagctgag accactctcg atagtttctt cagcagagcg 2700
ggattagttg gggagataga ccttcctctt gaaggcacaa ccaacccaaa tggttatgca 2760
aattgggaca tagatataac aggttatgcg cagatgcgta gaaaggtgga gctgttcacc 2820
tacatgcgtt ttgacgcaga attcaccttc gtcgcgtgca cgcccaccgg ggaggttgtc 2880
ccacaattac tccaatatat gtttgtgcca cctggggccc ccaagccaga atccagagaa 2940
tccctcgcat ggcaaactgc caccaatccc tcggtttttg ttaagctatc agacccccca 3000
gcgcaggttt cagttccatt catgtcacct gcgagtgctt accaatggtt ttatgacgga 3060
tatcccacgt tcggtgaaca caagcaggaa aaagaccttg aatacggggc atgtccaaac 3120
aacatgatgg gcacgttctc agtgcggacc gtaggaacct cgaagtccaa gtacccttta 3180
gtaattagga tttatatgag gatgaagcac gtcagggcat gggtacctcg tccaatgcgc 3240
aaccaaaact atctattcaa agccaaccca aattacgccg gcaactccat taagccaacc 3300
ggtgccagtc gcacagcgat caccactctc ggaaaatttg ggcaacaatc cggggccatc 3360
tatgtgggta actttagagt ggttaatcgc catcttgcca ctcacaatga ttgggcgaac 3420
cttgtttggg aagacagctc tcgcgactta ctcgtatcat ctaccaccgc tcagggttgt 3480
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<211> 7448
<212> DNA
<213> 肠道病毒71 C7/Osaka株 (Enterovirus 71 C7/Osaka strain)
<400> 12
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ctccaagctg ctgaaattgg ggcatcgtca aatactagtg atgagagtat gattgaaaca 2640
cgatgcgttc ttaactcaca cagtacagcg gagaccacct tggacagctt cttcagtagg 2700
gcaggtttgg taggagagat agatctccct cttgagggta ccactaatcc aaatggttat 2760
gccaactggg acatagacat aactggttac gcacaaatgc gcagaaaagt ggagctgttc 2820
acctacatgc gctttgatgc ggaattcact tttgttgcgt gcactcctac tggtgaggtt 2880
gttccacaat tactccagta tatgtttgtt ccccctggtg ctcccaaacc agagtctaga 2940
gagtcacttg cttggcagac agccacaaac ccctcagttt ttgtcaagtt gactgatccc 3000
ccggcacagg tctcagttcc gtttatgtca cccgcgagcg cttaccagtg gttttacgac 3060
gggtacccca cgtttggaga acataaacag gagaaagacc ttgagtatgg agcgtgtcct 3120
aataatatga tgggcacttt ctcggtgcga accgtggggt cattaaagtc caagtaccct 3180
ttggttgtca gaatatatat gagaatgaag catgtcaggg cgtggatacc tcgcccgatg 3240
cgcaaccaaa actacttgtt caaagccaac ccaaactatg ccggtaactc cattaaaccg 3300
accggcacta gtcgtactgc cattactacc cttggaaagt tcggccagca atctggggcc 3360
atctacgtgg gcaacttcag agtggttaat cgtcacctcg ctactcacaa tgactgggcg 3420
aatctcgtct gggaagacag ctcccgcgac ctattagtat cgtctaccac cgcccagggc 3480
tgtgacacaa ttgcacgttg tgactgtcaa acaggagtgt actattgtaa ctccaagaga 3540
aagcactacc cagtcagctt ctctaaaccc agcctcatat atgtggaagc tagcgagtat 3600
taccctgcta gataccaatc gcacctgatg cttgcagcgg gccactctga gcccggtgac 3660
tgcggaggca tcttaaggtg tcaacatggt gtagttggta tagtgtccac gggtggcaac 3720
gggctcgttg gttttgctga tgtgagggat ctcttgtggt tagatgaaga ggccatggag 3780
caaggtgtgt ccgactatat taaggggctc ggtgacgcgt ttggaacagg cttcaccgat 3840
gctgtatcca gggaagttga agcccttagg aaccacctca tagggtctga tggagcagtt 3900
gagaaaatcc taaagaacct tatcaagctg atttcagcgt tagtaattgt gatcaggagt 3960
gattatgata tggtcaccct cacagcaact ttagccctga ttggttgtca tggaagtcct 4020
tgggcttgga ttaaagccaa aacagcatcc attttaggta tccccatcgc ccagaagcag 4080
agtgcttctt ggctaaagaa atttaatgat atggcgagtg ccgccaaggg tttagaatgg 4140
atatccaaca aaattagtaa gttcattgac tggctcaggg agaagattgt tccagcagct 4200
aaggagaaag cagaattttt aaccaatttg aagcaattac cactgttaga gaaccagatc 4260
acgaatttag agcagtccgc tgcctcacaa gaggaccttg aagctatgtt tgggaatgtg 4320
tcatacctcg cccatttctg tcgcaagttc caaccattat acgctacgga agctaagcga 4380
gtctatgttc tagagaagag aatgaacaac tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 4440
gaacctgtat gtctcatcat tagaggctca ccgggcactg gaaagtccct tgcgaccggt 4500
atcattgctc gggccatagc agacaagtat cactctagtg tgtactcact tccaccagat 4560
cctgaccatt ttgacgggta caaacagcaa gtggtcacag ttatggatga tctgtgtcaa 4620
aatcctgacg gcaaagacat gtcattattt tgccagatgg tgtccaccgt ggattttatc 4680
ccaccaatgg cttctctcga agaaaaggga gtttctttca catctaaatt tgttatcgca 4740
tctaccaacg ccagcaacat tatagtgcct acagtgtctg actctgacgc cattcgtcgc 4800
aggttttaca tggattgcga cattgaggtg acagactcat acaaaacaga cttgggtaga 4860
ctagacgctg gacgggctgc taagttatgc tctgaaaaca acaccgcaaa cttcaaacga 4920
tgcagcccac tagtgtgtgg gaaagctatt caacttaggg acaggaagtc taaggtcagg 4980
tacagcgtgg acacagtggt ttctgaactt attagagaac acaatagcag atccgctatt 5040
ggtaacacaa ttgaagcact attccaaggc ccacccaagt tcaggccaat tagaatcagt 5100
cttgaagaga agccagcccc agacgctatt agcgatctcc tcgctagtgt agacagcgag 5160
gaagtgcgcc aatactgtag ggagcaaggc tggatcatcc ctgaaactcc caccaatgtt 5220
gaacgacatc ttaatagagc agtgctagtc atgcaatcca tcgctactgt ggtggcagtc 5280
gtctcactgg tgtacgtcat ttacaagctc tttgcggggt ttcaaggtgc gtattctgga 5340
gctcccaagc aaatgctcaa gaaacctgtc ctccgcacgg caacagtaca gggtccgagt 5400
cttgactttg ctctatcctt gctgagaagg aacatcaggc aagtccaaac agatcaaggg 5460
cattttacta tgttaggtgt cagggatcgc ttggccgttc tcccacggca ctcacagccc 5520
gggaagacta tttgggtgga gcataaactt gtgaacatcc ttgacgcaat cgagctggtg 5580
gatgagcagg gcgttaattt ggaactcaca ttggtgacac tagatactaa tgaaaaattt 5640
agagatatca ccaagttcat tccagagacc attagcggcg ctagtgatgc aactttagtg 5700
atcaacacag aacatatgcc atcaatgttt gtcccagtgg gggacgttgt gcagtacggg 5760
ttcttgaacc ttagtggaaa gccaactcat aggaccatga tgtacaattt ccctacaaaa 5820
gcaggacagt gtggaggtgt ggtcacatca gtcggtaaga ttgtcggtat ccacattggc 5880
ggcaacgggc gccaggggtt ctgtgctggt ctgaagagga gttacttcgc aagtgtgcag 5940
ggtgagatcc aatgggtgaa gcctaacaag gaaactggta gactgaacat caatggacca 6000
actcgcacta agttggagcc tagcgtattt catgatgtgt ttgaaggcaa taaggaacca 6060
gcagttttaa caagtaaaga ccctagattg gaggtcgact ttgagcaagc cctgttttcc 6120
aagtatgtgg gcaatgtttt acacgagccc gatgaatatg tgactcaagc tgccctccac 6180
tatgcgaatc aacttaaaca attggacata aacactagca agatgagcat ggaggaagcg 6240
tgctatggca ctgaaaacct ggaagcaata gacctctgca ctagtgccgg atatccatac 6300
agcgcccttg gcattaagaa aagagacatt ctcgacccca caaccaggga tgtgtctaag 6360
atgaaattct atatggataa atacgggcta gatctgccat actctaccta tgtaaaggat 6420
gagcttaggt ccctggataa aatcaagaaa ggaaagtcac gcctgataga ggctagtagc 6480
ttgaatgact ctgtctacct cagaatgact tttgggcacc tttacgaagt gtttcatgct 6540
aaccctggca ctgtgactgg ctcagcagtg ggttgcaacc cggacgtgtt ttggagcaaa 6600
ctaccgattc tgctgcctgg gtcactcttt gccttcgact actcaggata tgatgctagt 6660
ctcagcccgg tatggttcag ggctctagaa gttgtgttac gggagattgg gtattcagag 6720
gaggccgtgt ccctaataga aggaatcaac cacacccacc atgtgtaccg gaacaaaaca 6780
tactgtgtac ttggtggaat gccctcaggg tgttctggta cttccatctt taatacaatg 6840
atcaacaaca tcatcattag aacccttttg atcaaaacct ttaagggaat agacctggat 6900
gagttgaaca tggtggccta tggggacgat gtgctggcta gttacccctt tcctattgat 6960
tgccttgagt tggctaagac tggcaaagag tatggtttga ccatgacacc tgcagacaaa 7020
tcaccctgtt tcaatgaagt aacatgggaa aatgctacct tcctgaagag agggttcttg 7080
ccagaccacc aatttccatt cttaattcac cctacgatgc ccatgagaga gatccatgag 7140
tccattcgat ggactaaaga cgcgcgcaac acccaagatc acgtgcgctc cctgtgtctg 7200
ttggcatggc acaatggtaa ggatgaatat gagaagtttg tgagtgcaat tagatcagtt 7260
ccagttggaa aagcgttggc cattcctaac tttgagaatc tgagaagaaa ttggctcgaa 7320
ttgttttaat attacagctt aaagctgaac cccactagaa atctggtcgt gttaatgact 7380
agtgggggta aatttgttat aaccagaata gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7440
aaaaaaaa 7448
<210> 13
<211> 7434
<212> DNA
<213> 肠道病毒71 2716-Yamagata-03株 (Enterovirus 71 2716-Yamagata-03 strain)
<400> 13
ttaaaacagc ctgtgggttg cacccactca caggacccac gtggtgctag cactctggtt 60
ctacggaacc cttgtgcgcc tgttttacgc cccctcccca atttgcaact tagaagcaat 120
tcacaacact gatcaatagc aggcatggcg caccagctat gtcttgatca agcacttctg 180
tttccccgga ccgagtatca atagactgtt cacgcggttg aaggagaaag cgtccgttat 240
ccggctaact acttcgagaa acccagtagc gccattgaaa ctgcagagtg tttcgctcca 300
cacttccccc gtgtagatca ggtcgatgag tcactgcaat ccccacgggc gaccgtggca 360
gtggctgcgc tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaat gtggacatgg 420
tgcgaagagt ctattgagct agttagtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa 480
ctgcggagca catgccttca atccagaggg tagtgtgtcg taatgggcaa ctctgcagcg 540
gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattctc acattggctg cttatggtga 600
caattacaga attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtgc aatagagcta 660
ttatatacct atttgttggt tttgtaccac taaccttaaa atctgcaacc actctcgact 720
atatattaac cctcaataca atcaaacatg ggctcacagg tgtccactca acgatccggc 780
tcccatgaaa actccaattc agctacagaa ggctccacca ttaattacac cactattaac 840
tattacaaag actcctatgc tgcgacagcg ggcaagcaga gcctcaaaca agaccctgat 900
aagtttgcta accctgtcaa ggacattttc actgaaatgg ctgcgcctct aaagtctcca 960
tccgctgaag cttgtggcta cagtgatcgc gtggcacaac tcaccattgg aaactccacc 1020
atcactacac aggaagcggc aaacatcata gtcggttatg gtgaatggcc ctcatactgc 1080
tctgatgacg acgctacagc ggtggataag ccaacgcgcc cagatgtttc cgtgaatagg 1140
ttttatacat tggacactaa actatgggaa aagtcatcca aggggtggta ttggaagttt 1200
cctgacgtat tgactgagac cggagtcttt ggccaaaacg cacagtttca ctatttatat 1260
agatcagggt tttgcatcca tgtgcaatgt aacgctagca agttccacca aggagcgctg 1320
ttagtcgcta tacttccaga gtatgtcata gggacagtgg cgggcggcac aggaacagag 1380
gacagtcacc ctccttacaa acaaacacaa ccaggtgccg acggttttga attgcagcac 1440
ccgtatgtgc tcgatgctgg gatccctata tcacaattga cagtatgccc ccatcaatgg 1500
attaacttac ggactaataa ctgtgccaca ataatagtgc catatatgaa tacactgcct 1560
tttgactccg ccctgaacca ttgcaatttt gggctgttgg tagtacccat tagcccatta 1620
gattttgacc aaggggcaac tccggttatc cctattacaa tcactctagc tccaatgtgc 1680
tccgaatttg ctggtctcag gcaggcagtc actcaaggct ttcccactga gccaaaacca 1740
gggacgaatc aattcttgac caccgatgat ggcgtctcag cacccattct accaaatttc 1800
catcccactc catgtattca catacccggt gaagtcagaa acctgcttga gttgtgtcaa 1860
gtggagacta ttcttgaggt taacaacgta cccaccaatg ctactagttt gatggaaaga 1920
ctacgattcc cggtgtccgc gcaagcgggg aaaggtgaat tgtgtgccgt gtttagggct 1980
gatcctggaa gagacggtcc atggcagtca acgatgctgg gccagttgtg tggatactac 2040
actcagtggt cagggtcact ggaggtcact ttcatgttca ccgggtcttt catggccacg 2100
ggtaagatgc tcatagctta tacaccccct ggcggtccct tacccaaaga tcgggctaca 2160
gcaatgctgg gcacacatgt tatctgggac tttgggctac aatcatctgt cacccttgtg 2220
ataccatgga tcagtaacac tcactacagg gcgcatgccc gggatggagt gttcgactac 2280
tataccacag gactggtcag tatctggtat caaacaaatt atgtagtccc aattggggca 2340
cccaacacag cttacataat agcactggcg gcggcccaga agaattttac catgaaactg 2400
tgcaaagaca ctagtcacat actacagaca gcctctattc agggagatag ggtggcagat 2460
gtgatcgaga gctctatagg ggacagcgtg ggtagggcac tcacccaggc cctgccagca 2520
cccacaggtc aaaacacaca ggtgagcagc catcgactag acactggtga agttccagcg 2580
ctccaagctg ctgagatcgg ggcatcgtca aatactagtg atgagagtat gattgagaca 2640
cgatgcgtcc ttaactcaca cagtacagca gagactaccc tggacagttt ctttagcaga 2700
gcaggtttgg taggagagat agatctccct ctagagggta ctaccaatcc aaatggttat 2760
gccaactggg atatagacat aactggttat gcacaaatgc gcaggaaagt ggagctgttc 2820
acctatatgc gctttgatgc ggaattcact ttcgttgcgt gcactcctac tggtgaggtt 2880
gttccacaac tactccagta tatgtttgtt ccccctggtg ctcctaaacc agagtctaga 2940
gaatcacttg cttggcagac agccacaaac ccttcagttt ttgtcaaatt aactgatccc 3000
ccggcacagg tctcagttcc gttcatgtca cccgcgagcg cttatcagtg gttttacgac 3060
gggtacccca cgtttggaga acacaaacag gagaaagatc ttgaatatgg agcgtgtcct 3120
aacaacatga tgggcacttt ctcggtgcgg accgtggggt cttcgaaatc caagtaccct 3180
ttggttgtca gaatatacat gagaatgaag catgtcaggg catggatacc tcgcccgatg 3240
cgcaaccaaa attacttgtt caaagccaat ccaaattatg ccggcaactc cattaagccg 3300
accggtacta gtcgtaccgc tattactacc cttggaaagt tcggccagca atctggggcc 3360
atctacgtgg gcaacttcag agtggttaat cgtcacctcg ctactcataa tgactgggca 3420
aacctcgttt gggaagacag ctcccgcgac ctattagtgt cgtctaccac cgcccagggc 3480
tgtgatacaa ttgcacgttg tgactgtcaa acaggagtgt actattgtaa ctccaagaga 3540
aagcactatc cagtcagctt ttctaaaccc agcctcatat atgtggaagc tagcgagtat 3600
taccctgcta ggtaccagtc gcacctgatg cttgcagcgg gccactctga gcccggcgac 3660
tgcggaggca tcttgaggtg tcaacatggt gtagttggta tagtgtccac gggtggcaac 3720
ggactcgttg gctttgctga tgtgagggac ctcttgtggt tagacgaaga agtcatggag 3780
caaggtgtct ccgactacat taaggggctt ggtgacgcgt ttgggacagg cttcaccgat 3840
gctgtgtcca gggaagttga agcccttagg aaccacctta taggatctga tggagcagtt 3900
gagaaaatcc taaagaacct tattaagctg atttcagcgt tagtaattgt gatcaggagc 3960
gattatgata tggtcaccct cacagctact ttagccctga ttggttgcca tggaagtcct 4020
tgggcttgga tcaaagccaa gacagcatcc attttaggca tccccattgc ccagaagcag 4080
agtgcttctt ggctaaagaa gttcaatgat atggcgagtg ccgccaaggg tttagagtgg 4140
atatccaaca aaattagtaa attcattgac tggctcagag agaagattgt tccagcagct 4200
agagagaaag cagaattctt aaccaacttg aagcaattgc cactgttaga gaaccagatc 4260
acgaatttag aacagtccgc tgcctcacaa gaggaccttg aagccatgtt tgggaatgtg 4320
tcatacctcg ctcatttctg tcgcaagttc caaccattat acgccacaga agctaagcgg 4380
gtctatgttc tagagaagag aatgaacaac tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 4440
gaacctgtat gtcttatcat tagaggctca ccaggcactg ggaagtccct tgcgaccgga 4500
atcattgctc gggccatagc agataagtat cactctagtg tgtactcact tccaccagac 4560
cctgaccatt ttgacgggta caaacagcaa gtggtcacag ttatggatga tctgtgtcag 4620
aatcccgacg gcaaggatat gtcgctattt tgccagatgg tgtccaccgt ggattttatc 4680
ccaccaatgg cttctcttga agaaaaggga gtttctttta catctaaatt tgttattgca 4740
tccaccaacg ccagcaacat tatagtgcct acagtgtctg actctgacgc catccgacgc 4800
aggttttaca tggattgcga cattgaggtg acggactcat ataaaacaga cttgggtaga 4860
ctagatgctg gacgggctgc taagttatgc tctgaaaaca acaccgcaaa cttcaaacga 4920
tgcagccctc tagtgtgtgg gaaggctatt caacttagag acaggaagtc caaggtcagg 4980
tacagcgtgg acacagtgat ctctgaacta attagagaat acaatagcag atccgctatt 5040
ggtaacacaa ttgaagcact attccaaggc ccgcctaagt tcaggccaat tagaatcagt 5100
cttgaggaga agccagcccc agacgctatt ggcgatcttc tcgctagtgt agacagcgag 5160
gaagtgcgcc aatactgtag ggagcaaggc tggatcatcc ctgaaactcc caccaatgtt 5220
gaacgacatc ttaacagagc agtgctagtt atgcaatcca tcgctactgt ggtggcagtt 5280
gtctcactgg tgtatgtcat ttacaagctc tttgcggggt ttcaaggcgc gtattctgga 5340
gctcccaagc aagtgctcaa gaaacccgtc ctccgcacgg caacagtgca gggtccaagt 5400
cttgactttg ctctatccct gctgagaagg aacatcaggc aagtccaaac agatcagggg 5460
cattttacca tgttaggtgt cagggatcgc ttagctgttc tcccacggca cgcacagccc 5520
gggaagacta tttgggtgga gcacaagctt gtgaacgtcc tcgacgcaat cgagctggtg 5580
gatgaacagg gcgttaattt ggaactcaca ttggtgacac tagacactaa tgaaaaattt 5640
agagatatca ccaagttcat tccagagacc attagcggcg ctagtgatgc aactttagtg 5700
atcaatacag aacatatgcc atcaatgttt gtcccagtgg gggacgtcgt gcagtatggg 5760
ttcttgaacc ttagtgggaa gccaacacat aggaccatga tgtacaattt ccctacaaaa 5820
gcaggacaat gtggaggtgt ggtcacatca gtcggtaaga ttgttggcat tcacattggc 5880
ggcaacgggc gccaagggtt ctgtgctggt ttgaagagga gttacttcgc aagtgtgcag 5940
ggtgagatcc aatgggtgaa gcctaacaaa gaaactggta gactgaacat caatggacca 6000
actcgcacta agctggagcc tagtgtgttt catgatgtgt ttgaaggcaa taaggaacca 6060
gcagtcttaa caagtaagga ccctagattg gaggtcgact ttgagcaagc cctgttttcc 6120
aagtatgtgg gcaatgtttt acatgagccc gatgaatacg tgactcaagc tgccctccac 6180
tatgcgaatc aactcaaaca gttggacata aacactagca agatgagcat ggaggaagcg 6240
tgctatggca ctgagaacct ggaagcaata gatctctgta ctagtgccgg atatccatac 6300
agcgcccttg gcatcaagaa aagagacatt ctcgaccccg taaccaggga tgtgtctaag 6360
atgaaattct atatggataa atacgggcta gatctgccat actccaccta cgtgaaggat 6420
gagcttagat ccctggataa aatcaagaaa ggaaaatcac gcctgataga ggctagtagc 6480
ttgaatgact ctgtctacct cagaatgacc tttgggcatc tttacgaggt atttcatgct 6540
aaccctggca ctgtgaccgg ttcggcagtg ggttgcaacc cagacgtgtt ttggagtaaa 6600
ctaccgatcc tactgcctgg gtcactcttt gcctttgact actcaggata tgatgctagc 6660
ctcagcccgg tatggttcag ggctctagaa gttgtgttac gggaaattgg gtatccagag 6720
gaggctgtgt ccctaataga aggaatcaac cacactcacc acgtgtaccg gaacaaaaca 6780
tattgtgtac ttggtgggat gccttcaggg tgttctggta cttccatctt taactcaatg 6840
atcaacaaca tcatcattag aaccctctta atcaaaacct ttaagggaat agacctggat 6900
gagttgaaca tggtggccta tggggacgat gtattggcta gttatccctt tcctatcgat 6960
tgccttgagc tggctaagac tggcaaagag tatggtttga ctatgacacc tgcagacaaa 7020
tcaccctgtt tcaatgaagt gacatgggaa aatgctacct tccttaagag agggttcttg 7080
ccagaccacc aatttccatt cttaattcac cctacgatgc ctatgagaga gatccatgag 7140
tccattcgat ggactaaaga cgcacgcaat acccaagatc acgtgcgctc tctgtgcctg 7200
ttggcatggc acaatggtaa ggatgaatat gaaaagtttg tgagtgcaat tagatcagtt 7260
ccagttggaa aagcgttggc cattcctaat tttgagaatt tgagaagaaa ttggctcgaa 7320
ttattttaac attacagctt aaagctgaac cccactagaa atctggtcgt gttaatgact 7380
agtgggggta aatttgttat aaccagaata gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 7434
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 Y90-3896 5'-引物
<400> 14
ctttcgtctt caagaattgc ggccgcgtaa tacgactcac tataggttaa aacagcctgt 60
gggttg 66
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 Y90-3896 3'-引物
<400> 15
gagaattgtc gaatatgttt aaactttttt tttttttttt tttttttttg ctattctgg 59
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 N772 5'-引物
<400> 16
ctaggcggcc gcgtaatacg actcactata ggttaaaaca gcctgtgggt tg 52
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 N772 3'-引物
<400> 17
cacagtcgac tttttttttt tttttttttt tttttgctat tctgg 45
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 C7/Osaka 5'-引物
<400> 18
ctaggcggcc gcgtaatacg actcactata ggttaaaaca gcctgtgggt tg 52
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 C7/Osaka 3'-引物
<400> 19
cacactcgag tttttttttt tttttttttt tttttgctat tctgg 45
<210> 20
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 2716-Yamagata 5'-引物
<400> 20
ctttcgtctt caagaattgc ggccgcgtaa tacgactcac tataggttaa aacagcctgt 60
gggttg 66
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> EV71 2716-Yamagata 3'-引物
<400> 21
gagaattgtc gaatatgttt aaactttttt tttttttttt tttttttttg ctattctgg 59
Claims (8)
1.一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞,其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞,其中所述病毒是肠道病毒71、柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒A14或柯萨奇病毒A7,所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素,并且过表达灵长类的清道夫受体B类成员2即SCARB2。
2.如权利要求1所述的宿主细胞,其中,所述宿主细胞不表达EXT1基因和/或EXT2基因。
3.如权利要求1或2所述的宿主细胞,其中,所述灵长类的SCARB2是人SCARB2。
4.如权利要求1或2所述的宿主细胞,其中,所述细胞是RD细胞。
5.一种稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒的方法,其包括下列步骤:
(1)向权利要求1~4中任一项所述的宿主细胞中导入所述强毒性的手足口病致病病毒的基因组RNA,以获得生产强毒性的手足口病致病病毒的细胞;
(2)培养通过所述步骤(1)中得到的所述细胞,以使强毒性的手足口病致病病毒增殖;以及
(3)回收通过所述步骤(2)中增殖的所述强毒性的手足口病致病病毒。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所述宿主细胞不表达EXT1基因和/或EXT2基因。
7.如权利要求5或6所述的方法,其中,所述灵长类的SCARB2是人SCARB2。
8.如权利要求5或6所述的方法,其中,所述细胞是RD细胞。
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