JP7031810B2 - 抗pd-1/抗her2天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造方法 - Google Patents
抗pd-1/抗her2天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造方法 Download PDFInfo
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Description
1)第1Fc鎖上においては、366番目及び399番目のアミノ酸置換、第2Fc鎖上においては、351番目、407番目及び409番目のアミノ酸置換;または
2)第1Fc鎖上においては、366番目及び409番目のアミノ酸置換、第2Fc鎖上においては、351番目、399番目及び407番目のアミノ酸置換。
前記アミノ酸位置は、Kabat EU索引番号体系によって番号が付けられる。
a)351番目において、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはトリプトファンに置換され、
b)366番目において、ロイシン、プロリン、トリプトファン、バリンに置換され、
c)399番目において、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニンまたはアラニンに置換され、
d)407番目において、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジンに置換され、
e)409番目において、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンに置換される。
a)第1Fc鎖のT366L及びD399R置換、第2Fc鎖のL351E,Y407L及びK409V置換;
b)第1Fc鎖のT366L及びD399C置換、第2Fc鎖のL351G,Y407L及びK409C置換;
c)第1Fc鎖のT366L及びD399C置換、第2Fc鎖のL351Y,Y407A及びK409P置換;
d)第1Fc鎖のT366P及びD399N置換、第2Fc鎖のL351V,Y407P及びK409S置換;
e)第1Fc鎖のT366W及びD399G置換、第2Fc鎖のL351D,Y407P及びK409S置換;
f)第1Fc鎖のT366P及びD399I置換、第2Fc鎖のL351P,Y407F及びK409F置換;
g)第1Fc鎖のT366V及びD399T置換、第2Fc鎖のL351K,Y407T及びK409Q置換;
h)第1Fc鎖のT366L及びD399A置換、第2Fc鎖のL351W,Y407H及びK409R置換を含む。
a)第1Fc鎖のT366L及びK409V置換、第2Fc鎖のL351E,Y407L及びD399R置換;
b)第1Fc鎖のT366L及びK409C置換、第2Fc鎖のL351G,Y407L及びD399C置換;
c)第1Fc鎖のT366L及びK409P置換、第2Fc鎖のL351Y,Y407A及びD399C置換;
d)第1Fc鎖のT366P及びK409S置換、第2Fc鎖のL351V,Y407P及びD399N置換;
e)第1Fc鎖のT366W及びK409S置換、第2Fc鎖のL351D,Y407P及びD399G置換;
f)第1Fc鎖のT366P及びK409F置換、第2Fc鎖のL351P,Y407F及びD399I置換;
g)第1Fc鎖のT366V及びK409Q置換、第2Fc鎖のL351K,Y407T及びD399T置換;
h)第1Fc鎖のT366L及びK409R置換、第2Fc鎖のL351W,Y407H及びD399A置換を含む。
1)第2の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、または第3の態様に記載の組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階;
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を還元させる段階;及び
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階。
共有原子の連結とは、ヘテロダイマー系二重特異性抗体において、2つのFc鎖の間;並びにいずれか1つのFc鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域の間;が共有結合によって1つの分子に連結されていることである。そのうちFc鎖は、1または複数の共有原子が、連結(または、二硫化結合鎖)を介して連結された第1抗原結合機能領域及び第2抗原結合機能領域を含み、前記第1Fc鎖及び第2Fc鎖は、それぞれ共有原子が、連結(イミン結合またはペプチド結合などの結合)を介して、1つの抗原結合機能領域に連結され、
該抗原結合機能領域は、抗原などの標的分子との特異性相互作用が発生する区域であり、その作用は、高度の選択性を有しており、1つの標的分子を識別する配列は、一般的に、他の分子配列を識別することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体の可変部、抗体可変部の構造変異体、受容体の結合領域、リガンド結合領域、または酵素結合領域を含む。
それぞれヒト抗PD-1(Pem)抗体の重鎖と軽鎖とを含むX0GC発現ベクターを構築する。前記抗体可変部の配列は、http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=9798に由来する。軽鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号9に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号10に示されている通りである。軽鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号3に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号4に示されている通りである。重鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号11に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号12に示されている通りである。重鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号13に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号14に示されている通りである。PCR方法により、軽鎖可変部及び軽鎖不変部、重鎖可変部及び重鎖不変部をそれぞれ増幅させる。本発明の全てのPCR反応において、NEB社のPhusionハイフィデリティーDNAポリメラーゼ(F-530L)を使用した。PCRプライマーは、相補的塩基配列の原則及び制限酵素サイトの必要に基づいて、一般的な設計を行う。反応系は、いずれもH2O 8.9μl、5×PhusionハイフィデリティーDNAポリメラーゼ緩衝液4μl、1mMのdNTP 4μl、フォワードプライマー1μl、リバースプライマー1μl、PhusionハイフィデリティーDNAポリメラーゼ0.1μl、テンプレート1μlで構成される。可変部と不変部とのPCR産物を、1.5%のアガロースゲルを介して、電気移動させた後、DNA回収キット(Promega、A9282、以下同一)を使用し、対応する断片を回収した。回収された可変部断片及び不変部断片をテンプレートにし、可変部のフォワードプライマー及び不変部のリバースプライマーを使用し、PCR反応をさらに一回行った後、対応する断片をさらに回収し、重鎖と軽鎖との全体長断片を得た。X0GCベクター及び全体長断片を、EcoRI(NEB、製品コードR3101L)及びHindIII(NEB、製品コードR3104L)を使用して酵素切断し、酵素制限反応系は、10×緩衝液32μl、EcoRI及びHindIIIそれぞれ0.5μl、ゲル回収で得た全体長断片3μl、H2O 14.5μlである。該制限酵素系を、37℃条件下で、3時間反応させた。制限酵素産物を、T4DNA連結酵素(NEB、製品コードM0202V)を利用して連結し(以下、同一)、反応系は、10×連結酵素緩衝液2μl、連結酵素0.5μl、ゲル回収で得た全体長断片3μl、ゲル回収で得たX0GCベクター3μl、H2O 11.5μlであった。それを室温で連結し、12時間反応させた。連結産物を、大腸菌コンピテント細胞DH5α(Tiangen、CB104、以下同一)に形質転換した。真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とをそれぞれ発現させるための抗体重鎖と抗体軽鎖とのX0GC発現ベクターを獲得した。
抗ヒトPD-1抗体の重鎖と軽鎖とを含む発現ベクターそれぞれを、293F細胞にトランスフェクションし(FreeStyle(登録商標)293-F Cells、製品コードR79007、invitrogen)、また抗ヒトHER2抗体の重鎖と軽鎖とを含む発現ベクターもそれぞれ293F細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの1日前に細胞を播種し、トランスフェクションの当日には、細胞を、遠心分離によって収集し、細胞を新鮮なFreeStyle(登録商標)293発現培地(FreeStyle(登録商標)293 Expression Medium、製品コード12338001、Gibco)に再懸濁させ、細胞密度は、200*105細胞/mLであった。トランスフェクション体積によってプラスミドを添加し、最終濃度が36.67μg/mLになれば、軽く均一混合し、次に、線形PEI(ポリエチレンイミン、線形、M.W.25000、製品コード43896、Alfa Aesar)を添加し、最終濃度が55μg/mLになれば、軽く均一混合した。その後、細胞培養器に添加し、120rpm速度の振盪器で37℃で1時間培養した。その後、トランスフェクション体積の19倍の新鮮な培地を添加した。続けて、120rpm速度の振盪器で、37℃で培養した。5~6日間トランスフェクションした細胞培養上澄み液を、遠心分離によって収集した。
AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及び親和性クロマトグラフィーrProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.、22mL、GE Healthcare)を使用し、4℃で精製を行った。まず、移動相A(20mMリン酸ナトリウム緩衝液、150mM塩化ナトリウム、pH7.4)で、クロマトグラフィーカラムの平衡化を行い、基線が安定化された後、前述の処理過程を経た細胞上澄み液をローディングした。流速は、5mL/minであった。サンプルをローディングした後には、移動相Aで平衡化を行った。該サンプルは、それぞれ抗PD-1発現物及び抗HER2発現物である。その後、まず、移動相B1で(0.5Mアルギニンを含む移動相A)、カラム体積の5倍を溶出させ、移動相B2で(100mMクエン酸、pH3.0)、カラム体積の5倍で洗浄し、溶出ピーク、すなわち、目的タンパク質のピークを収集した。前記洗浄段階の流速は、いずれも5mL/minであった。抗PD-1-Fc1の溶出ピーククロマトグラムは、図1に示されている通りであり、抗HER2-Fc2の溶出ピークも、それと類似している(結果は含まず)。表示された溶出ピーク(灰色領域で表示)を収集し、1Mの酢酸ナトリウム溶液を滴下し、5.0に調節した。
抗PD-1/抗HER2ヘテロダイマー抗体分子の構造は、図2に示されている通りである。
十分に密封した10mg/mLのPD-1/HER2ヘテロダイマーサンプルを、40℃の恒温器(BINDER KBF240)に放置し、対応する時間ポイントに(基線(第0日)、1日後、3日後、5日後、7日後、14日後)、20μgのサンプルを取り、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)を行って分離させた。前記SEC-HPLCの条件は、次の通りである:(1)排除クロマトグラフィーカラム:TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience)、5μm、7.8mm×30cm;(2)移動相:5mM PBS、150mM NaCl、pH6.7;(3)流速:0.6mL/min;(4)紫外線探知波長:280nm;(5)収集時間:30min。使用した測定器は、Agilent 1200 Infinityクロマトグラフィー装置であり、Agilent ChemStationを利用し、クロマトグラフ記録を行い、余剰モノマーの比率を計算した。図9(10mg/mL)及び図10(1mg/mL)に示されているように、40℃の実験条件下で、前記ダイマーは、明らかな凝集が起こらないので、前記PD-1/HER2ヘテロダイマーは、比較的優秀な熱安定性を有すると見られる。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用し、PD-1/HER2ヘテロダイマー抗体と、1つの抗原との結合能を測定した。
フローサイトメトリー(FACS)を使用し、PD-1高発現のCHO/PD-1(GenScript、製品コードM00529)細胞上と、HER2高発現のSK-BR-3細胞上とにおいて、PD-1/HER2ヘテロダイマー抗体と二重標的抗原との同時結合能を測定した。
pH9.6のリン酸塩緩衝溶液を利用し、96ウェル高吸着ELISAプレート上において、組み換えヒトPD-1-Fcコーティングを行った。コーティング濃度は、1μg/mL、コーティング量は、ウェル当たり100μLであり、該コーティングは、4℃で一晩行われた。PBST洗浄を5回行った。1%のBSAを含むPBSTを利用し、ウェル当たり300μLになった時点で密封し、25℃で1時間培養させた。PBST洗浄を5回行った。1%のBSAを含んだPBSTで配列希釈したヘテロダイマーサンプル及び対照群を添加し、同時に、最終濃度1μg/mLであるビオチン標識のPD-L1-Fc、または最終濃度4μg/mLであるビオチン標識のPD-L2をウェル当たり100μLずつ添加し、25℃で1時間培養した。PBST洗浄を5回行った。その後、1%のBSAを含んだPBSTにおいて、1:1,000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識のストレプトアビジン(BD、製品コード554066)を、ウェル当たり100μL添加し、25℃で1時間培養した。PBST洗浄を5回行った。表色基質TMBを、ウェル当たり100μLずつ添加し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を、ウェル当たり100μLずつ添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、450nmの吸光度を読み取った。
ヒトPBMC細胞(Lonza、製品コードCC-2702)を収集した。ヒトPBMC細胞を、細胞密度2×106/mLで、完全培地(10%のFBSを含むRPMI 1640)に再懸濁させた。ウェル当たり100μL(ウェル当たり2×105個の細胞)で96ウェルプレートに接種した後、完全培地を使用して希釈したPD-1/HER2ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を、ウェル当たり50μLずつ添加した。完全培地で希釈した、最終濃度1μg/mLのPHA(Sigma、製品コードL-2769)を、ウェル当たり50μLずつ添加した。培養プレートを、37℃の二酸化炭素恒温器に配置して培養した。3日間培養させた後、50μLの上澄み液を抽出し、サイトカインIL-2(RayBiotech、製品コードELH-IL2)の検出に利用した。
実験材料としては、Beijing Huafukang Biotechnologyから購入した、6~8週齢メスSDラットを使用した。ラットを環境に1週間適応させた後、任意にグループに分け、グループごとに3匹のラットが含まれる。全てのグループに、それぞれPD-1単一クローン抗体、HER2単一クローン抗体、PD-1/HER2ヘテロダイマー抗体を投与した。用量は、いずれも20nmol/kgであり、静脈注射で1回投与した。投与直後、投与後5分、30分、1時間、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間、216時間、264時間、312時間、360時間、408時間、480時間ごとに、眼瞼から、0.2mL~0.3mLの血液を採取した。抗凝固剤を使用せず、血液サンプルを、室温で30分~1時間放置し、血液凝固後には、3000rpmの速度で10分間遠心分離た。得られた血清サンプルを-80℃で冷凍し、テストのために保管した。
(付記)
本開示は以下の態様を含む。
付記1:PD-1と特異的結合することができる第1抗原結合機能領域、及びHER2と特異的結合することができる第2抗原結合機能領域を含み、1又は複数の二硫化結合を介して連結された第1Fc鎖及び第2Fc鎖を含み、前記第1Fc鎖と前記第2Fc鎖は、共有原子が結合又はリンカーを介して、それぞれPD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域に連結されるか、あるいは前記第1Fc鎖及び前記第2Fc鎖は、共有原子が結合又はリンカーを介して、それぞれHER2抗原結合機能領域及びPD-1抗原結合機能領域に連結され、前記第1Fc鎖及び第2Fc鎖は、以下の部位において、5個アミノ酸の置換を含む:
1)第1Fc鎖上においては、T366番目及びD399番目のアミノ酸置換、第2Fc鎖上においては、L351番目,Y407番目及びK409番目アミノ酸の置換;又は
2)第1Fc鎖上においては、T366番目及びK409番目のアミノ酸置換、第2Fc鎖上においては、L351番目,D399番目及びY407番目のアミノ酸置換;
前記アミノ酸置換を含む第1Fc鎖と第2Fc鎖は、それぞれホモダイマーを形成する傾向なしに、互いにヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、
前記アミノ酸位置は、Kabat EU索引番号体系によって番号が付けられる、
ヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記2:前記第1Fc鎖及び第2Fc鎖のアミノ酸置換は、
a)L351G、L351Y、L351V、L351P、L351D、L351E、L351K又はL351W;
b)T366L、T366P、T366W又はT366V;
c)D399C、D399N、D399I、D399G、D399R、D399T又はD399A;
d)Y407L、Y407A、Y407P、Y407F、Y407T又はY407H;及び
e)K409C、K409P、K409S、K409F、K409V、K409Q又はK409R;
である、付記1に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記3:前記アミノ酸置換は、
第1Fc鎖のT366L及びD399R置換、第2Fc鎖のL351E,Y407L及びK409V置換;
b)第1Fc鎖のT366L及びD399C置換、第2Fc鎖のL351G,Y407L及びK409C置換;
c)第1Fc鎖のT366L及びD399C置換、第2Fc鎖のL351Y,Y407A及びK409P置換;
d)第1Fc鎖のT366P及びD399N置換、第2Fc鎖のL351V,Y407P及びK409S置換;
e)第1Fc鎖のT366W及びD399G置換、第2Fc鎖のL351D,Y407P及びK409S置換;
f)第1Fc鎖のT366P及びD399I置換、第2Fc鎖のL351P,Y407F及びK409F置換;
g)第1Fc鎖のT366V及びD399T置換、第2Fc鎖のL351K,Y407T及びK409Q置換;
h)第1Fc鎖のT366L及びD399A置換、第2Fc鎖のL351W,Y407H及びK409R置換
を含む、付記1又は2に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記4:前記アミノ酸置換は、
a)第1Fc鎖のT366L及びK409V置換、第2Fc鎖のL351E,Y407L及びD399R置換;
b)第1Fc鎖のT366L及びK409C置換、第2Fc鎖のL351G,Y407L及びD399C置換;
c)第1Fc鎖のT366L及びK409P置換、第2Fc鎖のL351Y,Y407A及びD399C置換;
d)第1Fc鎖のT366P及びK409S置換、第2Fc鎖のL351V,Y407P及びD399N置換;
e)第1Fc鎖のT366W及びK409S置換、第2Fc鎖のL351D,Y407P及びD399G置換;
f)第1Fc鎖のT366P及びK409F置換、第2Fc鎖のL351P,Y407F及びD399I置換;
g)第1Fc鎖のT366V及びK409Q置換、第2Fc鎖のL351K,Y407T及びD399T置換;
h)第1Fc鎖のT366L及びK409R置換、第2Fc鎖のL351W,Y407H及びD399A置換
を含む、付記1~3のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記5:前記第1Fc鎖のアミノ酸置換は、T366L及びD399Rであり、第2Fc鎖のアミノ酸置換は、L351E、Y407L及びK409Vである、付記1に記載のヘロダイマー系二重特異性抗体。
付記6:前記Fc鎖は、IgG由来のものである、付記1~5のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記7:前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域は、Fab断片又はscFv断片である、付記1~6のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記8:前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域は、いずれもFab断片である、付記1~7のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記9:前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域のうち一つは、Fab断片であり、他の一つは、scFvである、付記1~7のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記10:前記Fab断片は、異なる第1重鎖可変部及び第2重鎖可変部、並びに異なる第1軽鎖可変部及び第2軽鎖可変部を含むものである、付記7~9のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記11:前記第1Fc鎖、及びそれと連結されるPD-1抗原結合機能領域、並びに前記第2Fc鎖、及びそれと連結されるHER2抗原結合機能領域、又は第1Fc鎖、及びそれと連結されるHER2抗原結合機能領域、並びに第2Fc鎖、及びそれと連結されるPD-1抗原結合機能領域は、単独で存在するか、あるいは還元剤と同時に存在する場合、ホモダイマーを形成する重量比率が、いずれも50%未満である、付記1~10のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記12:前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号2,4,6,18,10,12,14,16及び18から選択されるものである、付記1~11のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
付記13:付記1~12のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体をコードする、分離されたポリヌクレオチド。
付記14:配列番号1,3,5,7,9,11,13,15及び17から配列が選択される、付記13に記載の分離されたポリヌクレオチド。
付記15:付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
付記16:前記発現ベクターが、pCDNAに基づいて改変して得られたプラスミドベクターX0GCである、付記15に記載の組み換え発現ベクター。
付記17:付記13又は14に記載のポリヌクレオチド、あるいは付記15又は16に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
付記18:ヒト胎児腎細胞HEK293、又はHEK293細胞を基に改変して得たHEK293T、HEK293E、HEK293F;チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、又はCHO細胞を基に改変して得たCHO-S、CHO-dhfr、CHO/DG44、ExpiCHOから選択される、付記17に記載の宿主細胞。
付記19:付記1~12のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチド、付記15又は16に記載の組み換え発現ベクター、あるいは付記17又は18に記載の宿主細胞、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
付記20:付記1~12のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体を生産する方法であって、
1)付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチド、あるいは付記15又は16に記載の組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階と、
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を精製及び還元させる段階と、
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階と
を含む方法。
付記21:前記宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293、又はHEK293細胞を基に改変して得たHEK293T、HEK293F、HEK293F;チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、又はCHO細胞を基に改変して得たCHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHOから選択される、付記20に記載の方法。
付記22:前記還元段階は、1)還元剤を添加する段階として、該還元剤が、2-メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリ(2-カルボキシエチル)ホスファイン、又はその他の化学的誘導体から選択される段階と、2)0.1mM以上の濃度のジチオトレイトールの存在下で、4℃条件下で、少なくとも3時間還元反応を行う段階と、3)脱塩などを介して、還元剤を除去する段階とを含む、付記20又は21に記載の方法。
付記23:前記酸化段階は、1)空気中で酸化させるか、あるいは酸化剤を添加することを含み、前記酸化剤は、L-デヒドロアスコルビン酸、又はその他の化学的誘導体から選択され、2)0.5mM以上の濃度のL-デヒドロアスコルビン酸の存在下で、4℃条件下で、少なくとも5時間酸化反応を行う段階を含む、付記20~22のいずれか1項に記載の方法。
付記24:分離精製段階をさらに含む、付記20~23のいずれか1項に記載の方法。
付記25:個体疾病の予防及び/又は治療に使用される薬物の製造における、付記1~12のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び/又は付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチド、及び/又は付記15又は16に記載の組み換え発現ベクター、及び/又は付記17又は18に記載の宿主細胞、又は付記19に記載の組成物の用途。
付記26:個体疾病の予防及び/又は治療に使用される薬物として使用される、付記1~12のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び/又は付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチド、及び/又は付記15又は16に記載の組み換え発現ベクター、及び/又は付記17又は18に記載の宿主細胞、及び/又は付記19に記載の組成物。
付記27:付記1~12のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及び/又は付記13又は14に記載の分離されたポリヌクレオチド、及び/又は付記15又は16に記載の組み換え発現ベクター、及び/又は付記17又は18に記載の宿主細胞、及び/又は付記19に記載の組成物をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、疾病を予防及び/又は治療する方法。
付記28:前記個体が哺乳動物であり、望ましくは、ヒト個体である、付記25に記載の用途、付記26に記載のヘテロダイマー系二重特異性分子、分離されたポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は付記27に記載の方法。
付記29:前記疾病が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、メラノーマなどの疾病から選択される、付記25に記載の用途、付記26に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、分離されたヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は付記27に記載の方法。
Claims (26)
- PD-1と特異的結合することができる第1抗原結合機能領域、及びHER2と特異的結合することができる第2抗原結合機能領域を含み、
1又は複数の二硫化結合を介して連結された第1Fc鎖及び第2Fc鎖を含み、
前記第1Fc鎖と前記第2Fc鎖は、共有結合又はリンカーを介して、それぞれPD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域に連結されるか、あるいは前記第1Fc鎖及び前記第2Fc鎖は、共有結合又はリンカーを介して、それぞれHER2抗原結合機能領域及びPD-1抗原結合機能領域に連結され、
前記第1Fc鎖及び第2Fc鎖は、以下の部位において、5個アミノ酸の置換を含む:第1Fc鎖上においては、T366番目及びD399番目のアミノ酸置換、第2Fc鎖上においては、L351番目,Y407番目及びK409番目アミノ酸の置換;ここで、前記第1Fc鎖のアミノ酸置換はT366L及びD399Rであり、前記第2Fc鎖のアミノ酸置換はL351E、Y407L、及びK409Vであり、
前記アミノ酸置換を含む前記第1Fc鎖と前記第2Fc鎖は、ホモダイマーを形成する傾向よりも、ヘテロダイマーを形成する傾向が高く、
前記アミノ酸位置は、Kabat EU索引番号体系によって番号が付けられる、
ヘテロダイマー系二重特異性抗体。 - 前記第1Fc鎖と前記第2Fc鎖は、IgG由来のものである、請求項1に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- 前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域は、Fab断片又はscFv断片である、請求項1又は2に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- 前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域は、いずれもFab断片である、請求項1~3のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- 前記PD-1抗原結合機能領域及びHER2抗原結合機能領域のうち一つは、Fab断片であり、他の一つは、scFv断片である、請求項1~3のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- 前記Fab断片は、互いに異なる第1重鎖可変部及び第2重鎖可変部、並びに互いに異なる第1軽鎖可変部及び第2軽鎖可変部を含むものである、請求項3~5のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- PD-1抗原結合機能領域と共有結合する前記第1Fc鎖、及びHER2抗原結合機能領域と共有結合する前記第2Fc鎖のそれぞれ、又は
HER2抗原結合機能領域と共有結合する前記第1Fc鎖、及びPD-1抗原結合機能領域と共有結合する前記第2Fc鎖のそれぞれ、
が還元剤の存在下で単独で存在する場合、ホモダイマー構成要素の重量比率が50%未満である、請求項1~6のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。 - 前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号2,4,6,8,10,12,14,16及び18から選択される少なくとも1つを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体をコードする、分離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1,3,5,7,9,11,13,15及び17から配列が選択される、請求項9に記載の分離されたポリヌクレオチド。
- 請求項9又は10に記載の分離されたポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、pCDNAに基づいて改変して得られたプラスミドベクターX0GCである、請求項11に記載の組み換え発現ベクター。
- 請求項9又は10に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項11又は12に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
- ヒト胎児腎細胞HEK293、又はHEK293細胞に由来するHEK293T、HEK293E、若しくはHEK293F;及びチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、又はCHO細胞に由来するCHO-S、CHO-dhfr、CHO/DG44、若しくはExpiCHOから選択される、請求項13に記載の宿主細胞。
- 請求項1~8のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、請求項9又は10に記載の分離されたポリヌクレオチド、請求項11又は12に記載の組み換え発現ベクター、あるいは請求項13又は14に記載の宿主細胞、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
- 請求項1~8のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体を生産する方法であって、
1)請求項9又は10に記載の分離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項11又は12に記載の組み換え発現ベクターを宿主細胞内で発現させることと、
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を精製及び還元させることと、
3)還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させることと
を含む方法。 - 前記宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293、又はHEK293細胞に由来するHEK293T、HEK293F、若しくはHEK293F;及びチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、又はCHO細胞に由来するCHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、若しくはExpiCHOから選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記還元は、
1)還元剤を添加することであって、前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリ(2-カルボキシエチル)ホスファイン、その他の化学的誘導体、又はそれらの組み合わせから選択される、還元剤を添加することと、
2)0.1mM以上の濃度のジチオトレイトールの存在下で、4℃で、少なくとも3時間還元反応を行うことと、
3)還元剤を除去すること(例えば、脱塩などによる)と、
を含む、請求項16又は17に記載の方法。 - 前記酸化は、
1)空気中で酸化させるか、あるいは酸化剤を添加することを含み、前記酸化剤は、L-デヒドロアスコルビン酸、又はその他の化学的誘導体から選択され、かつ、
2)0.5mM以上の濃度のL-デヒドロアスコルビン酸の存在下で、4℃で、少なくとも5時間酸化反応を行うことを含む、
請求項16~18のいずれか1項に記載の方法。 - 分離及び精製をさらに含む、請求項16~19のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の疾病の予防及び/又は治療に使用される薬物の製造における、請求項1~8のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、請求項9又は10に記載の分離されたポリヌクレオチド、請求項11又は12に記載の組み換え発現ベクター、請求項13又は14に記載の宿主細胞、又は請求項15に記載の組成物の使用。
- 個体の疾病の予防及び/又は治療に使用される薬物として使用される、請求項1~8のうちいずれか1項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、請求項9又は10に記載の分離されたポリヌクレオチド、請求項11又は12に記載の組み換え発現ベクター、請求項13又は14に記載の宿主細胞、又は請求項15に記載の組成物。
- 前記個体が哺乳動物(例えば、ヒト)である、請求項21に記載の使用。
- 前記個体が哺乳動物(例えば、ヒト)である、請求項22に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、分離されたポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記疾病が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、及びメラノーマから選択される、請求項21又は23に記載の使用。
- 前記疾病が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、及びメラノーマから選択される、請求項22又は24に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、分離されたポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は組成物。
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