CN105111314B - 一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种新型融合蛋白，以及该新型融合蛋白组成的药物组合物及该新型融合蛋白的制备方法和用途。本发明中该新型融合蛋白的结构通式如下：X‑连接肽‑Y‑连接肽‑IgG Fc片段或Y‑连接肽‑X‑连接肽‑IgG Fc片段；其中，X为VEGF‑Trap及其衍生物；Y为PD‑1抗体片段及其衍生物或者PD‑1拮抗剂片段及其衍生物。本发明具有新生血管抑制和T细胞免疫激活作用，而且还具有两种功能的协同促进的作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著。

Description

一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途

本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及的是一种抑制肿瘤生长的新型融合蛋白及药物组合物及该新型融合蛋白的制备方法和用途。

背景技术

免疫逃逸是肿瘤的恶化进程中非常重要的一步。肿瘤细胞通过避免人体免疫***的杀伤作用得以快速生长，从而促进癌症的发生。T细胞表面重要的负调节分子PD-1、CTLA-4和TIM-3均能够抑制癌症发生过程中T细胞的免疫杀伤作用。目前，临床上已有针对PD-1和CTLA-4靶点的药物，这些药物在临床上治疗效果非常显著。

程序细胞死亡1(PD-1)受体主要在激活的T细胞和B细胞中表达，其主要功能是抑制免疫***细胞的激活，这也是免疫***一种正常的自稳机制，因过度的T/B细胞激活会引起自身免疫病，所以PD-1是我们人体的一道护身符。在病理情况下，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1信号通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞，从而导致癌症的产生。阻断这一信号通路的PD-1抗体可部分恢复T细胞的功能，使T细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。目前针对PD-1的抗体已有两个药物上市，分别是Nivolumab和Pembrolizumab，二者在临床上对多种癌症均表现出显著的治疗效果。

VEGF-A是肿瘤细胞表达的一类促血管新生的生成因子，它的主要作用是提供免疫抑制的微环境，为肿瘤细胞的增殖和癌症的发生创造有利条件。科学家Magali Terme（Magali T，Thibault V ，et al,2015，J. Exp. Med.212:139-148）研究发现VEGF-A营造的肿瘤微环境能够引起CD8+T细胞表面PD-1分子的上调，从而引起CD8+T细胞的免疫杀伤作用降低。同时发现VEGF-A的刺激能够引起TIM-3，CTLA-4，LAG-3等抑制分子的表达。

现有技术中已有利用VEGF-A抗体和PD-1抗体作用***的报道，临床应用中常常是单独使用其中一种抗体或同时使用两种抗体对肿瘤进行治疗，当同时采用上述两种抗体进行治疗时则需要每天多次注射给药，不仅给操作者带来不便，而且给受试者也带来更多痛苦。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中VEGF-Trap和PD-1抗体在临床应用中需要每天多次注射给药的问题，提供既具有VEGF TRAP和PD-1抗体生理活性，又具有长效功能的一种新型融合蛋白，并公开了该新型融合蛋白组成的药物组合物及该新型融合蛋白的制备方法和用途。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种新型的融合蛋白，其结构通式如下：

X-连接肽-Y-连接肽-IgG Fc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgG Fc片段；

其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为PD-1抗体片段及其衍生物或者PD-1拮抗剂片段及其衍生物。

本发明并不是简单的将两种抗体蛋白混合，而是采用两种抗体进行融合后组成一种新型的融合蛋白，该蛋白能同时抑制PD-1和VEGF-A的活性，从而既能抑制肿瘤血管的新生，又能双重抑制PD-1的产生和活性，多条途径激活T细胞；其具有既能饥饿肿瘤细胞，又能激活T细胞杀伤肿瘤细胞的效果。

本发明对单独使用PD-1抗体和VEGF-A抗体，组合使用PD-1抗体和VEGF-A抗体，以及使用PD-1抗体和VEGF-A抗体结合的融合蛋白VNI的效果进行小鼠内肿瘤生长情况检测，检测结果如表7和图3所示。通过表7可知：采用本发明的新型融合蛋白，其不仅仅能同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，而且还能达到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著；并且，通过图3所示，采用本发明的新型融合蛋白还具有有效延长各抗体单元生理活性功能效果的作用。

优选地，所述连接肽为式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n所示的氨基酸序列，该n是1～4的整数。所述X的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3，或其核苷酸编码序列为SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4。所述Y的氨基酸序列为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7，或其核苷酸编码序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8。所述IgG Fc片段为IgG1 Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3Fc片段或IgG4 Fc片段，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9、11、13、15，或其核苷酸编码序列分别为SEQ ID NO：10、12、14、16。

一种制备新型融合蛋白的方法，将权利要求1-6任一项所述新型融合蛋白的编码核苷酸序列***表达载体中，并将此表达载体引入相应的表达***进而进行融合蛋白的表达。本发明融合蛋白的表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。

上述表达***中融合蛋白的宿主细胞，可以为CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。

一种药物组合物，由权利要求1-6任一项所述的新型融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂组成。

进一步，所述药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针。

一种新型融合蛋白的用途，所述权利要求1-6任一项所述的新型融合蛋白用于肿瘤的治疗；所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和***癌中的一种或多种。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1、本发明的融合蛋白不仅能同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，而且还能达到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著；

2、本发明的新型融合蛋白能有效延长各抗体单元生理活性功能效果，进而减少一个疗程的总用药量，减少用药成本；

3、本发明可有效减少注射给药的次数，减轻给药痛苦。

附图说明

图1为VNI对HUVEC细胞增殖影响的EC50值曲线示意图。

图2为VNI刺激PBMC产生IFNγ的曲线示意图。

图3为鼠源VNI在体内抑制肿瘤生长的对比情况示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 蛋白制备

一种新型融合蛋白，其结构通式如下：

X-连接肽-Y-连接肽-IgG Fc片段；其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为PD-1抗体片段及其衍生物或者PD-1拮抗剂片段及其衍生物。

本实施例中该X为VEGF-Trap，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；Y为PD-1抗体片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述连接肽为式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n所示的氨基酸序列，该连接肽中n为3；IgG Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；即，本实施例中合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

本实施例中上述新型融合蛋白的具体合成路线如下：

1.构建重组质粒

1.1按照X-连接肽-Y-连接肽-IgG Fc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgG Fc片段的通式，得到合成融合蛋白的基因片段和引物，并将合成融合蛋白的基因片段和引物重组至质粒载体puc57中获得puc57-VNI质粒。该合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，该基因和引物由专业公司北京金唯智公司合成。

1.2将puc57-VNI质粒和pCHO1.0质粒分别进行双酶切处理，该酶切体系的建立：

在1.5ml EP管中加入如下成分： pCHO1.0质粒或puc57-VNI质粒40μl，Buffer4 10μl，AvrⅡ和BstZ17I各5μl，灭菌水45μl，混匀后在37℃下反应5h，利用QIAGEN产物纯化试剂盒回收，分别获得基因片段pCHO1.0和VNI。

1.3在T4连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的基因片段pCHO1.0和VNI基因片段连接；连接反应体系如下：

在1.5ml EP管中加入如下成分2μl 的pCHO1.0，6μl 的VNI，10×T4 Buffer 1μl，1μl的T4 DNA连接酶，混匀后在室温（20℃左右）下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT(KANA)平板培养基上37℃静置过夜，平板编号pCHO1.0-VNI。

1.4从pCHO1.0-VNI平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定；

菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×Taq HS 10μL、菌液模板 2μL、上下游引物P1和P2各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件:95℃ 2min，一个循环；94℃ 60s、53℃ 60s、72℃ 120s，30个循环；最后72℃ 5min。通过琼脂糖凝胶电泳分析结果，选取出具有目标产物的正确菌落。

1.5通过PCR筛选鉴定的菌落接种后提取再分别进行酶切鉴定；即首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析；

酶切体系：在1.5ml EP管中加入如下成分：质粒2μl，Buffer1 1μl，BSA 0.1μl，AvrⅡ和BstZ17I各1μl，补灭菌水至10μl，混匀后在37℃下反应4h。通过琼脂糖凝胶电泳分析结果，选取出酶切鉴定正确的菌落。

1.6将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落随机接种数个菌落再进行测序鉴定，选取出表达质粒保存备用。

2.质粒转染及细胞筛选

采用宿主细胞CHO-S或DG44，按照Freedom CHO-S Kit试剂盒说明书分别进行质粒转染，转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养8h，摇瓶培养的条件为：37℃、8%CO₂、110rpm/min。通过细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。

转染48h后进行两步加压筛选：10P/100M，20P/200M（P=10μg/mL Puromycin，M=nMMTX）；30P/500M，50P/1000M，获得初筛细胞。以有限稀释法进行单克隆细胞筛选，通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。

3.蛋白表达和纯化

筛选高产克隆细胞从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。

收集培养7天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0.45μm 滤膜过滤，调节pH 至7.4，用蛋白A琼脂糖亲和柱层析（HiTrap Protein-A Sepharose affinitycolumn）纯化融合蛋白，5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液（20mM磷酸盐，pH 7.4）平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10 倍体积PBS缓冲液(0.02mol/L磷酸盐，pH 7.4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1M甘氨酸缓冲液（pH3）将目的蛋白从柱上洗脱，即为本发明的新型融合蛋白VNI。通过SDS-PAGE检测，该新型融合蛋白VNI的纯度达到90%以上。

实施例2.VNI结合动力学分析

（一）VNI和VEGF-A的结合动力学分析

通过Loading将25μg/ml Biotin-hVEGF-A结合于SA sensor上；根据预实验设置浓度范围：分别为10000、5000、1000、500、100nM，以Sample Diluent buffer为空白对照。于Octet QK检测平台中的动力学分析进行hVEGF-A与VNI、VEGF-Trap和PD1抗体的动力学参数检测，试验步骤设置如表1所示：

表1

检测步数	溶液	步骤类型	检测时间(s)
				1	Sample Diluent buffer	Baseline	120
2	Biotin-hVEGF-A	Loading	360
				3	Sample Diluent buffer	Baseline	120
4	样品	Association	720
				5	Sample Diluent buffer	Dissociation	1800

通过上述试验步骤检测得到的实验结果如表2所示：

表2 结合动力学参数比较

KD (M)

kon(1/Ms)

kon Error

kdis(1/s)

kdis Error

Full R^2

VNI

1.33E-10

4.34E+05

1.73E+04

5.79E-05

1.70E-05

0.99448

VEGF-Trap

0.83E-10

9.51E+05

6.11E+04

7.93E-05

3.23E-05

0.99368

PD-1抗体

4.36E-03

1.20E+01

1.25E+01

5.25E-02

1.13E-03

0.91908

如上表2显示，VNI仍保持与VEGF-A的高亲和力，在体外仍能很好地结合VEGF-A；但结合力弱于VEGF-TRAP。而PD-1抗体与VEGF-A几乎没有结合。

（二）VNI和PD-1的结合动力学分析

通过Loading将25μg/ml Biotin-h PD-1结合于SA sensor上；根据预实验设置浓度范围：分别为10000、5000、1000、500、100nM，以Sample Diluent buffer为空白对照。于Octet QK检测平台中的动力学分析进行h PD-1与VNI、VEGF-Trap和PD1抗体的动力学参数检测，试验步骤设置如表3所示：

表3

检测步数	溶液	步骤类型	检测时间(s)
				1	Sample Diluent buffer	Baseline	120
2	Biotin-hPD-1	Loading	360
				3	SampleDiluent buffer	Baseline	120
4	样品	Association	720
				5	Sample Diluent buffer	Dissociation	1800

通过上述试验步骤检测得到的实验结果如表4所示：

表4 结合动力学参数比较

KD (M)

kon(1/Ms)

kon Error

kdis(1/s)

kdis Error

Full R^2

VNI

5.5E-10

1.32E+05

7.74E+04

7.32E-05

2.37E-05

0.99646

VEGF-Trap

6.24E-3

3.07E+01

3.29E+02

1.92E-01

1.79E-06

0.89421

PD1抗体

2.17E-10

9.71E+05

1.19E+03

2.11E-04

1.80E-06

0.99911

如上表4显示，VNI与PD-1保持高亲和力结合，但结合力弱于PD-1抗体。而PD-1抗体片段或者拮抗剂与PD-1结合力非常弱。

综上所述，VNI在体外仍能保持与VEGF-A和PD-1高亲和结合，推测该分子有高效体内活性。

实施例3. VNI的体外生物学活性检测。

（一）对HUVEC细胞增殖的影响比较研究

对数生长期的HUVEC细胞接种于96孔培养板，3×10³ cells/孔，100μl/孔，37℃，5%CO₂培养20h；用Base培养基配制不同摩尔浓度的VNI、PD-1抗体及VEGF-Trap（9.7～10000ng/ml）分别与40ng/ml的VEGF混匀，37℃孵育2h；再加之接种有HUVEC细胞的96孔板上，100μl/孔，每组3复孔，37℃，5%CO₂继续孵育96h，阴性对照组加分别加Base培养基和完全培养基；加CCK-8试剂，20μl/well, 37℃避光孵育2h，450nm检测吸光值，VNI对HUVEC细胞增殖影响的EC50值曲线示意图如图1所示，实验结果如表5所示。

表5

sample	EC50 (ng/ml)	standard Error	R-Square
				VNI	229.74	20.19	0.983
VEGF-Trap	197.62	17.59	0.979
				PD1抗体	1.23E12	7.11E15	0.608

通过表5以及图1显示，VNI的体外生物学活性略低于VEGF-Trap，而PD-1抗体对VEGF刺激HUVEC细胞增殖活性基本没有抑制作用。

（二）对巨细胞病毒裂解物刺激PBMC 细胞的细胞因子分泌的影响

从CMV 阳性（曾感染过巨细胞病毒）的供体分离外周血单个核细胞(PBMC) ，CMV裂解物能刺激这类细胞产生IFNγ，抗PD-1 抗体可增强CMV 裂解物刺激PBMC产生IFNγ。

将105 个来自CMV阳性供体的人PMBC 在总体积200μl 中培养，并在每个孔中加入CMV裂解物。将各种浓度的抗PD-1 抗体、VNI和PD-1抗体片段或者拮抗剂加到每个孔中。常规条件培养细胞第4 天后，从每份培养物中取100μl培养基用于细胞因子IFNγ测量，VNI刺激PBMC产生IFNγ的曲线示意图如图2所示，测量结果如表6所示。

表6

sample	EC50 (ng/ml)	standard Error	R-Square
				VNI	112.42	16.75	0.951
VEGF-Trap	--	--	--
				PD1抗体	82.95	15.82	0.978

通过图2和表6显示，在CMV裂解物作用下，VNI呈浓度依赖刺激PBMC细胞产生IFNγ，在低浓度时其作用能力低于PD-1抗体，但在高浓度时与PD-1抗体作用相当。VEGF-TRAP基本不能刺激PBMC产生IFNγ。

实施例4. 鼠源VNI抑制小鼠体内移植肿瘤生长作用研究

由于小鼠PD-1与人源化人源PD-1抗体不具有交叉作用，进而导致人源PD-1抗体在小鼠体内无法阻断PD-1作用，在小鼠体内不能发挥PD-1抗体抑制肿瘤生长作用，因而本发明采用鼠源VNI体内处理植入有癌性肿瘤的小鼠以检验抗体对肿瘤生长的体内影响。

鼠源PD-1抗体和鼠源VNI的制备：首先用小鼠PD-1免疫大鼠，参照《组织培养和分子细胞学技术》（鄂征主编）杂交瘤细胞制备方法，获得抗小鼠PD-1抗体基因，将该基因重组至真核表达载体中，获得鼠源PD-1抗体，该抗体作为对照备用；然后，另将本发明中融合蛋白VNI的人源抗PD-1抗体fab序列替换成小鼠PD-1抗体基因的fab序列，形成抗小鼠PD-1抗体和VEGF-TRAP的融合蛋白鼠源VNI，将该序列重组至真核表达载体中，经转染、表达和纯化获得重组鼠源VNI。

根据体重将6-8周龄之间的雌性AJ小鼠随机分成6组，每组包含10只动物。在第0天将溶于200μl DMEM 培养基的2×106个SA1/N纤维肉瘤细胞在右侧皮下植入小鼠。用PBS对照或10mg/kg 的药物处理小鼠。在第1、4、8 和11天用大约200μl 含有药物的PBS或对照通过腹膜内注射给动物剂量给药。各组组成如下：(1)PBS 对照组，(2)鼠源VNI组，(3)鼠源PD-1抗体组，(4)VEGF-TRAP组。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约8周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量( 高度×宽度×长度) 并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3) 或显示大于15％的体重减少时将小鼠处死，药物处理后无肿瘤鼠占百分比如表7所示，鼠源VNI在体内抑制肿瘤生长的情况如图3所示。

表7

组别	研究鼠只数	无肿瘤只数（只）	无肿瘤百分数（%）
				PBS组	10	0	0
鼠源VNI组	10	7	70
				鼠源PD-1抗体组	10	3	30
VEGF-TRAP组	10	0	0

上述对比实验中，PBS组中9只鼠约在28天达到肿瘤终点，有1只鼠肿瘤溃烂；鼠源VNI组3只鼠在56天达到肿瘤终点，其余7只无肿瘤；鼠源PD-1抗体组7只鼠在56天达到肿瘤终点，其余3只鼠无肿瘤；VEGF-TRAP组有6只鼠在42天达到肿瘤终点，其余4只鼠在49天达到肿瘤终点。

通过图3、表7以及上述实验结果描述可知：本发明的新型融合蛋白VNI，其不仅仅能同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，而且还能达到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著；并且，通过图3所示，采用本发明的新型融合蛋白还具有有效延长各抗体单元生理活性功能效果的作用。

实施例5

本实施例中X的核苷酸编序列和Y的核苷酸编序列不同，本实施例中所述X的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：4，所述Y的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：8。所述IgG Fc片段为IgG3 Fc片段，该IgG3 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO：14。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中所述IgG Fc片段为IgG2 Fc片段，该IgG2 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO：12。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都百世博生物技术有限公司

<120> 一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途

<130> 2015

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 未知

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys

195 200 205

<210> 2

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgacaccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360

gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420

ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480

agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540

ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600

agggtccatg aaaag 615

<210> 3

<211> 202

<212> PRT

<213> 未知

<400> 3

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser

100 105 110

Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn

115 120 125

Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His

130 135 140

Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

145 150 155 160

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

165 170 175

Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

180 185 190

Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys

195 200

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<211> 615

<212> DNA

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agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120

tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180

ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240

aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300

gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360

tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420

aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480

aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540

acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600

gaaaagggcc cgggc 615

<210> 5

<211> 232

<212> PRT

<213> 未知

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val

115 120 125

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala

165 170 175

Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe

180 185 190

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

195 200 205

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly

210 215 220

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230

<210> 6

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc gtggtgcagc ctggccggtc cctgcggctg 60

gactgcaagg cctccggcat caccttctcc aactccggca tgcactgggt gcggcaggcc 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtggcctgg atctggtacg acggctccaa gcggtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgttc 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caccaacgac 300

gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgtcctccg gcgggtccgg cgggtccggc 360

gggtccggcg ggtccgagat cgtgctgacc cagtcccctg ccaccctgtc cctgtcccct 420

ggcgagcggg ccaccctgtc ctgccgggcc tcccagtccg tgtcctccta cctggcctgg 480

taccagcaga agcctggcca ggcccctcgg ctgctgatct acgacgcctc caaccgggcc 540

accggcatcc ctgcccggtt ctccggctcc ggcttcggca ccgacttcac cctgaccatc 600

tcctccctgg agcctgagga cttcgccgtg tactactgcc agcagtcctc caactggcct 660

cggaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaag 696

<210> 7

<211> 232

<212> PRT

<213> 未知

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asn Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val

115 120 125

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala

165 170 175

Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe

180 185 190

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

195 200 205

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Asn Phe Pro Arg Thr Phe Gly

210 215 220

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230

<210> 8

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc gtggtgcagc ctggccggtc cctgcggctg 60

gactgcaagg cctccggcat caccttctcc aactccggca tgcactgggt gcggcaggcc 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtggcctgg atctggtacg acggctccaa gcggtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgttc 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ctccaacgag 300

gacttctggg gccagggcac cctggtgacc gtgtcctccg gcgggtccgg cgggtccggc 360

gggtccggcg ggtccgagat cgtgctgacc cagtcccctg ccaccctgtc cctgtcccct 420

ggcgagcggg ccaccctgtc ctgccgggcc tcccagtccg tgtcctccta cctggcctgg 480

taccagcaga agcctggcca ggcccctcgg ctgctgatct acgacgcctc caaccgggcc 540

accggcatcc ctgcccggtt ctccggctcc ggcttcggca ccgacttcac cctgaccatc 600

tcctccctgg agcctgagga cttcgccgtg tactactgcc agcagtccac caacttccct 660

cggaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaag 696

<210> 9

<211> 227

<212> PRT

<213> 未知

<400> 9

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 10

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa a 681

<210> 11

<211> 227

<212> PRT

<213> 未知

<400> 11

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 12

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 60

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 180

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 240

ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 300

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 360

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aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 480

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 540

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600

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agcctctccc tgtctccggg taaa 684

<210> 13

<211> 264

<212> PRT

<213> 未知

<400> 13

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

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Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala

35 40 45

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

130 135 140

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260

<210> 14

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacacatgcc cacggtgccc agagcccaaa 60

tcttgtgaca cacctccccc gtgcccacgg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 120

cccccatgcc cacggtgccc agcacctgaa ctcctgggag gaccgtcagt cttcctcttc 180

cccccaaaac ccaaggatac ccttatgatt tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 240

gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaagt ggtacgtgga cggcgtggag 300

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 360

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 420

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggacagccc 480

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 540

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 600

agcgggcagc cggagaacaa ctacaacacc acgcctccca tgctggactc cgacggctcc 660

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacatcttc 720

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccgcttca cgcagaagag cctctccctg 780

tctccgggta aa 792

<210> 15

<211> 229

<212> PRT

<213> 未知

<400> 15

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly

225

<210> 16

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gctgagtcca agtatggccc tccctgccct ccttgccctg ctcctgaggc tgctggaggc 60

cctagcgtgt tcctgttccc ccctaagcct aaggacaccc tgatgatttc ccggaccccc 120

gaggtgacct gtgtggtggt ggatgtgtcc caggaggacc ctgaagtgca gttcaactgg 180

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggaaga gcagttcaac 240

agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 300

gagtacaagt gcaaggtgag caataagggc ctgccctcct ccatcgagaa gaccatttcc 360

aaggccaagg gccagcccag ggaaccccag gtgtacaccc tccctcccag ccaggaggag 420

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc ctccgacatt 480

gccgtcgagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac accccccgtg 540

ctggacagcg atggcagctt tttcctgtac tccaggctga ccgtcgacaa gtccaggtgg 600

caggagggca acgtcttctc ctgctccgtg atgcatgagg ccctgcacaa ccactacacc 660

cagaagtccc tgtccctgag cctgggc 687

<210> 17

<211> 684

<212> PRT

<213> 未知

<400> 17

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser

100 105 110

Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn

115 120 125

Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His

130 135 140

Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

145 150 155 160

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

165 170 175

Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

180 185 190

Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser

195 200 205

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

210 215 220

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

225 230 235 240

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

245 250 255

Ala Trp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

260 265 270

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

275 280 285

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

290 295 300

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

305 310 315 320

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val

325 330 335

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

340 345 350

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp

355 360 365

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala

370 375 380

Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe

385 390 395 400

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

405 410 415

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly

420 425 430

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

450 455 460

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

465 470 475 480

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

485 490 495

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

500 505 510

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

515 520 525

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

530 535 540

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

545 550 555 560

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

565 570 575

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

580 585 590

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

595 600 605

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

610 615 620

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

625 630 635 640

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

645 650 655

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

660 665 670

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

675 680

<210> 18

<211> 2159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agatctccta gggccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg 60

ctcagctgtc tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac 120

agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg 180

gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct 240

gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac 300

aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac 360

tatctcacac atcgacaaac caatacaatc atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga 420

attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat 480

gtggggattg acttcaactg ggaataccct tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta 540

aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt gagatgaaga aatttttgag caccttaact 600

atagatggtg taacccggag tgaccaagga ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg 660

atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg gtccatgaaa agggcgggtc cggcgggtcc 720

caggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc gtggtgcagc ctggccggtc cctgcggctg 780

gactgcaagg cctccggcat caccttctcc aactccggca tgcactgggt gcggcaggcc 840

cctggcaagg gcctggagtg ggtggcctgg atctggtacg acggctccaa gcggtactac 900

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgttc 960

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caccaacgac 1020

gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgtcctccg gcgggtccgg cgggtccggc 1080

gggtccggcg ggtccgagat cgtgctgacc cagtcccctg ccaccctgtc cctgtcccct 1140

ggcgagcggg ccaccctgtc ctgccgggcc tcccagtccg tgtcctccta cctggcctgg 1200

taccagcaga agcctggcca ggcccctcgg ctgctgatct acgacgcctc caaccgggcc 1260

accggcatcc ctgcccggtt ctccggctcc ggcttcggca ccgacttcac cctgaccatc 1320

tcctccctgg agcctgagga cttcgccgtg tactactgcc agcagtcctc caactggcct 1380

cggaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaagggcg gcggaggctc cggcggaggc 1440

ggctccggcg gcggcggctc cgctgagtcc aagtatggcc ctccctgccc tccttgccct 1500

gctcctgagg ctgctggagg ccctagcgtg ttcctgttcc cccctaagcc taaggacacc 1560

ctgatgattt cccggacccc cgaggtgacc tgtgtggtgg tggatgtgtc ccaggaggac 1620

cctgaagtgc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 1680

ccccgggaag agcagttcaa cagcacctac agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 1740

caggactggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtga gcaataaggg cctgccctcc 1800

tccatcgaga agaccatttc caaggccaag ggccagccca gggaacccca ggtgtacacc 1860

ctccctccca gccaggagga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa 1920

ggcttctacc cctccgacat tgccgtcgag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat 1980

tacaagacca caccccccgt gctggacagc gatggcagct ttttcctgta ctccaggctg 2040

accgtcgaca agtccaggtg gcaggagggc aacgtcttct cctgctccgt gatgcatgag 2100

gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgtccctga gcctgggctg attaattaa 2159

Claims (5)

1. 一种新型融合蛋白，其特征在于，其由核苷酸序列SEQ ID NO：18所编码。

2.一种制备新型融合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1所述新型融合蛋白的编码核苷酸序列***表达载体中，并将此表达载体引入相应的表达***进而进行融合蛋白的表达。

3.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求1所述的新型融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂组成。

4.根据权利要求3所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂形式为注射剂。

5.一种新型融合蛋白的用途，其特征在于，所述权利要求1所述的新型融合蛋白用于肿瘤治疗药物的制备；所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、胰腺癌和***癌中的一种或多种。