JP6859549B2 - 医薬品活性を有するヘテロアリール化合物 - Google Patents

Description

本発明は、医薬品活性を有するヘテロアリール化合物の技術分野に関する。

Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（以下、略語Ｂｔｋ）は、非受容体型チロシンキナーゼ
であるＴｅｃファミリーのキナーゼに属し、Ｂ細胞系及び骨髄細胞系の細胞に選択的に出
現する。Ｂｔｋは、Ｂ細胞のシグナル伝達を行う重要な役割を果たしており、Ｂ細胞の生
存、分化、増殖及び活性化などに寄与する因子である。Ｂ細胞抗原受容体（（Ｂ ｃｅｌ
ｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ））を介したＢ細胞のシグナルは、広範
囲に生物学的反応を誘発し、そのシグナル伝達が異常である場合、Ｂ細胞の異常な活性化
及び／又は病原性自己抗体の形成などを引き起こす。Ｂｔｋは、このＢＣＲを介したＢ細
胞へのシグナル伝達経路の一部の作用を担っていると考えられている。したがって、ヒト
Ｂｔｋ遺伝子の欠失は、Ｂ細胞の異常な分化を誘導し、免疫グロブリンの産生を著しく減
少させ、それによって、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（ＸＬＡ）の発症を引き起こすこと（
特許文献１参照）が知られている。この疾患の症状には、末梢血におけるＢ細胞の著しい
減少、及び／又は細菌感染に対する感受性の増加が挙げられる。また、Ｂｔｋは、マスト
細胞の活性化及び／又は血小板の生理学的機能に関与することも知られている。したがっ
て、Ｂｔｋ阻害活性を有する化合物は、アレルギー疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、血
栓塞栓性疾患、癌など、Ｂ細胞及び／又はマスト細胞に関連する疾患の治療に有用である
（非特許文献２参照）。

しかし、本発明の化合物の従来技術として、以下の化合物が知られている。

Ｂｔｋ阻害活性を有する化合物には、一般式（Ａ）

（式中、ＬａＡは、ＣＨ２、０、ＮＨ又はＳを示し、ＡｒＡは、置換又は未置換のアリー
ル基、又は置換又は未置換のヘテロアリール基を示し、ＹＡは、アルキル基、ヘテロアル
キル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基
から選ばれる任意の置換基を示し、ＺＡは、ＣＯ、ＯＣＯ、ＮＨＣＯ、ＣＳを示し、Ｒ７
−Ａ及びＲ８−Ａは、独立してＨ、未置換のＣ１−Ｃ４アルキル基、置換のＣ１−Ｃ４ア
ルキル基、未置換のＣ１−Ｃ４ヘテロアルキル基、置換のＣ１−Ｃ４ヘテロアルキル基、
未置換のＣ３−Ｃ６シクロアルキル基、置換のＣ３−Ｃ６シクロアルキル基、未置換のＣ
２−Ｃ６ヘテロシクロアルキル基、及び置換のＣ２−Ｃ６ヘテロシクロアルキル基を示し
、又はＲ７−Ａ及びＲ８−Ａは、一緒に結合を形成し、Ｒ６−Ａは、Ｈ、置換又は未置換
のＣ１−Ｃ４アルキル基、置換又は未置換のＣ１−Ｃ４ヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６ア
ルコキシ基アルキル基、Ｃ１−Ｃ８アルキルアミノアルキル基、置換又は未置換のＣ３−
Ｃ６シクロアルキル基、置換又は未置換のアリール基（ここで、各基の定義は、抜粋され
ている。）を示す。）に示される化合物（特許文献１、２及び３参照）が知られている。

また、一般式（Ｂ）

（式中、Ｌは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＨ−、−Ｃ （Ｏ）、−Ｃ
Ｈ２Ｏ、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−、又は−ＣＨ（ＯＨ）−を示し、Ｒ１は、ハロゲン
原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４ハロアルキル基、又はＣ１
−４ハロアルコキシ基を示し、環１は、それぞれ独立にハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル
基、Ｃ１−４アルコキシ基、シアノ基、Ｃ１−４ハロアルキル基、又はＣ１−４ハロアル
コキシ基から選ばれる１−５個の置換基によって置換され得る４−７員の環状基を示し、
環１における置換基が２個以上である場合、該置換基は、これらが結合して環１を構成す
る原子とともに４−７員の環状基を形成し、環２は、１−３個の−Ｋ−Ｒ２により置換さ
れた４−７員の飽和複素環を示し、Ｋは、−Ｃ（Ｏ）−を示し、式中、左側の結合が環２
に結合され、Ｒ２は、それぞれ独立にＮＲ３Ｒ４、ハロゲン原子、ＣＯＮＲ５Ｒ６、ＣＯ
Ｒ７及びＯＲ８から選ばれる１−５個の置換基によって置換され得るＣ２−４アルケニル
基、又はＣ２−４アルキニル基を示し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に水素原子、又は
ＯＲ９又はＣＯＮＲ１０Ｒ１１によって置換され得るＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ３及
びＲ４は、結合する窒素原子とともにオキソ基又はヒドロキシ基によって置換され得る４
−７員の含窒素飽和複素環を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に水素原子、Ｃ１−
４アルキル基、又はフェニル基を示し、Ｒ７は、水素原子、又はＣ１−４アルキル基を示
し、Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、フェニル基、又はベンゾトリアゾリル基を
示し、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−４アルキル基を示し、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独
立に水素原子、Ｃ１−４アルキル基を示し、ｎは、０−４の整数を示し、ｍは、０−２の
整数を示し、ｎが２個以上である場合、Ｒ１は、同じであってもよく、異なってもよい）
に示されるものが知られている。

先行技術文献
特許文献
特許文献１：特表２０１０−５０４３２４号公報
特許文献２：国際公開第２００８／１２１７４２号ハンドブック
特許文献３：国際公開第２０１０／００９３４２号ハンドブック
非特許文献
非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ，第３６１巻，第２２６−２３３頁，１９９３年
非特許文献２：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，第７巻，第６号，第６２４−６３２頁，２００７年

本発明の目的は、より優れた代謝安定性などを有する、Ｂｔｋ選択的阻害活性を有する新
規化合物を提供することである。

上記目的を達成させるために、本発明は、下記技術案を採用する。

以下のような一般式化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ又はＩｇ、その光学異性
体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和物、そのＮ酸化物、又はこれらのプロドラッ
グである。

（Ｒ_１は、Ｈ、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_４アルキル基、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_４ヘ
テロアルキル基を示し、
Ｒ_２は、Ｒ_６ＣＯ、Ｒ_７ＳＯ、Ｒ_８ＳＯ_２又はＲ_９により置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル
基を示し、
Ｒ_３は、Ｈ、１つ又は複数の置換基、たとえば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
）、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は未置換のアミノ基、置換又
は未置換のアルキル基を示し、
Ｒ_４は、Ｈ、１つ又は複数の置換基、たとえば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
）、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は未置換のアミノ基、置換又
は未置換のアルキル基を示し、
Ｒ_５は、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６アルキル基、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６ヘテロア
ルキル基、置換又は未置換のアリール基、置換又は未置換のヘテロアリール基、置換又は
未置換のＣ_３−Ｃ_６シクロアルキル基、置換又は未置換のＣ_２−Ｃ_６ヘテロシクロアルキ
ル基を示し、
Ｒ_６は、アルケニル基、アルキニル基、及びアルキル基、アルケニル基、アミン基又はハ
ロゲン置換アルケニル基、アルキニル基であり、
Ｒ_７、Ｒ_８は、独立してＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ
、両方は、ヒドロキシ基、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルキル基、（Ｃ_１
−Ｃ_４アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ
基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルコキシ基、Ｃ_６−Ｃ_１０アリール基又はＣ_３−Ｃ_７ヘテロシク
ロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の基によって置換されてもよく、又は、ハロゲン
又はシアノ基から選ばれる１つ又は複数の基によって置換されてもよいＣ_１−Ｃ_５ヘテロ
アリール基であり、
Ｒ_９は、独立してハロゲン、シアノ基又はＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキ
ニル基から選ばれ、両方は、ヒドロキシ基、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロア
ルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、Ｃ_１
−Ｃ_３アルコキシ基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルコキシ基、Ｃ_６−Ｃ_１０アリール基、Ｃ_１−
Ｃ_５ヘテロアリール基又はＣ_３−Ｃ_７ヘテロシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数
の基によって置換されてもよく、
Ｚは、ＣＨ_２、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり、
ｎ_１は、０又は１を示し、ｎ_２は、１−４の整数を示し、ｎ_３は、０−１の整数を示し、
Ｘは、窒素又は炭素を示し、ベンゼン環の任意の位置にあってもよく、Ｙは、窒素を示す
。

好ましくは、
Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_４ヘテロアルキル基を示し、
Ｒ_２は、Ｒ_６ＣＯ、Ｒ_７ＳＯ、Ｒ_８ＳＯ_２又はＲ_９により置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル
基を示し、Ｒ_６は、アルケニル基、アルキニル基、及びアルキル基、アルケニル基、アミ
ン基又はハロゲン置換アルケニル基、アルキニル基を示し、Ｒ_７、Ｒ_８は、独立してＣ_２
−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ、Ｒ_９は、独立してハロゲン
、シアノ基又はＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ、
Ｒ_３は、Ｈを示し、
Ｒ_４は、Ｈ、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、置換又は未置換のアルキル基を
示し、
Ｒ_５は、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６アルキル基、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６ヘテロア
ルキル基、置換又は未置換のアリール基、置換又は未置換のヘテロアリール基を示し、
Ｚは、Ｏであり、
ｎ_１は、０又は１を示し、ｎ_２は、１−４の整数を示し、ｎ_３は、０−１の整数を示し、
Ｘ表示窒素又は炭素、ベンゼン環の任意の位置にあってもよい。）

本特許では、一般式化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ又はＩｇは、一般式（Ｉ
ａ−Ｉｇ）に示される化合物、又は一般式化合物Ｉａ−Ｉｇと呼ばれることもある。

医薬品組成物であって、前記一般式化合物Ｉａ−Ｉｇ、その光学異性体又はこれらの混合
物、その塩、その溶媒和物、そのＮ−酸化物、又はこれらのプロドラッグを含有する。

前記一般式化合物Ｉａ−Ｉｇ、その光学異性体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和
物、そのＮ−酸化物、又はこれらのプロドラッグの、Ｂｔｋ阻害薬としての使用。

前記一般式化合物Ｉａ−Ｉｇ、その光学異性体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和
物、そのＮ−酸化物、又はこれらのプロドラッグの、Ｂｔｋ関連疾患の予防及び／又は治
療薬としての使用、さらに、Ｂｔｋ関連疾患、たとえば、アレルギー性疾患、自己免疫疾
患、炎症性疾患、血栓塞栓性疾患、又は癌を予防及び／又は治療する医薬品としての使用
、またさらに、非ホジキンリンパ腫を予防及び／又は治療する医薬品としての使用。

前記一般式化合物Ｉａ−Ｉｇ、その光学異性体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和
物、そのＮ−酸化物、又はこれらのプロドラッグを含有する医薬品組成物の、Ｂ細胞活性
化阻害剤としての使用。

Ｂｔｋ関連疾患の予防及び／又は治療方法は、上記［１］に記載の一般式（Ｉａ−Ｉｇ）
に示される化合物、その光学異性体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和物、そのＮ
−酸化物、又はこれらのプロドラッグを有効量で哺乳動物に投与することを含む。

本発明の有益な効果は、以下のとおりである。

本発明による新規化合物は、Ｂｔｋ選択的阻害活性を有する以外、代謝安定性に優れてお
り、肝臓毒性などを回避できる化合物であり、このため、安全性に優れて、非ホジキンリ
ンパ腫などのＢ細胞及び／又はマスト細胞関連疾患の治療剤として有用である。

本発明では、「Ｂｔｋ選択的阻害活性を有する」とは、Ｂｔｋ以外のチロシンキナーゼ、
特にＬｃｋ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）、ＬｙｎＡ（ｖ−ｙｅｓ−１
山口（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）肉腫ウイルス関連癌遺伝子ホモログアイソフォームＡ）に
対してＢｔｋ選択的阻害活性を有することを意味する。該特性によって、ほかのチロシン
キナーゼの阻害による好ましくない副作用を回避できる。たとえば、Ｌｃｋ 欠損マウス
には、網膜異常（癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第１６巻、２３５１−２３５６頁、１
９９８年）が認められており、このため、Ｌｃｋを阻害すると、眼に対する副作用を引き
起こし得ることが知られている。

本発明では、ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である。

本発明では、Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基などの直鎖又は分岐のＣ１−Ｃ４アルキル基
である。

本発明では、Ｃ１−Ｃ４アルキレン基は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチ
レン基及びこれらの異性体等である。本発明では、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基とは、メトキ
シ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ
−ブトキシ基などの直鎖又は分岐のＣ１−Ｃ４アルコキシ基である。

本発明では、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基は、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル
基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１，３−ブタジエニル基などの
直鎖又は分岐のＣ２−Ｃ４アルケニル基である。Ｃ２−Ｃ４アルキニル基は、エチニル基
、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニ
ル基、１，３−ブタジイニル基などの直鎖又は分岐のＣ２−Ｃ４アルキニル基である。

異性体
本発明では、特に断らない限り、すべての異性体も含まれる。たとえば、アルキル基は、
直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を含む。さらに、二重結合、環、縮合環における幾何
異性体（Ｅ型、Ｚ型、シス体、トランス体）、不斉炭素原子などの存在により発生する光
学異性体（Ｒ、Ｓ型、α、β立体配置、エナンチオマー、ジアステレオマー）、旋光性を
有する光学活性体（Ｄ、Ｌ、ｄ、１型）、クロマトグラフィー分離による極性物（高極性
物、低極性物）、バランス化合物、回転異性体、これらを任意の割合で混合した混合物、
ラセミ混合物は、すべて本発明に含まれる。また、本発明では、互変異性体により生じる
すべての異性体も含まれる。

また、本発明における光学異性体は、純度１００％のものを含むだけではなく、純度５０
％未満のほかの光学異性体を含む。

本発明では、特に断らない限り、当業者が公知する符号

は、紙面に向かう一側に結合される（即ちα立体配置）ことを意味し、

は、紙面の観察者の手前側に結合される（即ちβ立体配置）ことを意味し、

は、α立体配置、β立体配置又はこれらを任意の割合で混合した混合物である。

一般式（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物は、公知の方法によって対応する塩に転化できる
。塩は、水溶性のものが好ましい。適切な塩として、アルカリ金属（カリウム、ナトリウ
ムなど）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）の塩、アンモニウム
塩、薬学的に許容される有機塩基（テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、メチ
ルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン
、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミンなど）の塩、酸付
加物塩（無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩
など）、有機酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマ
ル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン
酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ヒドロキシエチルスルホン酸塩、
グルクロン酸塩、グルコン酸塩）などが挙げられる。

一般式（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物及びその塩は、溶媒和物に転化してもよい。溶媒
和物は、低毒性且つ水溶性のものが好ましい。適切な溶媒和物として、たとえば、水、ア
ルコール類の溶媒（たとえば、エタノールなど）の溶媒和物が挙げられる。

また、一般式（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物のプロドラッグとは、生体内で酵素及び／
又は胃酸などによって反応して、一般式（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物に転化できるも
のを意味する。一般式（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物のプロドラッグとしては、一般式
（Ｉａ−Ｉｇ）に示される化合物がヒドロキシ基を有する場合、該ヒドロキシ基がアシル
化、アルキル化、ホスホリル化、ボロニル化された化合物が挙げられる。

薬物における用途
本発明の化合物は、選択的なＢｔｋ阻害作用を有するため、Ｂｔｋ関連疾患、即ち、Ｂ細
胞及び／又はマスト細胞関連疾患、たとえば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、炎症性
疾患、血栓塞栓性疾患、癌、移植片対宿主病などの予防及び／又は治療剤として効果的に
利用できる。また、本発明の化合物は、Ｂ細胞活性化を選択的に阻害する作用も有するた
め、Ｂ細胞活性化阻害剤として効果的に利用できる。

本発明では、アレルギー性疾患として、たとえば、アレルギー、アレルギー反応、アレル
ギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎が挙げられる。

本発明では、自己免疫疾患として、たとえば、炎症性腸疾患、関節炎、ループス、リウマ
チ、乾癬性関節炎、変形性関節炎、スティル病、若年性関節炎、Ｉ型糖尿病、重症筋無力
症、橋本甲状腺炎、Ｏｒｄ´ｓ甲状腺炎、バセドウ病、シェーグレン症候群、多発性硬化
症、ギランバレー症候群、急性流行性脳脊髄炎、アジソン病、オプソクローヌス・ミオク
ローヌス症候群、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性肝
炎、セリアック病、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、視神経炎、強
皮症、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式抗体自己免
疫性溶血性貧血、多発血管炎性肉芽腫症、乾癬、全身性脱毛症、ベーチェット病、慢性疲
労症候群、自律神経障害、子宮内膜疾患、間質性膀胱炎、筋硬直、外陰部痛、全身性エリ
テマトーデスが挙げられる。

本発明では、炎症性疾患として、たとえば、喘息、虫垂炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支
炎、滑液包炎、子宮頸炎、胆管炎、胆嚢炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、
皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織
炎症、胃炎、胃腸炎、肝炎、汗腺膿瘍、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎
、腎炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、膵炎、おたふく風邪、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎
、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、耳管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜
炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎が挙げられる。

本発明では、血栓塞栓性疾患として、たとえば、心筋梗塞、狭心症、血管形成術後の再閉
塞、血管形成術後の再狭窄、大動脈冠動脈バイパス術後の再閉塞、大動脈冠動脈バイパス
術後の再狭窄、脳梗塞、一過性虚血、末梢血管閉塞、肺塞栓症、深部静脈血栓症が挙げら
れる。

本発明では、癌には、非ホジキンリンパ腫が含まれ、好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ
腫であり、たとえば、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ
腫（節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫
、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、濾胞
性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性
白血病／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞腫、マントル細胞リンパ
腫、縦隔大細胞Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病挙げられ
る。また、本発明における癌のうち、非ホジキンリンパ腫以外の癌には、腺内分泌腫瘍が
含まれ、たとえば、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、成長ホルモン腫
瘍、ＶＩＰ産生腫瘍（ＶＩＰｏｍａ）、ＰＰ産生腫瘍（ＰＰｏｍａ）、ＧＲＦ産生腫瘍が
挙げられる。

本発明の化合物は、単独で投与し得るが、以下のためにほかの医薬品と組み合わせて、複
合医薬品として投与してもよい。

１）該化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増強させること、
２）該化合物の薬物動態及び吸収を改善したり、投与量を低減させたりすること、及び／
又は、
３）該化合物の副作用を低減させること。

本発明の化合物とほかの医薬品との複合医薬品は、１つの製剤に２種の成分を配合した配
合剤の形態として投与してもよく、個別の製剤として投与する形態としてもよい。それぞ
れの製剤で投与する場合、同時投与する場合と、所定の時間おきに投与する場合が含まれ
る。また、所定の時間おきに投与する場合は、まず本発明の化合物を投与し、次にほかの
医薬品を投与してもよいし、まずほかの医薬品を投与し、次に本発明の化合物を投与して
もよい。これらの投与方法は、同じであってもよく、異なってもよい。

上記複合医薬品で予防及び／又は治療効果を果たす疾患については特に限定がなく、本発
明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増強できる疾患であればよい。

アレルギー性疾患に対する本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増
強するためのほかの医薬品として、たとえば、抗ヒスタミン薬、ロイコトリエン拮抗薬、
抗アレルギー薬、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤、トロンボキサン合成酵素阻害剤、ス
テロイドが挙げられる。

自己免疫疾患に対する本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増強す
るほかの医薬品として、たとえば、免疫阻害剤、ステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬、
エラスターゼ阻害剤、カンナビノイド−２受容体刺激薬、プロスタグランジン、プロスタ
グランジン合成酵素阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤
、接着分子阻害剤、抗ＴＮＦ−α製剤、抗ＩＬ−１製剤、抗ＩＬ−６製剤などの抗サイト
カインタンパク質製剤、サイトカイン阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬、抗ＣＤ２０抗体
が挙げられる。

炎症性疾患に対する本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増強する
ほかの医薬品として、たとえば、ステロイド、エラスターゼ阻害剤、カンナビノイド−２
受容体刺激薬、プロスタグランジン、プロスタグランジン合成酵素阻害剤、ホスホジエス
テラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、接着分子阻害剤、抗ロイコトリエン薬、
抗コリン薬、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤、トロンボキサン合成酵素阻害剤、キサン
チン誘導体、去痰薬、抗菌薬、抗ヒスタミン薬、抗サイトカインタンパク質製剤、サイト
カイン阻害剤、フォルスコリン製剤、メディエーター遊離阻害剤、非ステロイド系抗炎症
薬が挙げられる。

血栓塞栓性疾患に対する本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増強
するほかの医薬品として、たとえば、血栓溶解薬、ヘパリン、ヘパリン類似体、低分子量
ヘパリン、ワルファリン、トロンビン阻害剤、因子Ｘａ阻害剤、ＡＤＰ受容体拮抗剤、シ
クロオキシゲナーゼ阻害剤が挙げられる。

非ホジキンリンパ腫に対する本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は
増強するほかの医薬品として、たとえば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗がん抗生物質、
植物アルカロイド、ホルモン薬、白金化合物、抗ＣＤ２０抗体、その他の抗がん剤が挙げ
られる。

抗ヒスタミン薬の例として、たとえば、塩酸アゼラスチン、エバスチン、塩酸エピナスチ
ン、フマル酸エメスチン、オーラノフィン、オキサトミド、塩酸オロパタジン、ｄ１−マ
レイン酸クロルフェニラミン、フマル酸クロムスチン、フマル酸ケトチフェン、シメチジ
ン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒドラミン、塩酸シプロヘプタジン、塩酸セチリ
ジン、デスロラタジン、テルフェナジン、ファモチジン、塩酸フェキソフェナジン、ベタ
ヒスチン、ベポタスチンベシル酸塩、ミゾラスチン、メキタジン、フランカルボン酸モメ
タゾン、ラニチジン、塩酸ラニチジン、ロラタジン、塩酸プロメタジン、ホモクロルシク
リジン塩酸塩が挙げられる。

ロイコトリエン拮抗薬の例として、たとえば、プロレナスト水和物、モンテルカストナト
リウム、ザフィルルカスト、アブルカスト、ポビルカスト、スルカスト、イラルカストナ
トリウム、ベルルカスト、リトルカスト、シナルカスト、ピロドマスト、トメルカスト、
ドカラストが挙げられる。

抗アレルギー薬の例として、たとえば、アンレキサノクス、アゼラスチン塩酸塩、イスラ
パファント、イブジラスト、イミトロダストナトリウム、エバスチン、塩酸エピスチン、
フマル酸エメダスチン、オキサトミド、塩酸オザグレル、塩酸オロパタジン、クロモグリ
ク酸、クロモグリク酸ナトリウム、フマル酸ケトチフェン、セラトロダスト、塩酸セチリ
ジン、スプラタスト、タザノラスト、テルフェナジン、ドミトロバンカルシウム水和物、
トラニラスト、ネドクロミル、フェキソフェナジン、塩酸フェキソフェナジン、ペミロラ
ストカリウム、メキタジン、ラマトロバン、レピリナスト、ロラタジンが挙げられる。

トロンボキサンＡ２受容体阻害剤の例として、たとえば、セラトロダスト、ドミトロバン
カルシウム水和物、ラマトロバンが挙げられる。

トロンボキサン合成酵素阻害剤の例として、たとえば、イミトロダストナトリウム、塩酸
オザグレルが挙げられる。

ステロイドの例として、たとえば、アムシノニド、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム
、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、シク
レソニド、ジフルプレドネート、プロピオン酸ベタメタゾン、デキサメタゾン、デフラザ
コルト、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ハルシノニド、パルミチン酸
デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、プレドニゾロンテブテート
、ブデソニド、プラステロン硫酸エステル、モメタゾンフランカルボン酸エステル、酢酸
フルオシノロン、フルオシノロン、フルドロキシコルチド、フルニソリド、プレドニゾロ
ン、プロピオン酸アクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸デキサメ
タゾン、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ベクロメタ
ゾン、ベタメタゾン、メチルプレドニゾロン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、メチ
ルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸ヒドロ
コルチゾンナトリウム、プレドニゾンリン酸ナトリウム、吉草酸ジフルコルトロン、吉草
酸デキサメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、酢酸コルチゾン、
ジフロラゾン酢酸エステル、酢酸デキサメタゾン、酢酸トリアムシノロン、酢酸パラミタ
ゾン、酢酸ハロプレドン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸プレドニゾロン、酢酸メチルプ
レドニゾロン、酪酸クロベタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコル
チゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾンが挙げられる。

免疫阻害剤の例として、たとえば、アザチオプリン、アスコマイシン、エベロリムス、ス
ルファサラジン、シクロスポリン、シクロホスファミド、シロリムス、タクロリムス、ブ
シラミン、アメトプテリン、レフルノミドが挙げられる。

疾患修飾性抗リウマチ薬の例として、たとえば、Ｄ−ペニシラミン、アクタリット、オー
ラノフィン、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ブシラミン、アメトプテリン、
レフルノミド、ロベンザリット二ナトリウム、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナ
トリウムが挙げられる。

プロスタグランジン類（以下、略語ＰＧ）として、たとえば、ＰＧＥ１製剤（たとえば、
アルプロスタジルα−シクロデキストリン包接体、アルプロスタジルなど）、ＰＧＩ２製
剤（たとえば、ベラプロストナトリウムなど）、ＰＧ受容体アゴニスト、ＰＧ受容体拮抗
剤などが挙げられる。ＰＧ受容体として、ＰＧＥ受容体（ＥＰｌ、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ
４）、ＰＧＤ受容体（ＤＰ、ＣＲＴＨ２）、ＰＧＦ受容体（ＦＰ）、ＰＧＩ２受容体（Ｉ
Ｐ）、ＴＸ受容体（ＴＰ）などが挙げられる。

プロスタグランジン合成酵素阻害剤の例として、たとえば、スルファサラジン、メサラジ
ン、オルサラジン、４−アミノサリチル酸、オーラノフィン、カルプロフェン、ジフェン
ピラミド、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェ
ン、ロルノキシカム、ロソプロフェン、メロキシカム、オキサプロジン、パルサール、ナ
プロキセンピペラジン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ザルトプロフェン、プラノ
プロフェンが挙げられる。

ホスホジエステラーゼ阻害剤の例として、たとえば、ロリプラム、シロミラスト、ロフル
ミラスト（ＢＹ−２１７）が挙げられる。

接着分子阻害剤の例として、たとえば、α４−インテグリン拮抗剤が挙げられる。

抗ＴＮＦ−α製剤の例として、たとえば、抗ＴＮＦ−α抗体、可溶性ＴＮＦ−α受容体、
抗ＴＮＦ−α受容体抗体、可溶性ＴＮＦ−α結合タンパク質、特にインフリキシマブ、エ
タネルセプトが挙げられる。

抗ＩＬ−１製剤の例として、抗ＩＬ−１抗体、可溶性ＩＬ−１受容体、抗ＩＬ−ｌＲａ及
び／又はＩＬ−１受容体抗体が挙げられ、特にアナキンラが挙げられる。

抗ＩＬ−６製剤の例として、抗ＩＬ−６抗体、可溶性ＩＬ−６受容体、抗ＩＬ−６受容体
抗体が挙げられ、特にトシリズマブが挙げられる。

サイトカイン阻害剤の例として、たとえば、スプラタスト、Ｔ−６１４が挙げられる。

抗コリン薬の例として、たとえば、トリヘキシフェニジル、塩酸トリヘキシフェニジル、
ビペリデン、塩酸ビペリデンが挙げられる。

キサンチン誘導体として、たとえば、アミノフィリン、テオフィリン、ドキソフィリン、
シパムフィリン、ジプロフィリンが挙げられる。

去痰薬として、アニシジンアルコール、重炭酸ナトリウム、ブロムヘキシン塩酸塩、カル
ボシステイン、アンブロキソール塩酸塩、メチルシステイン塩酸塩、アセチルシステイン
、Ｌ−エチルシステイン塩酸塩、チロキサポールが挙げられる。

抗菌薬の例として、たとえば、セフロキシムナトリウム、メロペネム三水和物、硫酸ネチ
ルマイシン、硫酸シソマイシン、セフチブテン、ＰＡ−１８０６、ＩＢ−３６７、トブラ
マイシン、ＰＡ−１４２０、ドキソルビシン、硫酸アストロマイシン、セフェタメトピボ
キシル塩酸塩が挙げられる。

メディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）遊離阻害剤の例として、たとえば、トラニラスト、
クロモグリク酸ナトリウム、アンレキサノクス、レピリナスト、イブジラスト、タザノラ
スト、ペミロラストカリウムなどが挙げられる。

血栓溶解薬の例として、たとえば、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、チソキナーゼ、ナサ
ルプラーゼ、ナテプラーゼ、ｔ−ＰＡ、パミテプラーゼ、モンテプラーゼ、プロテインキ
ナーゼ、ストレプトキナーゼが挙げられる。

ヘパリン類似体の例として、たとえば、フォンダパリヌクスが挙げられる。

低分子量ヘパリンの例として、たとえば、ダナパロイドナトリウム、エノキサパリン（ナ
トリウム）、ナドロパリンカルシウム、ベミパリン（ナトリウム）、レビパリン（ナトリ
ウム）、チンザパリン（ナトリウム）が挙げられる。

トロンビン阻害剤の例として、たとえば、アルガトロバン、キシメラガトラン、メラガト
ラン、ダビガトラン、ビバリルジン、レピルジン、ヒルディン、デシルジンが挙げられる
。

ＡＤＰ受容体拮抗剤の例として、たとえば、チクロピジン塩酸塩、クロピドグレルが挙げ
られる。

シクロオキシゲナーゼ阻害剤の例として、たとえば、アスピリンが挙げられる。

アルキル化剤の例として、たとえば、塩酸メクロレタミン−Ｎ−オキサイド、シクロホス
ファミド、イホスファミド、メルファラン、チオテパ、カルボコン、ブスルファン、プロ
カルバジン塩酸塩、ダカルバジン、ラニムスチンなどが挙げられる。

代謝拮抗剤の例として、たとえば、メトトレキサート、メルカプトプリン、６−メルカプ
トプリン、フルオロウラシル、テガフール、テガフールウラシル、カルモフール、ドキシ
フルリジン、シタラビン、エノシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム
、塩酸ゲムシタビン、塩酸プロカルバジン、ヒドロキシ尿素などが挙げられる。

抗癌性抗生物質の例として、たとえば、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、塩酸ダ
ウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アムルビシン、ネオカルジノスタチン、塩酸ピ
ラルビシン、（塩酸）エピルビシン、塩酸イダルビシン、クロモマイシンＡ３、（塩酸）
ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ピラルビシン、ジノスタチンスチマラマーなどが
挙げられる。

植物性製剤の例として、たとえば、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビン
デシン、塩酸イリノテカン、エトポシド、フルタミド、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセ
ル水和物、パクリタキセルなどがが挙げられる。

ホルモン剤の例として、たとえば、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、メピチ
オスタン、エピチオスタノール、ゴセレリン酢酸塩、ホスフェストロール（ホンバン）、
クエン酸タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、ベンゾニトリル水和物、メドロキシ
プロゲステロン酢酸エステル、ビカルタミド、リュープロレリン酢酸塩、アナストロゾー
ル、エキセメスタンなどが挙げられる。

白金化合物の例として、たとえば、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンなどが
挙げられる。

抗ＣＤ２０抗体の例として、たとえば、リツキシマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ
が挙げられる。

ほかの抗癌剤の例として、たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼ、オクトレオチド酢酸塩、ポ
ルフィマーナトリウム、酢酸ミトキサントロンが挙げられる。

また、本発明の化合物と組み合わせる複合医薬品として、今まで既存の医薬品だけでなく
、将来現れる医薬品を含む。

本発明の化合物は、通常、医薬品有効成分として経口又は非経口の形態で全身又は局所投
与する。経口剤として、たとえば、内服用液体製剤（たとえば、エリキシル剤、シロップ
剤、薬理学的に許容される水剤、懸濁剤、エマルジョン剤）、内服用固体製剤（たとえば
、錠剤（舌下錠、口腔崩解錠を含む）、丸剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプ
セル、ゼラチンカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、糖衣錠剤などが挙
げられる。非経口剤として、たとえば、液体製剤（たとえば、注射剤（皮下注射剤、静脈
内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤など）、点眼剤（たとえば、水性点眼剤
（水性点眼液、水性懸濁点眼液、粘性点眼液、可溶性点眼液など）、非水性点眼剤（非水
性点眼液、非水性懸濁点眼液など））など）、外用剤（たとえば、軟膏（眼用クリーム）
）、点耳剤などが挙げられる。これら製剤は、速放製剤、徐放製剤などの放出徐放製剤で
あってもよい。これら製剤は、公知の方法によって調製できる。

経口剤である内服用液体製剤の場合は、たとえば、有効成分を通常使用されている希釈剤
（たとえば、精製水、エタノール又はこれらの混合液など）に溶解、懸濁又は乳化させて
調製する。さらに、該液体製剤は、湿潤剤、懸濁助剤、乳化剤、甘味剤、調味剤、香味剤
、防腐剤、緩衝剤などを含有してもよい。

経口剤である内服用固体製剤は、たとえば、有効成分を賦形剤（たとえば、乳糖、マンニ
トール、グルコース、微結晶セルロース、でんぷんなど）、粘着剤（たとえば、ヒドロキ
シプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）
、崩壊剤（たとえば、セルロースグルコン酸カルシウムなど）、潤滑剤（たとえば、ステ
アリン酸マグネシウムなど）、安定剤、共溶媒（グルタミン酸、アスコルビン酸等）など
と混合して、常法によって製剤化することができる。また、必要に応じてコート剤（たと
えば、白砂糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピル
メチルセルロースなど）で被覆してもよく、また、２以上の層で被覆してもよい。

非経口剤である外用剤は、公知の方法又は通常使用されている処方によって調製できる。
たとえば、軟膏剤は、有効成分を基剤において粉砕又は溶融することによって調製できる
。軟膏基剤は、公知のもの、又は通常使用されている基剤から選ばれてもよい。たとえば
、高級脂肪酸又は高級脂肪酸エステル（たとえば、アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチ
ン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ミリス
チン酸エステル、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステルなど）、ワックス類（たと
えば、蜜蝋、鯨蝋、ミネラルワックスなど）、界面活性剤（たとえば、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテルリン酸エステルなど）、高級アルコール（たとえば、セチルアルコー
ル、ステアリルアルコール、ヘキサデシルアルコールなど）、シリコンオイル（たとえば
、ジメチルポリシロキサンなど）、炭化水素類（たとえば、親水性ワセリン、白いワセリ
ン、精製ラノリン、流動パラフィンなど）、グリコール類（たとえば、エチレングリコー
ル、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチ
レングリコールなど）、植物油（たとえば、ひまし油、オリーブオイル、ゴマ油、テレビ
ン油など）、動物油（たとえば、ミンクオイル、卵黄油、スクワラン、スクアレンなど）
、水、吸収促進剤、抗腫剤から選ばれる１種又は２種以上の混合物として使用できる。さ
らに、保湿剤、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、香味剤などを含有してもよい。

非経口剤である注射剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン及び使用時に溶媒に溶解又は懸濁
させて使用する固体注射剤を含む。注射剤は、たとえば、有効成分を溶媒に溶解、懸濁又
は乳化してなる注射剤であってもよい。溶媒として、たとえば、注射用蒸留水、生理食塩
水、植物油、プロピングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールなどのアルコー
ル類など、及びこれらの組み合わせが使用できる。さらに、該注射剤は、安定剤、共溶媒
（たとえば、グルタミン酸、アスコルビン酸、ポリソルベート８０など）、懸濁助剤、乳
化剤、無痛化剤、緩衝剤、防腐剤などを含有してもよい。これらは、最終工程において滅
菌又は無菌操作法によって調製できる。また、無菌固体製剤を調製してもよく、たとえば
、凍結乾燥品の場合は、使用前に無菌化又は無菌の注射用蒸留水又はほかの溶媒に溶解さ
せて使用することができる。

本発明の化合物を医薬品の有効成分として使用する場合の投与量は、症状、年齢、剤形な
どに応じて適切に選択すればよく、経口剤の場合は、好ましくは、１日あたり１回〜複数
回（たとえば、１〜３回）で１〜５００ｍｇ投与する。点眼剤の場合は、好ましくは、１
日あたり１回〜複数回（たとえば、１〜８回）、１〜複数滴／１回の量で、目に０．００
０００１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度、より好ましくは０．００００１〜０．０５％（ｗ／ｖ
）の濃度の点眼剤を滴下する。また、眼用クリームの場合、好ましくは、１日あたり１回
〜複数回（たとえば、１〜４回）で０．０００００１〜５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは
０．００００１〜０．０５％（ｗ／ｗ）の濃度の眼用クリームを塗布する。

勿論、前記のとおり、投与量は、さまざまな条件に応じて変化することができ、このため
、上記投与量よりも少ない量で投与すると十分である場合も、上記範囲を超える必要があ
る場合もある。

ドナー５１７ Ｔ細胞活性化に対する試験物の阻害作用である。 ドナー５１７ Ｂ細胞及び末梢血単核細胞の活性化に対する試験物の阻害作用である。 ドナー５８１ Ｔ細胞活性化に対する試験物の阻害作用である。 ドナー５８１ Ｂ細胞及び末梢血単核細胞の活性化に対する試験物の阻害作用である。 ドナー９５６ Ｔ細胞活性化に対する試験物の阻害作用である。 ドナー９５６ Ｂ細胞及び末梢血単核細胞の活性化に対する試験物の阻害作用である。 試験物で処理された後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激されたＤＯＨＨ２細胞のｐ−Ｂｔｋ／ｔ−Ｂｔｋの相対発現レベルである。 試験物で処理された後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激されたＤＯＨＨ２細胞のｐ−ＰＬＣγ／ｔ−ＰＬＣγの相対発現レベルである。 試験物で処理された後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激されたＤＯＨＨ２細胞のｐ−Ｅｒｋ／ｔ−Ｅｒｋの相対発現レベルである。 試験物を投与された雄ＳＤラットの体重変化である。 試験物を投与された雌性ＳＤラットの体重変化である。 試験物を投与された雄ＳＤラットの摂食量の変化である。 試験物を投与された雌性ＳＤラットの摂食量の変化である。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されな
い。

クロマトグラフィーにより得られた分離位置、及びＴＬＣに示されている括弧内の溶媒は
、使用されている溶出溶媒又は展開溶媒を示し、割合は、体積比を示す。

本明細書に使用されている化合物の名称は、一般には、ＩＵＰＡＣ規則に従って命名され
るコンピュータープログラム−Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ社製のＡＣＤ／Ｎａｍｅ（登録商標）を用い、又はＩＵＰＡＣ命名法に従って命
名される。

実施例１：３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−４−アミン

三口フラスコに化合物４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（５０ｇ、０．３７
ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）を加え、Ｎ−ブロモスクシン
イミド（７８．１ｇ、０．４４ｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）
からなる溶液を室温で滴下し、滴下終了後、６５℃に昇温して撹拌しながら４ｈ反応させ
た。反応液を乾固になるまで蒸発させて、水（５００ｍＬ）を加え、０℃で１ｈ撹拌して
、土色固体を析出させ、ｐＨ＝７に調整してろ過し、ろ過ケーキを水（２５０ｍＬ）、冷
たいエタノール（２５０ｍＬ）で順次洗浄し、真空乾燥させて、土色固体６５ｇを得て、
収率は、８２％であった。

実施例２：３−ブロモ−１−（３−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリ
ミジン−４−アミン

窒素ガスの保護下、実施例１で調製された化合物（２０ｇ、０．０９３ｍｏｌ）、化合物
Ｎ−ＢＯＣ−３−ヒドロキシピペリジン（２８．２１ｇ、０．１４ｍｏｌ）及びトリフェ
ニルホスフィン（８５．７９ｇ、０．３３ｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２００ｍ
Ｌ）に加えて、茶色の懸濁液とし、０℃に降温して、温度を５℃以下に保持しながらアゾ
ジカルボン酸ジイソプロピル（６６．１４ｇ、０．３３ｍｏｌ）を滴下し、溶液が徐々に
透明な淡黄色になり、滴下終了後、徐々に０−１０℃に昇温して撹拌しながら３ｈ反応さ
せ、濃塩酸（７８ｍＬ）を加えて、５０℃に昇温して撹拌しながら２ｈ反応させ、室温に
降温してろ過し、ろ過ケーキに水を加えて溶解させ、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを
８に調整して、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させてろ過
し、乾固まで真空濃縮させて、略白色の固体１９．５ｇを得て、収率は、７０％であった
。ｍ／ｚ （ ＭＨ^＋ ） ２９７， １Ｈ ＮＭＲ （ ４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ
）δ１．９４−２．１１， ２．９２−２．９８，３．０１−３．３６，３．４５−３．
４７，５．１２−５．１９， ８．５０−８．５１， ９．６１−９．８７。

実施例３：３−（４−フェノキシフェニル）−１−（３−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例２で得られた化合物（１．０ｇ、１．０ｅｑ）、４−フェノキシフェニルボロン酸
（１．７ｇ、１．３ｅｑ）、炭酸カリウム（１．６ｇ、４．０ｅｑ）をｄｉｏｘａｎｅ（
２１ｍｌ）／Ｈ_２Ｏ（９ｍｌ）に懸濁させて、窒素バブリングにより酸素除去を１０ｍｉ
ｎ行った。テトラトリフェニルホスフィンパラジウム（０．１ｇ、０．０５ｅｑ）を加え
て、５ｍｉｎバブリングし続けた。還流するまで加熱して、４ｈ後、サンプリングしてＴ
ＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝９：１）を行った。反応終了後、室温に降温して、
分液し、有機層を濃縮させて油状物を得た。水１０ｍｌ、酢酸エチル１５ｍｌを加えて、
不溶物が認められた。４Ｎ塩酸でｐＨを２−３に調整して、清澄化させた。分液して有機
層を除去し、水層を酢酸エチル１０ｍｌｘ２で洗浄した。４Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを８−９に調整して、酢酸エチル２０ｍｌを加えて清澄化させて抽出した。飽和食塩水
１０ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウム３ｇで乾燥させた。減圧濃縮させて、淡黄色固体
０．５ｇを得た。

実施例４：１−（３−（１−ニトロソピペリジニル））−３−（４−フェノキシフェニル
）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例３で得られた化合物（４．５ｇ）を水２０ｍｌに懸濁させ、酢酸を加えて清澄化さ
せた。Ｎ_２、１０℃でＮａＮＯ_２溶液２０ｍｌを滴下し、固体を析出させた。０−１０℃
で６ｈ撹拌し、サンプリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝１０：１）を行って
、反応終了後、炭酸ナトリウム固体を加えて余分な酢酸を消費し、酢酸エチル４０ｍｌを
加えた。分液して、水層を１０ｍｌｘ２酢酸エチルで抽出し、有機層を合併して、飽和食
塩水で洗浄した。乾固まで減圧濃縮させて、淡黄色固体４．５ｇを得た。
δ８．２５−８．３（ｄ，１Ｈ）， ７．３８−７．４７（ｍ，４Ｈ）， ７．１８−７
．２１（ｍ，２Ｈ），７．１３−７．２２（ｍ，５Ｈ）， ５．７９−５．８２（ｓ，２
Ｈ），５．０３−５．０８（ｍ，１Ｈ），４．８４−４．９１（ｍ，１ Ｈ）， ４．４
７−４．５６（ｍ，１ Ｈ） ， ４．１１−４．１５（ｍ，１ Ｈ），２．６５−２
．７４（ｍ，１Ｈ），２．６０−２．６４（ｍ，１Ｈ） １．９９−２．０９（ｍ，１Ｈ
），１．７２−１．７５（ｍ，１Ｈ）

実施例５：１−（３−（１−ニトロソピペリジニル））−３−（４−フェノキシフェニル
）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン

Ｎ_２、−１０℃で、水素化アルミニウムリチウム（４ｅｑ）を無水テトラヒドロフラン（
２０ｖｏｌ）に加えて、温度を−１０℃以下に維持した。実施例４で得られた化合物（２
ｇ）を無水テトラヒドロフラン（１０ｖｏｌ）に懸濁させ、懸濁液をゆっくりと反応フラ
スコに滴下して、温度を０℃未満に維持した。滴下終了後、４ｈ保温し、サンプリングし
てＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝２：１）を行った。Ｎａ_２ＳＯ_４・１０Ｈ_２Ｏで反
応液をクエンチさせて、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフラン１０ｍｌで濯
ぎ、乾固まで減圧濃縮させて、白色泡沫状の固体を得てシリカゲルカラムを通し、目標産
物（１ｇ）を得た。

実施例６：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ
［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル）アクリルアミド（化合物Ｄ
Ｄ００１−１）

Ｎ_２で、実施例５で得られた化合物（０．１ｇ）を２−メチルテトラヒドロフラン５ｍｌ
に溶解して、７％ＮａＨＣＯ_３溶液を加えた。塩化アクリロイル（１．１ｅｑ）を２−メ
チルテトラヒドロフランに溶解して、ゆっくりと反応フラスコに滴下した。０℃以下で２
ｈ撹拌し、サンプリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１０：
５：１）を行って静置して分液し、水層を５ｍｌｘ２の酢酸エチルで抽出し、有機層を合
併して、飽和食塩水で洗浄した。減圧濃縮させて、シリカゲルカラム（溶出液酢酸エチル
：ジクロロメタン：メタノール＝１０：５：１）を通し、白色固体ＤＤ００１−１（０．
１ｇ）を得た。 δ８．５１−８．５４（ｄ，１Ｈ），８．４１−８．４２（ｍ，２Ｈ）
，８．１１−８．３２（ｍ，２Ｈ），７．８５−７．８９（ｍ，２Ｈ），７．７８−７．
８２（ｍ，２Ｈ），７．１８−７．２１（ｍ，２Ｈ），６．５２−６．６３（ｍ，１Ｈ）
，６．１３−６．２１（ｍ，１Ｈ），５．６９−５．７７（ｍ，１Ｈ）， ３．８１−３
．８７（ｍ，１Ｈ）， ３．６０−３．３．６３（ｍ，１Ｈ），３．１９−３．３３（ｍ
，２Ｈ），１．７８−２．０８（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．５８（ｍ，２Ｈ）

実施例７：１−（３−（１−メチルアミノピペリジニル））−３−（４−フェノキシフェ
ニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例５で得られた化合物（０．２ｇ）をメタノール（５ｍｌ）に懸濁させた。Ｎ_２で、
パラホルムアルデヒド（１．０ｅｑ）を加えて、６４℃で４ｈ還流させ、サンプリングし
てＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝２：１）を行った。室温に降温して、シアノ水素化
ホウ素ナトリウム／エタノール溶液を加えた。添加終了後、６４℃で２ｈ還流させ、サン
プリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝２：１）を行った。乾固まで減圧濃縮さ
せて、シリカゲルカラム（溶出液酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１０：５：
１）を通し、白色泡沫状固体（０．１ｇ）を得た。

実施例８：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ
［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル）−Ｎ−メチルアクリルアミ
ド（ＤＤ００１−２）

実施例７で得られた化合物に対して実施例６の操作を行い、化合物ＤＤ００１−２を得た
。δ８．４７−８．５５（ｄ，１Ｈ），８．３９−８．４０（ｍ，２Ｈ），８．０９−８
．２７（ｍ，２Ｈ），７．８１−７．８５（ｍ，２Ｈ），７．７５−７．８１（ｍ，２Ｈ
）７．１６−７．１９（ｍ，１Ｈ）６．４９−６．６１（ｍ，１Ｈ），６．０９−６．１
５（ｍ，１Ｈ），５．６６−５．７３（ｍ，１Ｈ），３．７９−３．８５（ｍ，１Ｈ），
３．５８−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．１１−３，２６（ｍ，２Ｈ），２．５７−２．６
５（ｓ，３Ｈ），１．７６−２．０６（ｍ，２Ｈ），１．４３−１．５５（ｍ，２Ｈ）

実施例９：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ
［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル）−Ｎ−エチルアクリルアミ
ド（ＤＤ００１−３）

パラホルムアルデヒドをアセトアルデヒドに変更して、実施例７→実施例８の操作を行い
、化合物ＤＤ００１−３を得た。

実施例１０：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル）−Ｎ−イソプロピルアク
リルアミド（ＤＤ００１−４）

パラホルムアルデヒドをアセトンに変更して、実施例７→実施例８の操作を行い、化合物
ＤＤ００１−４を得た。

実施例１１：３−スチリル−１−（３−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］
ピリミジン−４−アミン

実施例２で得られた化合物（０．２ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶
解して、スチレン（１．２ｅｑ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｅｑ）
を加えた。窒素ガスで、トリス（ｏ−トリル）ホスフィン（０．１ｅｑ）、酢酸パラジウ
ム（０．１ｅｑ）を加えた。１００℃で１０ｈ保温した。反応終了後、減圧濃縮させて、
シリカゲルカラムを通し、淡黄色固体０．１ｇを得た。

実施例１２：１−（３−（４−アミノ−３−スチリル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］
ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン（ＤＤ００１−
５）

実施例１１で得られた化合物に対して実施例６の操作を行い、化合物ＤＤ００１−５を得
た。

実施例１３：１−（３−（４−アミノ−３−（２−（２−ピリジル）ビニル）−１Ｈ−ピ
ラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１
−オン（ＤＤ００１−６）

スチレンを２−ビニルピリジンに変更して、実施例１１→実施例１２の操作によって、化
合物ＤＤ００１−６を得た。
δ８．５７−８．６１（ｄ，１Ｈ），８．１９−８．２１（ｓ，１Ｈ），７．９８−８．
０１ （ｄ，１Ｈ），７．８３−７．７９（ｄ，１Ｈ），７．５５−７．６０（ｂｒｓ，
２Ｈ），７．５３−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．４９−７．５１（ｍ，１Ｈ），７．３１
−７．３４（ｍ，１Ｈ），６．７１−６．９１（ｍ，１Ｈ），６．０７−６．１５（ｍ，
１Ｈ），５．６０−５．７２（ｍ，１Ｈ），４．０７−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７０
−３．７６（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３３（ｍ，１Ｈ），２．１０−２．１８（ｍ，
１Ｈ），１．６１−１．６２ （ｍ，１Ｈ），１．２３−１．３８（ｍ，１Ｈ）

実施例１４：１−（３−（４−アミノ−３−（４−クロロスチリル）−１Ｈ−ピラゾロ［
３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン（
ＤＤ００１−７）

スチレンを４−クロロスチレンに変更して、実施例１１→実施例１２の操作によって、化
合物ＤＤ００１−７を得た。

実施例１５：１−（３−（４−アミノ−３−（３−クロロスチリル）−１Ｈ−ピラゾロ［
３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル）−２−プロペン−１−オン（
ＤＤ００１−８）

スチレンを３−クロロスチレンに変更して、実施例１１→実施例１２の操作によって、化
合物ＤＤ００１−８を得た。

実施例１６：１−（３−（４−アミノ−３−（２−クロロスチリル）−１Ｈ−ピラゾロ［
３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン（
ＤＤ００１−９）

スチレンを２−クロロスチレンに変更して、実施例１１→実施例１２の操作によって、化
合物ＤＤ００１−９を得た。

実施例１７：３−ブロモ−１−（３−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピペリ
ジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−４−アミン

窒素ガスで、実施例２で得られた化合物（１０ｇ）をジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶
解して、トリエチルアミン（２．１ｅｑ）を加え、約１０℃で二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチ
ル（１．３ｅｑ）を加えて、保温して４−５ｈ撹拌すると、反応を終了させた。１０％ク
エン酸で洗浄して分液した。有機層を飽和炭酸ナトリウム溶液で洗浄して、飽和食塩で水
洗して乾燥させ、減圧濃縮させて、白色固体１２ｇを得た。

実施例１８：３−（４−シアノフェニル）−１−（３−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
ニル）−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例１７で得られた化合物（１２ｇ）、４−シアノフェニルボロン酸（１．２ｅｑ）、
炭酸カリウム（２．５ｅｑ）をジオキサン／水（１２０ｍｌ／４０ｍｌ）に溶解して、窒
素バブリングによって水素除去を２０ｍｉｎ行った。テトラトリフェニルホスフィンパラ
ジウム（０．０５ｅｑ）を加え、窒素ガスバブリングによって酸素除去を１０ｍｉｎ持続
した。還流するまで加熱して、４−５ｈ保温すると、反応を終了させた。４０℃程度に降
温して熱いうちに分液し、有機層を乾固まで減圧濃縮させて、白色化合物（１０ｇ）を得
た。

実施例１９：３−（４−（アミノ（ヒドロキシイミノ）メチル）フェニル）−１−（３−
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ
］ピリミジン−４−アミン

実施１８で得られた化合物１０ｇ（１．０ｅｑ）をエタノールに懸濁させ、トリエチルア
ミン（２．１ｅｑ）、塩酸ヒドロキシルアミン（２．０ｅｑ）を順次加えて、還流するま
で加熱して、３ｈ後、サンプリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝１０：１）を
行った。反応終了後、乾固まで減圧濃縮させ、白色固体を得て、水及び酢酸エチルを加え
て、清澄化させて分液し、水層を除去し、有機層を飽和食塩水で洗浄して、分液した。減
圧濃縮させて、白色固体１０ｇを得た。

実施例２０：３−（４−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾリル）フェニル）−１
−（３−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３
，４−Ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例１９で得られた化合物０．５ｇ（１．０ｅｑ）をトルエンに懸濁させ、トリエチル
アミン（２．０ｅｑ）を加えて、塩化アセチルを滴下し、固体を析出させて、１００℃で
一晩放置した。反応終了後、Ｈ_２Ｏ ６ｖｏｌ、酢酸エチル６ｖｏｌを加えた。分液して
、有機層を取り、有機層を、１０％クエン酸、飽和重炭酸ナトリウム、飽和食塩水で洗浄
し、乾固まで減圧濃縮させた。シリカゲルカラムを通し、淡白色固体（０．２ｇ）を得た
。

実施例２１：３−（４−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾリル）フェニル）−１
−（３−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−４−アミン

実施例２０で得られた化合物（０．２ｇ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解して
、濃塩酸（１ｍｌ）を加え、５０℃で２ｈ保温した。反応終了後、炭酸ナトリウムでｐＨ
を７−８に調整し、酢酸エチル（１０ｍｌｘ２）で抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥
させ、乾固まで減圧濃縮させて、白色固体（０．１ｇ）を得た。
実施例２２：１−（３−（４−アミノ−３−（４−（５−メチル−１，２，４−オキサジ
アゾール−３−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル
）−１−ピペリジニル）−２−プロペン−１−オン（ＤＤ００１−１０）

実施例２１で得られた化合物に対して実施例６の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１０を
得た。

実施例２３：１−（３−（４−アミノ−３−（４−（５−ビニル−１，２，４オキサジア
ゾール−３−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル）
−１−ピペリジニル）−２−プロペン−１−オン（ＤＤ００１−１１）

塩化アセチルを塩化アクリロイルに変更して、実施例１９で得られた産物に対して実施例
２０→実施例２１→実施例２２の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１１を得た。

実施例２４：１−（３−（４−アミノ−３−（４−（５−（３−クロロプロピル）−１，
２，４オキサジアゾール−３−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミ
ジン−１−イル）−１−ピペリジニル）−２−プロペン−１−オンＤＤ００１−１２

塩化アセチルを４−塩化クロロブチリルに変更して、実施例１９で得られた産物に対して
実施例２０→実施例２１→実施例２２の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１２を得た。

実施例２５：１−（３−（４−アミノ−３−（４−（５−フェニル−１，２，４オキサジ
アゾール−３−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン−１−イル
）−１−ピペリジニル）−２−プロペン−１−オンＤＤ００１−１３

塩化アセチルを塩化ベンゾイルに変更して、実施例１９で得られた産物に対して実施例２
０→実施例２１→実施例２２の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１３を得た。

実施例２６：３−（６−アミノ−８−オキソ−７，８−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イ
ル）ピペリジン−１−ｔ−ブチルホーメート

４，６−ジクロロ−５−ニトロピリミジンを出発原料として、特許ＣＮ２０１１８００２
６８３７の合成方法を参照して、目標化合物３０．６ｇを得た。

実施例２７：３−［６−アミノ−８−オキソ−７−（４−フェノキシフェニル）−７，８
−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル］ピペリジン−１−ｔ−ブチルホーメート

実施例２６で得られた化合物（９．０ｇ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）に懸濁させ、
４−フェノキシフェニルボロン酸（１３．３ｇ、２．３ｅｑ）、４Ａ分子篩（９．０ｇ）
を加え、ピリジン（２．０ｅｑ）を加えて清澄化させ、酢酸銅（２．０ｅｑ）を加えて、
開放したまま８−１０℃で７２ｈ反応させ、サンプリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：ＰＥ
＝１：２）を行った。反応終了後、１０％クエン酸溶液で洗浄した。分液して、水層を捨
てて、有機層を、飽和炭酸ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄し、得た溶液をそのまま接
ぎのステップに用いた。

実施例２８：６−アミノ−７−（４−フェノキシフェニル）−９−（ピペリジン−３−イ
ル）−７、９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン

実施例２７で得られた溶液に濃塩酸１０ｍｌを滴下して、２５−３０℃で４ｈ撹拌し、サ
ンプリングしてＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝１０：１）を行った。反応終了後、水
２０ｍｌを加えて分液し、水層を得た。４Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９−１０に調
整し、酢酸エチル５０ｍｌで抽出した。分液して、水層を酢酸エチル２５ｍｌｘ２で抽出
した。有機層を合併して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、固体
６．０ｇを得た。

実施例２９：Ｎ−（３−（６−アミノ−８−オキソ−７−（４−フェノキシフェニル）−
７，８−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）ピペリジン−１−イル）アクリルアミドＤ
Ｄ００１−１４

実施例２８で得られた化合物（１．０ｇ）に対して実施例４→実施例５→実施例６の操作
を行い、化合物ＤＤ００１−１４（０．１ｇ）を得た。

実施例３０：Ｎ−（３−（６−アミノ−８−オキソ−７−（４−フェノキシフェニル）−
７，８−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）ピペリジン−１−イル）−Ｎ−メチルアク
リルアミドＤＤ００１−１５

実施例２８で得られた化合物（１．０ｇ）に対して実施例４→実施例５→実施例７→実施
例８の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１５（５０ｍｇ）を得た。

実施例３１：Ｎ−（３−（６−アミノ−８−オキソ−７−（４−フェノキシフェニル）−
７，８−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）ピペリジン−１−イル）−Ｎ−エチルアク
リルアミドＤＤ００１−１６

実施例２８で得られた化合物（１．０ｇ）に対して実施例４→実施例５→実施例９の操作
を行い、化合物ＤＤ００１−１６（４０ｍｇ）を得た。

実施例３２：Ｎ−（３−（６−アミノ−８−オキソ−７−（４−フェノキシフェニル）−
７，８−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）ピペリジン−１−イル）−Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドＤＤ００１−１７

実施例２８で得られた化合物（１．０ｇ）に対して実施例４→実施例５→実施例１０の操
作を行い、化合物ＤＤ００１−１７（６０ｍｇ）を得た。

実施例３３：３−［６−アミノ−７−（４−シアノフェニル）−８−オキソ−７，８−ジ
ヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル］ピペリジン−１−ｔ−ブチルホーメート

実施例２６で得られた化合物（１０ｇ）をｄｉｏｘａｎｅ（１５０ｍｌ）に溶解し、４−
ブロモベンゾニトリル（１．３ｅｑ）、ＢＩＮＡＰ（２，２´−ビス（ジフェニルホスフ
ィノ）−１，１´−ビナフチル）（０．２ｅｑ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３．
０ｅｑ）、酢酸パラジウム（０．２ｅｑ）を加えた。窒素ガスで酸素を除去し、還流する
まで加熱して、４−６ｈ保温した。反応終了後、乾固まで減圧濃縮させた。濃縮物に酢酸
エチル（１００ｍｌ）、水（３０ｍｌ）を加えた。分液して、水層を酢酸エチル（２０ｍ
ｌ）で抽出した。有機層を合併して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた。乾固まで減圧濃縮させて、淡黄色固体を得た。

実施例３４：９−（１−アリルピペリジン−３−イル）−６−アミノ−７−（４−（５−
メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル）−７、９−ジヒドロ−８
Ｈ−プリン−８−オンＤＤ００１−１８

実施例３３で得られた化合物に対して実施例１９→実施例２０→実施例２１→実施例２２
の操作を行い、化合物ＤＤ００１−１８を得た。

実施例３５：９−（１−アリルピペリジン−３−イル）−６−アミノ−７−（４−（５−
ビニル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル）−７、９−ジヒドロ−８
Ｈ−プリン−８−オンＤＤ００１−１９

実施例３３で得られた化合物に対して実施例１９→実施例２３の操作を行い、化合物ＤＤ
００１−１９を得た。

実施例３６：９−（１−アリルピペリジン−３−イル）−６−アミノ−７−（４−（５−
（３−クロロプロピル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル）−７、
９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンＤＤ００１−２０

実施例３３で得られた化合物に対して実施例１９→実施例２４の操作を行い、化合物ＤＤ
００１−２０を得た。

実施例３７：９−（１−アリルピペリジン−３−イル）−６−アミノ−７−（４−（５−
フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル）−７、９−ジヒドロ−
８Ｈ−プリン−８−オンＤＤ００１−２１

実施例３３で得られた化合物に対して実施例１９→実施例２５の操作を行い、化合物ＤＤ
００１−２１を得た。

実施例３８：４−ブロモ−Ｎ−（ピリジン−２−イル）ベンズアミド

２−アミノピリジン（０．６５ｇ、１．０ｅｑ）、ピリジン（０．８ｇ、１．５ｅｑ）を
ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解し、ゆっくりと４−塩化ブロモベンゾイル（１．５ｇ
）を滴下し、滴下終了後、室温で４ｈ撹拌すると、反応を終了させた。水、１０％クエン
酸で洗浄した。減圧乾燥させて、固体４−ブロモ−Ｎ−（２−ピリジル）−ベンズアミド
１．５ｇ（７９％）を得た。

実施例３９：Ｎ−（ピリジン−２−イル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，
３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンズアミド

実施例３８で得られた化合物（１．０ｅｑ）をジオキサンに溶解して、ビスピナコラート
ジボロン（１．３ｅｑ）、酢酸カリウム（１．６ｅｑ）を加えた。反応混合物を窒素ガス
で脱気し、次に、１，１´−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（Ｉ
Ｉ）ジクロリドジクロロメタン（０．０５ｅｑ）を添加した。還流して８ｈ反応させ、反
応終了後、大部分の溶媒を減圧濃縮させて、酢酸エチルで溶解し、水及び塩水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（溶出剤ジ
クロロメタン／メタノール＝２０：１）によって、白色固体Ｎ−（ピリジン−２−イル）
−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベ
ンズアミド（７５．３％）を得た。

実施例４０：４−（９−（１−アクリルアミドピペリジン−３−イル）−６−アミノ−８
−オキソ−８、９−ジヒドロ−７Ｈ−プリン−７−イル）−Ｎ−（ピリジン−２−イル）
ベンズアミドＤＤ００１−２２

４−ブロモベンゾニトリルを実施例３８で得られた化合物に変更して、実施例３３の操作
を行い、得られた産物に対して実施例２８→実施例２９の操作を行い、化合物ＤＤ００１
−２２を得た。

実施例４１：４−（１−（１−アクリルアミドピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１
Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（ピリジン−２−イル）ベン
ズアミド ＤＤ００１−２３

４−フェノキシフェニルボロン酸を実施例３９で得られた化合物に変更して、実施例３→
実施例４→実施例５→実施例６の操作を行い、化合物ＤＤ００１−２３を得た。
実施例４２：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−（２−フルオロフェノキシ）フェニル
）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）アク
リルアミド ＤＤ００１−２４

４−フェノキシフェニルボロン酸を４−（２−フルオロフェノキシ）フェニルボロン酸に
変更して、実施例３→実施例４→実施例５→実施例６の操作を行い、化合物ＤＤ００１−
２４を得た。

実施例４３：１−（３−（４−アミノ−３−（４−フルオロスチリル）−１Ｈ−ピラゾロ
［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オ
ンＤＤ００１−２５

スチレンを５−フルオロ−２−ビニルピリジンに変更して、実施例１１→実施例１２の操
作によって、化合物ＤＤ００１−２５を得た。

実施例４４：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）−４−（ジメチルアミ
ノ）ブタ−２−エナミドＤＤ００１−２６

実施例５で得られた化合物１−（３−（１−ニトロソピペリジニル））−３−（４−フェ
ノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（０．５ｇ、
１．０ｅｑ）、トリエチルアミン（０．３８ｇ、３．０ｅｑ）及び４−（ジメチルアミノ
）−２−ブテン酸塩酸塩（０．２１ｇ、１．０ｅｑ）のジクロロメタン溶液に、２−（７
−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロホスフェート（０．４７ｇ、１．０ｅｑ）を加えた。室温で１．５ｈ撹拌した。反応
終了後、混合物を水洗して、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮させた。残留物をシ
リカゲルカラムで精製し（溶出液ジクロロメタン／メタノール＝１０：１〜５：１）、目
標化合物としてＮ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラ
ゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）−４−（ジメチルア
ミノ）ブタ−２−エナミド０．２５ｇ（４０％）ＤＤ００１−２６を得た。

実施例４５：Ｎ−（３−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ブタ−２−インアミド
ＤＤ００１−２７

４−（ジメチルアミノ）−２−ブテン酸を２−ブチン酸に変更して、実施例４４の操作を
行い、目標化合物ＤＤ００１−２７を得た。δ８．６（ｄ，１Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ
），７．９８（ｄ，１Ｈ），７．８３（ｄ，１Ｈ），７．６（ｂｒｓ，２Ｈ），７．５３
（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｍ，１Ｈ），７．３１（ｍ，１Ｈ），６．７１−６．９１（ｍ
，１Ｈ），６．０７−６．１５（ｍ，１Ｈ），５．６０−５．７２（ｍ，１Ｈ），４．０
７−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．７６（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．３３（ｍ
，１Ｈ），２．１０−２．１８（ｍ，１Ｈ），１．６１−１．６２ （ｍ，１Ｈ），１．
２３−１．３８（ｍ，１Ｈ）

実施例４６：１−（３−（４−アミノ−３−（２−（ピリジン−２−イル）ビニル）−１
Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）−４−（ジ
メチルアミノ）ブタ−２−プロペン−１−オンＤＤ００１−２８

塩化アクリロイルを４−（ジメチルアミノ）−２−ブテン酸に変更して、実施例１３及び
実施例４４と類似した操作を行い、化合物１−（３−（４−アミノ−３−（２−（ピリジ
ン−２−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリ
ジン−１−イル）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−プロペン−１−オンＤＤ００１−
２８を得た。

実施例４７：（１−（３−（４−アミノ−３−（２−（ピリジン−２−イル）ビニル）−
１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ブタ−２
−イン１−オンＤＤ００１−２９

４−（ジメチルアミノ）−２−ブテン酸を２−ブチン酸に変更して、実施例４６の操作を
行い、目標化合物（１−（３−（４−アミノ−３−（２−（ピリジン−２−イル）ビニル
）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ブタ
−２−イン１−オンＤＤ００１−２９を得た。δ８．５１−８．５５（ｄ，１Ｈ），８．
２１−８．２７（ｓ，１Ｈ）， ７．８３−７．７９（ｄ，１Ｈ）， ７．６８−７．７
２ （ｄ，１Ｈ），７．５５−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．５３−７．５７（ｍ，１Ｈ）
，７．４９−７．５１（ｍ，１Ｈ），７．３１−７．３４（ｍ，１Ｈ），６．７１−６．
９１（ｍ，１Ｈ），６．０７−６．１５（ｍ，１Ｈ），５．６０−５．７２（ｍ，１Ｈ）
，４．０７−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．７６（ｍ，１Ｈ）， １．９２−１
．９５（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．６２ （ｍ，１Ｈ）

実施例４８：３−（８−アミノ−１−ヨードイミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−３イル）
ピペリジン−１−ベンジルホルメート

Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨを１−（ベンジルオキシカルボニル）ピペリジン−３−ギ酸、Ｎ−ブロ
モスクシンイミドをＮ−ヨードスクシンイミドに変更して、特許ＣＮ２０１２８００４５
３８３における中間体１の合成方法を参照して、化合物２−（８−アミノ−１−ヨードイ
ミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−３イル）ピペリジン−１−ベンジルホルメートを生成し
た。

実施例４９：３−（８−アミノ−１−（４−フェノキシフェニル）イミダゾ［１，５−ａ
］ピラジン−３イル）ピペリジン−１−ベンジルホルメート

３−（８−アミノ−１−ヨードイミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−３イル）ピペリジン−
１−ベンジルホルメート（５ｇ、１０．４８ｍｍｏｌ）、４−フェノキシフェニルボロン
酸（２．６９、１．２ｅｑ）、炭酸カリウム（５．０７ｇ、３．５ｅｑ）をｄｉｏｘａｎ
ｅ（２１ｍｌ）／Ｈ２Ｏ（９ｍｌ）に懸濁させ、窒素バブリングによって酸素除去を１０
ｍｉｎ行った。テトラトリフェニルホスフィンパラジウム（０．２４ｇ、０．０２ｅｑ）
を加えて、５ｍｉｎバブリングし続けた。還流するまで加熱して、４ｈ後、サンプリング
してＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝９：１）を行った。反応終了後、室温に降温
して、分液し、有機層を濃縮させて油状物を得た。水１０ｍｌ、酢酸エチル１５ｍｌを加
えて、不溶物が認められた。４Ｎ塩酸でｐＨを２−３に調整して、清澄化させた。分液し
て、有機層を除去し、水層を酢酸エチル１０ｍｌｘ２で洗浄した。４Ｎ水酸化ナトリウム
溶液でｐＨを８−９に調整して、酢酸エチル２０ｍｌを加えて清澄化させ、抽出した。飽
和食塩水１０ｍｌで洗浄して、無水硫酸ナトリウム３ｇで乾燥させた。減圧濃縮させて、
３−（８−アミノ−１−（４−フェノキシフェニル）イミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−
３イル）ピペリジン−１−ベンジルホルメート４．２ｇを得た。

実施例５０：１−（４−フェノキシフェニル）３−ピペリジン−３−イルイミダゾ［１，
５−ａ］ピラジン−８−アミン

３−（８−アミノ−１−（４−フェノキシフェニル）イミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−
３イル）ピペリジン−１−ベンジルホルメート（２ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）に３３％臭化
水素酸／酢酸溶液（３８．５ｍｍｏｌ、７ｍｌ）を添加して、室温で２ｈ撹拌した。混合
物に水／ジクロロメタン（１：１、３０ｍｌ）を加えた。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐ
Ｈを８−９に調整して、分液し、水相をジクロロメタン（１０ｍｌ）で抽出した。有機層
を合併して、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過して濃縮させ、１−（４−フェノキ
シフェニル）３−ピペリジン−３−イルイミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−８−アミンを
得た。

実施例５１：Ｎ−（３−（８−アミノ−１−（４−フェノキシフェニル）イミダゾ［１，
５−ａ］ピラジン−３イル）ピペリジン−１−イル）アクリルアミド

化合物１−（４−フェノキシフェニル）３−ピペリジン−３−イルイミダゾ［１，５−ａ
］ピラジン−８−アミンに対して実施例４→実施例５→実施例６の操作を行い、化合物Ｎ
−（３−（８−アミノ−１−（４−フェノキシフェニル）イミダゾ［１，５−ａ］ピラジ
ン−３イル）ピペリジン−１−イル）アクリルアミドを得た。

目標化合物のリスト

生物学的実験例１：Ｂｔｋ阻害活性及びＢｔｋに対する選択性の測定（生体外試験）
Ｂｔｋ酵素阻害活性の測定
キナーゼ反応：
緩衝液： ５０ｍＭＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０、０．１ｍＭ Ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ
、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％ ＢＳＡ；
２ｎＭ ＢＴＫ；
１ｍＭ ＴＫ−ｐｅｐｔｉｄｅ、２０ ｍＭ ＡＴＰ、５０ ｎＭ ＳＥＢ；
１５ ｍｉｎｕｔｅｓ 予備保温；
２３℃ ９０ ｍｉｎｕｔｅｓ 反応；
発色反応：
発色緩衝液： ５０ ｍＭＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．８ Ｍ ＫＦ、２０ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．０１％ ＢＳＡ；
６．７ ｎＭ ＴＫ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ、６２．５ ｎＭ ＸＬ６６５；
２３℃ ６０ｍｉｎｕｔｅｓ 反応；
検出デバイス：
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＃ ２１０４）
試験化合物の各濃度での阻害率の阻害曲線に基づいて、試験化合物の５０％阻害率の値（
ＩＣ_５０値）を算出した。
ほかのキナーゼ（たとえば、Ｌｃｋ、ＬｙｎＡの阻害活性の測定には、Ｂｔｋの代わりに
各種キナーゼを用いて、上記方法と同様に操作した。
その結果、本発明の目標化合物のＩＣ_５０値を表１に示す。
表１

また、ほかのキナーゼ、特にＬｃｋ、ＬｙｎＡに対する本発明の化合物のＢｔｋ選択的阻
害活性に関しては、各種キナーゼのＩＣ_５０値の比に基づいて算出し、表２を示す。
表２

この結果から分かるように、本発明の目標化合物は、Ｂｔｋ阻害活性だけではなく、ほか
のキナーゼに対してもＢｔｋ選択的阻害活性を有する。

生物学的実験例２：ヒト及びラットの肝ミクロソーム安定性試験
緩衝液の調製：
１． １００ ｍＭ リン酸カリウム塩緩衝液、ｐＨ ７．４
２． １０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２
試験化合物溶液の調製：
１．メタノール溶液（４９５μＬ）で試験化合物溶液（１０ｍＭ、５μＬ）を希釈して、
１００μＭ 溶液を調製した。
２．作動液の調製：上記溶液（５０μＬ）をリン酸カリウム緩衝液（４５０μＬ、１００
ｍＭ）で希釈して、希釈液（１０μＭ）を得た。
ＮＡＤＰＨ 再生系（イソクエン酸デヒドロゲナーゼの最終濃度１ ｕｎｉｔ／ｍＬ）：
１．β−ＮＡＤＰ、サプライヤー：ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ０５０５
２．イソクエン酸、サプライヤー：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ１２５２
３．イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、サプライヤー：ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ２０
０２
肝ミクロソーム溶液の調製（最終濃度０．５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）

停止液：
１００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及び１００ｎｇ／ｍＬのラベタロールを含む冷アセトニ
トリルを内部標準とする。
１．．空白以外の平板（Ｔ０、Ｔ５、Ｔ１０、Ｔ２０、Ｔ３０、Ｔ６０、ＮＣＦ６０）に
１０μＬ／孔で作動液を加えた。
２．．８０μＬ／孔でミクロソーム溶液を加えて、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし
た。
３． ＮＣＦ６０平板に１孔あたり１０μＬ １００ｍＭリン酸塩緩衝液を加えて、３７
℃で温浴処理し、計時し始めた。

４． 予備加熱後、１０μＬ／孔でＮＡＤＰＨ再生系を加えて、反応を開始させた。
５．．３７℃でインキュベートして、計時し始めた。

６．．３００μＬ／孔で停止液（４℃、１００ｎｇ／ｍＬトルブタミド及び１００ｎｇ／
ｍＬラベタロール含有）を加えて、反応を停止した。
７．．平板を１０ｍｉｎ振とうさせた。
８．．４℃、回転数４０００ｒｐｍで遠心処理した。
９．．サンプルに対してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検出を行った。
データ分析Ｕｓｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｒｓｔ ｏｒｄｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃ
ｓ ｔｏ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔ１／２ ａｎｄ Ｃｌｉｎｔ（ｍｉｃ）：一次動力学
方程を用いてｔ１／２及びＣｌｉｎｔ（ｍｉｃ）を計算した。
一次動力学方程：

実験結果を表３に示す。
表３

実験結果における各化合物ＣＬ_{ｉｎｔ（ｌｉｖｅｒ）}（ｍｌ／ｍｉｎ／ｋｇ）値を比較し
た結果、本発明の化合物は、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂよりも優れている安定性を有する。

生物学的実施例３：ＰＢＭＣ／Ｂ／Ｔ細胞活性化への生体外試験化合物の影響
１．試薬、器具
1)

2)

２．抗体

３．サンプル表

４．Ｍｅｔｈｏｄ
４．１ サンプルの準備

Ｎｏｔｅ： Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ ｉｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＢＭＣ／Ｂ ｃｅｌｌ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ；Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６ ｉｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃ
ｔｉｖａｔｉｏｎ
４．２ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＭの準備

４．３ 分離 Ｂ細胞及びＴ細胞
細胞分離の手順については、ＳＴＥＭＣＥＬＬキッドを参照する。
４．４ 共培養
４．４．１ Ｂ細胞の活性化
共培養系は、以下のとおりである。

４．４．２ ＰＢＭＣの活性化
共培養系は、以下のとおりである。

４．４．３ Ｔ細胞の活性化
共培養系は、以下のとおりである。

４．５ 抗体染色及びデータ分析
共培養前の２４時間に、標準的な方法で抗体染色を行った。
４．５．１． ＰＢＭＣ及びＢ細胞の活性化
ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２０
ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６９
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ
Ｋｉｔ
４．５．２ Ｔ細胞の活性化
ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ４
ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ™５．５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８
ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６９
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ
Ｋｉｔ
５．結果
Ｄｏｎｏｒ ５１７
Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図１参照。
Ｄｏｎｏｒ ５１７
Ｂ ａｎｄ ＰＢＭＣ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図２参照。

Ｄｏｎｏｒ ５８１
Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図３参照。
Ｄｏｎｏｒ ５８１
Ｂ ａｎｄ ＰＢＭＣ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図４参照。
Ｄｏｎｏｒ ９５６
Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図５参照。
Ｄｏｎｏｒ ９５６
Ｂ ａｎｄ ＰＢＭＣ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎは図６参照。
実施例の化合物６及び比較物（Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）は、０．１ｕＭの濃度では、明らか
なＢ細胞活性阻害作用を示し、１０ｕＭの濃度では、Ｔ細胞活性阻害作用を示した。

生物学的実施例４：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる、ＤＯＨＨ２細胞ｐ−Ｂｔ
ｋ／ｔ−Ｂｔｋ、ｐ−ＰＬＣγ／ｔ−ＰＬＣγ、ｐ−Ｅｒｋ／ｔ−Ｅｒｋの発現レベルへ
の試験化合物の影響の検討
１．試薬

２．器具

3. 抗体

４．サンプルの準備：

５．細胞培養
１）対数期ＤＯＨＨ２細胞を収集した。
２）細胞濃度を所望の濃度に調整した。
３）６孔板に細胞懸濁液２ｍｌを加えて培養した。試験物ごとに、５ｎＭ、１００ｎＭ及
び２０００ｎＭという３つの濃度を設置し、濃度ごとに１回繰り返した。
Ｐｌａｔｅ１：

４）試験物を板孔に加えて、ＤＭＳＯを対照とし、ＤＭＳＯの最終濃度を０．１％とした
。
５）１ｈ培養した。
６）ＤＯＨＨ２ ｃｅｌｌｓと試験物を１ｈ培養した後、その体積に対して１０倍のＰＢ
Ｓ溶液で３回洗浄し、次に、ａｎｔｉ−ＩｇＧ（３０μｇ／ｍＬ；ａｂ９８５３１）で２
ｍｉｎ刺激した。
６．タンパク質の抽出及び定量化
１）細胞を収集して、１２００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心処理した。
２）氷浴処理した１×ＰＢＳで細胞を１回濯いだ。
３）各管へ氷浴処理した１×ＲＩＰＡ緩衝液（１％プロテアーゼ阻害剤Ｃｏｃｋｔａｉｌ
及び１％ホスファターゼ阻害剤Ｃｏｃｋｔａｉｌ ２含有）を０．５ｍｌ加えて、氷浴で
３０ｍｉｎ培養した。
４）４℃、１４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心処理して、上清液を収集した。
５）Ｐｉｅｒｃｅ™ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてタン
パク質濃度を測定した。
６）ＢＣＡタンパク質の定量結果に基づいて、ＲＩＰＡ緩衝液と４×ＬＤＳサンプル緩衝
液と１０×サンプル還元剤を用いてすべてのサンプルを同じ最終濃度（ｄｉｌｕｔｅ ａ
ｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉ
ｏｎ）に希釈した。１００℃で１０ｍｉｎ加熱した。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
１）１０μＬ／孔でサンプルにＮｕＰＡＧＥ® Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓ ｇｅｌを加えた。８０Ｖ電圧で３０ｍｉｎ、１２０Ｖ電圧で９０ｍｉｎ処理し
た。
Ｇｅｌ １：

２）ｉＢｌｏｔ®２Ｇｅｌ転移装置を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移し
て、７ｍｉｎ保持した。
３）タンパク質を１ｘＴＢＳＴ（５％脱脂乳含有）と室温で１ｈ培養した。
４）１ｘＴＢＳＴで３回洗浄し、１回５ｍｉｎとした。
５）膜を希釈一次抗体５−１０ｍＬとともに４℃で培養し、緩やかに振とうさせて一晩放
置した。
６）１ｘＴＢＳＴで３回洗浄し、１回１０ｍｉｎとした。
７）膜をＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ二次抗体とともに室温で培養し、緩やかに１ｈ振
とうさせた。
８）１ｘＴＢＳＴで３回洗浄し、１回１０ｍｉｎとした。
９）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙキッドにおけるＨ
ＲＰ基質を加えた。
１０）Ｔａｎｏｎ ５２００ ｍｕｌｔｉにより化学発光を検出した。
７．バンド強度の定量化
Ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙソフトウェアを用いて、各着色バン
ドの強度を定量化した。
8. 結果
ＤＯＨＨ２細胞を試験物で処理した後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇによって、そのｐ−Ｂｔｋ／ｔ−Ｂｔｋの相対発現レベルを分析し、結果
を図７に示した。
ＤＯＨＨ２細胞を試験物で処理した後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇによって、そのｐ−ＰＬＣγ／ｔ−ＰＬＣγの相対発現レベルを分析し、
結果を図８に示した。
ＤＯＨＨ２細胞を試験物で処理した後、ａｎｔｉ−ｌｇＧで刺激し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇによって、そのｐ−Ｅｒｋ／ｔ−Ｅｒｋの相対発現レベルを分析し、結果
を図９に示した。
実験結果から分かるように、ＤＯＨＨ２細胞を化合物６与Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂで処理した
ところ、そのｐ−Ｂｔｋ／ｔ−Ｂｔｋ 、ｐ−ＰＬＣγ／ｔ−ＰＬＣγ、ｐ−Ｅｒｋ／ｔ
−Ｅｒｋのいずれの相対レベルも、顕著に低下した。

生物学的実施例５：ｈＥＲＧ電流遮断試験
１．陽性対照薬：塩酸アミトリプチリン（Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈ
ｌｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、国際的に使用されている標準ｈＥＲＧチ
ャネルブロッカー）
２．溶液及び化合物の調製
細胞外液（ｍＭ）：ＨＥＰＥＳ １０、ＮａＣｌ １４５、ＫＣｌ ４、ＣａＣｌ２ ２
、ＭｇＣｌ２ １、Ｇｌｕｃｏｓｅ １０、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調整
し、浸透圧を至２９０−３００ｍＯｓｍにして、ろ過し、４℃で保存した。
電極内液（ｉｎ ｍＭ）：ＨＥＰＥＳ １０、ＫＯＨ ３１．２５、ＫＣｌ １２０、Ｃ
ａＣｌ２ ５．３７４、ＭｇＣｌ２ １．７５、ＥＧＴＡ １０、Ｎａ２−ＡＴＰ ４、
１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整し、浸透圧を２８０−２９０ｍＯｓｍにして
、ろ過し、−２０℃で保存した。
化合物の調製：まず、陽性対照薬である塩酸アミトリプチリン、化合物６及びＩｂｒｕｔ
ｉｎｉｂを１００％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ２６５０）に溶解し、
いずれも３０ｍＭのストック液を調製した。実験前に、ＤＭＳＯを用いて上記ストック液
を希釈して各試験濃度の１０００倍の溶液とし、次に、細胞外液を用いて１０００倍希釈
して所望の濃度とした。細胞外液におけるＤＭＳＯの最終濃度は、０．１％であった。
３．細胞株
安定細胞株ＣＨＯ−ｈＥＲＧは、ＡＶＩＶＡ社から購入した。品質を制御するために、最
小シーリング抵抗は、５００ＭΩ以上、且つ、ｈＥＲＧ電流は、０．４ｎＡ以上であった
。
４．電気生理学的試験
全細胞パッチクランプ技術を用いてｈＥＲＧ電流を記録した。細胞懸濁液を３５ｍｍの培
養皿に加えて、倒立顕微鏡のステージにセットした。細胞が付着した後、細胞外液を用い
て流速１−２ｍＬ／ｍｉｎで灌流した。ガラス微小電極をマイクロピペットプラーにより
２つのステップで引き、その水中抵抗値を２−５ＭΩとした。全細胞記録を確立した後、
クランプ電位を−８０ｍＶにした。電圧刺激を与えると＋６０ｍＶまで脱分極し、次に−
５０ｍＶまで再分極して、ｈＥＲＧテール電流を引き出した。すべての記録は、電流が安
定的になった後に行われた。細胞外の灌流投与は、低濃度から始まり、濃度ごとに、電流
が安定的になるまでに５−１０ｍｉｎかかり、さらに次の濃度に進む。
５．データ収集及び分析
Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びｐＣＬＡＭＰ
ソフトウェア（１０．２バージョン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＡ
／Ｄ−Ｄ／Ａデジタル−アナログ変換を行い、刺激印加及び信号収集を行い、パッチクラ
ンプアンプ（Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
で信号を増幅した。
Ｃｌａｍｐｆｉｔ（１０．２バージョン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＥＸ
ＣＥＬ（２０１３バージョン、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ
を用いて、さらに、データ分析及び曲線フィッティングを行った。データは、すべて平均
値±標準偏差で表される。
データ処理には、ｈＥＲＧに対するブロック効果を判断するとき、テール電流のピーク値
及びそのベースラインを校正した。テール電流の阻害率で各濃度での各化合物の作用を示
した。ＩＣ５０数値は、Ｈｉｌｌ方程を用いてフィッティングした得たものである。

ｙ：Ｉ／Ｉ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}；ｍａｘ：１００％；ｍｉｎ：０％；［ｄｒｕｇ］：試験物の
濃度；ｎ_Ｈ：Ｈｉｌｌ斜率；ＩＣ_５０：試験物の最大半数阻害濃度。
６．結果
本試験では、全細胞パッチクランプ技術を用いて、ｈＥＲＧチャンネルを安定的に発現さ
せたＣＨＯ−Ｋ１細胞株について化合物６及びＩｂｒｕｔｉｎｉｂによるｈＥＲＧ電流へ
のブロック作用を検出した。試験化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、Ｌｏｇｉｓｔｉ
ｃ方程を用いてベストフィットしたものである。ｈＥＲＧに対する化合物のブロック効果
を下記表に示した。Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅは、最も広く使用されているｈＥＲＧ電
流をブロックするツール医薬品の１つであるため、本研究では、陽性対照医薬品とし、結
果は、以下のとおりである。
ＣＨＯ−Ｋ１安定細胞株について記録された化合物によるｈＥＲＧ電流へのＩＣ_５０数値

生物学的実施例６：単回投与毒性試験
ＳＰＦグレードの健康な雄ＳＤラット２０匹、雌２０匹を選択して、体重別に４群にラン
ダムに分け、１群１０匹、雌雄半分とした。実験１日目に、第１群（０ｍｇ／ｋｇ）の動
物に空白溶媒を強制経口投与し、第２群（４００ｍｇ／ｋｇ）、第３群（１０００ｍｇ／
ｋｇ）、第４群（２０００ｍｇ／ｋｇ）動物にＤＤ００１ｙを強制経口投与した。連続的
に１４日間観察した。
実験にわたって、すべての動物に対して、実験１日目に１回（投与後２時間）、２〜１４
日まで詳細な臨上観察を１日１回行った。動物を群分けるする当日、投与当日（投与前）
、投与後４、７、１０、１３日目及び解剖当日に、体重を量って記録した。実験の２、６
、９、１３日目に、２４時間内で各ケージの摂食量を量って記録した。生きているすべて
の動物に対して１５日目に肉眼解剖を行って検査した。
１．試験品及び対照品の調製
溶媒対照群：溶媒（０．５％ ＭＣ（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、０．４％ ｃ
ｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を
適切な容器に吸い取り、測定した結果、ｐＨ値７の無色澄清溶液であった。
化合物６（４００ｍｇ／ｋｇ）：化合物６ １５０７．１ｍｇを秤量して適切な容器に加
え、該容器へ溶媒（０．５％ ＭＣ（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、０．４％ ｃ
ｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を
加えて３０ｍｌまで定容し、２０分間超音波処理し、１５分間撹拌して、混合機で５分間
混合して、測定した結果、ｐＨ値７の白色懸濁液であった。
化合物６（１０００ｍｇ／ｋｇ）：化合物６ ３７６５．５ｍｇを秤量して適切な容器に
加え、該容器へ溶媒（０．５％ ＭＣ（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、０．４％
ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
を加えて３０ｍｌまで定容し、２５分間超音波処理し、２１分間撹拌して、混合機で５分
間混合して、測定した結果、ｐＨ値７の白色懸濁液であった。
化合物６（２０００ｍｇ／ｋｇ）：化合物６ ７５３０．５ｍｇを秤量して適切な容器に
加え、該容器へ溶媒（０．５％ ＭＣ（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、０．４％
ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
を加えて３０ｍｌまで定容し、３０分間超音波処理し、３１分間撹拌して、測定した結果
、ｐＨ値７の白色懸濁液にであった。
実験の設計表

動物は、強制経口投与前、１０〜１６ｈ禁食し、投与２ｈ後、摂食させる。
３．結果
試験対象の具体的な状況及び行動は、図１０−１３に示された。
試験には、死亡した動物がなかった。実験終了まで生きているすべての動物は、体重が試
験の進行に伴って増え、溶媒対照群に比べて、異常が認められなかった。４００ｍｇ／ｋ
ｇ群及び１０００ｍｇ／ｋｇ群では、個別の動物には、赤色乾燥分泌物（鼻周の周り）、
２０００ｍｇ／ｋｇ群では、個別の動物には、赤色乾燥分泌物（鼻周の周り）、赤色湿性
分泌物（鼻周の周り）、赤色乾燥分泌物（左眼の周り）が現れ、これら異常は、試験品の
投与に繋がる可能性がある。投与後２日目、１０００ｍｇ／ｋｇ群及び２０００ｍｇ／ｋ
ｇ群の動物は、摂食量が溶媒対照群より低く、６日目に、正常に戻った。各動物の肉眼解
剖には、異常が認められなかった。
本試験の条件では、ＳＤラットへ化合物６を単回経口投与したところ、最大耐量（ＭＴＤ
）は、２０００ｍｇ／ｋｇであった。

Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂデータは、ＦＤＡ Ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃ
ｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｎｄａ／２０１
３／２０５５５２Ｏｒｉｇ１ｓ０００ＣｌｉｎＰｈａｒｍＲ．ｐｄｆ （ａｃｃｅｓｓｅ
ｄ Ｊｕｎ ２０１５）から入手された。

生物学的実施例７：ＳＤラット、ビーグル犬のそれぞれに試験物を単回静脈投与及び経口
投与した場合の薬物動態学の研究
雄ＳＤラット６匹を選択して、実験の設計表のように群分け及び投与を行った。第１群の
３匹の動物に静脈注射投与し、投与当日に１回投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇであり、
投与体積は、５ｍＬ／ｋｇであった。第２群の３匹の動物に強制経口投与し、投与当日に
１回投与し、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇであり、投与体積は、１０ｍＬ／ｋｇであった。
すべての動物に対して、ケージの隣で毎日２回観察し、発症、損傷や死亡などの状況があ
るか否か、及び餌や水が十分であるか否かを確認した。試験には、すべての投与動物に対
して、投与前及び採血時刻に詳細な臨床観察を行った。
投与前（０ｈ）、投与０．０８３ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、
８ｈ及び２４後ｈ、合計１０個の時刻に、大腿静脈から血液サンプルを採血して血中濃度
検出を行った。
雄ビーグル犬６匹を選択して、実験の設計表のように群分け及び投与を行った。第１群の
３匹の動物に静脈注射投与し、投与当日に１回投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇであり、
投与体積は、２．５ｍＬ／ｋｇであった。第２群の３匹の動物に強制経口投与し、投与当
日に１回投与し、投与量は、３０ｍｇ／ｋｇであり、投与体積は、５ｍＬ／ｋｇであった
。
すべての動物に対して、ケージの隣で毎日２回観察し、発症、損傷や死亡などの状況があ
るか否か、及び餌や水が十分であるか否かを確認した。試験には、すべての投与動物に対
して、投与前及び採血時刻に詳細な臨床観察を行った
投与前（０ｈ）、投与０．０８３ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、
８ｈ及び２４後ｈ、合計１０個の時刻に、大腿静脈から血液サンプルを採血して血中濃度
検出を行った。
実験の設計表

＊経口投与前、すべての動物は、一晩禁食し（１０−１４時間）、投与２時間後、摂食さ
せる。

＊経口投与前、すべての動物は、一晩禁食し（１０−１８時間）、投与２時間後、摂食さ
せた。
結果
化合物６を投与されたＳＤラットの一部の薬物動態パラメータを下表に示し、ＳＤラット
では、２ｍｇ／ｋｇの化合物６を静脈注射投した場合、Ｃ_ｍａｘは、６５８．４９ｎｇ／
ｍＬであり、ＡＵＣ_{（０−ｔ）}は、２７０．５２ｈ＊ｎｇ／ｍＬであり、１０ｍｇ／ｋｇ
の化合物６を強制経口投与した場合、Ｃ_ｍａｘは、４４７．０９ｎｇ／ｍＬであり、ＡＵ
Ｃ_{（０−ｔ）}は、４４９．１８ｈ＊ｎｇ／ｍＬであった。
化合物６を投与されたのビーグル犬の一部の薬物動態パラメータを下表に示した。ビーグ
ル犬では、２ｍｇ／ｋｇの化合物６を静脈注射投与した場合、Ｃ_ｍａｘは、１２２５．９
０ｎｇ／ｍＬであり、ＡＵＣ（０−ｔ）は、８８８．２２ｈ＊ｎｇ／ｍＬであり、３０ｍ
ｇ／ｋｇの化合物６を強制経口投与した場合、Ｃ_ｍａｘは、３８２８．６３ｎｇ／ｍＬで
あり、ＡＵＣ（０−ｔ）は、７４１９．１６ｈ＊ｎｇ／ｍＬであった。

Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂデータは、ＦＤＡ Ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃ
ｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｎｄａ／２０１
３／２０５５５２Ｏｒｉｇ１ｓ０００ＣｌｉｎＰｈａｒｍＲ．ｐｄｆ （ａｃｃｅｓｓｅ
ｄ Ｊｕｎ ２０１５）から入手される。

生物学的実施例８：生体外腫瘍細胞増殖に対する活性化合物の阻害作用の研究
１． 細胞系及び培養方法

２． 培地
表．培地及び試薬

３．細胞活性実験用の試薬及び器具
Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ 発光細胞活性検出キット （Ｐｒｏｍｅ
ｇａ−Ｇ７５７３）．
２１０４ ＥｎＶｉｓｉｏｎ プレートリーダー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ．
４．実験方法及びステップ
４．１ 細胞培養
腫瘍細胞系をそれぞれの培養条件で３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて培養
した。定期的に継代させ、対数成長期にある細胞をプレーティングに用いた。
４．１．１ 細胞プレーティング
１）トリパンブルーで細胞を染色して、生細胞をカウントした。
２）細胞濃度を適切な濃度に調整した。
３）培養板の１孔あたり細胞懸濁液９０μＬを加え、空白対照孔には、細胞を含まない培
養液を加えた。
４）培養板を、３７℃、５％ＣＯ_２、及び１００％相対湿度のインキュベーターにおいて
一晩培養した。
４．２ 化合物ストックプレートの調製
４００×化合物のストックプレートの調製：ＤＭＳＯを用いて化合物を最高濃度から最低
濃度に勾配希釈した。
４．３ １０×化合物作動液の調製及び化合物による細胞処理
１）１０×化合物作動液の調製：Ｖ字形底部付きの９６孔板に細胞培養液７６μＬを加え
て、４００×化合物ストックプレートから化合物４μＬを吸い取り、９６孔板の細胞培養
液に加えた。溶媒対照及び空白対照には、ＤＭＳＯ ４μＬを加えた。化合物又はＤＭＳ
Ｏを加えた後、ピペットを用いて均一にピペッティングした。
２）医薬品添加：１０×化合物作動液１０μＬを、表１のように細胞培養板に加えた。溶
媒対照及び空白対照には、ＤＭＳＯ−細胞培養液混合液１０μＬを加えた。ＤＭＳＯ最終
濃度は、０．５０％であった。
３）９６孔細胞板をインキュベーターに入れて７２ｈ培養した。
４．４ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ 発光法による細胞活性検出
以下のステップによって、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ 発光法細胞活
性検出キッド（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｇ７５７３）の取り扱い書に従って行った。
１）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を溶融して室温まで放置した。
２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質を室温まで放置した。
３）１本のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ 緩衝液を加
えて基質を溶解し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ作動液を調製した。
４）緩やかに渦旋式で振とうをして十分に溶解させた。
５）細胞培養板を取り出して３０分間放置し、室温になるまで平衡化させた。
６）各孔に５０μＬ（１孔における細胞培養液の体積の半分）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇ
ｌｏ作動液を加えた。アルミホイルで細胞板を包んで遮光させた。
７）培養板をオービタルシェーカーにおいて２分間振動させて、細胞分解を誘導した。
８）培養板を室温で１０分間放置して、発光信号を安定化させた。
９）２１０４ ＥｎＶｉｓｉｏｎ プレートリーダーにおいて発光信号を検出した。
５．データ分析
以下の式で検出化合物の阻害率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）を算出した。
ＩＲ（％）＝（１−（ＲＬＵ化合物−ＲＬＵ空白対照）／（ＲＬＵ溶媒対照−ＲＬＵ空白
対照））＊１００％。
生体外腫瘍細胞増殖に対する化合物６の阻害作用

Claims (3)

1. 下記一般式化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ又はＩｇ、その光学異性体又はこ
   れらの混合物、その塩、その溶媒和物、又はそのＮ酸化物。
   

   

   （Ｒ_１は、Ｈ、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_４アルキル基を示し、
   Ｒ_２は、Ｒ_６ＣＯ、Ｒ_７ＳＯ、Ｒ_８ＳＯ_２又はＲ_９により置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル
   基を示し、
   Ｒ_３は、Ｈ、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ基、ニト
   ロ基、シアノ基、置換又は未置換のアミノ基、置換又は未置換のアルキル基を示し、
   Ｒ_４は、Ｈ、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ基、ニト
   ロ基、シアノ基、置換又は未置換のアミノ基、置換又は未置換のアルキル基を示し、
   Ｒ_５は、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６アルキル基、置換又は未置換のアリール基、置換又
   は未置換のヘテロアリール基、置換又は未置換のＣ_３−Ｃ_６シクロアルキル基、置換又は
   未置換のＣ_２−Ｃ_６ヘテロシクロアルキル基を示し、
   Ｒ_６は、アルケニル基、アルキニル基、及びアルキル基、アルケニル基、アミン基又はハ
   ロゲン置換アルケニル基、アルキニル基であり、
   Ｒ_７、Ｒ_８は、独立してＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ
   、両方は、ヒドロキシ基、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルキル基、（Ｃ_１
   −Ｃ_４アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ
   基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルコキシ基、Ｃ_６−Ｃ_１０アリール基又はＣ_３−Ｃ_７ヘテロシク
   ロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の基によって置換されてもいよく、又は、ハロゲ
   ン又はシアノ基から選ばれる１つ又は複数の基によって置換されてもよいＣ_１−Ｃ_５ヘテ
   ロアリール基であり、
   Ｒ_９は、独立してハロゲン、シアノ基又はＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキ
   ニル基から選ばれ、両方は、ヒドロキシ基、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロア
   ルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）アミノ基、Ｃ_１
   −Ｃ_３アルコキシ基、Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルコキシ基、Ｃ_６−Ｃ_１０アリール基、Ｃ_１−
   Ｃ_５ヘテロアリール基又はＣ_３−Ｃ_７ヘテロシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数
   の基によって置換されてもよく、
   Ｚは、ＣＨ_２、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり、
   ｎ_１は、０又は１を示し、ｎ_２は、１の整数を示し、ｎ_３は、０−１の整数を示し、
   ｎ _３ が１である場合、ピペリジンのＮに結合する基はＲ _２ であり、
   Ｘは、窒素又はＣＲ _４ を示し、ベンゼン環の任意の位置にあってもよく、Ｙは、窒素を示
   す。）
2. Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基を示し、
   Ｒ_２は、Ｒ_６ＣＯ、Ｒ_７ＳＯ、Ｒ_８ＳＯ_２又はＲ_９により置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル
   基を示し、Ｒ_６は、アルケニル基、アルキニル基、及びアルキル基、アルケニル基、アミ
   ン基又はハロゲン置換アルケニル基、アルキニル基であり、Ｒ_７、Ｒ_８は、独立してＣ_{２
   −}Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ、Ｒ_９は、独立してハロゲン
   、シアノ基又はＣ_２−Ｃ_６アルケニル基又はＣ_２−Ｃ_６アルキニル基から選ばれ、
   Ｒ_３は、Ｈを示し、
   Ｒ_４は、Ｈ、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、置換又は未置換のアルキル基を
   示し、
   Ｒ_５は、置換又は未置換のＣ_１−Ｃ_６アルキル基、置換又は未置換のアリール基、置換又
   は未置換のヘテロアリール基を示し、
   Ｚは、Ｏであり、
   ｎ_１は、０又は１を示し、ｎ_２は、１の整数を示し、ｎ_３は、０−１の整数を示し、
   ｎ _３ が１である場合、ピペリジンのＮに結合する基はＲ _２ であり、
   Ｘは、窒素又はＣＲ _４ を示し、ベンゼン環の任意の位置にあってもよい、
   ことを特徴とする請求項１に記載の一般式化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ又
   はＩｇ、その光学異性体又はこれらの混合物、その塩、その溶媒和物、又はそのＮ酸化物
   。
3. 請求項１又は２に記載の一般式化合物Ｉａ−Ｉｇ、その光学異性体又はこれらの混合物、
   その塩、その溶媒和物、又はそのＮ−酸化物を含有する医薬品組成物。

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