JP6829636B2

JP6829636B2 - 抗白髪剤

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Publication number: JP6829636B2
Application number: JP2017061437A
Authority: JP
Inventors: 顕策井口; 倉田　隆一郎; 隆一郎倉田; 真也原; 周太石塚
Original assignee: Mandom Corp
Current assignee: Mandom Corp
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2017-03-27
Publication date: 2021-02-10
Anticipated expiration: 2037-03-27
Also published as: JP2018162235A

Description

本発明は、抗白髪剤に関する。また、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒｔｙｐｅＭ）の活性促進剤に関する。

白髪の発生は代表的な老徴であり、外見の印象に与える影響が大きい。若々しくいたいと願う生活者の多くは、染毛剤や染毛料を用いて染色することにより白髪化に対応している。しかし、これらの染毛方法は手間がかかること、髪や頭皮に悪影響を及ぼす可能性があること、さらに自然な色に染まり難いこと等の様々な問題があった。このため、染毛剤や染毛料に頼らない抗白髪方法（例えば、白髪化の予防方法やその改善方法）の開発が求められている。

毛髪の色を決定するメラニン色素はメラノサイトで産生される色素成分である。メラノサイトは毛母細胞と隣り合う形で毛球部に存在しており、毛母細胞が細胞***して髪が作り出される際に、メラノサイトからメラニン色素が受け渡され、髪の内部に取りこまれる。したがって、メラノサイトにおけるメラニン合成が正常に行われない場合は、髪がメラニンを取り込むことができず、白髪が発生することとなる。

メラノサイトにおけるメラニン合成は、ＭＩＴＦ−Ｍが重要な役割を果たしている（非特許文献１）。ＭＩＴＦ−Ｍは、メラノサイト合成に関わる酵素であるチロシナーゼや、その関連タンパク質であるＴＲＰ−１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＴＲＰ−２（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−２）の転写制御を行うことが知られている。また、ＭＩＴＦ−Ｍは前記のタンパク質の転写制御以外にも、メラノサイトの分化誘導、遊走、抗アポトーシスに関連することが知られている。

上述の通り、白髪化のメカニズムをターゲットとした研究は盛んに行われている。しかしながら、これらの知見は抗白髪の抜本的解決方法の発見には繋がっていない。

ＥｍｉＫ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３０７、Ｉｓｓｕｅ５７１０、２００５年２月４日、ｐ．７２０−７２４

本発明の目的は、白髪化のメカニズムをターゲットとした抗白髪剤を提供することである。また、メラニン合成に重要な役割を果たすことが知られているＭＩＴＦ−Ｍを活性化する、活性促進剤（ＭＩＴＦ−Ｍ活性促進剤）を提供することである。

上記の様な事情に鑑み、本発明者は白髪化のメカニズムに着目して鋭意研究を重ねた結果、ベルゲニアリグラタ抽出物がメラノサイト（色素形成細胞）の細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａｒｅｃｅｐｔｏｒＩＩ）、ＥＤＮＲＢ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＢ）、及びＳＣＦＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ、別名：ｃ−Ｋｉｔ，ＣＤ１１７）の活性を促進させること、及びＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させることを見出して本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、ベルゲニアリグラタ抽出物を有効成分とする抗白髪剤を提供する。

また、本発明は、ベルゲニアリグラタ抽出物を有効成分とするＭＩＴＦ−Ｍ活性促進剤についても提供する。

本発明の抗白髪剤は、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する結果、メラノサイトにおけるメラニン合成を促進し、高い抗白髪作用（白髪化の予防やその改善）を発揮する。

in vitro試験におけるベルゲニアリグラタ抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ in vitro試験におけるサンショウ果皮抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ in vitro試験におけるホップ花抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ in vitro試験におけるベルゲニアリグラタ抽出物、サンショウ果皮抽出物、及びホップ花抽出物によるＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現量を示すグラフ in vivo試験（被験者１）におけるベルゲニアリグラタ抽出物によるＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現量を示すグラフ in vivo試験（被験者２）におけるベルゲニアリグラタ抽出物によるＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現量を示すグラフ

本発明は、ベルゲニアリグラタ抽出物を有効成分とする抗白髪剤に関する。また、ベルゲニアリグラタ抽出物を有効成分とするＭＩＴＦ−Ｍ活性促進剤に関する。なお、これらを「本発明の抗白髪剤」又は「本発明の活性促進剤」と称する場合がある。

本発明の抗白髪剤及び活性促進剤は、ベルゲニアリグラタ抽出物が有効成分であることを特徴とする。ベルゲニアリグラタ抽出物は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性を促進する。また、これらの細胞質受容体を活性化させることにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する。つまり、本発明の抗白髪剤及び活性促進剤は、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲを活性化することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進し、その結果、メラニン合成をはじめとする各種の生理作用を発揮する。この生理作用の一つとして、例えば、抗白髪作用（白髪化の予防やその改善）が挙げられる。

なお、本発明の抗白髪剤及び活性促進剤がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する理由は、ベルゲニアリグラタ抽出物が、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対して活性があることによるものであると推察される。つまり、本発明の抗白髪剤及び活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進する抗白髪剤及び活性促進剤といえる。また、本発明の抗白髪剤及び活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する抗白髪剤及び活性促進剤といえる。

ベルゲニアリグラタ抽出物は、ベルゲニアリグラタの各部位から抽出溶媒を用いて抽出することにより得られるものである。抽出方法は特に限定されず、公知の各種抽出方法を用いることができる。抽出原料としては、ベルゲニアリグラタの葉、枝、材部、樹皮、根等の部位や、これらを乾燥したものが用いられる。この中でも、特にベルゲニアリグラタの根が好ましい。抽出方法としては、常温で、又は加温して、抽出溶媒により抽出すること等が挙げられる。

抽出溶媒としては、通常の植物の抽出に用いられる溶媒であれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、水等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。この中でも、水及び１，３−ブチレングリコールからなる抽出溶媒が好ましい。

ベルゲニアリグラタ抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、ベルゲニアリグラタ抽出物をカラムクロマト法等により、分画、精製して用いることもできる。また、ベルゲニアリグラタ抽出物は、減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。なお、ベルゲニアリグラタ抽出物としては、例えば、「パシャンベエキスＳＫ」（香栄興業株式会社製）等の市販品を使用することができる。

本発明の活性促進剤は、頭皮に塗布されることにより経皮的に吸収されて毛根部位に達し、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させる。本発明の活性促進剤はこれらの作用を有することにより、抗白髪剤として用いることができる。さらに、本発明の抗白髪剤及び活性促進剤は、スカルプケア剤等の皮膚外用品や、シャンプー、トリートメント剤等の頭髪料に配合して用いることができる。

本発明の皮膚外用品及び頭髪料は、例えば、液状、ミスト状、霧状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ワックス状、フォーム状等の各種剤形に調製して使用できる。また、本発明の所望の効果の発現が阻害されない範囲であれば、例えば、低級アルコール、多価アルコール、糖アルコール、紫外線吸収剤、香料、防腐剤、キレート剤、抗菌剤、酸化防止剤、保湿剤、清涼剤、ビタミン類、カチオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、両性ポリマー、アニオン性ポリマー、植物抽出液、噴射剤、ｐＨ調整剤、アミノ酸、抗炎症剤、収斂剤、色素、増粘剤等のその他の添加剤を含んでいてもよい。

皮膚外用品又は頭髪料におけるベルゲニアリグラタ抽出物の配合量は、その使用態様に応じて適宜調整されるが、製剤全体の０．００００５〜０．０５質量％の範囲で配合することが好ましく、０．０００１〜０．０２５質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．０００５〜０．０１質量％の範囲で配合することが更に好ましい。なお、ベルゲニアリグラタ抽出物の配合量は固形分換算を基準とする。

なお、本発明の活性促進剤は、抗白髪剤以外にも、皮膚の抗白斑治療剤、抗皮膚黒色化剤、美白剤といった皮膚化粧料としても好適に用いることができる。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

＜in vitro試験＞
［被験物質１（１．０体積％のベルゲニアリグラタ抽出物を含む培地）の調製］
１５μＬのパシャンベエキスＳＫ（０．５質量％のベルゲニアリグラタ根エキスを含むベルゲニアリグラタ抽出物；香栄興業株式会社製）を１４８５μＬのＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳを１．０体積％含む表皮メラニン細胞用増殖培地；以下、「Ｍｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）」と称する）に添加し、混和後にフィルター濾過処理を行うことにより１．０体積％のベルゲニアリグラタ抽出物を含む培地を調製した。

［被験物質２（１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地）の調製］
パシャンベエキスＳＫの代わりにサンショウ抽出液−Ｊ（０．１８質量％のサンショウ果皮エキスを含むサンショウ果皮抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地を調製した。

［被験物質３（１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地）の調製］
パシャンベエキスＳＫの代わりにホップ抽出液ＢＧ−ＪＮ（１．８質量％のホップ花エキスを含むホップ花抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、ホップ花抽出物の終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地を調製した。

［陰性対照１の調製］
ブタンジオールを終濃度が１．０体積％となるようにＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）に添加し、陰性対照１を調製した。

［メラノサイトの調製］
ヒトメラノサイトはＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を培養液とし、Ｔ７５フラスコを用いてＣＯ₂インキュベーター（５体積％ＣＯ₂、３７℃）内で必要細胞数に達するまで培養した。その後、Ｔ７５フラスコから培地を除き、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを添加、細胞を洗浄後に３ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、すぐに２ｍＬの添加したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去、室温にて１〜２分静置し、細胞を剥離した。その後、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを加え細胞を回収し、さらに１０ｍＬのトリプシン中和液を添加・混合し、その細胞溶液を１７０×ｇ、５分間遠心した。沈殿（細胞）にＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を添加、懸濁後に細胞数を血球計算板にて測定することによりヒトメラノサイトを調製した。

［被験物質等の活性試験］
培養して得られたヒトメラノサイトを１．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ウェルの２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ₂インキュベーター内（５体積％ＣＯ₂、３７℃）で、２４時間培養後、ウェルに被験物質１〜３、陰性対照１をそれぞれ０．５ｍＬずつ添加した。その後、２４時間培養し、細胞を回収した。

上記試験から得られた各細胞からトータルＲＮＡを回収した。ＲＮＡ抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＩＳＯＧＥＮ溶液によりサンプルの細胞を溶解した後、クロロホルムを加えて遠心分離し、水相に溶解しているＲＮＡを得た。その後、水相にイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させＲＮＡを単離した。

ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＲＮＡが入ったチューブにｃＤＮＡ合成に必要な試薬（ｒａｎｄｏｍｈｅｘａｍｅｒｓ、ｄＮＴＰｍｉｘ、ＭｇＣｌ₂、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ）を加えた後、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間の条件で順次反応させてｃＤＮＡを合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲチューブにサンプル（合成させたｃＤＮＡ）を調製し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲシステムを用いて、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの遺伝子の発現量を定量した。ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。各遺伝子の発現量はΔΔＣｔ値として算出した。

増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ２遺伝子のＣｔ値を引いたＣｔ（目的遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ２）＝ΔＣｔ値である。さらにΔＣｔ値より溶媒対照区の平均ΔＣｔ値を引いたΔＣｔ（サンプル処理区）−ΔＣｔ（ブランク区）＝ΔΔＣｔ値とする。ΔΔＣｔ値を乗数項に代入した２−ΔΔＣｔ値が相対発現量となる。

以上の結果を図１〜４に纏めた。得られた結果から、１．０体積％のベルゲニアリグラタ抽出物を含む培地は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対する活性を有し、その相乗効果により強力なＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用を発揮することが明らかとなった。その一方で、サンショウ果皮抽出物、及びホップ花抽出物のＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用は低いことが明らかとなった。

＜in vivo試験＞
［被験物質４（２．０質量％のベルゲニアリグラタ抽出物を含むサンプル）の調製］
エタノールを５０．００質量％、ｌ−メントールを０．４０質量％、リン酸二水素ナトリウムを０．０４質量％、リン酸一水素ナトリウムを０．０３質量％、パシャンベエキスＳＫを２．０質量％、及び精製水を４７．５３質量％となる様に配合し、被験物質４を調製した。

［陰性対照２の調製］
パシャンベエキスＳＫを用いず、精製水を４９．５３質量％使用したこと以外は被験物質４と同様にして、陰性対照２を調製した。

［被験物質等の活性試験］
２名の被験者（被験者１及び２）から頭皮に被験物質４を塗布した後、それぞれ５本の毛髪をピンセットで抜去し、チューブに入れた。得られた毛根部の細胞からトータルＲＮＡを回収した。また、陰性対照２についても同様の操作を行った。

検体からのＲＮＡ抽出はＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＣｅｌｌ−ｔｏ−ＣｔＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＬｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎとＤＮａｓｅＩを９９：１で混合した溶液を５０ｕＬ/ｔｕｂｅずつ検体に加え、ピペッティングで混和した。その後５分間室温で反応させた後、ＸｅｎｏＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌとＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎとを１：５で混合した溶液を５ｕＬ/ｔｕｂｅずつ検体に加え、ピペッティングで混合し、２分間室温で反応させた。

ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＲＮＡが入ったチューブにｃＤＮＡ合成に必要な試薬（ｒａｎｄｏｍｈｅｘａｍｅｒｓ、ｄＮＴＰｍｉｘ、ＭｇＣｌ₂、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ）を加えた後、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間の条件で順次反応させてｃＤＮＡを合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲチューブにサンプル（合成させたｃＤＮＡ）を調製し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲシステムを用いて、ＭＩＴＦ−Ｍの遺伝子の発現量を定量した。ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。各遺伝子の発現量はΔΔＣｔ値として算出した。

以上の結果を図５（被験者１）及び図６（被験者２）に纏めた。なお、図５及び６におけるＭＩＴＦ−Ｍの相対発現量は、５つの検体の平均値を示す。また、図中の「なし」とは頭皮に陰性対照２を塗布した場合、「あり」とは頭皮に被験物質４を塗布した場合を意味している。得られた結果から、２．０質量％のベルゲニアリグラタ抽出物を含むサンプルは、顕著なＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用を発揮することが明らかとなった。

以上の結果から、in vivo試験においてもベルゲニアリグラタ抽出物がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進することが明らかとなった。つまり、ベルゲニアリグラタ抽出物がＭＩＴＦ−Ｍ活性促進剤として有効な効果を発揮する成分であることが示された。そして、ベルゲニアリグラタ抽出物によってＭＩＴＦ−Ｍが活性化されることにより、メラノサイトにおけるメラニン合成が促進され、その結果、高い抗白髪作用（白髪化の予防やその改善）が発揮されることとなる。つまり、ベルゲニアリグラタ抽出物が抗白髪剤として有効な効果を発揮する成分であることが示された。

Claims

ベルゲニアリグラタ抽出物を有効成分とするＭＩＴＦ−Ｍ活性促進剤。