KR20170105910A

KR20170105910A - 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20170105910A
Application number: KR1020160029272A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 김윤석
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-09-20

Abstract

본 발명은 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물의 항산화 활성과 미백 효과를 특징으로 인체에 안전하고 항산화와 미백 효과를 갖는 화장품 소재 개발에 관한 것으로, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻음으로써, 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물로서 항산화 활성과 미백 효과를 갖는 피부 미백용 화장품 소재로서 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 및 그 용도{Skin whitening composition comprising extracts of Galla Rhois and use thereof}

본 발명은 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물의 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 인체에 안전하고 항산화와 미백 효과를 갖는 화장품 소재 개발에 관한 것이다.

피부 속 기저층에 존재하는 멜라닌은 티로시나제(산화효소, tyrosinase)로 티로신(아미노산, tyrosine)을 수산화(hydroxylation)시킨 뒤 도파 (L-3,-dihydroxy-L-phenylalanine, DOPA)를 만들고 이후에 티로신의 촉매에 의해 산화된다. 이후 도파퀴논(DOPA quinone)을 생성하고 일련의 반응을 통해 DOPA chrome, 5,6-dihydroxy indole, indole 5,6-quinone을 만든 후 최종적으로 멜라닌이 합성된다. 멜라닌을 합성하는 과정 중 티로시나제 효소는 멜라닌 합성의 속도조절단계인 티로신 기질을 도파(DOPA)로 전환하고 이후 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환을 매개한다. 따라서 티로시나제 활성 억제제를 찾는 연구가 피부 미백제의 개발에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있다. 또한, 멜라닌은 멜라노사이트라는 색소세포에서도 합성되는 단백질 복합체로 피부와 머리카락의 색을 결정짓고 빛의 흡수와 산란을 통해 UV광선에 의한 세포손상과 독성 약물의 흡수 등 여러 중요한 작용을 수행한다. 그러나 자외선 노출에 의한 멜라닌의 과잉 생산은 피부 노화의 원인으로 기미, 주근깨 등을 형성하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인해 세포의 사멸과 피부암을 유발하기도 한다. 이러한 이유로 멜라닌을 억제하기 위한 연구가 많이 진행되며, 현재까지 알려진 멜라닌 생성 저해제로는 하이드로퀴논 (hyeroquinone), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아젤라익산(azelaic acid), 아스코르빈산(ascorbic acid; vitamin C)등이 있다. 하지만 피부안정성과 제형 안정성의 문제로 제한된 양만 사용되고 있으며, 그 기전에 관해서 아직까지 완전히 규명되지 않았다.

오배자(Galla Rhois)는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Ruschinensis)에서 진딧물(Melaphis chinensis)의 산란에 의해 생긴 벌레집의 일종이다. 이는 매미목의 진딧물과의 곤충인 오배자 면충(하얀 솜털이 붙어 있는 것처럼 보이는 해충)이며 야산에 기생하는 붉은 나무의 새잎에 기생함으로써 형성된 충영(식물체에 곤충이 산란 기생하여 그 결과로 생긴 이상 발육된 부분)으로 일본, 중국과 함께 우리나라 각지에 분포한다. 또한, 오배자는 문합, 백충창이라고도 말하며 생김 모양에 따라 화부자, 목부자, 이부자, 부자라고도 불린다. 오배자의 성분에는 탄닌이 50~70%로서, 주성분은 penta-m-digalloyl-ββ-glucose 이고, 유리 갈산(gallic acid), 지방, 수지 및 전분도 포함되어 있다. 함유 유기물로는 말릭에시드(malic acid), 타르타르산(tartaric acid), 시트르산(citric acid) 및 플라보노이드 글루코시드(flavonoid glucoside) 등이 있다. 한편, 오배자의 약리 효과 연구에서는 항암 효과, 장내 세균 억제효과, 항당뇨 효과가 알려져 있고 이들 약효의 주성 분은 갈산 메틸 에스테르(gallic methylester)임이 보고 되었다. 오배자의 약리작용과 관련된 주된 화합물로는 갈로타닌(gallotanin) 류와 트리테르페노이드(triterpenoid) 화합물 등이 알려져 있다. 또한 오배자는 지혈작용이 있어 약재로 사용되며 건선이나 종기 및 피부염 등의 외상에 외용재로 사용되고 있다. 최근에는 항균효과에 집중 연구되고 있으며 항산화, 항혈전 및 항바이러스 등이 보고 되고 있다. 이같은 오배자의 항산화 및 항염에 대한 연구는 다수 보고되고 있으나, 추출된 분획물 수준에서 멜라닌생성 억제에 관한 연구는 거의 보고되지 않고 있다. 따라서 본 발명에서 제시하는 오배자 추출물의 항산화 활성과 미백 활성의 실험을 통한 결과들은 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백 효능의 화장품 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 우수한 미백 성분을 천연물로부터 개발하기 위한 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물을 인체에 안전하고 항산화 활성과 미백 효과를 갖는 화장품 소재로서 개발하고자 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제2015-0039168호, 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상치료용 의약 조성물 및 이를 함유하는 드레싱 제제, 공개일자 2015년 04월 09일

본 발명의 목적은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻음으로써 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물로서 항산화 활성과 미백 효과를 갖는 피부 미백용 화장품 소재로서 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 오배자(Galla Rhois)추출물에 대한 분획 방법의 흐름도이며,
도 2는 오배자 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능의 측정 결과이며,
도 3은 오배자 추출물에 대한 항산화력 측정 결과이며,
도 4는 오배자 추출물에 대한 티로시나제의 억제 효과에 대한 결과이며,
도 5는 오배자 추출물에서 B16/F10 흑생종 세포(melanoma cell)의 독성 효과의 결과이며,
도 6은 오배자 추출물에서 쥐 흑생종 (mouse melanoma) 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과이며,
도 7은 Western blot을 이용한 오배자 추출물에서 티로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 및 Microphthalmia-associated transcription factor(MITF) 단백질 발현의 결과이며,
도 8은 Real-time PCR를 이용한 티로시나제(tyrosinase), Microphthalmia-associated transcription factor(MITF), TRP-1 및 TRP-2의 전사RNA(mRNA) 발현의 결과이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 이와 같은 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 이 용어들은 하나의 구성요소들을 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 '연결되어' 있다거나, 또는 '접속되어' 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 '직접 연결되어' 있다거나, '직접 접속되어' 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, '포함한다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소,

부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일 실시 예를 상세히 설명한다.

본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 제 1 유기용매는 수용액 중에서 반응을 진행시킬 수 있는 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디옥산, 디메틸술폭사이드, 에탄올, 메탄올 등과 같이 물과 쉽게 섞이는 극성 유기용매 또는 이들 하나 이상의 혼합 용매의 사용이 가능하다. 또한, 상기 제 2 유기용매는 무수 조건으로 반응을 진행시키는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 벤조니트릴 등과 같은 니트릴화 용매, 사염화탄소, 클로로포름, 또는 디클로로메탄과 같은 할로겐화 알킬 용매, 테트라히드로푸란 또는 디옥산과 같은 에테르 용매, N, N-디메틸포름아미드와 같은 아미드, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트 또는 t-부틸 아세테이트와 같은 에스테르류, 아세톤, 메틸에틸케톤 또는 메틸이소부틸케톤과 같은 케톤류, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류 등의 무극성 유기 용매 또는 이들 하나 이상의 혼합 용매의 사용이 가능하다. 또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 상기 조성물의 오배자 메탄올(Methanol)추출물이 세포에 노출되었을 때 흑색종 (B16/F10) 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 세포 생존율 측정기법인 MTT 측정(assay)을 진행하였고, 이때 오배자 추출물의 농도를 10, 50, 100 μg / mL를 처리하였다. 본 발명의 도 5에 도시된 바와 같이, 오배자 추출물의 농도별 결과 10 μg / mL 처리구에서 88.1%의 생존을 보였고, 100 μg / mL에서는 60.2%의 생존율를 보였다(도면 5 참조). 또한, 상기 조성물의 미백 효과를 확인하기 위해 쥐 흑색종(mouse melanoma) 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정하였다. 세포에 멜라닌세포자극호르몬(αα-MSH)을 처리하여 멜라닌의 발현을 유도하였고, 그 후 오배자 추출물을 농도별로 처리하고 멜라닌의 생합성 된 양을 측정하였다. 본 발명의 도 6에 도시된 바와 같이, 멜라닌세포자극호르몬(αα-MSH)을 단독으로 처리한 세포에서 멜라닌 발생양은 111.15%로 비 처리구에 비해 양이 증가하였고, 대조군으로 알부틴(arbutin) 500 μM 처리한 곳은 95.3%까지 감소하였다. 그리고 오배자 추출물을 처리한 구간은 100 μg / mL 처리 구에서는 70.6% 억제효과를 보였다(도면 6 참조).

또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물의 멜라닌 합성 저해 특징을 확인하기 위하여 본 발명에서는 멜라닌 합성의 속도결정 단계에 관여하여 멜라닌 합성을 저해하는 티로시나제 억제 실험(Tyrosinase inhibition assay)을 진행하였다. 티로시나제(tyrosinase)가 효소로 작용하여 생성되는 멜라닌을 측정하고 상기 조성물의 티로시나제(tyrosinase) 억제에 의한 미백효과를 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 미백 효과의 측정결과 오배자 추출물이 농도 의존적으로 티로시나제(tyrosinase)억제 효과가 있었으며 알부틴(Arbutin) 10 mg / mL 의 처리한 곳은 27.7%의 억제률에 비해 오배자 추출물 100 μg / mL 농도에서 75.3%의 높은 억제률을 나타냈다(도면 4 참조). 또한, 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나제(tyrosinase) 뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2와 MITF 단백질 발현을 확인한 결과 티로시나제(tyrosinase)와 TRP-1, TRP-2 및 MITF 티로시나제(tyrosinase)는 오배자 메탄올 추출물 50 μg / mL, 100 μg / mL 농도에서 현저한 감소를 보였으며, TRP-1과 TRP-2, MITF는 α-MSH 처리군에 비해 알부틴(Arbutin)대조군은 적은 감소량을 보였고 오배자 추출 처리구는 많은 감소량을 보였다. 그리고, 오배자 추출물을 처리하였을 경우 티로시나제(tyrosinase)와 TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현이 유의하게 감소하였다(도면 7 참조). 더욱이 본 발명은 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 조성물의 멜라닌 저해 특징에 의한 미백 확인을 위한 유전자 발현에 미백 효능을 확인하기 위하여 Qpcr을 진행하였다. Qpcr은 증폭산물의 생성량을 모니터링 하여 target DNA의 양을 분석하는 실험이다. Qpcr data는 항존유전자(housekeeping gene)인 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)와 비교하여 상대적인 수치(dCt = geneGADPDH)를 사용하였다. 표준화(normalization)한 GAPDH 대비 상대적인 유전자 발현의 비율(2n-dCt)을 의미한다. 흑색종(melanoma)을 유도한 곳보다 티로시나제(tyrosinase)와 MITF, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA양이 발현 억제가 일어남을 확인할 수 있었다(도면 8 참조).

본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물 일 수도 있다.

본 발명의 조성물을 피부 미백용 화장품으로 사용하는 경우, 오배자 추출물을 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(파운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤), 등에 화장료의 건조중량에 대하여 0.05 ~ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물일 수도 있다. 본 발명은 상기 화장품 조성물의 멜라닌 합성 저해를 확인하기 위하여 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 측정(Assay)을 통한 항산화 작용의 평가를 진행하였다. 본 발명에서 항산화작용의 지표로 사용되는 전자공여능은 DPPH 라디컬 소거능을 측정하여 확인하였다. 도 2에 도시된 측정결과 추출물은 농도 의존적으로 소거능이 증가하였으며, 500 μg / mL에서는 68.2%의 소거능을 보였다(도면 2 참조). 또한, 본 발명에서는 항산화 작용을 측정하는 방법 중 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine (Fe³³-TPTZ)복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe²-TPTZ)으로 환원되는 것을 이용하는 방법으로, 항산화제의 환원력을 이용한 Ferric reducing/antioxidant power(FRAP) 측정(assay)을 진행하였다. 또한, 도 3에 도시된 FRAP 측정(assay)결과는 농도 의존적으로 효과가 증가하였으며, 비타민 (Vit) C가 1 mg / mL 농도에서 6 mM의 소거량을 나타냈었는데, 오배자 추출물의 경우 500μg / mL에서 5.42 mM의 소거량을 나타냈다(도면 3 참조).

또한, 본 발명의 상기 조성물은 오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 조성물을 함유하는 기능성 식품으로서는 과자, 가공식품, 조합 유지, 유제품, 음료 등의 각종 식품을 들 수 있고, 형상 또는 성상도 특별히 제한되지 않아 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 어느 것이라도 된다. 즉, 본 발명의 조성물을 섭취함으로써 그 미백 효과를 발현하는 것으로, 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클을 개선 혹은 방지하여, 투명감 있는 아름다운 피부로 유지하는데 크게 기여할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물 일 도 있다. 또한, 본 발명의 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물 일 수도 있다. 본 발명에서 정의되는 "기능성 식품"은 기능성 식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 기능성 식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다. 또한, 본 발명은 피부 미백 효과와 항산화 효과를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 기능성 식품으로 제조 및 가공이 가능하다. 본 발명의 추출물을 포함하는 기능성 식품은 피부 미백 효과와 항산화 효과를 위한 목적으로 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시 예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 오배자 추출

본 발명의 사용한 오배자는(생산지: 중국) 분쇄한 후 천연물 500 g에 메탄올 1 리터를 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 3회 추출한 후 액을 농축하였다. 증류수에 추출물을 현탁한 다음 핵산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(n-butanol)을 사용하여 순차적으로 분획과 추출하여 각 용매별 추출물을 얻었고 그 중에 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 추출한 층을 동결 건조하여 사용하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 오배자(Galla Rhois)추출물에 대한 분획 방법의 흐름도를 나타낸다 (도면 1 참조).

< 실시예 2> 시약 및 기기

항산화 활성 능력을 측정을 위해 시약으로 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, USA), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) (Sigma, USA), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) 를 사용하였고, 아스코르브산(ascorbic acid), 티로시나제 효소(mushroom tyrosinase), (Sigma, USA), 다이메틸설폭시화물 (dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma, USA), 멜라닌합성 억제를 확인하기 위한 알파 멜라닌세포자극호르몬(αα-Melanicyte stimulating hormone, αα-MSH, Sigma, USA), L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA, Sigma, USA), 세포배지 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Thermo, USA), 우태혈청 (fetal bovine serum, FBS, Thermo, USA), 타이로신 (trypsin, Thermo, USA), 100 U/mL 페니실린 (penicillin), 0.1 mg/mL 스트렙토마이신(streptomycin, Thermo, USA), 트리졸 (TRIzol, Tri-reagent, Invitrogen, USA)등의 시약을 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 자외 및 가시선 분광분석기기 (UV/Vis-spectrophotometer, BIO-RAD, USA), 중합효소 연쇄 반응 (PCR, T1 Thermocycler, Biometra, Germany), 역전사 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR, CFX connect, Bio-Rad, USA)을 사용하였다.

< 실시예 3> 1,1- diphenyl -2- picrylhydrazyl ( DPPH ) 측정( Assay )

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 멜라닌 생성에서 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)의 산화가 티로시나제(Tyrosinase)의 초기 반응 속도에 영향을 준다. 그러므로 전자공여능(electron donating ability, EDA)이 있을 경우 멜라닌의 생성에 효과가 있을 것으로 예상하여 DPPH의 환원력을 이용하여 측정하였다. 실험 방법은 Blios의 실험방법을 변형하여 사용하였다. 시료 10 μL에 메탄올 100 μL와 0.25 mM DPPH (in MeOH) 90 μL을 혼합하여 암실에서 30 min 간 반응한 다음 분광광도계를 사용하여 517 nm에서 측정하였다. 양성대조군으로 아스코르브산 (ascorbic acid)을 사용하였고 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 백분율로 나타내었다.

저해율(%) = (A-B)/A×100

A : 시료를 첨가하지 않았을 때의 흡광도

B : 시료를 첨가하였을 때의 흡광도

< 실시예 4> Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정(assay)

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정(assay)는 Benzie와 Strain의 방법을 변형하여 사용하였다. FRAP 시약(reagent)은 25 mL 아세테이트 (acetate buffer, 300 mM, pH 3.6)를 37 ℃에서 가온 후, 40 mM 염산 (HCl)에 용해한 10 mM TPTZ((2-pyridyl)-s-triazine) 5 mL과 20 mM 황산 제1철(FeSO4) 2.5 mL을 가하여 FRAP reagent를 제조하였다. FRAP 시약(reagent) 0.9 mL에 각 농도의 샘플을 0.03 mL와 증류수 0.09 mL를 넣은 다음 37 ℃에서 10 min 동안 반응시켜 593 nm에서 분광광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 5> 티로시나제 억제 효과 측정( Tyrosinase Inhibition Assay )

멜라닌은 티로시나제(tyrosinase)가 티로신(tyrosine)을 산화하여 생성이 시작된다. 오배자 추출물이 tyrosinase와 경쟁적으로 억제를 하여 미백 효능을 검증하는 방법으로 Yagi의 방법을 변형하여 시행하였다.

< 실시예 6> 세포배양

흑색종 세포 (B16/F10 melanoma cell)에 배양에 사용하였던 배지는 10% 우태혈청 (Fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin)을 배지인 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 가하여 사용하였다. 세포는 37 ℃와 5% CO₂₂상태에서 배양하였고, 흑색종 세포(B16/F10 melanomacell) 에 각 조건 별로 실험 도구인 96 well plate에는 5 ×× 10⁴cell/well, 배양 도구인 100 mm cell culture dish는 1 ×× 10 cell/mL와 60 mm cell culture dish는 1 × 10 cell/mL로 배양하였다.

< 실시예 7> 세포독성 측정 (세포 생존율 측정기법, MTT assay )

오배자 메탄올 추출물이 세포에 노출되었을 때 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 세포 생존율 측정기법인 MTT assay를 진행하였다. 96 well plate에는 5 × 10⁴cell/well 되도록 분주 후 24 h 동안 배양한 후 각 농도에 맞도록 sample을 첨가하였다. 24 h 뒤에 배지를 제거한 후 배지(media)와 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide in PBS 5 mg/ml) 9:1로 섞었다. 실험도구 플레이트의 각 well마다 MTT를 섞은 배지를 200 μL씩 가하고 항온기 (incubator)에 4 h 반응 후 다시 배지를 제거하였다. 다이메틸설폭시화물(DMSO)과 에탄올을 1:1 비율로 섞어 150 μL씩 분주하여 녹인 다음 분광광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 550 nm에서 측정하였다.

< 실시예 8> 멜라닌 억제량 측정( Melanin Contents Assay )

오배자 추출물을 실제 멜라닌 억제량을 측정하기 위하여 멜라닌 세포에 오배자 추출물을 처리 후 멜라닌이 생성된 양을 확인하였다. 흑색종 세포 (B16/F10 melanoma cell)을 100mm cell culture dish (배양 접시)에 1 × 10 cell/mL의 농도로 24 h 동안 배양한 후 멜라닌세포자극호르몬(α-Melanicyte stimulating hormone , α-MSH)을 10 nM 되도록 처리하였고, 4 h 뒤에 오배자 추출물을 처리하였다. 24 h 뒤에 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)로 2회 세척 후 쎌 스크리퍼(cell screaper)로 cell을 모았다. 세포벽을 녹여서 DNA가 잘 빠져나오도록 하는 역할을 하는 Lysis buffer (0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.8, 1%(v/v) triton X-100)를 1 mL 첨가한 다음 4 ℃ 30 min 간 반응 하였다. 반응한 용액을 13,000 rpm 10 min 간 원심분리 하였고, 상등액은 BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 정량법으로 정량을 하였다. 침전물은 1 N 가성소다(NaOH)용액 1 mL 첨가한 다음, 90 ℃에서 1 h 반응한 뒤 단백질양에 맞춰 희석하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 9> Western blot

흑색증 세포 (B16/F10 melanoma cell)을 100mm cell culture dish에 1× 10 cell/mL의 농도로 24 h 동안 배양한 후 α-MSH을 10 nM 되도록 처리하였고, 4 h 뒤에 오배자 추출물을 처리하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 세포침전물을 Radioimmune precipitation assay (RIPA)buffer에 용해시킨 후 15,000 rpm 에서 15 min 간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 단백질은 BCA 단백질 정량법 정량하였고, 50μL 상층액과 x5 SDS sample buffer(1 M Tris-HCl(pH 6.8) 0.6 mL, glycerol 5 mL, 10% SDS 2 mL, β-mercaptoethanol 0.5 mL, 1% bromophenolblue 1mL, H₂O 0.9 mL)를 10μL 혼합한 후 7.5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate ) 폴리아마이드 젤(polyacrylamide gel)에서 전기영동 하였다. 그 다음 니트로섬유소막 (Nitrocellulose membrane)를 사용하여 Transfer (전개된 단백질들은 membrane에 부착시키는 과정)를 진행하였다. 5% skim milk로 1 h 동안 blocking (비특이적 결합을 줄여주는 역할) 시킨 다음 티로시나제(tyrosinase), 액틴(actin), TRP-1, TRP-2의 항체 (antibody)를 1:1000으로 희석하여 각각 실온에서 1 h 동안 반응시켰다. PBS-T (0.1% tween-20을 포함된 10mM phosphate, 2.7mM Potassium Chloride, 137mM sodium chloride, pH7.4) 로 5회 세척한 후 티로시나제(tyrosinase), 액틴(actin), TRP-1 및 TRP-2를 anti-goat Igg (Immunoglobulin G)로 2차 항체(antibody)를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1 h 동안 반응시켰다. TBST (Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 세척한 후 단백질 발현의 확인(western detection)용액으로 발색 후 필름으로 인화하였다.

< 실시예 10> 유전자발현 분석

흑색종 세포(B16/F10 melanoma cell)을 100 mm cell culture dish에 1× 10 cell/mL 농도로 분주하여 24 h 동안 배양한 후 α-MSH을 10 nM 되도록 처리하였다. 4 h 뒤에 오배자 추출물을 각 농도별로 처리하였다. 24 h 뒤에 1 mL TRIzol reagent를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA (ribonucleic acid, D-리보오스를 당성분으로 하는 핵산)에 200 μL 클로로포름 (choloroform): 이소아밀알콜 (isoamylalcohol) (24:1)을 넣고 잘 섞은 후 14,000 rpm으로 20 min 간 원심 분리하였다. 원심 분리된 튜브에서 상층액 500 μL을 새로운 튜브에 담은 뒤 500 μL 이소프로필알콜 (Isopropyl alcohol)을 넣어 RNA를 침전시킨 후 70% 에탄올(ethanol)로 세척하였다. 상온에서 튜브를 자연 건조 시켰다. RNAase free water에서 RNA를 녹인 후 RNase-free DNase를 첨가하고 -70 ℃에 보관 하였다.

< 실시예 11> 상보적 DNA ( complementary DNA , cDNA) 합성

대조군 및 시험군에서 각각 분리한 총 RNA 1 μg에 Oligo dT 2 μL를 넣은 후 DEPC (diethyl pyrocarbonate) water 8 μL 넣고 조심스럽게 혼합한 다음, 65 ℃에서 5 min 간 반응 후 다시 얼음에 넣어 4 ℃를 유지한 후 5 X reaction buffer 4 μL, RiboLock™™ RNase Inhibition (20 U/μL) 1 μL 및 10 mM dNTP mix 2 μL와 RevertAid™™ M-MuLV reverse transcriptase (200 u/μL) 1 μL를 가하여 총 양을 20 μL로 만들었다. 이 후, 42 ℃에서 60 min 간 반응 한 다음 4 ℃에서 최종 추출하였다. 합성된 cDNA는 -20 ℃에 보관 하였다.

< 실시예 12> 실시간 중합효소 연쇄반응 ( Real - time RT- PCR )

오배자 추출물의 미백 효능 확인하기 위하여 미백과 관련된 DNA 발현율을 측정였다. Taqman Universal Master Mix Ⅱ (Life technologies)와 Taqman gene expression assay를 사용하여 진행하였고, quantitative real time PCR 조건은 변성 (denaturation)은 95 ℃ 에서 15 s, 풀림 (annealing)은 68 ℃ 에서 60 s 를 40 Cycle 진행하고 최종 추출은 72 ℃ 에서 30 s 반응하였다. 상대적인 melanogenic protein mRNA발현 비교는 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA와 비교하였다.

표 1은 본 발명의 PCR에 사용되는 프로브를 정리한 것이다.

Gene	Applied Biosystems reference
Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH)	Mm99999915-g1
Tyrosinase	Mm00495817-m1
Tyrosinase-related protein-1(TRP-1)	Mm00453201-m1
DOPAchrome tautomerase(DCT, TRP-2)	Mm01225584-m1
Microphthalmia-associated transcription factor(MITF)	Mm00434954-m1

Claims

오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물.
오배자(Galla Rhois) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 오배자를 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분핵물을 얻는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.