JP6817302B2 - Ｐｄ１および／またはｌａｇ３結合性物質 - Google Patents

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Description

本出願は、２０１５年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，００９号の利益を主張するものであり；この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
コンピュータ読取可能なフォーマットのヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照によりその全体が組み込まれる。配列表を含有するファイルは、２０１６年１１月１５日に作成され、「２４２３８ＷＯＰＣＴＳＥＱ」と名付けられた１９９ｋバイトのＡＳＣＩＩテキストファイルである。
本発明は、一部において、プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ１」）、例えばヒトＰＤ１およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に結合するアミノ酸配列に関する。とりわけ、本発明は、一部において、ＰＤ１およびＬＡＧ３に結合する改良された重鎖免疫グロブリン単一可変ドメイン（本明細書中で「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」とも呼ばれる）、並びにかかるＩＳＶＤを含むポリペプチドおよび他の化合物に関する。本発明の他の態様、実施形態、特徴、使用および利点は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。
プログラム死受容体１（ＰＤ−１）は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞上で主に発現する免疫抑制性受容体である。そのリガンドとの相互作用は、インビトロおよびインビボの両方においてＴ細胞応答を減弱させることが示されている。ＰＤ１とそのリガンドの１つであるＰＤ−Ｌ１との間の相互作用の遮断は腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強することが示されており、それゆえ免疫系による腫瘍細胞のクリアランスにおいて有益であろう。
ＰＤ−１（遺伝子Ｐｄｃｄ１によりコードされる）はＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーである。ＰＤ−１は、そのリガンド（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）が会合すると抗原受容体シグナル伝達を負に制御することが示されている。マウスＰＤ−１の構造、並びにマウスＰＤ−１とヒトＰＤ−Ｌ１との共結晶構造は解明されている（Ｚｈａｎｇ，Ｘ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７−３４７（２００４）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：３０１１−６（２００８））。ＰＤ−１および類似のファミリーメンバーは、リガンド結合に関与するＩｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子の結合に関与する細胞質側末端を含有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質側末端は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。
Ｔ細胞刺激の後、ＰＤ‐１はその細胞質側末端内のＩＴＳＭモチーフにチロシンホスファターゼＳＨＰ‐２を補充し、ＣＤ３ Ｔ細胞シグナル伝達カスケードに関わるエフェクター分子、例えばＣＤ３ゼータ、ＰＫＣシータおよびＺＡＰ７０などの脱リン酸化を導く。ＰＤ−１がＴ細胞応答をダウンモジュレートするメカニズムはＣＴＬＡ−４のそれと類似しているが別個のものであり、両分子は重複するシグナル伝達タンパク質のセットを制御する（Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２５：９５４３−９５５３（２００５））。Ｂｅｎｎｅｔｔおよび共同研究者は、Ｔ細胞シグナル伝達のＰＤ−１介在性阻害は活性化シグナルと阻害シグナルの両方が同じ表面上にある場合にのみ有効であることを示しており、これはＰＤ−１シグナル伝達メカニズムが時空間的に決定されることを指し示すものである（Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：７１１−８（２００３））。ＰＤ−１は、活性化リンパ球（末梢ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）上に発現することが示され、またＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ）Ｔ細胞、並びにＮＫ−Ｔ細胞上で胸腺での発達の間に発現することも示されている。
ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）は、恒常的に発現するか、または非造血組織並びに種々の腫瘍タイプを包含する種々の細胞タイプにおいて誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞および樹状細胞（ＤＣ）上で発現するが、微小血管内皮細胞などの末梢細胞、および心臓、肺などの非リンパ器官上でも発現する。対照的に、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージおよびＤＣ上でのみ見出される。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、末梢性寛容の維持におけるＰＤ−１の役割を示唆しており、末梢における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞応答の制御に役立ち得る。両方のリガンドは、細胞外領域中にＩｇＶおよびＩｇＣ様ドメインの両方を含有するＩ型膜貫通受容体である。両方のリガンドは、既知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域を含有する。
ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用は、インビトロおよびインビボでのリンパ球増殖の阻害を導く。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の破壊は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を増大させ、細胞周期の進行を遮断することが示されている。Ｐｄｃｄ１−／−マウスの最初の解析は、いかなる劇的な免疫学的表現型も同定しなかった。しかしながら、老齢マウスは、Ｐｄｃｄ１欠損が戻し交配された系統によって異なる自発性自己免疫疾患を発症した。これらは、ループス様増殖性関節炎（Ｃ５７ＢＬ／６）（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１５６３−１５７２（１９９８））、致死性心筋症（ＢＡＬＢ／ｃ）（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９−３２２（２００１））およびＩ型糖尿病（ＮＯＤ）（Ｗａｎｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１８２３−１１８２８（２００５））を包含する。全体的に見て、ノックアウト動物の分析は、ＰＤ−１が主として末梢寛容の誘導および制御において機能するという理解に導いた。それゆえに、ＰＤ−１経路の治療的遮断は、免疫寛容を克服するのに有用であり得る。かかる選択的遮断は、がんまたは感染症の治療において並びにワクチン接種の際の免疫のブーストにおいて役に立ち得る（予防的または治療的のいずれかで）。
がんにおけるＰＤ−１の役割は、文献において確立されている。腫瘍微小環境は、腫瘍細胞を効率的な免疫破壊から保護することができることが知られている。ＰＤ−Ｌ１は、近年、多数のマウスおよびヒトの腫瘍上で発現すること（およびＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞株の大部分においてＩＦＮガンマにより誘導可能であること）が示されており、免疫回避を媒介すると推論されている（Ｉｗａｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）。
ヒトにおいて、（腫瘍浸潤リンパ球上での）ＰＤ−１および／または（腫瘍細胞上での）ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学によって評価された多数の原発性腫瘍生検において見出されている。かかる組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、***、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞および膵臓のがん並びに頭頸部の腫瘍が挙げられる（Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：１７５７−６１（２００７）；Ｎｏｍｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：２１５１−７．（２００７））。より著しいことには、腫瘍細胞上でのＰＤ−リガンド発現は、複数の腫瘍タイプにわたってがん患者の予後不良と相関している（Ｏｋａｚａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：８１３−８２４（２００７）中に概説されている）。
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の増強を導き、それゆえ免疫系による腫瘍細胞のクリアランスにおいて有益であり得る。この課題に取り組むため、多数の研究が行われた。侵攻性膵臓がんのマウスモデルにおいて、Ｔ．Ｎｏｍｉら（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：２１５１−２１５７（２００７））は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の治療的有効性を実証した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに対する抗体の投与は腫瘍増殖を顕著に阻害した。抗体遮断は腫瘍内への腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を効果的に促進し、ＩＦＮガンマ、グランザイムＢおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターのアップレギュレーションをもたらした。加えて、著者らは、ＰＤ−１遮断を化学療法と組み合わせることで効果的に相乗効果を得ることができることを示した。別の研究において、扁平上皮癌のマウスモデルを用いることで、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は腫瘍増殖を顕著に阻害した（Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ． ４２：２６８−２７４（２００６））。
他の研究において、ＰＤ−Ｌ１でのマウスマスト細胞腫株のトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養したときに腫瘍細胞の溶解の減少を導いた。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂを加えると溶解は回復した（Ｉｗａｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。インビボで、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、マウス腫瘍モデルにおける養子Ｔ細胞移入療法の有効性を向上させることが示された（Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：６５０１−６５０５（２００３））。がん治療におけるＰＤ−１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験から得られている。ＰＤ−Ｌ１を発現する骨髄腫細胞は、野生型動物でのみ増殖した（腫瘍増殖および結果としての関連動物死をもたらす）が、ＰＤ−１欠損マウスにおいては増殖しなかった（Ｉｗａｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。
ヒトの研究において、Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇら（（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：１２２３−１２３４（２００７））は、完全ヒト抗ＰＤ−１抗体を用いたＰＤ−１遮断が、ワクチン抗原およびワクチン接種した個体由来の細胞を用いたエクスビボ刺激アッセイにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の絶対数を増やすことを示した。同様の研究において、ＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は、腫瘍関連抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の細胞溶解活性の増強および腫瘍特異的ＴＨ細胞によるサイトカイン産生の増加をもたらした（Ｂｌａｎｋ Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：３１７−３２７（２００６））。同じ著者らは、ＰＤ−Ｌ１遮断は抗ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせて用いたときにインビトロで腫瘍特異的Ｔ細胞応答を増やすことを示した。
全体的に見て、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、がん治療のための抗体治療薬開発のための十分に検証された標的である。抗ＰＤ−１抗体はまた、慢性ウイルス感染症において有用であり得る。急性ウイルス感染症の後に生成されるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は高度に機能的であり、防御免疫の重要な構成成分を構成する。対照的に、慢性感染症はウイルス特異的Ｔ細胞応答の機能障害（消耗）の程度を変化させることをしばしば特徴とし、この欠損は宿主が持続する病原体を排除することができない主な理由である。機能的エフェクターＴ細胞は感染症の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染症の過程で徐々に機能を失う。Ｂａｒｂｅｒら（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−６８７（２００６））は、ＬＣＭＶの実験室株に感染したマウスが慢性感染症を発症し、血液および他の組織中に高レベルのウイルスをもたらすことを示した。これらのマウスは最初は強いＴ細胞応答を発現したが、最終的にはＴ細胞消耗すると感染により死亡した。著者らは、慢性感染マウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断する抗体を注射することによって逆転させることができることを見出した。
近年、ＰＤ−１はＨＩＶ感染個体由来のＴ細胞上で高度に発現しており、受容体の発現は障害されたＴ細胞機能および疾患進行と相関することが示された（Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４３：３５０−４（２００６）．；Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． １２：１１９８−２０２（２００６））。両方の研究において、リガンドＰＤ−Ｌ１の遮断は、インビトロでＨＩＶ特異的なＩＦＮ−ガンマ産生細胞の増殖を顕著に増加させた。
他の研究はまた、ウイルス感染のコントロールにおけるＰＤ−１経路の重要性を示唆する。ＰＤ−１ノックアウトマウスは、野生型マウスよりも良好なアデノウイルス感染のコントロールを呈する（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９８：３９−５０（２００３））。また、ＨＢＶトランスジェニック動物へのＨＢＶ特異的Ｔ細胞の養子移入は肝炎を起こした（Ｉｓｏｇａｗａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：５３−６３（２００５））。これらの動物の疾患状態は、肝臓における抗原認識および肝細胞によるＰＤ−１アップレギュレーションの結果として変動する。
加えて、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）は活性化Ｔ細胞（Ｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２１３−２１７，１９９４）、ＮＫ細胞（Ｔｒｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１：１３９３−１４０５，１９９０）、Ｂ細胞（Ｋｉｓｉｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：２０８１−２０８８，２００５）および形質細胞様樹状細胞（Ｗｏｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２：１８８５−１８９１，２００９）上に発現する細胞表面分子であり、これらのリンパ球サブセットの機能において重要な役割を果たす。加えて、ＬＡＧ３とその主要なリガンドであるクラスＩＩ ＭＨＣとの間の相互作用は、樹状細胞機能の調節に役割を果たすと考えられる（Ａｎｄｒｅａｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：３８７４−３８８０，２００２）。近年の前臨床研究は、ＣＤ８ Ｔ細胞消耗におけるＬＡＧ−３の役割を実証している（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：２９−３７，２００９）。
慢性ウイルス感染症と同様に、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター機能の障害、および、炎症誘発性サイトカインの産生減少および抗原再刺激に対する応答性低下を特徴とする消耗した表現型を示す。これは、例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの細胞外因的メカニズム、および消耗した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上でアップレギュレートされる阻害分子などの細胞内因的メカニズムによって媒介される。これらの阻害メカニズムは、有効な抗腫瘍免疫に対する手強い障壁を代表するものである。
ＬＡＧは寛容化ＴＩＬ上で発現し、このことはそれらが腫瘍介在性の免疫抑制に寄与することを示唆する。ＬＡＧ３の阻害は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化増強を導き得て、そこから治療的利益が得られ得る。
Ｚｈａｎｇ，Ｘ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７−３４７（２００４） Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：３０１１−６（２００８） Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２５：９５４３−９５５３（２００５） Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：７１１−８（２００３） Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１５６３−１５７２（１９９８） Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９−３２２（２００１） Ｗａｎｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１８２３−１１８２８（２００５） Ｉｗａｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１２２９３−１２２９７（２００２） Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３） Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７−１２６６（２００３） Ｄｏｎｇ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ８：７９３−８００（２００２） Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：７４６２−７４６７（２００３） Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６６：３３８１−５（２００６） Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：１７５７−６１（２００７） Ｎｏｍｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：２１５１−７（２００７） Ｏｋａｚａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：８１３−８２４（２００７） Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ． ４２：２６８−２７４（２００６） Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：１２２３−１２３４（２００７） Ｂｌａｎｋ Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：３１７−３２７（２００６） Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−６８７（２００６） Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４３：３５０−４（２００６） Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． １２：１１９８−２０２（２００６） Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９８：３９−５０（２００３） Ｉｓｏｇａｗａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：５３−６３（２００５） Ｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２１３−２１７，１９９４ Ｔｒｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１：１３９３−１４０５，１９９０ Ｋｉｓｉｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：２０８１−２０８８，２００５ Ｗｏｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２：１８８５−１８９１，２００９ Ａｎｄｒｅａｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：３８７４−３８８０，２００２ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：２９−３７，２００９
本発明は、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を含むが；１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および１１２位のうちの１または複数における変異であって、ここで、前記位置は、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされ（例えば、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ、および任意にＥ１Ｄ；またはＬ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｗ５２ａＶ、Ｎ７３Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ、Ｗ１００ａ、および任意にＥ１Ｄ）を有する、ＰＤ１（例えばヒトＰＤ１）に結合するＰＤ１結合性物質（ｂｉｎｄｅｒ）（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）またはナノボディを包含し、アミノ酸配列：ＩＨＡＭＧ（配列番号３）またはＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）またはＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７；ここでＸはＷまたはＶである）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列：ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）またはＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号８、ここでＸはＷまたはＦである）を含むＣＤＲ３を包含する。本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、ＬもしくはＶから選ばれる１１位のアミノ酸残基；Ｔ、ＶもしくはＬから選ばれる８９位のアミノ酸残基；Ｔ、ＫもしくはＱから選ばれる１１０位のアミノ酸残基；および／またはＳ、ＫもしくはＱから選ばれる１１２位のアミノ酸残基を含む。本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、８９Ｔ；８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；８９Ｌと１１０Ｋまたは１１０Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１２Ｋまたは１１２Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１Ｖおよび１１０Ｋまたは１１０Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１Ｖおよび１１２Ｋまたは１１２Ｑとの組み合わせ；１１Ｖと１１０Ｋまたは１１０Ｑとの組み合わせ；１１Ｖと１１２Ｋまたは１１２Ｑとの組み合わせよりなる群から選択されるメンバーである１または複数の記載された変異を含む。本発明のある実施形態において、１１位、８９位、１１０位および１１２位におけるアミノ酸は、本明細書中で表Ｂに示されるもののいずれかである。本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１位、１４位、４１位、７４位、８３位、８７位および１０８位よりなる群から選択される１もしくは複数の位置における変異、および／または、１もしくは複数のそれ自体公知のヒト化置換を含む（このため、本明細書中で引用される従来技術、例えばＷＯ０８／０２００７９またはＷＯ０９／１３８５１９への参照がなされる。本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸のＣ末端伸長を含む。例えば、本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、式−Ｘ（ｎ）によるＣ末端伸長を含み、ここでＸおよびｎは：（ａ）ｎ＝１およびＸ＝Ａｌａであり；（ｂ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ａｌａであり；（ｃ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ａｌａであり；（ｄ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｅ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｆ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ａｌａであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｇ）ｎ＝１およびＸ＝Ｇｌｙであり；（ｈ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ｇｌｙであり；（ｉ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ｇｌｙであり；（ｊ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｋ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｌ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ｇｌｙであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；（ｍ）ｎ＝２および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙであり；（ｎ）ｎ＝３および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙであり；（ｏ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ；または（ｐ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙであり、ここで残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれ、例えばＡ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。本発明はまた、１１位、８９位、１１０位および１１２位における１または変異類および配列番号９−４０よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列との少なくとも８５％（例えば８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９または１００％）の配列同一性（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長並びに任意のＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を提供する。本発明はまた、１または複数の分子に連結されたＰＤ１に結合するＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を含む多重特異性免疫グロブリンであって、ここで前記分子はＰＤ１結合性物質が結合するエピトープではないエピトープ（例えばＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ２７）に結合する前記多重特異性免疫グロブリンを提供し、ＰＤ１結合部分およびＣＴＬＡ４結合部分；ＰＤ１結合部分およびＢＴＬＡ結合部分；ＰＤ１結合部分およびＬＡＧ３結合部分；またはＰＤ１結合部分、ＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分を含み、これは例えば１または複数のリンカー、例えばペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。本発明の１つの実施形態において、多重特異性免疫グロブリンは、ＣＴＬＡ４ナノボディ、ＬＡＧ３ナノボディ、ＢＴＬＡナノボディ、ＣＤ２７ナノボディおよび第一のＰＤ１ナノボディのエピトープと同じまたは異なるエピトープに結合するＰＤ１ナノボディよりなる群から選択される１または複数の分子に連結された第一のＰＤ１ナノボディを含み；これは例えばＰＤ１結合部分およびＣＴＬＡ４結合部分；ＰＤ１結合部分およびＢＴＬＡ結合部分；ＰＤ１結合部分およびＬＡＧ３結合部分；またはＰＤ１結合部分、ＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分を含む。
本発明は、例えば配列番号９−４０から選択される本明細書中に記載されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたはナノボディを包含する。
本発明はまた、さらなる治療剤を伴う本発明のＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）を提供する。
さらなる治療剤を伴ってもよいＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）を含む注入装置および容器が本発明により提供される。
本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）をコードするポリヌクレオチド；または前記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは前記ポリヌクレオチドもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記免疫グロブリンの発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして、前記宿主細胞および／または前記培地から免疫グロブリンを精製することを含んでもよい、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）を作成する方法を提供する。かかる方法により生産されるＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、本発明の一部である。
本発明はまた、ＰＤ１をさらなる治療剤を伴ってもよいＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）と接触させることを含む、ＰＤ１がＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に結合することを防ぐ方法を提供する。
本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の本発明のＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）を対象に投与することを含む、対象の体内において免疫応答を増強する方法を提供する。加えて、本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の本発明のＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性ＩＳＶＤ、例えばナノボディ）を対象に投与することを含む、対象の体内においてがん（例えば転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんまたは胃がん）または感染性疾患（細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症）を治療または予防する方法を提供する。本発明のある実施形態において、対象はまた、ＰＤ１結合性物質を伴ってさらなる治療剤または治療手法を投与される。
本発明は、アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）またはＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）またはＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７；ここでＸはＷまたはＶである）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）を含むＣＤＲ３を含む、ＰＤ１に結合するＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を提供し、これは、配列番号１または２に関して１１位（例えばＬ１１Ｖ）および８９（例えばＩ８９Ｌ）における１もしくは複数の変異またはＥ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｗ５２ａＶ、Ｎ７３（Ｑ、ＰまたはＳ）、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ、Ｗ１００ａＦから選択される１もしくは複数の変異を含む。本発明のある実施形態において、変異は、Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｋ８３ＲおよびＩ８９Ｌ；またはＬ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｋ８３ＲおよびＩ８９Ｌである。本発明のある実施形態において、変異は、Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｗ５２ａＶ、Ｎ７３（Ｑ、ＰまたはＳ）、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ、Ｗ１００ａＦまたはＬ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｗ５２ａＶ、Ｎ７３（Ｑ、ＰまたはＳ）、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ、Ｗ１００ａＦである。本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質は、アミノ酸配列：ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳ ＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶ ＩＴＷＳＧＧＩＴＹＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹ ＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤ ＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫ ＨＱＳＳＷＹＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５７）を含む。
本発明はまた、アミノ酸配列ＧＲＴＦＳＤＹＶＭＧ（配列番号６５）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＡＩＳＥＳＧＧＲＴＨ（配列番号６６）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＴＬＬＷＷＴＳＥＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤＹ（配列番号６７）を含むＣＤＲ３を含む、ＬＡＧ３に結合するＬＡＧ３結合性物質を提供し、これは、例えばアミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥ ＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧ ＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ ＲＴＦＳＤＹＶＭＧＷ ＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥ ＦＶＡＡＩＳＥＳＧＧ ＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧ ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫ ＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬ ＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣ ＡＴＴＬＬＷＷＴＳＥ ＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤ ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ ＳＳ（配列番号６４）を含む。
ＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質は、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質のような単一の分子であり得て、これは本発明の一部であり、ここで前記分子はＰＤ１およびＬＡＧ３に結合し、アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）またはＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）またはＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７；ここでＸはＷまたはＶである）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）を含むＣＤＲ３を含むＰＤ１結合性物質、ならびに、アミノ酸配列ＧＲＴＦＳＤＹＶＭＧ（配列番号６５）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＡＩＳＥＳＧＧＲＴＨ（配列番号６６）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＴＬＬＷＷＴＳＥＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤＹ（配列番号６７）を含むＣＤＲ３を含むＬＡＧ３結合性物質を含み、任意に半減期エクステンダーを含んでもよく、例えば、ここでＰＤ１結合性物質は、アミノ酸配列：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳ ＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶ ＩＴＷＳＧＧＩＴＹＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹ ＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤ ＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫ ＨＱＳＳＷＹＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳおよび（配列番号５７）を含み；そして、ＬＡＧ３結合性物質は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥ ＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧ ＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ ＲＴＦＳＤＹＶＭＧＷ ＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥ ＦＶＡＡＩＳＥＳＧＧ ＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧ ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫ ＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬ ＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣ ＡＴＴＬＬＷＷＴＳＥ ＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤ ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ ＳＳ（配列番号６４）を含み；任意に半減期エクステンダーを含んでもよい。例えば、本発明のある実施形態において、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、例えば下に示される順番での部分を含む：
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）もしくは１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｘ（例えばＮ７３ＰまたはＮ７３ＱまたはＮ７３Ｓ），Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・ＬＡＧ３結合性物質１１Ｂ０９もしくは１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・半減期エクステンダー、例えばＡＬＢ１１００２；および任意に、
・Ｃ末端伸長、例えばアラニン；
または
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）もしくは１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｘ（例えばＮ７３ＰまたはＮ７３ＱまたはＮ７３Ｓ），Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）もしくは１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｘ（例えばＮ７３ＰまたはＮ７３ＱまたはＮ７３Ｓ），Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・ＬＡＧ３結合性物質１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・ＬＡＧ３結合性物質１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）；
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ、２０ＧＳもしくは３５ＧＳ（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））；
・半減期エクステンダー、例えばＡＬＢ１１００２；および任意に、
・Ｃ末端伸長、例えばアラニン。
半減期エクステンダーは、本発明のある実施形態において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２である。本発明のある実施形態において、ＨＳＡ結合性物質は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳ（配列番号６０）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬ（配列番号６１）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＧＧＳＬＳＲ（配列番号６２）を含むＣＤＲ３を含み、例えばアミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧＮＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ ＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤ ＴＡＬＹＹＣＴＩＧＧ ＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬ ＶＴＶＳＳＡ（配列番号５９）を含む。かかる半減期エクステンダーそれ自体は、本発明の一部である。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質、ＬＡＧ３結合性物質、ＨＳＡ結合性物質および／またはＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、注入装置または容器の中にあり、さらなる治療剤を伴ってもよい。かかる装置または容器は、本発明の一部である。
本発明はまた、本明細書に示される結合性物質のいずれかをコードするポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチドを含む任意のベクター（例えばプラスミド）、並びに前記ポリヌクレオチドまたはベクターを、例えば異所性でまたは１もしくは複数の宿主細胞染色体内に組み込んで含む任意の宿主細胞（例えばＣＨＯまたは真菌細胞、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））を提供する。
本発明はまた、結合性物質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えばＣＨＯまたは真菌細胞、例えばピキアなど、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記結合性物質の発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして、場合により前記宿主細胞および／または前記培地から結合性物質を精製することを含んでもよい、本明細書に示される結合性物質のいずれかを作成する方法を提供する。ベクターまたはポリヌクレオチドは、１または複数の宿主細胞染色体内に組み込まれていてもよい。かかる方法により生産される任意の結合性物質もまた、本発明の一部である。
本発明はまた、例えば本明細書中で論じられるように、ＰＤ１を、さらなる治療剤を伴ってもよい本発明のＰＤ１結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）と接触させることを含む、ＰＤ１がＰＤ−Ｌ１および／もしくはＰＤ−Ｌ２に結合することを防ぐ方法または何らかのＰＤ１活性を阻害する方法を提供する。本発明はまた、例えば本明細書中で論じられるように、ＬＡＧ３を、さらなる治療剤を伴ってもよい本発明のＬＡＧ３結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）と接触させることを含む、ＬＡＧ３がＭＨＣクラスＩＩに結合することを防ぐ方法または何らかのＰＤ１活性を阻害する方法を提供する。本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の本発明の結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）を対象に投与することを含む、対象（例えばヒト）の体内において免疫応答を増強する方法を提供する。本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の本発明の結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）を対象に投与することを含む、対象（例えばヒト）の体内においてがん（例えば転移性がん、固形腫瘍または血液がん）または感染性疾患（例えば細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症）を治療または予防する方法を提供する。対象に投与されるとき、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）は、さらなる治療剤または治療手法、例えば外科的腫瘍摘出術を伴って投与されてもよい。
本明細書中で具体的に言及されるアミノ酸位置のうちのいくつか、およびいくつかの代替的ナンバリング方式（例えばＡｈｏおよびＩＭＧＴ）によるそれらのナンバリングを載せた表を示す。 ＰＤ１結合性物質の配列を示す。 １０２Ｃ１２配列と配列番号９−４０の配列とのアラインメントを示す（ＷＯ２００８／０７１４４７、配列番号３４８を参照されたい）。 チャイニーズハムスター卵巣細胞中で生産されるモノクローナル抗体について主要なＮ−結合型グリカン（ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン）および遺伝子改変酵母細胞中で生産されるモノクローナル抗体について主要なＮ−結合型グリカン（遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン）を示す：正方形：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）；丸：マンノース（Ｍａｎ）；菱形：ガラクトース（Ｇａｌ）；三角形：フコース（Ｆｕｃ）。 Ｆ０２３７００２７５（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）またはＦ０２３７００７０６（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）による、ヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１の一価の結合を示す。ＧＡＭ＝ＦＬＡＧエピトープに結合するマウス抗体を検出するために用いられたヤギ抗マウス二次抗体；α−ＦＬＡＧ＋ＧＡＭ＝用いられたヤギ抗マウス二次抗体＋構成物のＣ末端にあるＦＬＡＧエピトープに結合するマウス抗体。 Ｆ０２３７６１１Ｂ０９−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６またはＦ０２３７００８４２（Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６による、ヒトＬＡＧ３を発現する３Ａ９細胞の一価の結合を示す。 （Ａ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２による、ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯの結合、または（Ｂ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３、Ｆ０２３７００９６２、Ｆ０２３７００６７８（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２）もしくはＦ０２３７０１１２７による、アカゲザルＰＤ−１を発現する３Ａ９の結合を示す。ＡＢＨ００７４＋ＧＡＭ＝用いられたヤギ抗マウス二次抗体＋ナノボディのフレームワークに結合するマウス抗体ＡＢＨ００７４。 （Ａ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７００９２４もしくはＦ０２３７００９６２による、ヒトＬＡＧ３を発現するＣＨＯの結合、または（Ｂ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２による、アカゲザルＬＡＧ３を発現する３Ａ９の結合を示す。 （Ａ）Ｆ０２３７００２７５またはＦ０２３７００７０６による、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｂ）Ｆ０２３７００２７５またはＦ０２３７００７０６による、ヒトＰＤ−Ｌ２−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｃ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３またはＦ０２３７００９６２による、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｄ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３またはＦ０２３７００９６２による、ヒトＰＤ−Ｌ２−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｅ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９３３またはＦ０２３７００９６２による、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｆ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９３３またはＦ０２３７００９６２による、ヒトＰＤ−Ｌ２−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｇ）Ｆ０２３７００９２９（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−ＨＩＳ６）、Ｆ０２３７０１１９０（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６）、Ｆ０２３７０１１９２（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６またはＦ０２３７０１１９３（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６）による、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１との間の結合の遮断；（Ｈ）Ｆ０２３７００９２９（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−ＨＩＳ６）、Ｆ０２３７０１１９０（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６）、Ｆ０２３７０１１９２（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６またはＦ０２３７０１１９３（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６）による、ヒトＰＤ−Ｌ２−ＦｃとヒトＰＤ１を発現するとの間の結合の遮断を示す。ＵＳ＝染色；ｈＰＤ−Ｌ１ ＥＣ３０＝得ることができる最大染色強度の３０％を与えるように用量設定されたｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの染色強度；ＧＡＨ＝ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃのヒトＦｃ部分を検出するために用いられたヤギ抗ヒト二次抗体。 （Ａ）Ｆ０２３７６１１Ｂ０９−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６、Ｆ０２３７００８４２−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６もしくはヒトＬＡＧ３−Ｆｃ；（Ｂ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２、ヒトＬＡＧ３−Ｆｃ；または（Ｃ）Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９３１もしくはＦ０２３７００９６２もしくはヒトＬＡＧ３−Ｆｃによる、Ｄａｕｄｉ細胞へのヒトＬＡＧ３−Ｆｃ結合の遮断を示す。Ｓｅｃのみ＝二次抗体のみ（ＧＡＨ／ＧＡＭ）。 （Ａ）Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６、Ｆ０２３７０１０１７、対照ナノボディ（ＩＲＲ０００８５；呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）結合性物質）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２；または（Ｂ）Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０、対照ナノボディ（ＩＲＲ０００８５）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２を使用した近接アッセイ（ベータ−ガラクトシダーゼ酵素断片補完アッセイ系）を示す。 （Ａ）Ｆ０２３７００７０６もしくは対照ナノボディ（ＩＲＲ０００４３；Ｃ末端 ＦＬＡＧ３−Ｈｉｓ６を有する３５ＧＳリンカーで連結された２つの抗リゾチームナノボディ）、（Ｂ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３、Ｆ０２３７００９６２もしくは対照ナノボディ（ＩＲＲ０００８５またはＩＲＲ０００８７；ＲＳＶ結合性物質）、（Ｃ）Ｆ０２３７００９２４ Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０もしくは対照ナノボディ（ＩＲＲ０００４３）、（Ｄ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７０１０１６、Ｆ０２３７０１０１７もしくは対照ナノボディ（ＩＲＲ０００４３）、または（Ｅ）Ｆ０２３７００７０６、Ｆ０２３７０１１９２（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６、Ｆ０２３７０１１９３（１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−ＨＩＳ６もしくは対照ナノボディ（ＩＲＲ０００８８；ＲＳＶ結合性物質）による、ＨＳＡ存在下でのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化（ＩＬ２プロモーターに作動可能に連結されたルシフェラーゼの発現）を示す。 （Ａ）ドナー９１、（Ｂ）ドナー９８５、（Ｃ）ドナー９０７、（Ｄ）ドナー９１、（Ｅ）ドナー９８５、（Ｆ）ドナー９０７、（Ｇ）ドナー９１（１０ｎＭ ＳＥＢを使用）、（Ｈ）ドナー９８５（１０ｎＭ ＳＥＢを使用）、（Ｉ）ドナー９０７（１０ｎＭ ＳＥＢを使用）、（Ｊ）ドナー９１（２５ｎＭ ＳＥＢを使用）、（Ｋ）ドナー９８５（２５ｎＭ ＳＥＢを使用）、（Ｌ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３、Ｆ０２３７００９６２もしくは対照ナノボディを使用したドナー９０７（２５ｎＭ ＳＥＢを使用）；またはＦ０２３７００９３１、Ｆ０２３７００９２４もしくは対照ナノボディを使用した（Ｍ）ドナー９１ （Ｎ）ドナー９８５ （Ｏ）ドナー９０７；またはＦ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０を使用した（Ｐ）ドナー９１、（Ｑ）ドナー９８５もしくは（Ｒ）ドナー９０７からのヒト末梢血単球の活性化（ＩＬ２産生）を示す。 （Ａ−Ｃ）様々な濃度のナノボディＦ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）もしくはＦ０２３７００９３３または対照抗体でのインターフェロン−ガンマ産生；（Ｄ−Ｆ）様々な濃度のナノボディＦ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０、Ｆ０２３７００９３１ Ｆ０２３７０１０１６もしくはＦ０２３７０１０１７または対照ナノボディでのインターフェロン−ガンマ産生を決定する、異なるドナーからのＣＤ４ Ｔ細胞および樹状細胞の混合リンパ球アッセイを示す。 （Ａ）Ｆ０２３７００６５６（１１Ｂ０９（Ｅ１Ｄ））、Ｆ０２３７００８４２または対照ＩｇＧ４；（Ｂ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２または対照ナノボディ（ＩＲＲ０００８５またはＩＲＲ０００８７；ＲＳＶ結合性物質）；（Ｃ）Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０または対照ナノボディ；（Ｄ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７０１０１６もしくはＦ０２３７０１０１７または対照ナノボディの存在下での、ＨＳＡ存在下でのヒトＬＡＧ３を発現する３Ａ９ Ｔ細胞の活性化アッセイを示す。 （Ａ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００８６２［これはＦ０２３７００８９２であるべき］もしくは対照ナノボディ、または（Ｂ）Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０、Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７０１０１６、Ｆ０２３７０１０１７、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２または対照ナノボディの存在下での、ヒトＬＡＧ３およびヒトＰＤ１を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞ならびにＲａｊｉ抗原提示細胞の活性化を示す。 様々な濃度の（Ａ）Ｆ０２３７００９３１（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９２４（ピキアまたはＣＨＯで発現させたもの）、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２もしくは対照ナノボディ；（Ｂ）Ｆ０２３７００９２４、Ｆ０２３７００９６９、Ｆ０２３７００９７０、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２もしくは対照ナノボディ；または（Ｃ）Ｆ０２３７００９３１、Ｆ０２３７０１０１６、Ｆ０２３７０１０１７、Ｆ０２３７００９３３もしくはＦ０２３７００９６２または対照ナノボディの存在下での、ヒトＰＤ１を発現するＪＹ細胞の存在下でのヒトＴ細胞クローンの活性化（インターフェロン−ガンマ産生）を示す。 本発明の配列を示す。 （Ａ）１２５秒時および（Ｂ）３６０秒時の健常ヒト対象血清；（Ｃ）１２５秒時および（Ｄ）３６０秒時のがん患者血清；または（Ｅ）黒色腫、（Ｆ）非小細胞がん（ＮＳＣＬＣ）、（Ｇ）頭頸部がん、（Ｈ）胃がんもしくは（Ｉ）結腸直腸がんを罹患している患者の血清による、Ｆ０２３７００９２４およびＦ０２３７００９３１および三価の対照ナノボディＴ０１３７００１１２（先在抗体の結合を低減させる変異を欠いているもの）への血清プレＡｂの反応性を示す。
本発明は、先在抗体（プレ抗体）のＩＳＶＤ内ネオエピトープへの反応性を遮断する変異を含むＩＳＶＤを提供する。ネオエピトープは、タンパク質が変異（例えばトランケート）したとき、またはそのフォールディングが変わったときに現れるタンパク質内のエピトープである。先在抗体は、ＩＳＶＤを受ける前の患者の体内に存在している抗体である。本発明のＩＳＶＤは、部分的に、Ｃ末端定常ドメインが除去されたラマ抗体に基づき；それゆえに、得られるＶＨＨのＣ末端中のネオエピトープをプレ抗体結合に曝露している。残基１１および８９の変異の組み合わせ（例えばＬ１１ＶおよびＩ８９ＬまたはＶ８９Ｌ）は驚くべきプレ抗体結合欠如を導くことが発見されている。残基１１２における変異もまたプレ抗体結合を著しく低減させることが示されている。Ｂｕｙｓｅ ＆ Ｂｏｕｔｔｏｎ（ＷＯ２０１５／１７３３２５）は、Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌ変異の組み合わせがＬ１１Ｖ変異単独またはＶ８９Ｌ変異単独と比べてプレ抗体結合の低減に著しい改良を与えることを示すデータを包含していた。例えば、Ｂｕｙｓｅ ＆ Ｂｏｕｔｔｏｎ、９７ページの表Ｈは、Ｖ８９Ｌ変異を単独で有するＩＳＶＤ（Ｃ末端伸長があるものまたはないもの）とＶ８９Ｌ変異をＬ１１Ｖ変異と組み合わせて有する同ＩＳＶＤ（やはり、Ｃ末端伸長があるものまたはないもの）との比較データを示した。また、２つの別々の実験中に生成されたにもかかわらず、Ｌ１１Ｖ／Ｖ８９Ｌの組み合わせについて表Ｈ中に示されたデータは、（同じＩＳＶＤ中の）Ｌ１１Ｖ変異単独について表Ｂ中に与えられたデータと比べて、Ｌ１１Ｖ／Ｖ８９Ｌの組み合わせにより得られるプレ抗体結合低減がＬ１１Ｖ変異単独についてのそれよりも大きいことを示した。ラマ抗体のスキャフォールド構造は非常に高度に保存されていることが知られていることから、１１位および８９位における変異の効果はあらゆるＩＳＶＤについて存在する可能性が高い。実際、その効果は図１９において、本発明の結合性物質Ｆ０２３７００９２４およびＦ０２３７００９３１を使用して実証され、これらは健常対象およびがんに罹患している対象において非常に低レベルのプレ抗体結合を呈することが示された。
本出願において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインにおけるアミノ酸残基／位置は、Ｋａｂａｔによるナンバリングを使用して指し示される。便宜上、図１は、本明細書中で具体的に言及されるアミノ酸位置のうちのいくつか、およびいくつかの代替的ナンバリング方式（例えばＡｈｏおよびＩＭＧＴ）によるそれらのナンバリングを載せた表を与える。この点は本明細書中でまたさらに論じられる。
ＣＤＲに関しては、当該技術分野で周知であるように、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義して説明するための複数の慣行があり、例えばＫａｂａｔ定義（配列変化性に基づくものであり、最も通例的に用いられる）およびＣｈｏｔｈｉａ定義（構造ループ領域の位置に基づくもの）などがある。例えばウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／への参照がなされる。本明細書および特許請求の範囲の目的のため、ＫａｂａｔによるＣＤＲも言及され得るとしても、ＣＤＲは最も好ましくはＡｂｍ定義（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づくもの）を基礎として定義され、その理由はこれはＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｉａ定義との間の最適な中間物であると考えられるからである。やはり、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／への参照がなされる。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８） Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ． ３２：１−７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７；Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ，Ｔａｉ Ｔｅ Ｗｕ，Ｃａｒｌ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｈａｒｏｌｄ Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋａｙ Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ． Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。本発明のある実施形態において、ＣＤＲ決定はＫａｂａｔに従い、例えばＶＨＨのＦＲ１は１−３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は３１−３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は３６−４９位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は５０−６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は６６−９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は９５−１０２位のアミノ酸残基を含み、およびＶＨＨのＦＲ４は１０３−１１３位のアミノ酸残基を含む。
本発明のある実施形態において、ＣＤＲは、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐｐ．３３−５１，２０１０）に従って決定される。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」とも呼ばれる）は、一般に、別の可変ドメインとの相互作用がない（例えば慣用的な四本鎖モノクローナル抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとの間に必要とされるＶＨ／ＶＬ相互作用がない）機能的抗原結合部位を形成することができる免疫グロブリン可変ドメイン（重鎖ドメインであっても軽鎖ドメインであってもよく、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメインまたはＶＬドメインを包含するもの）を指すために用いられる。ＩＳＶＤの例は当業者に明らかであり、例えばナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよび／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨを包含するもの）、ＩｇＮＡＲ、ドメイン、ＶＨドメインであるかまたはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂｓ（商標））およびＶＬドメインであるかまたはＶＬドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂｓ（商標））が挙げられる。重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメインまたはＶＨＨドメイン）に基づくおよび／またはこれに由来するＩＳＶＤが一般に好ましい。最も好ましくは、ＩＳＶＤはナノボディである。
用語「ナノボディ」は、一般にＷＯ０８／０２００７９またはＷＯ０９／１３８５１９中に定義されるとおりであり、それゆえに具体的態様において、一般に、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨもしくはラクダ化ＶＨ（例えばラクダ化ヒトＶＨ）または一般に配列最適化されたＶＨＨ（例えば化学的安定性および／または溶解性、公知のヒトフレームワーク領域との最大のオーバーラップならびに最大の発現のために最適化されたもの）を意味する。なお、用語ナノボディまたはナノボディ類はＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標であり、それゆえにナノボディ（登録商標）および／またはナノボディ類（登録商標）とも呼ばれる）。ＩＳＶＤの例は、１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）である。他のＩＳＶＤは本明細書中で表ＡおよびＣ中にも見られる。
多重特異性結合性物質（例えば多重特異性ＩＳＶＤ）は、例えば第一のＰＤ１またはＬＡＧ３結合部分（例えばＩＳＶＤまたはナノボディ）、および第一のＰＤ１またはＬＡＧ３結合部分のエピトープ以外のエピトープに（例えばＣＴＬＡ４、ＣＤ２７および／またはＢＴＬＡに）結合する１または複数の（例えば１、２、３、４、５個の）付加的な結合部分（例えばＩＳＶＤまたはナノボディ）を含む分子であり；例えばＰＤ１もしくはＬＡＧ３結合部分およびＣＴＬＡ４結合部分；ＰＤ１もしくはＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分；１つもしくは２つのＰＤ１結合部分および１つもしくは２つのＬＡＧ３結合部分およびヒト血清アルブミン結合部分；またはＰＤ１結合部分、ＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分を含む。多重特異性結合性物質は、例えばＦ０２３７００９３１またはＦ０２３７００８９９である。
結合部分または結合ドメインまたは結合ユニットは、抗原に結合する、例えばＩＳＶＤまたはナノボディのような分子である。結合部分または結合ドメインまたは結合ユニットは、例えば多価または多重特異性免疫グロブリンのようなより大きな分子の一部分であり得て、この分子は、１つより多くの部分、ドメインもしくはユニットを包含するおよび／または別の機能的要素、例えば半減期エクステンダー（ＨＬＥ）、標的化ユニットおよび／または例えば（ｓｕｃｈ ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような低分子を含む。
一価のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、単一の抗原結合ドメインを含む分子である。二価のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は、２つの抗原結合ドメインを含む（例えば二重特異性抗体を包含する慣用的な抗体）。多価のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は、１つより多くの抗原結合ドメインを含む。
単一特異性のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は単一の抗原に結合し；二重特異性のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は２つの異なる抗原に結合し、多重特異性のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は１つより多くの抗原に結合する。
二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は、単一特異性があるが、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する。多重パラトピック（ｍｕｌｔｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）のＰＤ１またはＬＡＧ３結合性物質は、同じ抗原に結合するが、抗原中の１つより多くのエピトープに結合する。
ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質もしくはＩＳＶＤ、ナノボディ、ＩＳＶＤベースの生物学的物質、ナノボディベースの生物学的物質または本明細書中で言及される任意の他のポリペプチドとの関係で（ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ）本明細書中で用いられる用語「半減期」は、一般に、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に記載されるように定義することができ、その中で言及されているように、ポリペプチドの血清濃度が、例えば天然のメカニズムによるそのポリペプチドの分解および／またはそのポリペプチドのクリアランスもしくは隔離のためにインビボで５０％低減するのにかかる時間をいう。本発明のポリペプチドのインビボ半減期は、それ自体公知の任意の方法で、例えば薬物動態学的分析などにより決定することができる。好適な技術は当業者に明らかであり、例えば一般にＷＯ０８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に記載されるとおりであり得る。ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中にも言及されているように、半減期は、例えばｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）のようなパラメーターを用いて表現することができる。なお、この点で、本明細書中で用いられる用語「半減期」は、とりわけ、ｔ１／２−ベータまたは終末相半減期（ここではｔ１／２−アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方が考慮されないことがある）をいう。例えば下の実験部並びに標準的なハンドブック、例えばＫｅｎｎｅｔｈ，Ａ ｅｔ ａｌ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）などを参照されたい。また、“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ，出版元Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，改訂２版（１９８２）も参照されたい。同様に、用語「半減期の増加」または「半減期増加」もまた（ａｓ ａｌｓｏ ａｓ）ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に定義されているとおりであり、とりわけ、ｔ１／２−アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方の増加を伴うまたは伴わない、ｔ１／２−ベータの増加をいう。
用語が本明細書中で具体的に定義されていない場合、それは当該技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者に明らかである。例えば標準的なハンドブック、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ．Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ ＩＩ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８５）；Ｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ．Ｅｄ．），Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（２００１）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｉｔｔ'ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０ｔｈ Ｅｄ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＵＫ（２００１）；およびＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ Ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００５）など並びに本明細書中で引用される一般的背景技術を参照されたい。
１または複数のナノボディを含有する多価の多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製の一般的説明のため、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，１０． ７３４６−７３５０，２００１；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４（２００１），２７７−３０２；並びに、例えばＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９９／２３２２１、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７への参照もなされる。
「単離された」ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞またはそれらが生産された細胞培養物からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。かかる生物学的分子としては、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の材料、例えば細胞デブリおよび増殖培地などが挙げられる。「単離された」ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、さらに、発現系の構成成分、例えば宿主細胞からのまたはその増殖培地の生物学的分子などを少なくとも部分的に含まないものであり得る。一般に、用語「単離された」は、かかる生物学的分子の完全な不存在を、または水、バッファーもしくは塩の不存在を、または抗体もしくは断片を包含する医薬製剤の構成成分を指すことを意図しない。
フレーズ「制御配列」は、特定の宿主生物中での作動可能に連結されたコーディング配列の発現のために必要なポリヌクレオチドをいう。原核生物に適した制御配列は、例えばプロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが知られている。
核酸またはポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドとの機能的関係に置かれたときに「作動可能に連結され」ている。例えばプレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係するタンパク質前駆体として発現するならばポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響するならばコーディング配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが転写を容易にするように位置するならばコーディング配列に作動可能に連結されている。常にではないが、一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接すること、分泌リーダーの場合は近接し、かつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しないならば、慣行的実務に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが用いられる。本発明は、１または複数の制御配列、例えばプロモーターなどに作動可能に連結されていてもよい、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
「ＰＤ１および／またはＬＡＧ３」結合性物質とは、
− ＰＤ１結合性物質；または
− ＬＡＧ３結合性物質；または
− ＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質の両方（すなわち、「ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質」）
を包含する結合性物質を指し、そして、場合により、例えばヒト血清アルブミンに結合する別の結合性物質を指してもよい。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１／ＬＡＧ結合性物質は、本明細書に示される
・１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−３５ＧＳ−１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａ；または
・１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−３５ＧＳ−１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−３５ＧＳ−１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａ
である。
本明細書中のＦ０２３７００９２４またはＦ０２３７００９３１を参照されたい。ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、ＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質を包含する。
本発明の範囲は、図１８（Ａ−Ｐ）に示される任意のＰＤ１結合性物質（またはかかるＰＤ１結合性物質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む任意のＰＤ１結合性物質）、図１８（Ａ−Ｐ）に示される任意のＬＡＧ３結合性物質（またはかかるＬＡＧ３結合性物質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む任意のＬＡＧ３結合性物質）または図１８（Ａ−Ｐ）に示される任意のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質もしくはそのＰＤ１結合部分および／またはＬＡＧ３結合部分のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む任意のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。図１８（Ａ−Ｐ）に示される結合性物質は、本発明のある実施形態において、その中にあるＣ末端エクステンダー（例えばＡ）、ＦＬＡＧおよび／またはＨＩＳタグ（例えばＨＨＨＨＨＨ（アミノ酸２９−３４または配列番号６８）；ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６９）；またはＡＡＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６８））を包含しない。任意のかかる結合性物質またはＣＤＲは、ある実施形態において、図１８（Ａ−Ｐ）に示されるもののバリアントであり得て、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の点変異（例えば保存的置換または欠失）を含む。
一般的に、基本的な抗体構造単位はテトラマーを含む。各々のテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖の対を包含し、各々の対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有す。各々の鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０個またはそれより多くのアミノ酸でできた可変領域を包含する。重鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定し得る。典型的に、ヒト軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。さらには、ヒト重鎖は典型的にミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２個またはそれより多くのアミノ酸でできた「Ｊ」領域につながれ、重鎖はまた約１０個より多くのアミノ酸でできた「Ｄ」領域も包含する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。
抗原結合断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｖ断片および一本鎖Ｆｖ分子が挙げられる。
「ＰＤ１結合性物質」または「ＰＤ１ ＩＳＶＤ」または「ＰＤ１ナノボディ」とは、それぞれＰＤ１に結合する結合性物質またはＩＳＶＤまたはナノボディを指す。同様の慣行は、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４または別の抗原に結合する分子に関して当てはめ得る。
次の性質は、ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２中で指し示される変異に関連する：
Ｅ１Ｄ：構成物Ｅ１の最初のアミノ酸におけるピログルタミン酸形成を防ぐ
Ｌ１１Ｖ：プレ抗体結合を減少させる
Ａ１４Ｐ：ヒト化
Ｗ５２ａＶ：Ｗ５２ａの酸化を防ぐ
Ｎ７３Ｐ：Ｎ７３脱アミド化を防ぐ
Ｎ７３Ｑ：Ｎ７３脱アミド化を防ぐ
Ｎ７３Ｓ：Ｎ７３脱アミド化を防ぐ
Ａ７４Ｓ：ヒト化
Ｋ８３Ｒ：ヒト化
Ｉ８９Ｌ：プレ抗体結合を減少させる
Ｗ１００ａＦ：Ｗ１００ａの酸化を防ぐ
またはＬＡＧ３結合性物質１１Ｂ０９で指し示される変異に関連する：
Ｌ１１Ｖ：プレ抗体結合を減少させる
Ａ１４Ｐ：ヒト化
Ｒ４１Ｐ：ヒト化
Ｎ４３Ｋ：ヒト化
Ａ６２Ｓ：ヒト化
Ａ７４Ｓ：ヒト化
Ｋ８３Ｒ：ヒト化
Ｖ８９Ｌ：プレ抗体結合を減少させる。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１はヒトＰＤ１である。本発明のある実施形態において、ヒトＰＤ１は、アミノ酸配列：
Figure 0006817302
（配列番号１３７）を含む。
本発明のある実施形態において、ＬＡＧ３はヒトＬＡＧ３である。本発明のある実施形態において、ヒトＬＡＧ３は、アミノ酸配列：
Figure 0006817302
（配列番号１３８）を含む。
ＰＤ１結合性物質
本発明は、改良されたＰＤ１結合性物質、例えば改良されたＰＤ１ ＩＳＶＤ、よりとりわけには改良されたＰＤ１ナノボディを提供する。本発明により提供される改良されたＰＤ１結合性物質は、本明細書中で「本発明のＰＤ１結合性物質」または「ＰＤ１結合性物質」とも呼ばれる。
本明細書中で論じられるとき、本発明の一価のＰＤ１結合性物質は、配列番号１または２のアミノ酸配列を包含するが、１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位または１１２位において（または本発明のＰＤ１結合性物質に関して本明細書に示される変異位置のいずれかにおいて）１または複数の変異を包含する。
本明細書中で論じられるとき、例えばＬＡＧ３を包含する多重特異性ＰＤ１結合性物質は、下で表Ａ−１およびＡ−２に示されるＰＤ１結合性物質の中にあるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＰＤ１結合部分を包含する（例えば１０２Ｃ１２またはリファレンスＡ中のもの）。場合により多重特異性結合性物質のＰＤ１結合部分は、配列番号１または２のアミノ酸を含むが、１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位または１１２位において１または複数の変異を包含するものであってもよい。
本発明は、改良されたＰＤ１結合性物質、例えば改良されたＰＤ１ ＩＳＶＤ、よりとりわけには改良されたＰＤ１ナノボディを提供する。本発明のＰＤ１結合性物質は、１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位において変異した配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであるポリペプチドを包含する。本発明により提供される改良されたＰＤ１結合性物質は、本明細書中で「本発明のＰＤ１結合性物質」または「ＰＤ１結合性物質」とも呼ばれる。これらの用語は、ＰＤ１に結合する任意の分子を包含し、本明細書に示されるＰＤ１に結合する分子のいずれかを包含する。例えば、この用語は、配列番号９−４０および５７よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を含むＩＳＶＤ、並びに、配列番号９−４０および５７よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を包含する任意の慣用的抗体またはその抗原結合断片；配列番号９−４０および５７よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を含み、ＰＤ１に結合し、また別の抗原、例えばＰＤ１の異なるエピトープ、ＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰにも結合する、例えばＰＤ１結合部分およびＣＴＬＡ４結合部分；ＰＤ１結合部分およびＢＴＬＡ結合部分；ＰＤ１結合部分およびＬＡＧ３結合部分；またはＰＤ１結合部分、ＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分を含む二重特異性免疫グロブリン（例えばＩＳＶＤ）のような多重特異性免疫グロブリンを包含する。多価ＰＤ１結合性物質は、１つより多くの抗原−結合ドメイン、例えば１つより多くのＩＳＶＤ（このうちの１または複数はＰＤ１に結合する）を含む。単一特異性ＰＤ１結合性物質は単一の抗原（ＰＤ１）に結合し；二重特異性ＰＤ１結合性物質は２つの異なる抗原（このうちの１つはＰＤ１である）に結合し、多重特異性ＰＤ結合性物質は１つより多くの抗原（このうちの１または複数はＰＤ１であり、このうちの１または複数は異なる抗原である）に結合する。例えば、本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質は、配列番号１０６−１２４から選択されるアミノ酸配列を含む。
よりとりわけ、本発明は、１０２Ｃ１２およびリファレンスＡのバリアントであって、いくらかの健常ヒト対象からの並びに患者からの血清中に存在し得る干渉因子（一般に「先在抗体」と呼ばれる）による結合が低減された、改良されたＰＤ１結合性物質を提供することを目的とする。ＷＯ１２／１７５７４１、ＷＯ２０１３／０２４０５９、および、例えばＨｏｌｌａｎｄらによるもの（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３，３３（７）：１１９２−２０３）、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）を参照されたい。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＰＤ１結合性物質は、好ましくは、１０２Ｃ１２中またはリファレンスＡ中に存在するものと同じＣＤＲの組み合わせ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有す。ＷＯ２００８／０７１４４７は、ＰＤ１に結合することができるナノボディおよびその使用を記載している。ＷＯ２００８／０７１４４７の配列番号３４８は１０２Ｃ１２と呼ばれるＰＤ−１特異的ナノボディを開示し、その配列は本明細書中に配列番号１として与えられる。また、ヒト化するＱ１０８Ｌ置換を有する１０２Ｃ１２のバリアント（本明細書中で「リファレンスＡ」とも呼ばれる）は本明細書中で参照化合物として用いられ、その配列は本明細書中に配列番号２として与えられる。本発明は、１０８位において変異、例えばＱ１０８Ｌを包含するＰＤ１結合性物質を包含する。
本発明は、下で表Ａ−２中に示される１０２Ｃ１２のバリアントであるＰＤ１結合性物質、およびかかる１０２Ｃ１２バリアントを含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。本発明の範囲は、下で表Ａ−２中に示される前記バリアントのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＰＤ１結合性物質、並びに下で表Ａ−２中に示される前記バリアントのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＰＤ１結合部分を含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。
表Ａ−１．ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２
Figure 0006817302
表Ａ−２ 配列最適化バリアント１０２Ｃ１２ ＰＤ１結合性物質（ＨＳＡ結合性物質と融合していてもよい）
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
＊ＰＤ１結合性物質ＣＤＲは下線および／または太字
本発明は、ＰＤ１結合性物質が上記表Ａ−１またはＡ−２に示されるＰＤ１結合性物質（例えば配列番号５７、９８、９９、１０３、１０４または１０５）中のＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つを含み、０、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、例えば保存的置換を含み、および／または表Ａ−１もしくはＡ−２に示されるＣＤＲ配列に対して１００、９９、９８、９７、９６もしくは９５％の配列同一性を含み、ここで、かかるＣＤＲを有するＰＤ１結合性物質がＰＤ１に結合する能力を保持する実施形態を包含する。本発明のある実施形態において、本発明のＰＤ１結合性物質の最初のアミノ酸はＥである。本発明のある実施形態において、本発明のＰＤ１結合性物質の最初のアミノ酸はＤである。かかるＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、本発明の一部である。
本発明は、配列番号５７、９８、９９、１０３、１０４もしくは１０５のアミノ酸配列、または８０％もしくはそれより多い（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の）アミノ酸配列同一性（すなわち、全アミノ酸配列を比べたもの）を含むアミノ酸配列を含む任意のＰＤ１結合性物質を包含し、ここでＰＤ１結合性物質はＰＤ１に結合する能力を保持しており、そしてＨＳＡ結合性物質を包含してもよい。かかるＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、本発明の一部である。
「１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）」と記載されるＰＤ１結合性物質は、１０２Ｃ１２（配列番号１）またはリファレンスＡ（配列番号２）の配列を有する結合性物質であり、しかしここで、その配列が変異Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３ＲおよびＩ８９Ｌを含む。この表記は、本明細書の全体を通じて、いくつかの異なる結合性物質に関して用いられる。例えば、「１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）」は、１１Ｂ０９のアミノ酸配列（配列番号６４）を含むＬＡＧ３結合性物質であり、しかしここで、この配列が変異Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｒ４１Ｐ、Ｎ４３Ｋ、Ａ６２Ｓ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３ＲおよびＶ８９Ｌを含む。
表Ａに示されるＰＤ１結合性物質の特定の残基についてのＫａｂａｔ残基番号は下の配列中に示される：
Figure 0006817302
（配列番号２）
１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ）の特定の残基についてのＫａｂａｔ残基番号は下の配列中に示される：
Figure 0006817302
（配列番号５７）。残基１はＥであってもよい。
変異は本明細書中で言及され得て、上に示されるようにそれらのＫａｂａｔ番号により指定される。
いくつかの好ましいが限定されない本発明のＰＤ１結合性物質は、１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ（任意選択）、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ）であり、配列番号９−４０、５７、９８、９９もしくは１０１−１０５に示されるアミノ酸配列を含み、または図２、図３または図１８（Ａ−Ｐ）中に収載される。配列番号２４から４０、１０１または１０２のＰＤ１結合性物質は、通常のＣ末端配列ＶＴＶＳＳ（配列番号５２、リファレンスＡ中に存在する）と比べて、Ｃ末端のアラニン伸長、すなわち、ＩＳＶＤ配列Ｃ末端（時に「１１４位」とも呼ばれる）においてアラニン残基を有する本発明のＰＤ１結合性物質の例である。このＣ末端のアラニン伸長は、ＩＳＶのＣ末端領域に位置する推定エピトープへのいわゆる「先在抗体」（ＩｇＧであると推定される）の結合を防ぐことができる。このエピトープは、他の残基のなかでも、Ｃ末端配列ＶＴＶＳＳ（配列番号５２）の表面に露出したアミノ酸残基並びに１４位におけるアミノ酸残基（ならびにアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば１１位、１３位および１５位）を包含するものと推定され、また８３位におけるアミノ酸残基（ならびにアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば８２位、８２ａ位、８２ｂ位および８４位）および／または１０８位におけるアミノ酸残基（ならびにアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば１０７位）を含み得る。
しかしながら、かかるＣ末端アラニン（または一般にＣ末端伸長）の存在はある範囲の対象（健常対象および医学的な症状または疾患を有する対象の両方）からの血清中に見出すことができる「先在抗体」の結合を大きく低減させる（またはいくつかの場合において、本質的に完全に防ぐ）ことができるが、何人かの対象からの血清（例えばいくつかの免疫疾患、例えばＳＬＥなどを有する患者からの血清など）は、ＩＳＶがかかるＣ末端アラニン（またはより一般にはかかるＣ末端伸長）を含有するときであってもＩＳＶのＣ末端領域に（かかる領域が曝露されたときに）結合することができる先在抗体を含有することがあることが見出されている。
したがって、本発明の１つの具体的目的は、本明細書中で「リファレンスＡ」と呼ばれるＰＤ１ナノボディの改良されたバリアントであって、いわゆる「先在抗体」、とりわけＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載された種類のもの（すなわち、Ｃ末端伸長の存在下であってもＩＳＶの露出したＣ末端領域に結合することができる先在抗体）による結合が低減された、ＰＤ１結合性物質を提供することである。
本発明は、配列番号１または２の配列と比べて次の変異：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ５２ａＶ
− ７３Ｑ、７３Ｐもしくは７３Ｓ
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｔもしくは８９Ｌ；
− １００ａＦ
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒおよび８９Ｌとの組み合わせ；
− １Ｄと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｑ ７３Ｓもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦとの組み合わせ；
− １Ｅと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒおよび１００ａＦ、および任意に１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ，７４Ｓ、８３Ｒ、および任意に１Ｄとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および任意に１Ｄとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および任意に１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含む、配列番号１または２の配列のバリアントであるアミノ酸配列を含むＰＤ１結合性物質を提供する。
とりわけ、本発明により提供されるＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、配列番号１または２のバリアントを含み、ここで、本発明のある実施形態において
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥおよびＤから選択され；
− １１位におけるアミノ酸残基は、ＬおよびＶから選択され；
− １４位におけるアミノ酸残基は、ＡおよびＰから選択され；
− ５２ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷおよびＶから選択され；
− ７３位におけるアミノ酸残基は、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＱから選択され；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、ＡまたはＳから選択され；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、ＫもしくはＲから選択され；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、Ｖ、ＩもしくはＬから選択され；
− １００ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷおよびＦから選択され；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫもしくはＱから選択され；および／または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫもしくはＱから選択され
例えば、ここでＰＤ１結合性物質は、次の変異：
（ｉ）１位は、ＤまたはＥである；
（ｉｉ）１１位は、Ｖである；
（ｉｉｉ）１４位は、Ｐである；
（ｉｖ）５２ａ位は、Ｖである；
（ｖ）７３位は、Ｐ、ＳまたはＱである；
（ｖｉ）７４位は、Ｓである；
（ｖｉｉ）８３位は、Ｒである；
（ｖｉｉｉ）８９位は、ＴまたはＬである；
（ｉｘ）１００ａ位は、Ｆである
のうちの１または複数を含み、
例えば、次の変異セット：
配列番号１または２のアミノ酸配列に対して、
ａ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、７４位はＳ、８３位はＲ；および８９位はＬ；
ｂ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、５２ａ位はＶ；７３位はＳ、ＰもしくはＱ；７４位はＳ、８３位はＲ；８９位はＬ；および１００ａ位はＦ；
ｃ．８９位はＬおよび１１位はＶ；
ｄ．８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱ；
ｅ．８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱ；
ｆ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、５２ａ位はＶ；７３位はＳ、ＰもしくはＱ；７４位はＳ、８３位はＲ；８９位はＬ；１００ａ位はＦおよび１１０位はＫもしくはＱ；
ｇ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、５２ａ位はＶ；７３位はＳ、ＰもしくはＱ；７４位はＳ、８３位はＲ；８９位はＬ；１００ａ位はＦおよび１１２位はＫもしくはＱ；
ｈ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱ；
ｉ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱ；
ｊ．１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱ；および／または
ｋ．１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱ
を含む。
特定の実施形態において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、配列番号１または配列番号２のバリアントであるアミノ酸配列を含み、ここで８９位はＴもしくはＬであり、または１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、７４位はＳ、８３位はＲおよび８９位はＬであり、または１１位はＶおよび８９位はＬであり（場合により１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）、これもまた本発明の一部である。本発明は、１１位がＶおよび８９位がＬであって、場合により１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列を包含する。
言及されているように、本明細書中に記載される本発明により提供されるＰＤ１結合性物質は、ＰＤ−１に結合することができる（とりわけ特異的に結合することができる）。本発明のある実施形態において、それらはＰＤ１に結合してＰＤ１とＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との間の結合を阻害することができる。例えば、本発明のある実施形態において、本発明のＰＤ１結合性物質はＰＤ１に結合し、（例えばＰＤ１を介した増殖およびサイトカイン産生阻害からＴ細胞を解放することにより）Ｔ細胞介在性免疫応答のＰＤ−１経路を介した阻害からＴ細胞を解放する。
表Ｂは、本発明のＰＤ１結合性物質中で１１位、８９位、１１０位および１１２位に存在することができるアミノ酸残基についての、いくつかの限定されない可能な組み合わせを収載する。
表Ｂ：配列番号１または２のＰＤ１結合性物質バリアント中のアミノ酸１１位、８９位、１１０位および１１２位における変異の可能な組み合わせ
Figure 0006817302
これらの位置は、例えばＥ１Ｄ、Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓおよび／またはＫ８３Ｒ（および／または他のもの）のような変異と組み合わせ得る。
本発明により提供されるＰＤ１結合性物質は、さらに本明細書中の説明、例および図において記載されるとおりであり、すなわち、これらは本明細書中に記載されるとおりであるＣＤＲを有し、本明細書中に開示されるとおりである配列番号１または２の配列と全体的な配列同一度（本明細書中に定義されるもの）を有し、および／またはこれらの参照配列（のうちの１つ）との限定的な数の「アミノ酸の相違」（本明細書中に記載されるもの）を持ち得る。
配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位において１または複数の変異を含む本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくは、次のＣＤＲ（Ｋａｂａｔ慣行による）：
− アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）、
を包含し、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は、場合により１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の置換、例えば、保存的置換を含んでもよい。
あるいは、ＣＤＲがＡｂｍ慣行に従って与えられるとき、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくは、次のＣＤＲ：
− アミノ酸配列ＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７、ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号８、これは配列番号５と同じである；ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を含み、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は、場合により１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の置換、例えば、保存的置換を含んでもよい。
本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、上に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に加えて、好ましくはまた：
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１または２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）；および／または
− 配列番号１または２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在せず；存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されず、および関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は考慮されない）を有す。
次の参考文献は、配列解析のためにしばしば用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００５） ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２（２０）：５１０１−５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ． １７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ． １０：６７−７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８） ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３． Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８） ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ． ２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７） ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
本発明により提供される本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の様々な態様および好ましい態様に関して、配列番号１または２に関する全体的な配列同一度および／または本発明のかかる結合性物質中に（すなわち配列番号１または２の配列と比べて）存在し得る「アミノ酸の相違」の数および種類に関していうと、特に述べられないかぎり、
（ｉ）本発明のアミノ酸配列が、配列番号１もしくは２の配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有するといえるとき、
および／または、
（ｉｉ）本発明のアミノ酸配列が、配列番号１もしくは２の配列との７未満、好ましくは５未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（やはり、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されず、および関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は考慮されない）を有するといえるとき、
これはまた、（関係する具体的態様により必要とされる）１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異ならびに存在し得る任意のＣ末端伸長以外に配列番号１または２の配列とアミノ酸の相違がない配列を包含する。
それゆえに、本発明の１つの具体的態様において、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むが１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位において少なくとも１つのアミノ酸変異を有する本発明のＰＤ１結合性物質は、配列番号１もしくは２との１００％の配列同一性（そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含し、Ｗ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいが、本明細書中に開示される１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異（類）もしくは変異の組み合わせ、および／または、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）を持ち得て、および／または配列番号１もしくは２とのアミノ酸の相違（すなわち、本明細書中に開示される１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異（類）または変異の組み合わせならびに存在し得る任意のＣ末端伸長以外のもの）を持たないものであり得る。
何らかのアミノ酸の相違が（すなわち、任意のＣ末端伸長ならびに関係する本発明の具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異のほかに）存在するとき、これらのアミノ酸の相違はＣＤＲ中および／またはフレームワーク領域中に存在し得るが、それらは好ましくはフレームワーク領域（Ａｂｍ慣行により定義されるもの、すなわちＡｂｍ慣行に従って定義されるＣＤＲ中ではない）中にのみ、すなわち、本発明のＰＤ１結合性物質が配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５中に存在するものと同じＣＤＲ（Ａｂｍ慣行に従って定義される）を有するように、存在する。
また、本発明の任意の態様による本発明のＰＤ１結合性物質が、配列番号１または２の配列と１または複数のアミノ酸の相違を（関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異のほかに）有するとき、（すなわち、配列番号１または２の配列と比べて）存在し得るかかる変異／アミノ酸の相違のいくつかの具体的であるが限定されない例は、例えば「ヒト化」置換であり；例えばＷＯ０９／１３８５１９（またはＷＯ０９／１３８５１９中で引用される従来技術中に）およびＷＯ０８／０２００７９（またはＷＯ０８／０２００７９中で引用される従来技術中に）、並びにＷＯ０８／０２００７９からの表Ａ−３からＡ−８（これは可能なヒト化置換を示すリストである）への参照がなされる。
また、本発明のＰＤ−１結合性物質がそれらが存在するポリペプチドのＮ末端部に存在するおよび／またはこれを形成するとき、それらは好ましくは１位にＤ（すなわち、リファレンスＡと比べたＥ１Ｄ変異）を含有する。かかるＮ末端ＰＤ−１結合性物質の好ましいが限定されない例は、配列番号２４または５７として与えられる。したがって、さらなる態様において、本発明は、そのＮ末端にＰＤ−１結合性物質（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）を有するポリペプチド（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）に関し、ここで前記ＰＤ−１結合性物質は１位にＤを有し、例えば配列番号２４、２５、５７または１０１−１０５である。
同様に、本発明のＰＤ−１結合性物質が一価の型で用いられるとき、これは、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）および１位におけるＤの両方を有す。かかる一価のＰＤ−１結合性物質についての好ましいが限定されない例は、配列番号４０として与えられる。したがって、さらなる態様において、本発明は、１位におけるＤおよびＣ末端伸長Ｘ（ｎ）（これは好ましくは単一のＡｌａ残基である）を有する本発明の一価のＰＤ−１結合性物質（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）に関する。１つの具体的態様において、前記一価のＰＤ−１結合性物質は、配列番号４０、１０１または１０２である。
好ましいが限定されない例を使用すると、配列番号２３、２４、３９、４０および５７は、配列番号１または２とのさらなるアミノ酸の相違、例えばＡ１４Ｐ、Ａ７４Ｓおよび／またはＫ８３Ｒなどを有する本発明のＰＤ−１結合性物質の例である（加えて、前の段落中で指し示すように、配列番号２４および４０および５７はＥ１Ｄ変異も有す）。それゆえに、ある具体的態様において、本発明は、少なくとも任意にＥ１Ｄ変異、Ａ１４Ｐ変異、Ａ７４Ｓ変異、Ｋ８３Ｒ変異および／またはＩ８９Ｌ変異の好適な組み合わせを、好ましくはこれらの変異のうちのいずれか２つの好適な組み合わせを、例えばこれらの変異の全てを有す、本発明のＰＤ−１結合性物質（すなわち、本明細書中に記載される１１位、８９位、１１０位および／または１１２位における変異を有すもの、これもまたさらに本明細書中に記載されるとおりである）に関する。
本発明のＰＤ１結合性物質は、それらが一価の型で用いられるとき、および／またはそれらが、それらが存在するポリペプチドのＣ末端に存在するおよび／またはこれを形成するとき（またはそうでなければ、それらがかかるポリペプチド中に、ＩＳＶＤのＣ末端が定常ドメイン（例えばＣＨ１ドメイン）と会合していないもしくは連結されていないことを一般に意味する「露出した」Ｃ末端を有するとき；（ＷＯ１２／１７５７４１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／６０６４３（ＷＯ２０１５１７３３２５）を参照されたい）、これはまた、好ましくは式（Ｘ）ｎのＣ末端伸長を有し、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、天然に存在するアミノ酸残基から独立して選ばれ（だが、好ましい１つの態様によると、これは何らシステイン残基を含まない）、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である。
かかるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）のいくつかの好ましいが限定されない例によると、Ｘおよびｎは、次のもの：
（ａ）ｎ＝１およびＸ＝Ａｌａ；
（ｂ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ａｌａ；
（ｃ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ａｌａ；
（ｄ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｅ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｆ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｇ）ｎ＝１およびＸ＝Ｇｌｙ；
（ｈ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ｇｌｙ；
（ｉ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ｇｌｙ；
（ｊ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｋ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｌ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｍ）ｎ＝２および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｎ）ｎ＝３および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｏ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；または
（ｐ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）
であることができ、態様（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｍ）および（ｎ）がとりわけ好ましく、ｎ＝１または２である態様が好ましく、ｎ＝１である態様がとりわけ好ましい。
なお、好ましくは、本発明のＰＤ１結合性物質中に存在する任意のＣ末端伸長は、（遊離の）システイン残基を含有しない（そのシステイン残基がさらなる機能付与、例えばＰＥＧ化のために用いられるまたは意図されるものでないかぎり）。
有用なＣ末端伸長のいくつかの具体的だが限定されない例は、次のアミノ酸配列：Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
本発明のＰＤ１結合性物質が１１０位または１１２位において変異を含有するとき（場合により本明細書中に記載される１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位および／または１００ａ位における変異と組み合わせてもよい）、フレームワーク４（１０９位から開始する）のＣ末端アミノ酸残基は、本発明のある実施形態において、配列番号１、２、９−４０、５７、１００、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７に示されるものであることができ、ここで５つのＣ末端残基は次のように置換することができる：
（ｉ）Ｃ末端伸長が存在しない場合：ＶＴＶＫＳ（配列番号４２）、ＶＴＶＱＳ（配列番号４３）、ＶＫＶＳＳ（配列番号４４）もしくはＶＱＶＳＳ（配列番号４５）；または
（ｉｉ）Ｃ末端伸長が存在する場合：ＶＴＶＫＳＸ（ｎ）（配列番号４６）、ＶＴＶＱＳＸ（ｎ）（配列番号４７）、ＶＫＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号４８）もしくはＶＱＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号４９）、例えばＶＴＶＫＳＡ（配列番号５０）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号５１）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号５２）もしくはＶＱＶＳＳＡ（配列番号５３）。
本発明のＰＤ１結合性物質が１１０位または１１２位において変異を含有する、あるいは含有しない（が、本明細書中に記載される１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位および／または１００ａ位における変異のみを含有する）とき、フレームワーク４（１０９位から開始する）のＣ末端アミノ酸残基は、本発明のある実施形態において、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５に示されるものであることができ、ここで５つのＣ末端残基は次のように置換することができる：
（ｉ）Ｃ末端伸長が存在しないとき：ＶＴＶＳＳ（配列番号５４）（配列番号１または２の配列におけるもののように）；または
（ｉｉ）Ｃ末端伸長が存在するとき：ＶＴＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号５５）、例えばＶＴＶＳＳＡ（配列番号５６）。これらのＣ末端配列において、Ｘおよびｎは、Ｃ末端伸長について本明細書中に定義されているとおりである。
本発明のＰＤ１結合性物質のいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５中に与えられ、これらの配列の各々は本発明のさらなる態様を形成する。これらのうち、配列番号９−２４、５７、９８、９９、１０３、１０４および１０５のＰＤ１結合性物質はＣ末端伸長を持たず、配列番号２５−４０、１０１および１０２のＰＤ１結合性物質はＣ末端アラニン（これは本明細書中に記載されるＣ末端伸長の好ましいが限定されない例である）を含有する。
本発明のＰＤ１結合性物質の例は、配列番号２３、２４、３９、４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５に示されるアミノ酸配列を含む。
それゆえに、本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、
− アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を含み、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで、Ｗ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいそのＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（そして、好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり；
ここで、本発明のある実施形態において
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥまたはＤであり；
− １１位におけるアミノ酸残基は、ＬまたはＶであり；
− １４位におけるアミノ酸残基は、ＡまたはＰであり；
− ５２ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷまたはＶであり；
− ７３位におけるアミノ酸残基は、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＱであり；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、ＡまたはＳであり；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、ＫまたはＲであり；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＬであり；
− １００ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷまたはＦであり；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫまたはＱであり；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫまたはＱであり、
例えば、ここでＰＤ１結合性物質は、次の変異：
（ｉ）１位は、ＥまたはＤである；
（ｉｉ）１１位は、Ｖである；
（ｉｉｉ）１４位は、Ｐである；
（ｉｖ）５２ａ位は、Ｖである；
（ｖ）７３位は、Ｓ、ＰまたはＱである；
（ｖｉ）７４位は、Ｓである；
（ｖｉｉ）８３位は、Ｒである；
（ｖｉｉｉ）８９位は、Ｌである；
（ｉｘ）１００ａ位は、Ｆである
のうちの１または複数を含み、
例えば、次の変異セット：
ａ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、７４位はＳ、８３位はＲおよび８９位はＬである；
ｂ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、５２ａ位はＶ；７３位はＳ、ＰもしくはＱ；７４位はＳ、８３位はＲ、８９位はＬおよび１００ａ位はＦである；
ｃ．１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、７４位はＳ、８３位はＲおよび８９位はＬである；
ｄ．８９位はＬおよび１１位はＶである；
ｅ．８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｆ．８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｇ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｈ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｉ．１１０Ｋもしくは１１０Ｑと１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および任意に１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；もしくは１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび任意に１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
ｊ．１１２Ｋもしくは１１２Ｑと１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および任意に１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；もしくは１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび任意に１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
ｋ．１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；または
ｌ．１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである
を含む。
さらなる態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）であって、
− アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を有し、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長並びに場合によりＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいそのＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここでＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、本発明のある実施形態において、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２のアミノ酸配列と比べた変異）：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ５２ａＶ；
− ７３Ｑ、７３Ｐもしくは７３Ｓ；
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｔもしくは８９Ｌ；または
− １００ａＦ
のうちの１または複数を含み、
例えば、次の変異セット：
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１００ａＦとの組み合わせ；
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒおよび／もしくは８９Ｌとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒおよび１Ｄおよび１Ｅとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１００ａＦおよび１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１００ａＦおよび１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
を含む。
言及されているように、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が一価の型で用いられるとき、および／またはポリペプチド（本明細書中に定義されるもの）のＣ末端に存在するとき、ＰＤ１結合性物質は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端伸長は本発明のＰＤ１結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。
本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）についてのいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４および１０５中に与えられ、これらのアミノ酸配列の各々は個々で本発明のさらなる態様を形成する。
言及されているように、本発明は、８９位がＴであり；または１位がＥもしくはＤ、１１位がＶ、１４位がＰ、５２ａ位がＶ、７３位がＰ、ＳもしくはＱ、７４位がＳ、８３位がＲ、８９位がＬおよび／もしくは１００ａ位がＦであり；または１１位がＶおよび８９位がＬである（場合により１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）配列番号１または２のアミノ酸配列を含むＰＤ１結合性物質を包含する。本発明のある実施形態においては、１１位がＶおよび８９位がＬであって、１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列である。
それゆえに、１つの好ましい態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を有し、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいそのＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで、本発明のある実施形態において、
− １位におけるアミノ酸は、ＥまたはＤであり；
− １１位におけるアミノ酸は、ＬまたはＶであり；
− １４位におけるアミノ酸は、ＡまたはＰであり；
− ５２ａ位におけるアミノ酸は、ＷまたはＶであり；
− ７３位におけるアミノ酸は、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＱであり；
− ７４位におけるアミノ酸は、ＡまたはＳであり；
− ８３位におけるアミノ酸は、ＫまたはＲであり；
− ８９位におけるアミノ酸は、Ｉ、ＴまたはＬであり；
− １００ａ位におけるアミノ酸は、ＷまたはＦであり；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫまたはＱであり（好ましくはＴであり）；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫまたはＱである（好ましくはＳである）。
別の好ましい態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を有し、そして
− 配列番号１または２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいそのＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで次の：
− １位におけるアミノ酸は、ＥもしくはＤである；
− １１位におけるアミノ酸は、ＬもしくはＶである；
− １４位におけるアミノ酸は、ＡもしくはＰである；
− ５２ａ位におけるアミノ酸は、ＷもしくはＶである；
− ７３位におけるアミノ酸は、Ｓ、Ｐ、ＮもしくはＱである；
− ７４位におけるアミノ酸は、ＡもしくはＳである；
− ８３位におけるアミノ酸は、ＫもしくはＲである；
− ８９位におけるアミノ酸は、Ｉ、ＴもしくはＬである；
− １００ａ位におけるアミノ酸は、ＷもしくはＦである；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫもしくはＱである（好ましくはＴである）；または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫもしくはＱである（好ましくはＳである）
のうちの１または複数が当てはまる。
１つの具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１Ｖと８９Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１００ａＦ、および任意に１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、１Ｄもしくは１Ｅ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１００ａＦとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、および／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅ、との組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１Ｄとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１Ｅとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１４Ｐとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、５２ａＶとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、７４Ｓとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８３Ｒとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１００ａＦとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８９Ｌ；または
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１４Ｐとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、５２ａＶとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、７４Ｓとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、８３Ｒとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１００ａＦとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび／もしくは１Ｄもしくは１Ｅとの組み合わせ；または
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌ
のうちの１または複数を含み、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、８９位にＴを含み、配列番号９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１１位にＶおよび８９位にＬを含み、配列番号９−４０、５７、１００、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＫａｂａｔによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
言及されているように、上の態様による本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくはさらに、Ａ１４Ｐ変異、Ａ７４Ｓ変異および／またはＫ８３Ｒ変異の好適な組み合わせを、好ましくはこれらの変異のうちのいずれか２つの好適な組み合わせを、例えばこれらの変異のうちの３つ全て（例えばＥ１Ｄ（任意）、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｗ５２ａＶ、Ｎ７３ＳまたはＮ７３ＱまたはＮ７３Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９ＬおよびＷ１００ａＦ）を含有するようなものである。ＬＡＧ３またはＨＳＡ結合性物質が本発明のＰＤ１結合性物質のＮ末端に存在するとき、Ｎ末端結合部分は、好ましくはＥ１Ｄ変異を有す。
別の態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７、ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を有し、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで、本発明のある実施形態において、
− １位におけるアミノ酸は、ＥまたはＤであり；
− １１位におけるアミノ酸は、ＬまたはＶであり；
− １４位におけるアミノ酸は、ＡまたはＰであり；
− ５２ａ位におけるアミノ酸は、ＷまたはＶであり；
− ７３位におけるアミノ酸は、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＱであり；
− ７４位におけるアミノ酸は、ＡまたはＳであり；
− ８３位におけるアミノ酸は、ＫまたはＲであり；
− ８９位におけるアミノ酸は、Ｖ、Ｉ、ＴまたはＬであり；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｔであり；
− １００ａ位におけるアミノ酸は、ＷおよびＦであり；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫまたはＱであり（好ましくはＴであり）；そして
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫまたはＱであり（好ましくはＳであり）、
例えば、本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質は、次の変異：
（ｉ）１位はＤまたはＥである；
（ｉｉ）１１位はＶである；
（ｉｉｉ）１４位はＰである；
（ｉｖ）５２ａ位はＶである；
（ｖ）７３位はＱ、ＰまたはＳである；
（ｖｉ）７４位はＳである；
（ｖｉｉ）８３位はＲである；
（ｖｉｉｉ）８９位はＬまたはＴである；
（ｉｘ）１００ａ位はＦである
のうちの１または複数を含み、
例えば、次の変異セット：
ａ．１１位はＶ；１４位はＰ；５２ａ位はＶ；７３位はＰ、ＳもしくはＱ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１００ａ位はＦであり；１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｂ．１１位はＶ；１４位はＰ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｃ．８９位はＬおよび１１位はＶである；
ｄ．８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｅ．８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｆ．１１位はＶ；１４位はＰ；５２ａ位はＶ；７３位はＰ、ＳもしくはＱ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１００ａ位はＦ；１１０位はＫもしくはＱであり、１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｇ．１１位はＶ；１４位はＰ；５２ａ位はＶ；７３位はＳ、ＰもしくはＱ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１００ａ位はＦ；１１２位はＫもしくはＱであり、１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｈ．１１位はＶ；１４位はＰ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１１０位はＫもしくはＱであり、１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｉ．１１位はＶ；１４位はＰ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；１１２位はＫもしくはＱであり、１位はＥもしくはＤであってもよい；
ｊ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｋ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｌ．１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；または
ｍ．１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである
を含む。
さらなる態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７、ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を有し、そして
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで免疫グロブリン単一可変ドメインは、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または２のアミノ酸配列と比べた変異）：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ５２ａＶ；
− ７３Ｑ、７３Ｓもしくは７３Ｐ；
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｌもしくは８９Ｔ；または
− １００ａＦ
のうちの１または複数を含み、
例えば、次の変異セット：
− ８９Ｔもしくは８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦもしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｔもしくは８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、もしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｌと１１Ｖ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑもしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑもしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑもしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑもしくは１Ｅもしくは１Ｄ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；または
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑ
を含む。
言及されているように、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が一価の型で用いられるとき、および／またはＰＤ１に結合する部分がポリペプチド（本明細書中に定義されるもの）のＣ末端に存在する場合、ＰＤ１結合部分は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端伸長は本発明のＰＤ１結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。
本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）についてのいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号９から４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５中に与えられ、これらのアミノ酸配列の各々は個々で本発明のさらなる態様を形成する。
言及されているように、本発明において、８９位がＴであり；または１位がＥもしくはＤ、１１位がＶ、１４位がＰ、５２ａ位がＶ、７３位がＰ、ＳもしくはＱ、７４位がＳ、８３位がＲ、８９位がＬおよび／または１００ａ位がＦであり；または１１位がＶおよび８９位がＬである（場合により１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）アミノ酸配列は、本発明の一部である。本発明のある実施形態においては、１１位がＶおよび８９位がＬであって、場合により１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列である。
それゆえに、１つの好ましい態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７、ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を有し、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）；
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで、本発明のある実施形態において、
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥまたはＤであり；
− １１位におけるアミノ酸残基は、ＬまたはＶであり；
− １４位におけるアミノ酸残基は、ＡまたはＰであり；
− ５２ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷまたはＶであり；
− ７３位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、Ｐ、ＮまたはＱであり；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、ＡまたはＳであり；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、ＫまたはＲであり；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＬまたはＩであり；
− １００ａ位におけるアミノ酸残基は、ＷまたはＦであり；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫまたはＱであり（好ましくはＴである）；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫまたはＱである（好ましくはＳにおいて）。
別の好ましい態様において、本発明は、ＰＤ１結合性物質（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７、ここでＸはＷまたはＶである）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を有し、そしてまた
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば１００％）の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長並びにＷ５２ａＶおよび／またはＷ１００ａＦ変異を含んでもよいＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長並びに関係する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）；
および／または
− 配列番号１もしくは２のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位における本明細書中に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有し、そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、
前記ＰＤ１結合性物質に関し、
ここで、例えば、次のもの：
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥもしくはＤである；
− １１位におけるアミノ酸残基は、Ｖである；
− １４位におけるアミノ酸残基は、Ｐである；
− ５２ａ位におけるアミノ酸残基は、Ｖである；
− ７３位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＰもしくはＱである；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、Ｓである；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、Ｒである；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｌである；
− １００ａ位におけるアミノ酸残基は、Ｆである；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、Ｔ、ＫもしくはＱである；または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、Ｓ、ＫもしくはＱである
のうちの１または複数が当てはまる。
１つの具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１Ｖと８９Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１００ａＦ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１つを含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１００ａＦ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１つを含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１Ｄとの組み合わせ；または
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１Ｅとの組み合わせ
のうちの１つを含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１または２の配列と比べた変異）：
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、５２ａＶ、７３Ｓもしくは７３Ｑもしくは７３Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１００ａＦ、および１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；または
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖ、１４Ｐ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、８９位にＴまたはＬを含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
別の態様において、本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１１位にＶおよび８９位にＬを含み、配列番号１、２、９−４０、５７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５の配列（例えばＡｂｍによる）中に存在するＣＤＲと同じＣＤＲを有し、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１または２のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を有す。
言及されているように、上の態様による本発明のＰＤ−１結合性物質は、好ましくはさらに、Ｅ１Ｄ変異、Ｌ１１Ｖ変異、Ａ１４Ｐ変異、Ｗ５２ａＶ変異、Ｎ７３ＳもしくはＮ７３ＱもしくはＮ７３Ｐ変異、Ａ７４Ｓ変異、Ｋ８３Ｒ変異、Ｉ８９Ｌ変異および／またはＷ１００ａＦ変異の好適な組み合わせを、好ましくはこれらの変異のうちのいずれか２つの好適な組み合わせを、例えばこれらの変異のうちの全てなどを含有するようなものである。ＰＤ−１結合性物質が一価であるとき、またはそのＰＤ１結合部分がポリペプチドのＮ末端に存在する場合、これは好ましくはＥ１Ｄ変異も有す。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明は、次のアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５のうちの１つから選ばれるアミノ酸配列を含むか、または本質的にこれからなる免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
別の具体的であるが限定されない態様において、本発明は、次のアミノ酸配列：配列番号２３、配列番号２４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５のうちの１つから選ばれるアミノ酸配列である、または本質的にこれからなる、免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
また、本明細書中で既に指示しているように、ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ Ｊｕｎ ２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文中でラクダ科動物からのＶＨＨドメインに適用されたように、または本明細書中で言及されるように、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）により与えられるＶＨについての一般的ナンバリングに従ってナンバリングされる。なお、ＶＨドメインについておよびＶＨＨドメインについて当該技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変わり得て、Ｋａｂａｔナンバリングにより指し示されるアミノ酸の総数に対応しないことがある（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングによる１または複数の位置は実際の配列中では占められていないこともあり、または実際の配列はＫａｂａｔナンバリングにより可能とされる数よりも多くのアミノ酸残基を含有することもある）。これは、一般に、Ｋａｂａｔによるナンバリングは実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングと対応することもしないこともあり得ることを意味する。一般に、しかしながら、Ｋａｂａｔのナンバリングによると、ＣＤＲ中のアミノ酸残基の数にかかわらず、Ｋａｂａｔナンバリングによる１位はＦＲ１の開始位置に相当し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔナンバリングによる３６位はＦＲ２の開始位置に相当し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔナンバリングによる６６位はＦＲ３の開始位置に相当し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔナンバリングによる１０３位はＦＲ４の開始位置に相当し、逆もまた同様である］。
ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングする代替的な方法は、ラクダ科動物からのＶＨＨドメインおよびナノボディと同様に適用することができる方法であり、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３（１９８９））により記載される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」およびいわゆる「接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）」である。しかしながら、本明細書、態様および図においては、特に指示がないかぎり、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによりＶＨＨドメインに適用されたようにＫａｂａｔによるナンバリングに従う。
本発明のこれらおよび他の態様、実施形態、利点、用途および使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載される少なくとも１つの（例えば１つ、２つまたは３つ）ＰＤ１結合部分を含むまたは本質的にこれからなるポリペプチドまたは他の化学物質に関する。
本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１または複数の他のアミノ酸配列、化学物質または部分と融合させることができる。これらの他のアミノ酸配列、化学物質または部分は、得られる本発明のＰＤ１結合性物質に１もしくは複数の所望の性質を付与することで、および／または得られる本発明のＰＤ１結合性物質の性質を所望のように変えることで、例えば、得られる本発明のＰＤ１結合性物質に、所望の生物学的および／もしくは治療活性を提供すること（例えば、得られるポリペプチドにＰＤ１およびその他の治療関連標的、例えばＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡまたはＣＤ２７に関して「二重特異性」になるように、得られる本発明のＰＤ１結合性物質に、アフィニティーおよび好ましくは別の治療関連標的に対する効力を提供すること）、所望の半減期を与えることおよび／もしくはそうでなければ薬物動態学的および／もしくは薬力学的性質を改変もしくは改良すること、ＰＤ１結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官（がん細胞およびがん組織を包含する）に標的化すること、細胞傷害効果を与えること、および／または検出可能なタグもしくは標識として働くことができる。かかる他のアミノ酸配列、化学物質または部分のいくつかの限定されない例は以下である：
− １もしくは複数の好適なリンカー（例えば９ＧＳ、１５ＧＳまたは３５ＧＳリンカー（９、１５、２０または３５個のＧおよびＳのアミノ酸の任意の組み合わせ、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（９ＧＳリンカー；配列番号１２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（２０ＧＳリンカー；配列番号１００）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（３５ＧＳリンカー；配列番号５８））、または（ＧＧＧＳ）ｎであって、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であるもの）；および／または
− ＰＤ１以外の治療関連標的に対する１もしくは複数の結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット（すなわち、ＰＤ１および他の治療関連標的、例えばＰＤ１の異なるエピトープ、ＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰの両方について二重特異性である本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を提供するためのもの）；および／または
− 半減期の増加を与える１もしくは複数の結合ドメインまたは結合ユニット（例えば、血清タンパク質、例えば血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して結合することができる結合ドメインまたは結合ユニット）、例えばＡＬＢ１１００２；および／または
− ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を所望の細胞、組織もしくは器官（例えばがん細胞）に標的化する１もしくは複数の結合ドメインもしくは結合ユニット；および／または
− ＰＤ１に対する特異性の向上を提供する１もしくは複数の結合ドメインもしくは結合ユニット（通常、これらはＰＤ１に結合することが可能だが、一般にそれら自体は本質的にＰＤ１に対して機能的ではない）；および／または
− ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が所望の細胞内に内部移行することを可能にする結合ドメイン、結合ユニットもしくは他の化学物質（例えばＷＯ０５／０４４８５８中に記載される内部移行性の抗ＥＧＦＲナノボディ）；および／または
− 半減期を改良する部分、例えば好適なポリエチレングリコール基（すなわち、ＰＥＧ化）、もしくは半減期の増加を与えるアミノ酸配列、例えばヒト血清アルブミン、もしくは好適なその断片（すなわち、アルブミン融合物）、もしくは例えばＷＯ２００８／０６８２８０中に記載される血清アルブミン結合ペプチド；および／または
− ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）、例えば細胞傷害性ペイロード；および／または
− 検出可能な標識もしくはタグ、例えば放射性標識もしくは蛍光標識；および／または
− ＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の固定化、検出および／もしくは精製に役立つことができるタグ、例えばＨＩＳ（例えばＨＨＨＨＨＨ；配列番号９３またはＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ；配列番号９４）またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号９５））（例えばＦＬＡＧ３）；および／または
− 機能化することができるタグ、例えばＣ末端のＧＧＣもしくはＧＧＧＣタグ；および／または
− Ｃ末端伸長Ｘ（ｎ）（例えば−Ａｌａ）、これは本発明のＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）について本明細書中にさらに記載されるとおりであり得て、および／または、ＷＯ１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５中に記載されるとおりであり得る。
本発明の範囲は、（好ましくはヒト）抗体（例えばＦｃ部分またはその機能的断片または１もしくは複数の定常ドメイン）の、および／またはラクダ科動物の重鎖のみの抗体（例えば１または複数の定常ドメイン）からの１または複数の部分または断片を包含するＰＤ１結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を包含する。
ＬＡＧ３結合性物質
本発明は、改良されたＬＡＧ３結合性物質、例えば改良された抗ＬＡＧ３ ＩＳＶＤ、よりとりわけには改良されたＬＡＧ３ナノボディ、例えば１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｒ４１Ｐ、Ｎ４３Ｋ、Ａ６２Ｓ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）；Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）；Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａ；またはＦ０２３７６１１Ｂ０９（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａを提供する。
論じられているように、本発明の「ＬＡＧ３結合性物質」は、ＬＡＧ３に結合する本明細書中に記載される任意の分子（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、並びに別の結合性物質と融合されるような分子を包含する任意の多価または多重特異性結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）である。例えば、ＬＡＧ３結合性物質は、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＣＴＬＡ４、ＨＳＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰに結合する部分と融合されたＬＡＧ３結合部分を包含し得る。個々のＬＡＧ３結合性物質は、それがより大きな分子、例えば多価分子の一部である場合、ＬＡＧ３結合部分と呼ばれ得て、ここでＬＡＧ３結合部分は、別の結合部分、例えばＦ０２３７００９２４またはＦ０２３７００９３１と融合されている。
本発明のＬＡＧ３結合性物質は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、１位、１１位、１４位、４１位 ４３位、６２位、７４位、８３位および／または８９位において変異したポリペプチドのバリアントであるポリペプチドを包含する。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、１１Ｂ０９中または１１Ｂ０９の配列（配列番号６３）を含む結合性物質中に存在するものと同じＣＤＲの組み合わせ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有す。表Ｂ−１を参照されたい。
本発明はまた、下の表Ｂ−２に示されるアミノ酸配列を含む１１Ｂ０９のバリアントであるＬＡＧ３結合性物質を包含する。本発明の範囲は、下で表Ｂ−２中に示される前記バリアント（ｖａｒａｉｎｔｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＬＡＧ３結合性物質を包含する。
加えて、本発明は、下で表Ｂ−２中に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはアミノ酸配列を包含するＬＡＧ３結合部分、または１１Ｂ０９のアミノ酸配列またはそのバリアントのうちの１つを含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。
表Ｂ−１．ＬＡＧ３結合性物質１１Ｂ０９
Figure 0006817302
表Ｂ−２．配列最適化１１Ｂ０９ ＬＡＧ３結合性物質
Figure 0006817302
Figure 0006817302
＊ＬＡＧ３結合性物質のＣＤＲは下線および／または太字。
本発明は、本発明のＬＡＧ３結合性物質（例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質中のもの）が上で表Ｂ−１またはＢ−２に示されるＬＡＧ３結合性物質（例えば配列番号６３、６４、９５、９６または９７）のＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つを包含し、各々が０、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、例えば保存的置換を含み、および／または表Ｂ−１もしくはＢ−２に示されるＣＤＲ配列に対して１００、９９、９８、９７、９６もしくは９５％の配列同一性を含み、かかるＣＤＲを有する本発明のＬＡＧ３結合性物質がＬＡＧ３に結合する能力を保持する実施形態を包含する。本発明のある実施形態において、本発明のＬＡＧ３結合性物質の最初のアミノ酸はＥである。本発明のある実施形態において、本発明のＬＡＧ３結合性物質の最初のアミノ酸は、ＥまたはＤである。
本発明は、ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００６５６（１１Ｂ０９（Ｅ１Ｄ）；配列番号６３（Ｅ１Ｄ））を包含する。
表Ｂ−１またはＢ−２に示されるＬＡＧ３結合性物質の特定の残基についてのＫａｂａｔ残基番号は下の配列中に示される：
Figure 0006817302
（配列番号６４）。場合により、残基１はＤであってもよい。
本発明は、配列番号６３、６４もしくは１２７（または配列番号９６もしくは９７のＬＡＧ３結合部分を有するもの）（並びにＥ１ＤまたはＤ１Ｅ変異を有するＬＡＧ３結合性物質）のアミノ酸配列を、または８０％もしくはそれより多い（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の）アミノ酸配列同一性（すなわち、全アミノ酸配列を比べたもの）を含むアミノ酸配列を含む任意のＬＡＧ３結合性物質を包含し、ここでＬＡＧ３結合性物質はＬＡＧ３に結合する能力を保持しており、そして場合によりＨＳＡ結合性物質を包含してもよい。
本発明は、配列番号６３、６４、９６、９７または１２７に示されるアミノ酸配列を含む結合性物質（または本明細書中に記載されるそのバリアント）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するＬＡＧ３結合性物質、例えばＬＡＧ３ ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）を包含し、これは、例えば次のＣＤＲ：
− アミノ酸配列ＧＲＴＦＳＤＹＶＭＧ（配列番号６５）を含むＣＤＲ１；および
− アミノ酸配列ＡＩＳＥＳＧＧＲＴＨ（配列番号６６）を含むＣＤＲ２；および
− アミノ酸配列ＴＬＬＷＷＴＳＥＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤＹ（配列番号６７）を含むＣＤＲ３
を含み、そして場合により
− 配列番号６３、６４、９６、９７もしくは１２７のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに１位、１１位、１４位、４１位 ４３位、６２位、７４位、７６位、８３位、８９位、１００位および／または１０５位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し、；
および／または
− 配列番号６３、６４、９６、９７もしくは１２７のアミノ酸との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されるとおりであり、存在し得る１位、１１位、１４位、４１位 ４３位、６２位、７４位、７６位、８３位、８９位、１００位および／または１０５位における本明細書に示される変異のいずれも考慮されず、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を有していてもよく、そして場合により
− 本明細書中に論じられるＣ末端伸長、例えば（Ｘ）ｎを有してもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である。
本発明はまた、１または複数の半減期エクステンダー、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、例えばＡＬＢ１１００２と融合したＬＡＧ３結合性物質を包含する。
多重特異性結合性物質
本発明は、ＰＤ１およびＬＡＧ３に結合する単一の多価、多重特異性分子に融合され得るＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質（ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）を包含し、本発明のある実施形態において、かかる結合性物質は、対象の体内での結合性物質の半減期を増加させる１または複数の半減期エクステンダーに連結されている。本発明のある実施形態において、半減期エクステンダーは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するＩＳＶＤ（例えばナノボディ）、例えばＡＬＢ１１００２である。本発明のある実施形態において、多重特異性結合性物質は、本明細書中に記載されるＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７である。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、
（１）表Ａ−１もしくはＡ−２に示されるＰＤ１結合性物質のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であって、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換（例えば保存的変異）を含んでもよい、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、または
アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）もしくはＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）を含むＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶ、例えばＷである）もしくはＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７；ここでＸはＷまたはＶ、例えばＷである）を含むＣＤＲ２；および
アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦ、例えばＷである）を含むＣＤＲ３、
を含むＰＤ１結合性物質、および
（２）表Ｂ−１もしくはＢ−２に示されるＬＡＧ３結合性物質のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であって、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換（例えば保存的変異）を含んでもよい、または
アミノ酸配列ＧＲＴＦＳＤＹＶＭＧ（配列番号６５）を含むＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＡＩＳＥＳＧＧＲＴＨ（配列番号６６）を含むＣＤＲ２；および
アミノ酸配列ＴＬＬＷＷＴＳＥＹＡＰＩＫＡＮＤＹＤＹ（配列番号６７）を含むＣＤＲ３、
を含むＬＡＧ３結合性物質を含み、そして場合により半減期エクステンダーおよび／またはＣ末端エクステンダー、例えば本明細書に示されるＨＳＡ結合性物質を含んでもよく、および／またはＣ末端エクステンダー、例えばアラニンを含んでもよい。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１結合性物質は、上で「ＰＤ１結合性物質」として示されるとおりであり、例えば配列番号５７、９８、９９、１０３、１０４または１０５のアミノ酸配列（ここで残基１はＥまたはＤであってもよい）を含む。本発明のある実施形態において、ＬＡＧ３結合性物質は、上で「ＬＡＧ３結合性物質」として示されるとおりであり、例えば配列番号６３、６４または９５のアミノ酸配列（ここで残基１はＥまたはＤであってもよい）を含む。
多重特異性結合性物質は、ＰＤ１およびＬＡＧ３を包含し得て、そして場合によりＨＳＡ結合性物質を包含してもよく、並びに付加的な抗原、例えばＣＤ２７、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７またはＴＳＬＰに結合する１または複数の結合性物質を包含してもよい。
ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が１または複数のさらなる結合ドメインまたは結合ユニット（例えば、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対する特異性の向上を与えるＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対するさらなる本質的な非機能的結合ドメインもしくは結合ユニット、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３以外の治療標的（例えばＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡまたはＣＤ２７）に対する結合ドメインもしくは結合ユニット、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンの標的に対する結合ドメインもしくは結合ユニット、および／またはＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化する、および／または、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にする結合ドメインもしくは結合ユニット）を含有するとき、これらの他の結合ドメインまたは結合ユニットは、好ましくは１または複数のＩＳＶＤ（例えばナノボディ）を含み、より好ましくは全てＩＳＶＤである。例えば、限定されることなく、これらの１または複数のさらなる結合ドメインまたは結合ユニットは、１または複数のナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよび／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨを包含するもの）、ＶＨドメインであるもしくはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体、ＶＨドメインであるもしくはＶＨドメインから本質的になるもしくはＶＨドメインに由来するｄＡｂ、またはさらにはＶＬドメインである、もしくはＶＬドメインから本質的になる（単一）ドメイン抗体もしくはｄＡｂであることができる。とりわけ、これらの１または複数の結合ドメインまたは結合ユニットは、存在するとき、１または複数のナノボディを含み得て、よりとりわけ、全てナノボディである。本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３以外の標的に結合するＩＳＶＤ（例えばナノボディ）は、別の標的、例えばＨＳＡ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡまたはＣＤ２７に結合する。
本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）がそのＣ末端にＩＳＶＤ（例えばナノボディ）（例えばこのＣ末端ＩＳＶＤは、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３に結合し、またはポリペプチド中に存在する場合、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対する特異性の向上を与えるＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対するさらなる本質的な非機能的ＩＳＶＤ、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンの標的に対するＩＳＶＤ、もしくはＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化するおよび／またはＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にするＩＳＶＤであり得る）を有するとき、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（すなわち、前記Ｃ末端ＩＳＶＤを含むもの）は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）（例えば−Ａｌａ）を有し、このＣ末端伸長は本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。
ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３に結合する１または複数の部分に加えて、任意のさらなるＩＳＶＤ（例えばナノボディ）（この１または複数のさらなるＩＳＶＤは、言及されているように、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対する特異性の向上を与えるＰＤ１および／またはＬＡＧ３に対するさらなる本質的な非機能的ＩＳＶＤ、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンの標的に対するＩＳＶＤ、および／または本発明のポリペプチドを特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化するおよび／または本発明のポリペプチドが細胞内に内部移行することを可能にするＩＳＶＤであり得る）を含有するとき、および、かかるさらなるＩＳＶＤが、ナノボディであるか、またはＶＨ配列であるか、またはＶＨ配列から本質的になるおよび／またはＶＨ配列に由来するＩＳＶＤである場合、本発明の好ましい態様によると、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質中に存在する前記１または複数の（好ましくは全ての）かかるＩＳＶＤは、それらの配列内に、先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異を含有する。とりわけ、本発明のこの態様によると、かかるさらなるＩＳＶＤは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであるか、および／または本質的に本発明のＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質について本明細書中に記載されるとおりの、１位、１１位、１４位、７４位、８３位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異の好適な組み合わせを含有し得る。１つの具体的態様において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質がそのＣ末端においてかかるＩＳＶＤを有するとき、Ｃ末端に存在するおよび／またはこれを形成する前記ＩＳＶＤは、先在抗体による結合を低減させるかかるフレームワーク変異を有し；前記Ｃ末端ＩＳＶＤは、好ましくはまた本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）（例えば−Ａｌａ）も有す。
ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が（すなわち、半減期エクステンダー、例えばＡＬＢ１１００２を欠く本発明の一価の結合性物質と比べて）半減期が増加したものであるとき、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、かかる半減期の増加を与えるための少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）（例えばＡＬＢ１１００２）を含有する。
かかるＩＳＶＤは、本発明のある実施形態において、好適な血清タンパク質、例えばトランスフェリンまたは（ヒト）血清アルブミンに対するものなどである。とりわけ、かかるＩＳＶＤまたはナノボディは、例えばＥＰ２１３９９１８、ＷＯ２０１１／００６９１５、ＷＯ２０１２／１７５４００、ＷＯ２０１４／１１１５５０中に記載されるヒト血清アルブミンに対する（単一）ドメイン抗体またはｄＡｂであり得て、とりわけＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００６／１２２７８７、ＷＯ２０１２／１７５４００またはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載される血清アルブミン結合ナノボディであり得る。とりわけ好ましい血清アルブミン結合ＩＳＶＤは、ナノボディＡｌｂ−１（ＷＯ２００６／１２２７８７を参照されたい）またはそのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ−８（ＷＯ２００６／１２２７８７、配列番号６２）、Ａｌｂ−２３（ＷＯ２０１２／１７５４００、配列番号１）、ならびに他のヒト化された（好ましくは配列最適化もされた）Ａｌｂ−１のバリアントおよび／またはＡｌｂ−８もしくはＡｌｂ−２３のバリアント（またはより一般には、Ａｌｂ−１、Ａｌｂ−８およびＡｌｂ−２３と本質的に同じＣＤＲを有するＩＳＶＤ）である。
論じられているように、本発明の「ＨＳＡ結合性物質」は、ＨＳＡに結合する分子、例えば本明細書中に記載されるものなどのいずれか（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、並びに別の結合性物質と融合されるような分子を包含する任意の多価または多重特異性結合性物質である。個々のＨＳＡ結合性物質は、それがより大きな分子、例えば多価分子の一部である場合、ＨＳＡ結合部分と呼ばれ得て、ここでＨＳＡ結合部分は別の結合部分と融合されている。
本発明のある実施形態において、半減期エクステンダーはヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ（例えばナノボディ）であり、例えば下で表Ｃ中にまとめられるＡＬＢ１１００２である。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＨＳＡ結合性物質は、好ましくは、ＡＬＢ１１００２またはＡＬＢ１１００２の配列（配列番号５９）を有するものと同じＣＤＲの組み合わせ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有す。表Ｃを参照されたい。
本発明はまた、下の表Ｃに示されるアミノ酸配列を含むＡＬＢ１１００２のバリアントであるＨＳＡ結合性物質を包含する。本発明の範囲は、下で表Ｃ中に示される前記バリアント（ｖａｒａｉｎｔｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＨＳＡ結合性物質を包含する。
加えて、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはＡＬＢ１１００２のアミノ酸配列または下記表Ｃ中に示されるそのバリアントのうちの１つを包含するＨＳＡ結合部分を含むＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。
表Ｃ．ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ナノボディＡＬＢ１１００２
Figure 0006817302
＊場合によりＡＬＢ１１００２はＣ末端アラニンを欠いていてもよい。場合によりＨＳＡ結合性物質は、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｅ１Ｄ、Ｖ１１Ｌおよび／またはＬ９３Ｖ変異を含み、例えば、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号５９）を含んでもよい。
本発明のある実施形態において、本発明のＨＳＡ結合性物質の最初のアミノ酸はＥである。本発明のある実施形態において、本発明のＨＳＡ結合性物質の最初のアミノ酸はＤである。
本発明は、ＨＳＡ結合性物質のＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つが各々０、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、例えば保存的置換を含み、および／または表Ｃに示されるＣＤＲ配列に対して９９、９８、９７、９６もしくは９５％の配列同一性を含み、ここで、かかるＣＤＲを有するＨＳＡ結合性物質がＨＳＡに結合する能力を保持する実施形態を包含する。
本発明のある実施形態において、半減期エクステンダーは、ＨＳＡ ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳ（配列番号６０）を含むＣＤＲ１；および
− アミノ酸配列ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬ（配列番号６１）を含むＣＤＲ２；および
− アミノ酸配列ＧＧＳＬＳＲ（配列番号６２）を含むＣＤＲ３
を含み、そして場合により
− 配列番号５９のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長は、配列同一度を決定するために考慮されない）を有し；
および／または
− 配列番号５９のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）；
を有してもよく、そして場合により
− Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、前記ＨＳＡ ＩＳＶＤである。
かかるヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）は、存在するとき、その配列内に先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異を含有し得る。とりわけ、かかる血清アルブミン結合ＩＳＶＤがＶＨドメインであるか、本質的にこれからなるおよび／またはこれに由来するナノボディまたは（単一）ドメイン抗体であるとき、血清アルブミン結合ＩＳＶＤは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりの、および／または本質的に本発明のＰＤ１結合性物質について本明細書中に記載されるとおりの１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）を含有し得る。例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）は、本発明のポリペプチド中で用いることができる、先在抗体による結合を低減させる１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異を含有するＡｌｂ−１、Ａｌｂ−８およびＡｌｂ−２３の多数のバリアントを記載している。
かかる血清アルブミン結合ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）がＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質のＣ末端に存在するとき、血清アルブミン結合ＩＳＶＤ（および結果として本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質）は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端伸長は本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。例えば、Ｃ末端伸長は単一のアラニン残基であり得る。これはまた好ましくは、先在抗体の結合を低減させる変異を、１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）などを有し、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載される。
しかしながら、言及されているように、本発明のポリペプチドの半減期を増加させる他の手段（例えばＰＥＧ化、ヒトアルブミンもしくは好適なその断片との融合、または好適な血清アルブミン結合ペプチドの使用）もまた、本発明の範囲の中に包含される。
一般に、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が、増加した半減期を有するとき（例えば半減期増加性ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）の存在または半減期を増加させる任意の他の好適な方法を介して）、得られる本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、半減期エクステンダーを欠く本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の半減期よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍よりも長い半減期（本明細書中に定義されるもの）を有する（ヒトおよび／または好適な動物モデル、例えばマウスまたはカニクイザルのいずれかにおいて測定されるように）。とりわけ、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、ヒト対象において少なくとも１日、好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも７日、例えば少なくとも１０日の半減期（本明細書中に定義されるもの）を有す。
１または複数のＩＳＶＤ（例えばナノボディ）に基づくＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質は異なる「型」を有することができ、すなわち、本質的に一価、二価または三価であることができ、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであることができ、二重パラトピック（本明細書中に定義されるおよび例えばＷＯ２００９／６８６２５中で定義されるもの）であることができることは本明細書中の開示から明らかである。例えば、本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は：
− 一価であること、すなわち、単一のＰＤ１またはＬＡＧ３結合部分（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を含むことができる。言及されているように、一価の型で用いられるとき、本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、本明細書中にさらに記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有す。本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質はまた、半減期が延長されたものであり得る；
− 二価または三価であって単一特異性であることができる。例えば、本発明のある実施形態において、本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は、それぞれＰＤ１に対してまたはＬＡＧ３に対して２つまたはそれより多いＩＳＶＤ（例えばナノボディ）を含み、これらは同じであっても異なってもよく；異なるときはＰＤ１またはＬＡＧ３の同じエピトープに対するものであってもＰＤ１またはＬＡＧ３上の異なるエピトープに対するものであってもよい（後者の場合、本発明の二重パラトピックまたは多重パラトピックＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質を提供するために）。本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質はまた、半減期が延長されたものであり得る；
− 二価、三価（または多価）であって二重特異性または三重特異性（または多重特異性）であることができる。例えば、本発明のある実施形態において、本発明のかかるＰＤ１結合性物質は、ＰＤ１および少なくとも１つの他の標的、例えばＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ２７に対するものであり；例えば、ＰＤ１結合部分およびＣＴＬＡ４結合部分；ＰＤ１結合部分およびＢＴＬＡ結合部分；ＰＤ１結合部分およびＬＡＧ３結合部分（すなわち、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質）；またはＰＤ１結合部分、ＬＡＧ３結合部分およびＢＴＬＡ結合部分を含む。本明細書中で記載されるように、前記他の標的は、例えば、ＰＤ１および前記他の治療標的に関して二重特異性である本発明のＰＤ１結合性物質を提供するように、別の治療関連標的（すなわち、ＰＤ１以外のもの）であり得る。前記他の標的はまた、半減期が増加した本発明のＰＤ１結合性物質を提供するように、半減期の増加を与える標的（例えばヒト血清アルブミン）であり得る。また本明細書中で言及されるように、かかる他の標的はまた、本発明のＰＤ１結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化することを可能にし得て、または本発明のＰＤ１結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にし得る。これらのアプローチ／ＩＳＶＤを組み合わせること、例えばＰＤ１についておよび少なくとも１つの他の治療関連標的について二重特異性であり、半減期が延長された本発明のＰＤ１結合性物質を提供することもまた可能である。
やはり、好ましくは、これらのＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質がＰＤ１結合部分またはＬＡＧ３結合部分以外の１または複数のＩＳＶＤ（例えばナノボディ）を包含するとき、これらの他のＩＳＶＤのうちの少なくとも１つ、好ましくは全ては、その配列内に先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異（例えば、とりわけ、本発明のＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであるか、および／または一般にＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりである１位、１１位、１４位、５２ａ位、７３位、７４位、８３位、８９位、１００ａ位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異の組み合わせ）を含有する。また、本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質がそれらのＣ末端においてそれぞれＰＤ１結合部分またはＬＡＧ３結合部分を有するとき、前記Ｃ末端のＰＤ１結合部分またはＬＡＧ３結合部分（および結果として本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質）は、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有す。同様に、本発明のかかるＰＤ１結合性物質、ＬＡＧ３結合性物質がそれらのＣ末端において別のＩＳＶＤ（すなわち、ＰＤ１結合部分またはＬＡＧ３結合部分ではなく、例えば半減期延長性ＩＳＶＤ）を有するとき、前記Ｃ末端ＩＳＶＤ（および結果として本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を有し、および／またはその配列内に先在抗体による結合を低減させる１もしくは複数のフレームワーク変異（やはり、本明細書中におよびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中にさらに記載されるとおりであるもの）を含有する。
当業者に明らかであるように、本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が局所使用（すなわち、皮膚上または眼内）を意図されたとき、または例えば消化管中のどこかで（すなわち、経口投与または坐剤による投与の後に）、もしくは肺中のどこかで（すなわち、吸入による投与の後に）（局所化された）治療作用を有する予定であるとき、またはそうでなければその意図される作用位置に直接的に（例えば直接的な注射により）適用する予定であるとき、本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は、通常、半減期延長を必要としない。また、ある種の急性の症状または適応症の治療のため、半減期が延長されていないことが好ましいこともある。これらの場合、本発明の一価のＰＤ１結合性物質もしくはＬＡＧ３結合性物質または半減期が延長されていない本発明の別のＰＤ１結合性物質もしくはＬＡＧ３結合性物質（本発明のＰＤ１結合性物質（ｂｉｎｄｅｒｏｒ）またはＬＡＧ３結合性物質を含むもの）（例えば、ＰＤ１またはＬＡＧ３に関して二価または二重パラトピックである本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質）の使用が好ましい。
本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質のいくつかの好ましいが限定されない例は下の表Ｄ−１ａおよびＤ−１ｂ中に模式的に表され、これらの各々は本発明のさらなる態様を形成する。半減期が延長されていない本発明の好適なポリペプチドの他の例は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。
表Ｄ−１ａ：半減期延長性ＩＳＶＤを有さない本発明のいくつかのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の略図
Figure 0006817302
Figure 0006817302
表Ｄ−１ｂ：半減期延長性ＩＳＶＤを有さない本発明のいくつかのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の略図
Figure 0006817302
Figure 0006817302
当業者に明らかであるように、本発明のＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤを含むもの）が全身投与および／または慢性疾患もしくは障害の予防および／もしくは治療を意図されたとき、通常、本発明の前記ＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は半減期（本明細書中に定義されるもの）が増加したものであることが好ましい。より好ましくは、本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質は、半減期延長性ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）、例えば好ましくはヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、とりわけナノボディ（本明細書中に記載されるもの）を含有する。
本発明のかかるＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質のいくつかの好ましいが限定されない例は下の表Ｄ−２ａおよびＤ−２ｂ中に模式的に表され、これらの各々は本発明のさらなる態様を形成する。半減期が延長された本発明の好適なＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質の他の例は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。一般に、半減期が延長された本発明のポリペプチドについては、Ｃ末端伸長の存在が大いに好ましい。
表Ｄ−２ａ：半減期延長性ＩＳＶＤを有する本発明のいくつかのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の略図
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
表Ｄ−２ｂ：半減期延長性ＩＳＶＤを有する本発明のいくつかのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の略図
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
Figure 0006817302
本発明のある実施形態において、本発明のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、下で表Ｄ−３中にまとめられる。
表Ｄ−３．本発明のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質
Figure 0006817302
Figure 0006817302
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Figure 0006817302
Figure 0006817302
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＊ＰＤ１結合性物質およびＬＡＧ３結合性物質のＣＤＲは下線および／または太字
分子中の任意の結合部分の最初の残基は、適宜、ＤまたはＥで置換されてもよい。
本発明は、配列番号１０６−１２４のアミノ酸配列、または８０％もしくはそれより多い（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の）アミノ酸配列同一性（すなわち、全アミノ酸配列を比べたもの）を含むアミノ酸配列を含む任意のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含し、ここでＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、ＰＤ１およびＬＡＧ３、および、任意にＨＳＡに結合する能力を保持している。
本発明は、次の部分の配置：
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えば，ＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば２０ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７６１１Ｂ０９（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｒ４１Ｐ，Ｎ４３Ｋ，Ａ６２Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｐ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば３５ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質１ＰＤ１０２Ｃ１２（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｗ５２ａＶ，Ｎ７３Ｓ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｉ８９Ｌ，Ｗ１００ａＦ）−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ＬＡＧ３結合性物質Ｆ０２３７００８４２−
・ペプチドリンカー、例えば９ＧＳ−
・ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２−
・任意にＣ末端伸長アラニン
を有する任意のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を包含する。
本発明のある実施形態において、本発明のＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質は、次の部分の配置：
・ＰＤ１結合性物質 配列番号９８；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号９８；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６３；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６３；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号９９；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号９９；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号９９；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・２０ＧＳリンカー 配列番号１００；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号５７；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５（Ｄ１Ｅ）；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５（Ｄ１Ｅ）；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０５；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４（Ｄ１Ｅ）；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４（Ｄ１Ｅ）；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｎ７３Ｓ）；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｄ１Ｅ、Ｎ７３Ｓ）；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｎ７３Ｓ）；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｄ１Ｅ、Ｎ７３Ｓ）；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｎ７３Ｓ）；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・３５ＧＳリンカー 配列番号５８；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
または
・ＰＤ１結合性物質 配列番号１０３（Ｎ７３Ｓ）；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＬＡＧ３結合性物質 配列番号６４；
・９ＧＳリンカー 配列番号１２５；
・ＨＳＡ結合性物質 配列番号５９；
・アラニン
を包含する。
交差遮断抗体
本発明はまた、本明細書中に開示される結合性物質のいずれかの結合を交差遮断することが可能な交差遮断結合性物質（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を提供する。かかる交差遮断結合性物質は、かかる交差遮断を呈する任意の分子、例えばＩＳＶＤ、ナノボディ、抗体またはその抗原結合断片であり得る。
一般的に、参照結合性物質を「交差遮断」するまたは参照結合性物質と「交差競合」する結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片は、競合アッセイにおいて参照結合性物質のその抗原への結合を５０％またはそれより多く遮断する結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片をいい、逆に、参照結合性物質は競合アッセイにおいて結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片のその抗原への結合を５０％またはそれより多く遮断する。交差遮断または交差競合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーといった当該技術分野で知られている任意のアッセイで決定することができる。
本発明のある実施形態において、交差遮断はＢｉａｃｏｒｅアッセイの使用により決定される。便宜上、２つの結合性物質への参照がなされるが、本発明の範囲は、本発明の結合性物質を交差遮断する抗体およびその抗原結合断片、例えばＦａｂ断片を包含する。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（例えばＢｉａｃｏｒｅ ３０００）は、製造業者の推奨に沿って操作される。
それゆえに、１つの交差遮断アッセイにおいて、ＰＤ１またはＬＡＧ３は、標準的なアミンカップリング化学を用いてＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップにカップリングされることで、ＰＤ１またはＬＡＧ３がコーティングされた表面を生成する。例えば、ＰＤ１またはＬＡＧ３の２００−８００共鳴単位がチップにカップリングされる（または容易に測定可能な結合レベルを与えるが用いられる試験試薬の濃度により容易に飽和可能である任意の量が）。
互いに交差遮断するそれらの能力が判定される２つの結合性物質（Ａ＊およびＢ＊と名付ける）を好適なバッファー中で１：１の結合部分のモル比で混合することで、試験混合物を作る。
試験ミックス中の各々の結合性物質濃度は、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉されたＰＤ１分子またはＬＡＧ３分子上のその結合性物質に対する結合部位を容易に飽和するのに十分に高いものであるべきである。混合物中の結合性物質は同じモル濃度である。
結合性物質Ａ＊を単独で、および結合性物質Ｂ＊を単独で含有する別々の溶液も調製する。これらの溶液中の結合性物質Ａ＊および結合性物質Ｂ＊は、試験ミックスと同じバッファー中で、同じ濃度であるべきである。
試験混合物を、ＰＤ１またはＬＡＧ３がコーティングされたＢｉａｃｏｒｅチップ上を通過させ、総結合量を記録する。チップを次いで、チップに結合したＰＤ１またはＬＡＧ３を損なわずに結合した結合性物質を除去するように処理する。本発明のある実施形態において、これは、チップを３０ｍＭ ＨＣｌで６０秒間処理することによりなされる。
結合性物質Ａ＊の溶液を単独で、次いでＰＤ１またはＬＡＧ３がコーティングされた表面上を通過させ、結合量を記録する。チップを再度、チップに結合したＰＤ１またはＬＡＧ３を損なわずに結合した結合性物質の全てを除去するように処理する。
結合性物質Ｂ＊の溶液を単独で、次いでＰＤ１またはＬＡＧ３がコーティングされた表面上を通過させ、結合量を記録する。
結合性物質Ａ＊および結合性物質Ｂ＊の混合物の最大理論的結合を次に算出し、これはＰＤ１またはＬＡＧ３表面上を単独で通過したときの各々の結合性物質の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論的最大値より小さい場合、２つの結合性物質は互いに交差遮断する。
それゆえに、一般的に、本発明による交差遮断結合性物質は、上のＢｉａｃｏｒｅ交差遮断アッセイにおいて、アッセイの際に第二の結合性物質の存在下で記録される結合が、例えば組み合わせた２つの結合性物質の最大理論的結合の８０％から０．１％の間（例えば８０％から４％）、例えば最大理論的結合の７５％から０．１％の間（例えば７５％から４％）、例えば最大理論的結合（ちょうど上で定義されているもの）の７０％から０．１％の間（例えば７０％から４％）になるように、ＰＤ１またはＬＡＧ３に結合するものである。
本発明のある実施形態において、本発明によってＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が交差遮断するか、または交差遮断の能力があるかを決定するため、ＥＬＩＳＡアッセイが用いられる。
アッセイの一般原則は、ＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングすることである。過剰量の第二の潜在的に交差遮断性の抗ＰＤ１結合性物質またはＬＡＧ３結合性物質を溶液中に加える（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していない）。限定的な量のＰＤ１またはＬＡＧ３を次いでウェルに加える。コーティングされた結合性物質と溶液中の結合性物質は限定的な量のＰＤ１分子またはＬＡＧ３分子の結合を競合する。プレートを洗浄して、コーティングされた結合性物質によって結合していないＰＤ１またはＬＡＧ３を除去し、また第二の溶液相の結合性物質も、並びに第二の溶液相の結合性物質とＰＤ１またはＬＡＧ３との間に形成された何らかの複合体をも除去する。結合したＰＤ１またはＬＡＧ３の量を次いで適切なＰＤ１またはＬＡＧ３検出試薬を用いて測定する。コーティングされた結合性物質を交差遮断することが可能な溶液中の結合性物質は、コーティングされた結合性物質が第二の溶液相の結合性物質の非存在下で結合することができるＰＤ１分子またはＬＡＧ３分子の数に対する、コーティングされた結合性物質が結合することができるＰＤ１分子またはＬＡＧ３分子の数の減少を引き起こすことが可能である。
発現方法
本発明は、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を作成する組換え方法であって、（ｉ）前記ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを導入すること、例えばここで前記ポリヌクレオチドはベクター中にあり、および／またはプロモーターに作動可能に連結されており；（ｉｉ）宿主細胞（例えばＣＨＯまたはピキアまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））を前記ポリヌクレオチドの発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして（ｉｉｉ）前記宿主細胞および／または宿主細胞が増殖した培地からＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を単離することを含んでもよい方法を包含する。例えば、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７を参照されたい。
本発明はまた、本明細書中に記載される本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、本発明のある実施形態において、１または複数の制御配列に作動可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、プラスミドまたはベクターの形態であり得る。やはり、かかるポリヌクレオチドは、一般に、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願中に、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７の中に記載されるとおりのものであることができる。
本発明はまた、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質をコードするかかるポリヌクレオチド、ベクターおよび／または本明細書中に記載されるＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質であるポリペプチド（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を含有する宿主または宿主細胞に関する。やはり、かかる宿主細胞は、一般に、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願中に、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７の中に記載されるとおりのものであることができる。具体的な宿主細胞の例は、下で論じられる。
ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の発現のための哺乳動物細胞を包含する宿主としての真核生物および原核生物の宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を包含する。これらとしては、なかでも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスターの細胞が挙げられる。とりわけ好ましい細胞株は、どの細胞株の発現レベルが高いかを決定することを通じて選択される。用いられ得る他の細胞株は昆虫細胞株（例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）またはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。真菌細胞としては酵母および糸状真菌細胞が挙げられ、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、任意のサッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のクリベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、任意のフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。本発明は、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を含有する、もしくはかかる結合性物質をコードするポリヌクレオチドを含有する、またはかかるポリヌクレオチドを含有するベクターを含有する、任意の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはピキア細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））を包含する。
さらに、産生細胞株からのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の発現は、多数の公知の技術を用いて増大させることができる。例えばグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）はある条件下で発現を増大させるための通例のアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号および第０３２３９９７ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号との関係で全体的にまたは一部が論じられている。それゆえに、本発明のある実施形態において、哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ）はグルタミン合成酵素遺伝子を欠損しており培地中でグルタミン酸の非存在下で増殖するが、免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドはグルタミン合成酵素遺伝子を含み、これは宿主細胞中の遺伝子欠損を補う。本明細書中で論じられる結合性物質またはポリヌクレオチドまたはベクターを含有するかかる宿主細胞、並びに本明細書中で論じられるかかる宿主細胞を用いて結合性物質を作成する発現方法は、本発明の一部である。
本発明は、ＰＤ１／ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を含む試料（例えば培養培地、細胞溶解液または細胞溶解液フラクション、例えば溶解液の可溶性フラクション）を精製媒体（例えばカチオン交換媒体、アニオン交換媒体および／または疎水***換媒体）に導入すること、および媒体に結合しない前記試料のフロースルーフラクションから精製されたＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を回収すること；またはフロースルーフラクションを捨て、結合したＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を媒体から溶出させて溶出物を回収することのいずれかを含む、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を精製する方法を包含する。本発明のある実施形態において、媒体は試料が付されるカラムの中にある。本発明のある実施形態において、宿主細胞中での抗体または断片の組換え発現の後に精製方法が行われ、例えばここでは宿主細胞が最初に溶解され、および溶解液は媒体上での精製の前に不溶性材料から精製されてもよく；またはここではＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が宿主細胞により培養培地中に分泌され、培地もしくはそのフラクションが精製媒体に付される。
一般的に、特定の細胞株または遺伝子導入動物中で生産される糖タンパク質は、その細胞株または遺伝子導入動物中で生産される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有す。それゆえ、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）の特定のグリコシル化パターンは、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の生産のために用いられるその特定の細胞株または遺伝子導入動物に依存したものとなる。非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は本発明の一部であり、非フコシル化抗体は典型的にインビトロおよびインビボの両方でそのフコシル化された対応物よりも強力な有効性を呈することが示されていることから、有利であり得る（例えばＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および第７，２１４，７７５号を参照されたい）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらのＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、それらの炭化水素構造はヒト血清ＩｇＧ中に存在するポピュレーションの正常な構成成分であることから、免疫原性である可能性は低い。
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で生産される免疫グロブリンに典型的に付加されるＮ−結合型グリカン（ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン）または遺伝子改変酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の中で生産される免疫グロブリンに典型的に付加されるＮ−結合型グリカン（遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン）を含むＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を包含する。例えば、本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、図４に示される「遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン」または「ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン」のうちの１または複数（例えばＧ０および／またはＧ０−Ｆおよび／またはＧ１および／またはＧ１−Ｆおよび／またはおよび／またはＧ２−Ｆおよび／またはＭａｎ５）を含む。本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカンを、すなわち、Ｇ０および／またはＧ１および／またはＧ２を含み、さらにＭａｎ５を包含してもよい。本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカンを、すなわち、Ｇ０−Ｆ、Ｇ１−ＦおよびＧ２−Ｆを含み、さらにＧ０および／またはＧ１および／またはＧ２および／またはＭａｎ５を包含してもよい。本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質上の全てのＮ−結合型グリカンのうちの約８０％から約９５％（例えば約８０−９０％、約８５％、約９０％または約９５％）が遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカンまたはＣＨＯ Ｎ−結合型グリカンである。Ｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ． ２８（３）：２３７−２５２（２０１１）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８（５）：３８７−３９２（２００７）を参照されたい。例えば、本発明のある実施形態において、遺伝子改変酵母細胞は、ＧＦＩ５．０またはＹＧＬＹ８３１６または米国特許第７，７９５，００２号もしくはＺｈａ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ９８８：３１−４３（２０１３）に示される株である。国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０６６７６５号も参照されたい。
組み合わせ
特定の実施形態において、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、例えば本明細書中で論じられる任意の疾患、例えばがんを治療または予防するため、かかる治療または予防の必要がある対象において、単独でまたは他のさらなる治療剤および／もしくは治療手法を伴って用いられ得る。さらなる治療剤を伴うかかるＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を含む組成物またはキット、例えば薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた本発明の一部である。
用語「伴う」は、構成成分である本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）が、別の薬剤、例えばペンブロリズマブまたはニボルマブと一緒に、例えば、同時送達のために１つの組成物にまたは別々に２つもしくはそれより多い組成物（例えばキット）に製剤化することができることを指し示す。各々の構成成分は、他の構成成分が投与されるのと異なる時に対象に投与することができ；例えば各々の投与は、間をあけて、所与の時間にわたって、同時でなく（例えば別々にまたは逐次的に）投与され得る。そのうえ、別々の構成成分は、同じ経路によりまたは異なる経路により対象に投与され得る（例えば、ここで本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は非経口的に投与され、パクリタキセルは経口的に投与される）。
特定の実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、抗がん治療剤または免疫調節薬剤、例えば免疫調節受容体阻害剤、例えば受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を伴って用いられ得る。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、阻害剤（例えば有機低分子または抗体もしくはその抗原結合断片）、例えばＭＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）阻害剤、細胞傷害剤、白金剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、微小管安定剤、タキサン、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ５２阻害剤、ＣＤ３０阻害剤、ＲＡＮＫ（核内因子カッパ−Ｂ受容体活性化因子）阻害剤、ＲＡＮＫＬ（核内因子カッパ−Ｂ受容体活性化因子リガンド）阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＣＤ２２阻害剤、ＣＤ７９ｂ阻害剤、ＥｒｂＢ２阻害剤またはファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤などのうちの１または複数を伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合断片（例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＣＴ−０１１）、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＴＩＭ３、抗ＣＳ１、（例えばエロツズマブ）、抗ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３（例えばリリルマブ）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７（例えばウレルマブ）、抗ＧＩＴＲ（例えばＴＲＸ５１８）、抗ＰＤ−Ｌ１（例えばＢＭＳ−９３６５５９、ＭＳＢ００１０７１８ＣまたはＭＰＤＬ３２８０Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ２、抗ＩＬＴ１、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ３、抗ＩＬＴ４、抗ＩＬＴ５、抗ＩＬＴ６、抗ＩＬＴ７、抗ＩＬＴ８、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ１３７、抗ＫＩＲ２ＤＬ１、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３、抗ＫＩＲ２ＤＬ４、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、抗ＫＩＲ３ＤＬ１、抗ＫＩＲ３ＤＬ２、抗ＫＩＲ３ＤＬ３、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＮＫＧ２Ｃ、抗ＮＫＧ２Ｅ、またはかかる標的；ＩＬ−１０、抗ＩＬ１０、抗ＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）もしくはＰＥＧ化ＩＬ−１０の任意の有機低分子阻害剤のうちの１または複数を伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０分子上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の分子量は、約１２，０００ダルトンまたは約２０，０００ダルトンである。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０（例えばＰＥＧ化ヒトＩＬ−１０）は、リンカー（例えばＣ２−１２アルキル、例えば−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−−など）を介してＩＬ−１０の単一サブユニットの単一のアミノ酸残基に共有結合した１または複数のポリエチレングリコール分子を含み、ここで前記アミノ酸残基はＮ末端アミノ酸残基のアルファアミノ基またはリジン残基のイプシロンアミノ基である。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０は（ＰＥＧ）ｂ−Ｌ−ＮＨ−ＩＬ−１０であり、ここでｂは１−９、ＬはＩＬ−１０の単一のアミノ酸残基の窒素（Ｎ）に共有結合したＣ２−１２アルキルリンカー部分である。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０のＩＬ−１０は式：［Ｘ−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］ｂ−Ｌ−ＮＨ−ＩＬ−１０であり、ここでＸはＨまたはＣ１−４アルキル；ｎは２０から２３００；ｂは１から９；およびＬはＣ１−１１アルキルリンカー部分であって、これは１つのＩＬ−１０サブユニットのアミノ末端におけるアルファアミノ基の窒素（Ｎ）に共有結合しており；ただしｂが１より大きいとき、ｎの総数は２３００を超えない。ＵＳ７，０５２，６８６を参照されたい。
本発明のある実施形態において、抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｌ１：ＫＴＳＱＮＩＦＥＮＬＡ（配列番号７１）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＮＡＳＰＬＱＡ（配列番号７２）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＨＱＹＹＳＧＹＴ（配列番号７３）
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＴＦＳＤＹＨＭＡ（配列番号７４）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＳＩＴＬＤＡＴＹＴＹＹＲＤＳＶＲＧ（配列番号７５）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＨＲＧＦＳＶＷＬＤＹ（配列番号７６）
を含む（ＵＳ７，６６２，３７９を参照されたい）。
本発明のある実施形態において、抗ＴＳＬＰ抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＩＦＴＤＹＡＭＨ（配列番号７７）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＴＦＩＰＬＬＤＴＳＤＹＮＱＮＦＫ（配列番号７８）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＭＧＶＴＨＳＹＶＭＤＡ（配列番号７９）
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＰＩＳＩＳＶＨ（配列番号８０）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＦＡＳＱＳＩＳ（配列番号８１）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＴＦＳＬＰＹＴ（配列番号８２）
を含む（ＷＯ２００８／７６３２１を参照されたい）。
本発明のある実施形態において、抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＩＩＫＡＴＹＭＨ（配列番号８３）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＲＩＤＰＡＮＧＥＴＫＹＤＰＫＦＱＶ（配列番号８４）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＡＷＹＦＤＶ（配列番号８５）
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡ（配列番号８６）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＨＡＫＴＬＡＥ（配列番号８７）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＨＹＹＧＳＰＬＴ（配列番号８８）
を含む（ＷＯ２０１２／０４３６７を参照されたい）。
それゆえに、本発明は、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を、ペンブロリズマブを伴って含む組成物；並びに、ペンブロリズマブ（例えばペンブロリズマブ２００ｍｇを３週毎に１回投薬）を伴う有効量のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質を対象に投与することを含む、対象においてがんを治療または予防する方法を包含する。対象は別のさらなる治療剤を伴って投与されてもよい。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；（配列番号８９）を含む免疫グロブリン重鎖（またはそのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）、およびアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９０）を含む免疫グロブリン軽鎖（またはそのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）を含むペンブロリズマブ抗体を伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９１）を含む免疫グロブリン重鎖（またはそのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）、およびアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９２）を含む免疫グロブリン軽鎖（またはそのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）を含む抗体を伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロン、４−ヒドロキシタモキシフェン、５−デオオキシウリジン（ｄｅｏｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５'−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−フルオロウラシル、６−メカプトプリン（ｍｅｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、７−ヒドロキシスタウロスポリン、Ａ−４４３６５４、酢酸アビラテロン、アブラキサン、ＡＢＴ−５７８、アコルビフェン、ＡＤＳ−１００３８０、アフリバーセプト、ＡＬＴ−１１０、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンジオスタチン、ＡＰ−２３５７３、ＡＲＱ−１９７、アルゾキシフェン、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０５２４０、アスパラギナーゼ、ＡＴＩ３３８７、ＡＴ−９２６３、アトラセンタン、アキシチニブ、ＡＺＤ１１５２、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、バタブリン、ＢＣ−２１０、ベソドトクス（ｂｅｓｏｄｕｔｏｘ）、ベバシズマブ、ＢＧＪ３９８、ビカルタミド、Ｂｉｏ１１１、ＢＩＯ１４０、ＢＫＭ１２０、ブレオマイシン、ＢＭＳ−２１４６６２、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−２７５２９１、ＢＭＳ−３１０７０５、ボルテジミブ（ｂｏｒｔｅｚｉｍｉｂ）、ブセレリン、ブスルファン、カルシトリオール、カンプトテシン、カネルチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣ８４９０、ＣＥＡ（組換えワクシニア−がん胎児抗原ワクチン）、セジラニブ、ＣＧ−１５２１、ＣＧ−７８１、クラミドシン、クロラムブシル、クロロトキシン、シレンジタイド、シミチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コビメトニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｎｉｂ）、ＣＯＬ−３、ＣＰ−７２４７１４、シクロホスファミド、シプロテロン、酢酸シプロテロン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダシノスタット、ダクチノマイシン、ダロツズマブ、ダヌセルチブ、ダサタニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）、ダウノルビシン、デカタニブ（ｄｅｃａｔａｎｉｂ）、デグエリン、デニロイキン、デオキシコホルマイシン、デプシペプチド、ジアリルプロピオニトリル、ジエチルスチルベストロール、ジフチトクス、ＤＮＥ０３、ドセタキセル、ドビチニブ、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、エドテカリン、イットリウム−９０標識エドトレオチド、エドトレオチド、ＥＫＢ−５６９、ＥＭＤ１２１９７４、エンコラフェニブ、エンドスタチン、エンザルタミド、エンザスタウリン、エピルビシン、エピチロンＢ（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ）、ＥＲＡ−９２３、アービタックス、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィクラツズマブ、フィナステリド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ＦＯＬＦＯＸレジメン、フルベストラント、ガレテロン、ガネテスピブ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ジャイマテカン、グルコピラノシルリピドＡ、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、ゴシポール、ＧＳＫ４６１３６４、ＧＳＫ６９０６９３、ＨＭＲ−３３３９、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、ＩＣ８７１１４、イダルビシン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｙｆｅｎｅ）、イホスファミド、ＩＭ８６２、イマチニブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、イミキモド、ＩＮＣ２８０、ＩＮＣＢ２４３６０、ＩＮＯ１００１、インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、イピリムマブ、イリノテカン、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ケトコナゾール、ＫＲＸ−０４０２、ラパチニブ、ラソフォキシフェン、ＬＥＥ０１１、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、酢酸リュープロリド、レバミソール、リポソーム内包パクリタキセル、ロムスチン、ロナファルニブ、ルカントン、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６４６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９４００２、ＬＹ３１７６１５、ＬＹ３００９１２０、マリマスタット、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ＭＥＫ１６２、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、加熱死菌マイコバクテリウム・オブエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｂｕｅｎｓｅ）懸濁物、トザセルチブ、ＭＬＮ８０５４、ナチトクラクス（ｎａｔｉｔｏｃｌａｘ）、ネオバスタット、ネラチニブ、ノイラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ニロチニブ、ニルチミド（ｎｉｌｕｔｉｍｉｄｅ）、ノラトレキセド、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、オブリメルセン、オクトレオチド、オファツムマブ、オレゴボマブ、オルナツズマブ（ｏｒｎａｔｕｚｕｍａｂ）、オルテロネル、オキサリプラチン、パクリタキセル、パルボシクリブ、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＥＧ−インターフェロン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、フェニルアラニンマスタード、ＰＩ−１０３、ピクチリシブ、ＰＩＫ−７５、ピペンドキシフェン、ＰＫＩ−１６６、プリカマイシン、ポリ−ＩＣＬＣ、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロゲスチン類、ＰＳＫタンパク質結合多糖（担子菌コリオルス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）由来）、ＰＬＸ８３９４、ＰＸ−８６６、Ｒ−７６３、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、リダフォロリムス、リツキシマブ、ロミデプシン、ＲＴＡ７４４、ルビテカン、スクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、Ｓｄｘ１０２、セリシクリブ、セルメチニブ、セマクサニブ、ＳＦ１１２６、シロリムス、ＳＮ３６０９３、ソラフェニブ、スピロノラクトン、スクワラミン、ＳＲ１３６６８、ストレプトゾシン、ＳＵ６６６８、スベロイルアナリドヒドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎａｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）、スニチニブ、合成エストロゲン、タランパネル、タリモジーン・ラハーパレプベック、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テスミリフェン、テストステロン、テトランドリン、ＴＧＸ−２２１、サリドマイド、６−チオグアニン、チオテパ、チシリムマブ、チピファルニブ、チボザニブ、ＴＫＩ−２５８、ＴＬＫ２８６、ＴＮＦ□（腫瘍壊死因子アルファ）、トポテカン、クエン酸トレミフェン、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリコスタチンＡ、トリシリビンホスフェート（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）一水和物、パモ酸トリプトレリン、ＴＳＥ−４２４、ウラシルマスタード、バルプロ酸、バルルビシン、バンデタニブ、バタラニブ、ＶＥＧＦトラップ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビタキシン、ビテスパン（ｖｉｔｅｓｐａｎ）、ボリノスタット、ＶＸ−７４５、ワートマニン、Ｘｒ３１１、Ｚ−１００バチルス・ツベルクロシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）熱水抽出物、ザノリムマブ、ＺＫ１８６６１９、ＺＫ−３０４７０９、ＺＭ３３６３７２またはＺＳＴＫ４７４のうちのいずれか１つまたは複数を伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、１または複数の制吐薬を伴い、これらとしては、限定されるものではないが、カソピタント（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ネツピタント（ＭＧＩ−Ｈｅｌｓｉｎｎ）および他のＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン（ＭＧＩ ＰｈａｒｍａによりＡｌｏｘｉとして販売）、アプレピタント（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪによりＥｍｅｎｄとして販売）、ジフェンヒドラミン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＢｅｎａｄｒｙｌ（登録商標）として販売）、ヒドロキシジン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＡｔａｒａｘ（登録商標）として販売）、メトクロプラミド（ＡＨ Ｒｏｂｉｎｓ Ｃｏ，；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡによりＲｅｇｌａｎ（登録商標）として販売）、ロラゼパム（Ｗｙｅｔｈ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪによりＡｔｉｖａｎ（登録商標）として販売）、アルプラゾラム（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＸａｎａｘ（登録商標）として販売）、ハロペリドール（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ；Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪによりＨａｌｄｏｌ（登録商標）として販売）、ドロペリドール（Ｉｎａｐｓｉｎｅ（登録商標））、ドロナビノール（Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＧＡによりＭａｒｉｎｏｌ（登録商標）として販売）、デキサメタゾン（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪによりＤｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）として販売）、メチルプレドニゾロン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＭｅｄｒｏｌ（登録商標）として販売）、プロクロルペラジン（Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣによりＣｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）として販売）、グラニセトロン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．；Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪによりＫｙｔｒｉｌ（登録商標）として販売）、オンダンセトロン（Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣによりＺｏｆｒａｎ（登録商標）として販売）、ドラセトロン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＡｎｚｅｍｅｔ（登録商標）として販売）、トロピセトロン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪによりＮａｖｏｂａｎ（登録商標）として販売）が挙げられる。
がん治療の他の副作用としては、赤血球細胞および白血球細胞の欠乏が挙げられる。したがって、本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、かかる欠乏を治療または予防する剤、例えばフィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファまたはダルベポエチンアルファを伴う。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、ワクチンを伴う。本発明のある実施形態において、ワクチンは、抗がんワクチン、ペプチドワクチンまたはＤＮＡワクチンである。例えば、本発明のある実施形態において、ワクチンは腫瘍細胞（例えば放射線照射腫瘍細胞）または樹状細胞（例えば腫瘍ペプチドをパルスした樹状細胞）である。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）は、治療手法を伴う。治療手法は、対象の治療において医師または臨床家により行われる１または複数のステップであって、何かしら臨床的に測定可能な程度に、かかる症候の退縮もしくは消失を誘導することによって、またはかかる症候（類）、例えばがんの症候、例えば腫瘍増殖もしくは転移の進行を阻害することによって治療された対象において（例えばがんおよび／または感染性疾患の）１または複数の症候を緩和することが意図されるものである。
本発明のある実施形態において、治療手法は抗がん放射線療法である。例えば、本発明のある実施形態において、放射線療法は外部照射療法（ＥＢＴ）であり：これは高エネルギーＸ線ビームを腫瘍の場所に送達させる方法である。ビームは患者の外で（例えば直線加速器により）生成され、腫瘍部位に標的化される。これらのＸ線はがん細胞を破壊することができ、慎重な治療計画により周辺の正常組織を温存することが可能になる。放射線源は患者の体内に設置されない。本発明のある実施形態において、放射線療法は、プロトンビーム療法であり：これはＸ線の代わりにプロトンを罹患組織に照射する、あるタイプの原体療法である。本発明のある実施形態において、放射線療法は原体外部照射放射線療法であり：これは放射線療法を個々の体の構造に適合させるための先進的技術を使用する手法である。
本発明のある実施形態において、放射線療法はブラキセラピーであり：これは、体内への一時的な放射性材料の設置であり、通常、ある領域に追加用量またはブーストの放射線照射を与えるために使用される。
本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を伴って投与される外科的手法は、外科的腫瘍摘出術である。
治療的使用
本発明は、さらなる治療剤または治療手法を伴ってもよい本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）の使用により予防または治療することができる少なくとも１つの疾患または障害を予防および／または治療する方法を包含し、この方法は、その必要がある対象に薬学的活性量のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質、および／またはこれを含む医薬組成物を投与することを含む。
「治療する」または「治療すること」は、例えば、がんもしくは感染性疾患を有するまたはがんもしくは感染性疾患を有することが疑われる対象の治療において、薬剤が治療活性を有する、本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質が有効な１または複数の疾患症候を有する対象に投与することを意味する。典型的に、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は、何かしら臨床的に測定可能な程度に、かかる症候の退縮もしくは消失を誘導することによって、またはかかる症候（複数可）、例えばがんの症候、例えば腫瘍増殖もしくは転移の進行を阻害することによって治療される対象または集団において（例えばがんまたは感染性疾患の）１または複数の症候を緩和する「有効量」または「有効用量」で投与される。ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の有効量は、例えば患者の疾患ステージ、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を誘起する薬剤の能力などの因子に応じて変わり得る。
治療される対象は任意の温血動物であり得るが、とりわけ哺乳類、よりとりわけヒトである。当業者に明らかであるように、治療される対象は、とりわけ、本明細書中に言及される疾患および障害に罹患しているまたはそのリスクがあるヒトである。一般に、治療レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持されているかぎり続けられる。やはり、これは臨床家が決定することができる。
本発明はまた、本明細書中に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、ポリペプチドまたは化合物、例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７を含み、そして少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでもよい医薬組成物に関する。かかる調製物、担体、賦形剤および希釈剤は、一般に、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７の中に記載されるとおりであり得る。
本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）の医薬組成物または滅菌組成物を調製するため、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質は薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。かかる組成物は本発明の一部である。
本発明の範囲は、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）または薬学的に許容される担体を包含するが実質的に水を含まないその医薬組成物を含む、乾燥例えば凍結乾燥された組成物を包含する。
治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより調製され得る（例えばＨａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
一般に、本明細書中に言及される疾患および障害の予防および／または治療のため、治療される具体的な疾患または障害、用いられる具体的な融合タンパク質または構成物の効力および／または半減期、用いられる具体的な投与経路および具体的な医薬製剤または組成物に応じて、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、一般に、１グラム／ｋｇ体重／日から０．０１マイクログラム／ｋｇ体重／日の間の量で、好ましくは０．１グラム／ｋｇ体重／日から０．１マイクログラム／ｋｇ体重／日の間の量で、例えば約１、１０、１００または１０００マイクログラム／ｋｇ体重／日の量で、連続的に（例えば注入による）、１日１回用量としてまたは１日の間で複数回に分けた用量として投与される。臨床家は、一般に、本明細書中に言及される因子に応じて好適な１日用量を決定することが可能である。また、具体的な場合において、臨床家は、例えば上で引用される因子および自身の専門的判断を基にして、これらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかである。一般に、投与量についてのいくつかのガイダンスは、本質的に同じ経路を介して投与される同じ標的に対する同等の慣用的抗体または抗体断片が通常投与される量から、親和性／結合、有効性、体内分布、半減期および当業者に周知の同様の因子の相違を考慮して得ることができる。
ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）の対象への投与様式は変えることができる。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼球内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内が挙げられる。
適切な用量の決定は、臨床家により、例えば当該技術分野において治療に影響することが知られているまたはその可能性があるパラメーターまたは因子を用いてなされる。一般に、用量の決定において、用量は最適用量よりもいくらか少ない量で始めて、その後、何らかのネガティブな副作用に対して所望のまたは最適な効果が達成されるまで少量ずつ増加させる。重要な診断的測定値としては、症候の、例えば炎症の症候の測定値、または生産される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。一般的に、用いられる生物学的物質は治療の標的となる動物と同じ種に由来することが望ましく、それによって試薬に対する何らかの免疫応答を最小化することができる。ヒト対象の場合、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が望ましいものであり得る。ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００９２４またはＦ０２３７００９３１）の適切な用量の選択においてガイダンスが利用可能である（例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ； Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。
疾患症候が緩和されたかどうかは、その症候の重症度または進行状態を判定するために医師または他の専門の医療提供者により典型的に用いられる任意の臨床的測定により判定することができる。本発明のある実施形態（例えば治療方法または製造物）はあらゆる対象における標的の疾患症候（類）の緩和において有効でないこともあるが、当該技術分野で公知である任意の統計的検定、例えばＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、カイ２乗検定、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ検定などにより決定されるように、統計的に有意な数の対象において標的の疾患症候（類）を緩和する。
本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）はＰＤ１（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）に結合する能力があることから、これらはとりわけ、がん、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんおよび胃がんの治療または予防のために用いることができる。
本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、感染性疾患、例えばウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生生物感染症のような治療または予防のために用いることができる。本発明のある実施形態において、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、肝炎ウイルス（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス類、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスまたはアルボウイルス脳炎ウイルスよりなる群から選択されるウイルスの感染症である。本発明のある実施形態において、細菌感染症は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、桿菌、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム・テタン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、バチルス・アントリシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒｉｃｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）およびボリエラ（Ｂｏｒｒｉｅｌｌａ）よりなる群から選択される細菌の感染症である。本発明のある実施形態において、真菌感染症は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガタス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目の属（ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、アブシジア（ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）よりなる群から選択される真菌の感染症である。本発明のある実施形態において、寄生生物感染症は、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、ジアルジア・ランビア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）よりなる群から選択される寄生生物の感染症である。
本発明はまた、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を対象に投与することにより；またはインビトロでＬＡＧ３をＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質と接触させることにより、対象の体内において
・ＬＡＧ３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する方法；
・ＬＡＧ３結合をＭＨＣクラスＩＩ分子と競合させる方法；
・ＬＡＧ３結合性物質、例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質を、活性化ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の表面上のネイティブなＬＡＧ３に結合させる方法；
・ＬＡＧ３のホモダイマー化を阻害する方法；および／または
・抗原特異的Ｔ細胞のＩＬ−２産生を刺激する方法
を包含する。かかる活性は、ＬＡＧ３結合性物質を介するものであり得る。それゆえに、かかる方法はまた、ＬＡＧ３結合性物質を包含する任意の結合性物質を使用して実施され得る。
本発明はまた、ＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質（例えばＦ０２３７００９２４またはＦ０２３７００９３１）を対象に投与することにより；またはインビトロでＰＤ１をＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質と接触させることにより、対象の体内において
・ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２との結合を阻害する方法
・ＰＤ１結合性物質、例えばＰＤ１／ＬＡＧ３結合性物質をＢ細胞および／またはＴ細胞に結合させる方法
・ＰＤ１を介したＴ細胞阻害、Ｔ細胞アポトーシスおよび／またはＴ細胞消耗を遮断する方法
を包含する。かかる活性は、ＰＤ１結合性物質を介するものであり得る。それゆえに、かかる方法はまた、ＰＤ１結合性物質を包含する任意の結合性物質を使用して実施され得る。
本発明はさらに、結合性物質を抗ヒト血清アルブミン結合性物質、例えばＡＬＢ１１００２と融合することにより、結合性物質、例えばＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質の半減期を増加させる方法を包含する。
本発明はまた、一般に、その必要がある対象（すなわち、前述の疾患のうちの１つに罹患している対象）に治療的有効量の本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）を投与することを含む、前述の疾患および障害を治療する方法に関する。本発明はまた、前述の疾患または障害のうちの１つの予防または治療における使用のための本発明のＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質に関する。
本明細書中に記載されるＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）、ポリペプチド、化合物およびポリヌクレオチド（例えばベクター）は、好ましくは循環に投与される。それらはそれ自体で、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質、ポリペプチド、化合物ならびにポリヌクレオチドが循環に入ることを可能にする任意の好適な方法で、例えば静脈内に、注射もしくは注入を通じて、またはＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質、ポリペプチド、化合物ならびにポリヌクレオチドが循環に入ることを可能にする任意の他の好適な方法（経口投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚を通じた投与、鼻腔内投与、肺を介した投与などを包含するもの）で投与することができる。好適な投与方法および経路は、やはり、例えばまたＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７の教示からも当業者に明らかである。
本発明はまた、本明細書に示されるＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００８９９；Ｆ０２３７００９３１；Ｆ０２３７０１０１６；Ｆ０２３７０１０１７；Ｆ０２３７００９２４；Ｆ０２３７００９６９；Ｆ０２３７００９７０；Ｆ０２３７０１１６３；Ｆ０２３７０１１６８；Ｆ０２３７０１１７３；Ｆ０２３７０１１７ Ｆ０２３７０１１７６；８；Ｆ０２３７０１１６１；Ｆ０２３７０１１６６；Ｆ０２３７０１１７１；Ｆ０２３７０１１７６；Ｆ０２３７０１１６２；Ｆ０２３７０１１６７；Ｆ０２３７０１１７２；またはＦ０２３７０１１７７）、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドのうちのいずれか、またはそれらの医薬組成物を含む注入装置を提供する。注入装置は、非経口の経路、例えば筋肉内、皮下または静脈内を介して患者の体内に物質を導入する装置である。例えば、注入装置は、シリンジ（例えば医薬組成物を予め充填したもの、例えば自動注入器など）であり得て、これは例えば注入される液体（例えばＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質またはその医薬組成物を含むもの）を入れるためのシリンダーもしくは注射外筒、液体の注入のために皮膚および／または血管を貫くための針；ならびに液体をシリンダーから押し出して針穴を通すためのプランジャーを包含する。本発明のある実施形態において、ＰＤ１および／またはＬＡＧ３結合性物質、または、その医薬組成物を含む注入装置は、静脈内（ＩＶ）注入装置である。かかる装置は、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質またはその医薬組成物をカニューレまたはトロカール／針の中に包含し、これは、そのカニューレまたはトロカール／針を通じて対象の体内に導入される液体（例えば生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２を含み、グルコースを包含してもよい乳酸リンゲル溶液）を入れるためのバッグまたはリザーバーに取り付け得るチューブに取り付け得る。本発明のある実施形態において、トロカールおよびカニューレが対象の静脈内に挿入されてトロカールが挿入されたカニューレから取り外されると、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質またはその医薬組成物は装置内に導入され得る。ＩＶ装置は、例えば末梢静脈内（例えば手または腕の中）に；上大静脈もしくは下大静脈内に、もしくは右心房内（例えば中心ＩＶ）に；または例えば上大静脈もしくは右心房に達するまで心臓に向かって進む鎖骨下、内頚もしくは大腿静脈内（例えば中心静脈ライン）に挿入され得る。本発明のある実施形態において、注入装置は自動注射器；ジェット式注射器または外部注入ポンプである。ジェット式注射器は、表皮に浸透する液体の高圧で細い噴射を用いることで、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質またはその医薬組成物を患者の体に導入する。外部注入ポンプは、ＰＤ１および／もしくはＬＡＧ３結合性物質またはその医薬組成物を制御された量で患者の体内に送達させる医療機器である。外部注入ポンプは、電気的に動いても機械的に動いてもよい。異なるポンプは異なる方法で作動し、例えばシリンジポンプは液体をシリンジリザーバー中に入れて可動ピストンが液体の運搬を制御し、エラストマーポンプは液体を伸縮性バルーンリザーバー中に入れて弾力のあるバルーン壁からの圧力が液体の運搬を駆動する。ペリスタルティックポンプにおいては、ローラーのセットが１本のフレキシブルチューブを挟んで下り、液体を前に押す。マルチチャネルポンプにおいては、複数のリザーバーから複数の速度で液体を運搬することができる。
なおまた、図、任意の配列表および実験部／実施例は本発明をさらに説明することのみのために与えられたものであって、本明細書中に明示的に指示がないかぎり、本発明の範囲および／または添付の特許請求の範囲を何らか制限するものと理解または解釈すべきではない。
本発明の他の態様、実施形態、利点および用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
これらの例は本発明を例証することを意図しており、限定するものではない。実施例に示される組成物および方法は本発明の一部を形成する。
実施例１：一価ヒトＰＤ−１ナノボディのＣＨＯ．Ｈｐｄ−１への結合
ヒトＰＤ−１を発現した細胞への結合をヒトＰＤ−１過剰発現ＣＨＯ細胞上で評価した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＰＢＳ／１０％ ＦＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム中で調製した。１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに移し、１００μＬ ナノボディ希釈物中で再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの１μｇ／ｍｌ 抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）または抗ＨＩＳ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１３９６）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍｌ ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図５に示される。
この実施例は、抗ヒトＰＤ−１一価ナノボディＦ０２３７００７０６がこれが由来したＦ０２３７００２７５一価ナノボディと同様の様式でヒトＰＤ−１に結合することを実証した。
実施例２：一価ヒトＬＡＧ−３ナノボディの３Ａ９．ｈＬＡＧ−３への結合
ヒトＬＡＧ−３を発現した細胞への結合をヒトＬＡＧ−３過剰発現３Ａ９細胞上で評価した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＰＢＳ／１０％ ＦＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム中に調製した。１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに移し、１００μＬ ナノボディ希釈物中で再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの１μｇ／ｍｌ 抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍｌ ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図６に示される。
この実施例は、配列最適化抗ヒトＬＡＧ−３一価ナノボディＦ０２３７００８４２がこれが由来したオリジナルのＦ０２３７６６１１Ｂ０９一価ナノボディと同様の様式でヒトＬＡＧ−３に結合することを実証した。
実施例３：ヒトＰＤ−１ナノボディを含有する多重特異性ナノボディのＣＨＯ．ｈＰＤ−１および３Ａ９．アカゲザルＰＤ−１への結合
ヒトＰＤ−１およびアカゲザルＰＤ−１を発現した細胞への結合を、それぞれヒトＰＤ−１過剰発現ＣＨＯ細胞およびアカゲザルＰＤ−１過剰発現３Ａ９細胞上で評価した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＰＢＳ／１０％ ＦＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム中に調製した。１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに移し、１００μＬ ナノボディ希釈物中で再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの３μｇ／ｍｌ ＡＢＨ００７４（アルブミン結合ナノボディの半減期延長部分を認識するモノクローナル抗体である）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍｌ ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図７（Ａ−Ｂ）に示された。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がヒトＰＤ１およびアカゲザルＰＤ−１の両方に結合することを実証した。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された。
実施例４：ヒトＬＡＧ−３ナノボディを含有する多重特異性ナノボディのＣＨＯ．ｈＬＡＧ３およびＣＨＯ．アカゲザル／カニクイザルＬＡＧ３への結合
ヒトおよび非ヒト霊長類ＬＡＧ−３（細胞外ドメインはカニクイザルおよびアカゲザルとの間で同一であり；それゆえ、この遺伝子はアカゲザル／カニクイザルＬＡＧ−３と呼ばれる）を発現した細胞への結合を、ヒトおよびアカゲザル／カニクイザルＬＡＧ−３過剰発現ＣＨＯ細胞で評価した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＰＢＳ／１０％ ＦＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム中に調製した。１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレートに移し、１００μＬ ナノボディ希釈物中で再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの１−３μｇ／ｍｌ ＡＢＨ００７４（アルブミン結合ナノボディの半減期延長部分を認識するモノクローナル抗体である）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍｌ ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図８（Ａ−Ｂ）に示される。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がヒトＬＡＧ−３およびアカゲザル／カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＬＡＧ−３の両方に結合することを実証した。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された。
実施例５：生物物理学的なＰＤ−Ｌ１−ＦｃおよびＰＤ−Ｌ２−Ｆｃの遮断アッセイ
リガンド競合アッセイをヒトＰＤ−１過剰発現ＣＨＯ細胞上で実施した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＰＢＳ／１０％ ＦＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム中に調製した。ナノボディの５倍希釈系列を１μＭ（２×）から開始して作成し、１１ｎＭ（２×）のヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃまたは２９ｎＭ（２×）のヒトＰＤ−Ｌ２−ｈＦｃで予め希釈して総量２２０μＬにした。２×１０４細胞／ウェルをＶ底９６ウェルプレート中に播種し、２００μＬ／ウェルのナノボディ／リガンド希釈物中で再懸濁した。４℃で９０分間のインキュベーション後、細胞を１００μＬ／ウェル アッセイバッファーで洗浄し、１００μＬ／ウェル ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４３−０９）中で再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図９（Ａ−Ｈ）に示される。
この実施例は、抗ヒトＰＤ−１ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００７０６がこれが由来したオリジナルのＦ０２３７００２７５一価モジュールと同様にヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１（図９（Ａ））およびＰＤ−Ｌ２（図９（Ｂ））とのその相互作用を完全に遮断することを実証した。加えて、この例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１（図９（Ｃ））およびＰＤ−Ｌ２（図９（Ｄ））とのそれらの相互作用を完全に遮断することを実証した。配列最適化された単一特異性、二価の対照の抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された（図９（Ｅ−Ｆ））。最後に、この例は、抗ヒトＰＤ−１ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００９２９の付加的なアミノ酸バリアントはヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１（図９（Ｇ））およびＰＤ−Ｌ２（図９（Ｈ））とのその相互作用を完全に遮断することを実証した。なお、Ｆ０２３７００７０６およびＦ０２３７００９２９は、抗ヒトＰＤ−１一価ナノボディ本体は同一であり、それぞれＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６融合タンパク質として、またはＨＩＳ６融合タンパク質としてのものであった。
実施例６：生物物理学的ＬＡＧ−３−Ｆｃ遮断アッセイ
リガンド競合アッセイは、表面での主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ（クラスＩＩ）の高い内因性発現を示すヒトＤａｕｄｉ細胞上で実施した。ナノボディの希釈系列をアッセイバッファー：ＨＢＳＳ／２％ ＦＢＳ中で調製した。実験前に、Ｄａｕｄｉ細胞上のＦｃ受容体をヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５６４２２０）および５μｇ／ｍＬ ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、００５−０００−００３）を使用して４℃で３０分間遮断した。ナノボディの５倍希釈系列を２μＭ（２×）から開始して作成し、８０ｎＭ（２×）ヒトＬＡＧ−３−ｈＦｃで予め希釈して総量１２０μＬにした。１×１０５細胞／ウェルをＶ底９６ウェルプレート中に播種し、１００μＬ／ウェルのナノボディ／リガンド希釈物中で再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、１００μＬ／ウェル ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４３−０９）中で再懸濁した。試料を４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬ／ウェルの５ｎＭ ＴＯＰＲＯ３（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ３６０６）溶液中で再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ（ＢＤ）上での分析を行った。これらの実験からのデータは、図１０（Ａ−Ｃ）に示される。
この実施例は、抗ヒトＬＡＧ−３ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００８４２がこれが由来したオリジナルのＦ０２３７６１１Ｂ０９一価ナノボディと同様にヒトＬＡＧ−３に結合し、ＭＨＣクラスＩＩとのその相互作用を完全に遮断することを実証した（図１０（Ａ））。加えて、この例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がヒトＬＡＧ−３に結合し、ＭＨＣクラスＩＩとのその相互作用を完全に遮断することを実証した（図１０（Ｂ−Ｃ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された。
実施例７：近接二量体化アッセイ
ベータ−ガラクトシダーゼ酵素断片補完アッセイ系に基づく近接二量体化を用いた。このアッセイは、ＰｒｏＬｉｎｋ（ＰＫ）と名付けられたタグを伴って作成された融合タンパク質、および酵素アクセプタータンパク質（ＥＡ）が第二のタンパク質に融合した補完タンパク質を利用する。Ｕ２ＯＳ細胞にＥＡサブユニットに融合したＬＡＧ−３の細胞外ドメイン（１−４７７）およびＰＫサブユニットに融合したＰＤ−１の細胞外ドメイン（１−１９９）を安定的にトランスフェクトした。Ｕ２ＯＳ．ＬＡＧ３（１−４７７）−ＥＡ．ＰＤ１（１−１９９）−ＰＫ細胞株＃９を、４連で３８４ウェルプレート上のＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＣＰ５プレーティング培地中に５，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、３７℃で４時間、５％二酸化炭素インキュベーター内で接着させた。１１点のナノボディ試料１：３希釈系列を次いで細胞に加え、３７℃で一晩（１６時間）、５％二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートした。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬をウェルに加え、暗所中、室温で１時間インキュベートし、プレートを次いでルミノメーター上で読み取った。これらの実験からのデータは、図１１（Ａ−Ｂ）に示される。
この実施例は、ＰＫサブユニットおよびＥＡサブユニットが一緒にされることで活性酵素複合体が形成されて光シグナルを与えたことにより、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１が細胞膜の中に発現したヒトＰＤ−１およびヒトＬＡＧ−３に同時に結合することを実証した（図１１（Ａ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３は個別に、および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２は個別に、両標的に同時に結合することはできず、それゆえ光シグナルを生成しなかった。二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１中の個々のモジュールは、３５アミノ酸長であるグリシン−セリンリンカー（３５ＧＳ）で連結された。二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７０１０１６およびＦ０２３７０１０１７はＦ０２３７００９３１と同一のＰＤ−１およびＬＡＧ−３モジュールを含有したが、構成物中の全モジュール間のグリシン−セリンリンカーはそれぞれ２０アミノ酸長（２０ＧＳ）または９アミノ酸長（９ＧＳ）であった。この例は、グリシン−セリンリンカーを３５ＧＳから９ＧＳに短くすることが細胞膜上の両標的に同時に結合して光シグナルを与える能力に与える影響はごくわずかであることを示した。合わせて、これらのデータは、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１が、同じ細胞が両標的を発現した場合に両標的に同時に結合することができることを示した。
この実施例はまた、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４が細胞膜の中に発現したヒトＰＤ−１およびヒトＬＡＧ−３に同時に結合することを実証した（図１１（Ｂ））。二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４中の個々のモジュールは、３５アミノ酸長であるグリシン−セリンリンカー（３５ＧＳ）で連結されている。二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９６９およびＦ０２３７００９７０は、Ｆ０２３７００９２４と同一のＰＤ−１およびＬＡＧ−３モジュールを含有したが、構成物中の全モジュール間のグリシン−セリンリンカーはそれぞれ２０アミノ酸長（２０ＧＳ）または９アミノ酸長（９ＧＳ）であった。この例は、グリシン−セリンリンカーを３５ＧＳから９ＧＳに短くすることが両標的に同時に結合して光シグナルを与える能力に与える影響はごくわずかであることを示した。合わせて、これらのデータは、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４は、同じ細胞が両標的を発現した場合に、両標的に同時に結合することができることを示した。
実施例８：遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃ＋ＴＨＰ−１．ＰＤ−Ｌ１アッセイ
クローンＤＴ９９９Ａ１は、ＩＬ−２介在性のルシフェラーゼレポーターを有するＰＤ−１導入遺伝子を発現するＪｕｒｋａＴ細胞クローン（Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃ）である。Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃを、ＲＰＭＩ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ １０−０４０−ＣＶ）＋熱不活化１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０９１０．０３）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ ２５−００５−ＣＩ）＋２ｕｇ／ｍｌ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）＋０．５ｍｇ／ｍｌ ジェネテシン（Ｇｉｂｃｏ １０１３１−０２７）中で増殖させた。２×１０５細胞／ｍｌで細胞を播種した後、細胞を週に２回分割し、密度が１×１０６細胞／ｍｌを超えたら分割した。ＰＤ−Ｌ１導入遺伝子を発現するＴＨＰ−１細胞（ＴＨＰ−１．ＰＤ−Ｌ１）を、ＲＰＭＩ培地＋熱不活化１０％ ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋０．５ｕｇ／ｍｌ ピューロマイシン中で増殖させた。３×１０５細胞／ｍｌで細胞を播種した後、細胞を週に２回分割し、１×１０６細胞／ｍｌに達したら分割した。
バイオアッセイは、アッセイ培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ １１８３５−０３０）＋１０％透析ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７９．０３）を用いて準備した。ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ８７６３）を６００ｕＭストックとして調製した。アッセイ培地を用いて４×（１２０ｕＭ）溶液を調製し、２５ｕＬを白色壁で仕切られた組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０３）に加えた。アッセイ培地を用いてナノボディを希釈して出発の４×濃度を得る。６つのナノボディ１０倍段階希釈を作成する。２５ｕｌのナノボディ用量設定分をアルブミンを含有する白色壁で仕切られた組織培養処理プレートに加える。ナノボディ＋アルブミンを室温で２０−３０分間インキュベートする。ＴＨＰ−１．ＰＤ−Ｌ１細胞のＴ−７５フラスコを回収し、細胞をスピンし、１０ｍｌのアッセイ培地中で再懸濁する。細胞懸濁液をカウントして、４×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を得るように調整する。Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃ細胞のＴ−７５フラスコを回収し、細胞を遠心分離し、１０ｍｌのアッセイ培地中で再懸濁する。細胞懸濁液をカウントして、１×１０６細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃ細胞懸濁液を得るように調整する。等量のＴＨＰ−１．ＰＤ−Ｌ１細胞＋Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＩＬ２ｌｕｃ細胞を混合し、この混合懸濁液に、２ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（２×）および１００ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ−ｇ（２×）を加える。刺激条件［ＩＦＮ−ｇ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ２８５−ＩＦ／ＣＦ）＋ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）］を含有する５０ｕＬ 細胞懸濁液をナノボディ用量設定分に加える。細胞をナノボディ用量設定分とともに約２２時間、インキュベーター内でインキュベートする。２２時間終了後、１０ｕｌの５５ｎｇ／ｍｌ 抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５５３３６；１１×作業溶液）を慎重に加え、インキュベーター内にさらに２時間静置する。２時間のインキュベーション終了後、白色テープ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１９９）をプレートの底に貼り、１００ｕｌのＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を加える。振盪しながら室温で３分間インキュベートする。０．１秒の積分時間で発光読み取りが可能なプレートリーダー上でプレートを読み取る。ＲＬＵ（相対的光単位）での生データは、直接的にプロットすることも、または処理ウェルをナノボディのないウェルで除算することにより得られるルシフェラーゼシグナルの倍率変化としてプロットすることができる。これらの実験からのデータは、図１２（Ａ−Ｅ）に示される。
この実施例は、抗ヒトＰＤ−１ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００７０６はＴ細胞株が発現したヒトＰＤ−１に結合し、共培養細胞株が発現したＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を遮断することで、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞に与えている抑制を軽減すること；それによって、ＰＤ−Ｌ１介在性抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した（図１２（Ａ））。さらには、この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４はＴ細胞株が発現したヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断すること；それによって、ＰＤ−Ｌ１介在性抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した（図１２（Ｂ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された。加えて、この実施例は、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９６９およびＦ０２３７００９７０が、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９２４分子と同様の効力を有することを示した（図１２（Ｃ））。同様に、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７０１０１６およびＦ０２３７０１０１７は、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９３１分子と同様の効力を持っていた（図１２（Ｄ））。また、この実施例は、配列最適化抗ヒトＰＤ−１ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００７０６の付加的なアミノ酸バリアントがＴ細胞株が発現したヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断すること；それによって、ＰＤ−Ｌ１介在性抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した（図１２（Ｅ））。
実施例９：ＳＥＢ活性化ヒトＰＢＭＣアッセイ
１０％ヒト血清（ＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１１８７５０８５）、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１５１４０１４８）、１×ベータ−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ２１９８５０２３）、１×ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１５６３００８０）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１１３６００７０）、１×非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ１１１４００７６）、ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログＨ４５２２−１００ＭＬ ｌｏｔ＃ＳＬＢＰ２７８３Ｖ）を添加した完全ＲＰＭＩ中のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍した。２．５Ｅ６細胞／ｍＬを懸濁し、１００ｕＬの一定分量を９６ウェルＵ底プレートに２．５Ｅ５細胞／ウェルで加えた。ナノボディを３倍希釈系列を用いて段階希釈して４×の作業ストックを調製し、６点の用量応答曲線を作った。５０ｕＬのナノボディ溶液をウェルに加え、連鎖球菌のエキソトキシンＢ（ＳＥＢ）溶液を調製しながら、室温で１５−３０分間インキュベートした。ストックのＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、カタログＢＴ２０２）を、蒸留水中でＳＥＢを１ｍｇ／ｍＬで再構成することにより調製し、−８０℃で冷凍した。２ｕｌのストックを１ｍＬの培地に加えることにより２ｕＭの作業溶液を作成し、２ｕＭ作業溶液を、１０倍希釈系列を用いて段階希釈して滴定曲線を作成した。５０ｕＬを内部標準として適切なウェルに加えて滴定曲線を作成し、アッセイが予想通りに実施されていることを確認し、異なるドナーから惹起することができる最大応答を決定した。２ｕＭ ＳＥＢ作業溶液を４０ｎＭ ＳＥＢに希釈し、５０ｕＬをウェルに加えて、ＰＢＭＣを刺激した（ＳＥＢ終濃度は１０ｎＭ）。３８℃で７２時間、５％ ＣＯ２でインキュベートする。上の１００ｕＬ上清を新たな９６ウェルプレート内に移し、ＭＳＤ Ｖ−ｐｌｅｘヒトＩＬ−２キット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｋ１５１ＱＱＤ−１）を用いたＩＬ−２分析のために１：２希釈する。念のため−８０℃で保存した。これらの実験からのデータは、図１３（Ａ−Ｒ）に示される。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４が、複数のドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＴ細胞受容体アゴニスト刺激後にＩＬ−２レベルの増加を生じさせることを実証した（Ａ−Ｒ）。
実施例１０：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）から精製し、液体窒素フリーザー内で凍らせた。冷凍ヒトＰＢＭＣを解凍し、完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清）中で希釈し、４５０×ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを完全ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１１８７５−１１９）；ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｈ４５２２−１００ｍＬ）中で再懸濁した。単球を、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１９０５９）を用いて濃縮した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２１５−ＧＭ−１１０）および５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２０４−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を含有する完全ＲＰＭＩ中１×１０６細胞／ｍｌ（５ｍｌ／ウェル）で、６ウェルプレートに移した。単球を３７℃で５日間インキュベートして、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。単球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を６日目に回収し、カウントし、ＭＬＲアッセイ中で刺激物質として用いた。
実験開始日に冷凍ヒトＰＢＭＣを解凍し、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する完全ＲＰＭＩ中で２倍希釈した。各ドナーからのＣＤ４ Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１７９５２）を用いて濃縮した。分離されたＣＤ４ Ｔ細胞を完全ＲＰＭＩ中に１×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。Ｍｏ−ＤＣを１：１０の比（１×１０５細胞／ｍｌ）でＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）と混合し、細胞混合物を２００ｕｌ／ウェルでＵ底９６ウェルプレート中に播いた。ナノボディを４倍希釈系列を用いて段階希釈し、５×作業ストックを調製した。５０μＬの各希釈物を２００μＬ培養液に加え、１×終濃度のナノボディ／抗体を与えた。実験開始後５日目に、Ｖ−ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；Ｋ１５０５２Ｄ−１）を用いたＩＦＮγ定量のために培養上清を集めた。これらの実験からのデータは、図１４（Ａ−Ｆ）に示される。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４が、異なるドナーから得られたアロジェニックＭｏ−ＤＣでの初回のＣＤ４ Ｔ細胞刺激後にＩＦＮ−ガンマレベルの増加を生じさせることを実証した（ａ−ｆ）。
実施例１１：遺伝子改変３Ａ９．ｈＬＡＧ−３アッセイ
３Ａ９．ｈＬＡＧ３は、ヒトＬＡＧ−３導入遺伝子を発現するマウス３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマである。ＬＫ３５．２（ＡＴＣＣ；ＨＢ−９８）は、クラスＩＩ拘束３Ａ９ Ｔ細胞ハイブリドーマに対する特異的抗原（すなわち、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ペプチドＤＧＳＴＤＹＧＩＬＱＩＮＳＲＷＷ）を提示するＩ−ＡｄｋおよびＩ−Ｅｄｋ分子を表面に有するマウスＢ細胞ハイブリドーマである。３Ａ９．ｈＬＡＧ３細胞をカウントし、新たな培地［ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６１８７０−０３６）＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ］に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＬＫ３５．２細胞をカウントし、新たな培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。２５μＬ ３Ａ９．ｈＬＡＧ３細胞（１Ｅ５細胞）を９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６１０）内のウェルに加えた。ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ８７６３）の４×（２００ｕＭ）溶液を調製し、２５μＬを細胞に加えた。ナノボディを完全培地中に５×濃度に希釈し、２０ｕｌの５×ナノボディを細胞に加えた。３Ａ９．ｈＬＡＧ３細胞をナノボディと共に３７℃で３０分間インキュベートした。
５００μＭ ＨＥＬペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカスタムペプチド）ストック溶液を調製し、−２０Ｃで保存した。ＨＥＬペプチドストックを１：２０（２５ｕＭ）で細胞培地中に希釈し、次いでさらにＨＥＬペプチドをＬＫ３５．２細胞に対して１：８３３に希釈した（最終ＨＥＬ濃度＝約３０ｎＭ）。ＬＫ３５．２細胞をペプチドと共に３７℃で３０分間インキュベートした。３３μＬ ペプチド処理ＬＫ３５．２細胞を、ナノボディ処理３Ａ９．ｈＬＡＧ−３細胞を含有する９６ウェルプレートに加えた。培養物を３７℃で２４時間インキュベートした。プレートを３００×ｇで５分間スピンし、ＩＬ−２分析（ＩＬ−２ Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｖ−Ｐｌｅｘ；Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｋ１５２ＱＱＤ−４）のために上清を集めた。これらの実験からのデータは、図１５（Ａ−Ｄ）に示された。
この実施例は、抗ヒトＬＡＧ−３ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００８４２はＴ細胞株が発現したヒトＬＡＧ−３に結合し、共培養細胞株が発現したＭＨＣクラスＩＩとのＬＡＧ−３の相互作用を遮断することで、ＭＨＣクラスＩＩがＴ細胞に与えている抑制を軽減すること；それによって、ＭＨＣクラスＩＩ介在性抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した。抗ヒトＬＡＧ−３ナノボディ一価モジュールＦ０２３７００８４２によるＭＨＣクラスＩＩを阻害する効力は、これが由来した元のナノボディＦ０２３７００６５６のそれと同様であった（図１５（Ａ））。さらには、この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がＴ細胞株が発現したヒトＬＡＧ−３に結合してＭＨＣクラスＩＩとのＬＡＧ−３の相互作用を遮断し；それによって、ＭＨＣクラスＩＩ介在性抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した（図１５（Ｂ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００９６２もまた示された。加えて、この実施例は、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９６９およびＦ０２３７００９７０が、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９２４分子と同様の効力を有することを示した（図１５（Ｃ））。同様に、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７０１０１６およびＦ０２３７０１０１７は、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９３１分子と同様の効力を持っていた（図１５（Ｄ））。
実施例１２：遺伝子改変二重特異性Ｊｕｒｋａｔ．ｈＰＤ−１．ＬＡＧ−３バイオアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ．ＬＡＧ−３．ＰＤ−１細胞（ＤＴ１０８８−クローンＧ１０ＰＤ１）の作製
選択マーカーとしてピューロマイシンを有するレトロウイルス送達系を用いて、ヒトＬＡＧ−３導入遺伝子をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｊｅ６．２．１１）内に導入した。限界希釈を行い、最適なＬＡＧ−３およびＣＤ３発現を有するクローン（ＤＴ１０８８Ｇ１０）を選び出した。選択マーカーとしてゲンチシンを有するレンチウイルス送達系を用いて、ヒトＰＤ−１導入遺伝子をＤＴ１０８８Ｇ１０クローン内に導入した。ＬＡＧ−３およびＰＤ−１の高発現によって細胞をＦＡＣＳでソートした。ソートした細胞プールを、ＲＰＭＩ完全培地［１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０９１０．０３）＋１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、１３−１１５Ｅ）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ、２５−００５−ＣＩ）＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２６−０６０−ＣＩ）＋１×非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１４５）＋０．２ｕｇ／ｍｌ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）＋０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ １０１３１−０２７）を補充したＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ １０−０４０−ＣＶ）］中で維持し、継代培養した。
Ｒａｊｉ．ＰＤ−Ｌ１発現細胞の作製
選択マーカーとしてピューロマイシンを有するレトロウイルス送達系を用いて、ヒトＰＤ−Ｌ１導入遺伝子をＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）内に導入した。ＰＤ−Ｌ１およびクラスＩＩの（内因性）発現によって細胞をソートして濃縮した。濃縮された細胞プールを、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．２５ｕｇ／ｍｌ ピューロマイシンを補充したＲＰＭＩ培地）中で維持し、継代培養した。
滅菌蒸留水中でＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＤＴ３０３）を１ｍｇ／ｍＬで再構成することによりストックのＳＥＤ毒素を調製し、−８０℃で保存した。０．８７×１０６Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞／ｍｌの懸濁液を、ＳＥＤ毒素（１．３×＝１３０ｎｇ／ｍｌ、最終１００ｎｇ／ｍｌ）と共に１０％透析ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７９．０３）を含有するＲＰＭＩ培地中で３０分間、３７℃インキュベーター内でインキュベートすることにより、Ｒａｊｉ．ＰＤ−Ｌ１細胞に毒素を予備負荷した。１０％透析ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に８×１０６Ｊｕｒｋａｔ．ＬＡＧ−３．ＰＤ−１細胞／ｍｌの懸濁液を調製した。ナノボディは、出発アッセイ濃度が１０ｕｇ／ｍｌの、８点の４倍用量設定（１２×＝１２０μｇ／ｍｌ）のナノボディとして調製した。
４５ｕｌ Ｊｕｒｋａｔ．ＬＡＧ−３．ＰＤ−１細胞懸濁液（８×１０６細胞／ｍｌ）を、４５ｕｌのナノボディ用量設定分と共に室温で３０分間、丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３５９）内でインキュベートした。３０分終了時に、３６ｕＬ ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ８７６３；１５Ｘ＝４５０ｕＭ、３０ｕＭの最終アッセイ濃度を得るため）をＪｕｒｋａｔ．ＬＡＧ−３．ＰＤ−１＋ナノボディ混合物に加えた。１１５ｕｌ ＳＥＤ負荷Ｒａｊｉ．ＰＤ−Ｌ１細胞をアッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１６７００８）に加えた。ＳＥＤ負荷Ｒａｊｉ．ＰＤ−Ｌ１細胞に、Ｊｕｒｋａｔ．ＬＡＧ−３．ＰＤ−１＋ナノボディ＋アルブミンの混合物３５ｕＬを慎重に層状に重ねた。アッセイプレートを、３７℃で２４時間、５％ ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、７５ｕＬ 上清をプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３６０５）に移し、−８０℃で冷凍した。試料は、ＭＳＤ ＩＬ−２ Ｖ−ｐｌｅｘキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ装置 Ｃａｔ＃Ｋ１５１ＱＱＤ）を用いて分析した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを用いて算出した。これらの実験からのデータは、図１６（Ａ−Ｂ）に示される。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がＴ細胞株が発現したヒトＰＤ−１およびヒトＬＡＧ−３の両方に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断し、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を遮断し；それによって、ＰＤ−Ｌ１介在性およびＭＨＣクラスＩＩ介在性の２つの抑制の阻害に基づいてＴ細胞をＴ細胞受容体アゴニストに対してより大きく応答させることを実証した（図１６（Ａ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００８６２は個々で２つの阻害メカニズムのうちの１つのみを遮断することができ、これはもっとより控えめにＴ細胞受容体アゴニストに応答するＴ細胞を導いた。加えて、この実施例は、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９６９およびＦ０２３７００９７０が３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９２４分子と同様の効力を有することを示した。同様に、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７０１０１６およびＦ０２３７０１０１７は、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９３１分子と同様の効力を持っていた（図１６（Ｂ））。
実施例１３：ヒトＴ細胞クローン＋ＪＹ．ｈＰＤ−Ｌ１アッセイ
ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンの作製および培養
ＭＨＣクラスＩＩ同種抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンＢＣ４−４９を、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株ＪＹとの２ラウンドの混合白血球反応により作製し、限界希釈によりクローニングした。クローンを２週間間隔で同種特異的抗原を使用して再刺激し、Ｙｓｓｅｌ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ １２４４０−０５３；ヒト血清ＡＢ、Ｇｅｍｉｍｉ １００５１２；ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ３０−００２−ＣＩ；ヒトアルブミン、Ｓｉｇｍａ Ａ９０８０；ＩＴＳ−Ｘ、Ｇｉｂｃｏ ５１５０００５６；トランスフェリン、Ｒｏｃｈｅ １０６５２２０２００１；ＰＡ Ｂｉｏｘｔｒａ Ｓｉｇｍａ ｐ５５８５；ＬＡ−ＯＡ−アルブミン、Ｓｉｇｍａ Ｌ９６５５）中で培養した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒにより提供された２つのヒトバフィーコートから新たなＰＢＭＣを分離し、１：１の細胞比でプールした。ＰＢＭＣを、使用前にガンマ線照射器内で線量４０００ｒａｄで放射線照射した。野生型ＪＹ細胞を調製し、線量５０００ｒａｄで放射線照射した。Ｔ細胞クローンをフィーダーと共に、２４ウェルプレート内で、１ｍＬ／ウェルで、ＣＤ４＋ Ｔ細胞 ０．２×１０６／ｍＬ、照射ＰＢＭＣ １×１０６／ｍＬ、照射ＪＹ ０．１×１０６／ｍＬ、および１００ｎｇ／ｍＬ ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ Ｌ９０１７）の終濃度で培養した。組換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２０２−ＩＬ／ＣＦ）を再刺激後３日目に終濃度１００ｎｇ／ｍＬで加え、増殖全体を通して３−４日毎に補充した。細胞を、０．５−１．０×１０６／ｍＬの間の最適濃度まで継代した。再刺激後７日目に、豊富なレベルのＬＡＧ−３および中程度のレベルのＰＤ−１がＴ細胞表面上に発現した。
ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞機能アッセイ
同種抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、抗原再刺激後７日目に２４ウェル培養プレートから回収し、次いで遠心分離により２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５７５−３８）を含有する２０ｍＬ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００２８０２）で２回洗浄した。ペレットをＹｓｓｅｌ培地中で再懸濁し、単一細胞懸濁液にした。試験ナノボディを、最高濃度１３３ｎＭから開始してＹｓｓｅｌ培地中で５倍連続希釈し、９６ウェルＵ底培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７７）中で１００μＬの容量で合計７回希釈することにより用量設定した。密度４×１０５細胞／ｍＬの５０マイクロリットルのＴ細胞懸濁液を、用量設定したナノボディを含有するウェル内に加えた。ナノボディ／Ｔ細胞混合物を、５％ ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター内で１時間プレインキュベートした。ヒトＰＤ−Ｌ１導入遺伝子を発現するＪＹ細胞（ＪＹ．ｈＰＤ−Ｌ１）を、共培養中で用いて、同種特異的抗原を提供した。Ｔ−７５フラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５６４９９）中、１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、１０−０４０−ＣＶ）中で培養したＪＹ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞を回収し、ガンマ線照射装置内で５０００ｒａｄの線量で放射線照射し、次いで遠心分離により２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ペレットをＹｓｓｅｌ培地中で再懸濁し、４０μｍ細胞ストレーナーでろ過した後に播いた。５０μＬ／ウェルの、濃度２×１０５細胞／ｍＬのＪＹ．ｈＰＤ−Ｌ１懸濁液を、プレインキュベートしたナノボディ−Ｔ細胞混合物に、２：１のＴ細胞対ＪＹ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞比で分注した。全ての条件は二重に行った。約３日間の培養後、１ウェルあたり１００μＬの上清をヒトＩＦＮγ定量のために回収した。ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡを実施し、ｈＩＦＮγ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＩＦ５０）を用いることにより、２連からプール上清のＩＦＮγレベルを判定した。アッセイは、製造業者により提供された標準的プロトコールに従って行った。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを用いて算出した。これらの実験からのデータは、図１７（Ａ−Ｃ）に示される。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４がＴ細胞クローンが発現したヒトＰＤ−１およびヒトＬＡＧ３の両方に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断し、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を遮断し；それによって、ＰＤ−Ｌ１介在性およびＭＨＣクラスＩＩ介在性の２つの抑制の阻害に基づいてＴ細胞をアロジェニック刺激に対してより大きく応答させることを実証した（図１７（Ａ））。単一特異性、二価の対照抗ヒトＰＤ−１ Ｆ０２３７００９３３および抗ヒトＬＡＧ−３ Ｆ０２３７００８６２は、個々に２つの阻害メカニズムのうちの１つのみを遮断することができ、これはもっとより控えめにアロジェニック刺激に応答するＴ細胞を導いた。加えて、この実施例は、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９６９およびＦ０２３７００９７０が、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９２４分子と同様の効力を有することを示した（図１７（Ｃ））。同様に、それぞれ２０ＧＳまたは９ＧＳリンカーを含有する二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７０１０１６およびＦ０２３７０１０１７は、３５ＧＳリンカーを含有する元のＦ０２３７００９３１分子と同様の効力を持っていた（図１７（Ｂ））。
実施例１４：Ｆ０２３７００９２４およびＦ０２３７００９３１へのプレ抗体結合の評価
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上に捕捉されたナノボディへの先在抗体の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実験を実施した。ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣ Ｓｅｎｓｏｒ ＣｈｉｐのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μＬ／分）で活性化し、ヒト血清アルブミン（ｈａｓ）をＰｒｏｔｅＯｎ Ａｃｅｔａｔｅバッファー ｐＨ４．５中に１０μｇ／ｍｌで注入（流速１００μｌ／分）することで固定化レベルを約３６００ＲＵにした。固定化の後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μＬ／分）で不活性化した。ナノボディをＨＳＡ表面上に４５μＬ／分で２分間注入し、ナノボディ捕捉レベルを三価のＦ０２３７００９２４について約６００ＲＵにして、五価のＦ０２３７００９３１について約１０００ＲＵにした。先在抗体を含有する試料をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）中で１：１０に希釈してから、その後４５μｌ／分で２分間注入し、続いて４００秒の解離ステップを行った。各サイクルの後（すなわち、新たなナノボディ捕捉および血液試料注入ステップの前）、４５μｌ／分で２分間のＨＣｌ（１００ｍＭ）注入でＨＳＡ表面を再生させた。センサーグラムの加工およびデータ解析は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。１）ナノボディ−ＨＳＡ解離および２）ＨＳＡのみを含有する参照リガンドレーンへの非特異的結合を差し引くことによる二重参照の後に、先在抗体の結合を示すセンサーグラムを得た。先在抗体の結合レベルは、レポート時を１２５秒（会合終了の５秒後）に設定することにより決定した。参照として、先在抗体を含有する試料はまた、これらの先在抗体（Ｔ０１３７００１１２）の結合を低減させるために改変されていない三価のナノボディの結合についても試験した。これらの実験からのデータは、図１９（Ａ−Ｉ）に示される。
二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４は３つのナノボディモジュール（１つのＰＤ−１モジュール、１つのＬＡＧ−３モジュールおよび１つの抗アルブミンモジュール）を持ち；一方、Ｆ０２３７００９３１は５つのナノボディモジュール（２つのＰＤ−１モジュール、２つのＬＡＧ−３モジュールおよび１つの抗アルブミンモジュール）を持っていた。配列最適化アプローチの１つの構成要素は、ヒト血清中に存在するナノボディモジュールへの反応性を減少させるナノボディフレームワーク内へのアミノ酸置換の組み込みであった。この実施例は、健常ヒトドナーからの血清パネル中に見出される３モジュールの二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４への先在的な反応性が、これらのフレームワークアミノ酸置換を含有しない異なる３モジュールのナノボディＴ０１３７００１１２構成物への先在的な反応性と比べて２つの時点で低減したことを実証した。５モジュールの二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１の反応性は、３モジュールのＦ０２３７００９２４よりも高かった（図１９（Ａ−Ｂ））。加えて、この実施例は、がん患者からの血清パネル中に見出される３モジュールの二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９２４への先在的な反応性が、これらのフレームワークアミノ酸置換を含有しない異なる３モジュールのナノボディＴ０１３７００１１２構成物への先在的な反応性と比べて、２つの時点で低減したことを実証した。５モジュールの二重特異性抗ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１の反応性は、３モジュールのＦ０２３７００９２４よりも高かった（図１９（Ｃ−Ｄ））。最後に、Ｆ０２３７００９２４およびＦ０２３７００９３１に対するがん患者からの血清パネルの反応性は、がんの徴候に基づいて分かれた（図１９（Ｅ−Ｉ））。
実施例１５：配列最適化ヒトＬＡＧ−３ナノボディの表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
ナノボディのカイネティクス分析は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術により、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実験を実施した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５の２つのフローチャネルをＥＤＣ（２００ｍＭ）／ＮＨＳ（５０ｍＭ）で活性化し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００８３９）を供給される固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０）中に５μｇ／ｍｌで注入することで、固定化レベルを約２０００ＲＵにした。固定化の後、表面を１Ｍ エタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で不活性化した。センサー調製時の流速は５μＬ／分に設定した。
カイネティクス分析において、６２．５ｎＭ ヒトＬＡＧ３−ｈＦｃを１つの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）表面上に１０μＬ／分で１分間注入し、補足レベルを約６００ＲＵにした。ナノボディの２．５倍段階希釈物（すなわち、Ｆ０２３７００８４２について５μＭから３．３ｎＭに下げたもの）をランニングバッファー中で作成してから、その後４５μＬ／分で２分間注入し、続いて９００秒の解離を行った。各サイクルの後（すなわち、新たなヒトＬＡＧ３−ｈＦｃ補足およびナノボディ注入ステップの前）、１０μＬ／分で２分間のＭｇＣｌ２（３Ｍ）注入で抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ）表面を再生させた。
センサーグラムの加工およびデータ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。１）ヒトＬＡＧ３−ｈＦｃ／抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ）解離および２）参照フローチャネルへの非特異的結合を差し引くことによる二重参照の後に、ナノボディの結合を示すセンサーグラムを得た。モデル「Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」を使用したフィッティングによって、加工された曲線を評価した。
この実施例は、抗ヒトＬＡＧ−３一価ナノボディＦ０２３７００８４２が高いアフィニティーを有してヒトＬＡＧ−３に結合することを実証した。
表Ｅ．ヒトＬＡＧ−３ナノボディの表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
Figure 0006817302
実施例１６：配列最適化ヒトＰＤ−１ナノボディの表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
ナノボディのカイネティクス分析は、ＳＰＲ技術により、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実験を実施した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５の２つのフローチャネルをＥＤＣ（２００ｍＭ）／ＮＨＳ（５０ｍＭ）で活性化した。ｈＰＤ−１−ｈＦｃを、１つの表面上に好適な固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ４．５）中、５μｇ／ｍｌで注入（４回）することで、固定化レベルを３０３ＲＵにした。固定化の後、表面を１Ｍ エタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で不活性化した。センサー調製時の流速は５μｌ／分に設定した。
カイネティクス分析において、ナノボディの２．５倍段階希釈物（すなわち、Ｆ０２３７００９２９、Ｆ０２３７０１１９２およびＦ０２３７０１１９３について１μＭから０．４６ｎＭに下げたもの）をランニングバッファー中で作成してから、その後４５μｌ／分で２分間注入し、続いて９００秒の解離を行った。各サイクルの後（すなわち、新たなナノボディ注入ステップの前）、４５μｌ／分で１分間の１０ｍＭグリシン ｐＨ１．５注入でｈＰＤ１−ｈＦｃ表面を再生させた。センサーグラムの加工およびデータ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。１）参照フローチャネルへの非特異的結合および２）ＨＢＳ−ＥＰ＋注入を差し引くことによる二重参照の後に、ナノボディの結合を示すセンサーグラムを得た。モデル「Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」を使用したフィッティングによって、加工された曲線を評価した。
この実施例は、抗ヒトＰＤ−１一価ナノボディＦ０２３７００９２９が高いアフィニティーを有してヒトＰＤ−１に結合することを実証した。加えて、この実施例は、配列最適化抗ヒトＰＤ−１一価Ｆ０２３７００９２９の付加的なアミノ酸バリアント（すなわち、Ｆ０２３７０１１９２およびＦ０２３７０１１９３）が高いアフィニティーを有してヒトＰＤ−１に結合することを実証した。
表Ｆ．配列最適化ヒトＰＤ−１ナノボディの表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
Figure 0006817302
実施例１７：異なる種のアルブミンに対する配列最適化された多重特異性ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３の、表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
ナノボディのカイネティクス分析は、ＳＰＲ技術により、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実験を実施した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５の４つのフローチャネルをＥＤＣ（２００ｍＭ）／ＮＨＳ（５０ｍＭ）で活性化し、ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．Ａ３７８２、ｌｏｔ．ＳＬＢＤ７２０４Ｖ）またはアカゲザル血清アルブミン（ＢｉｏＷｏｒｌｄ、ｃａｔ．２２０７００９９−１、ｌｏｔ．Ｌ１５０９１００１ＤＡ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ４．５中、５μｇ／ｍｌで注入することで、３つのフローチャネル上での固定化レベルをそれぞれ１７９から３１２ＲＵの間にした。固定化の後、表面を１Ｍ エタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で不活性化した。センサー調製時の流速は５μｌ／分に設定した。
カイネティクス分析において、ナノボディの３倍段階希釈物（すなわち、６μＭから２．７ｎＭに下げたもの）をランニングバッファー中で調製してから、その後４５μｌ／分で２分間注入し、続いて９００秒の解離を行った。各サイクルの後（すなわち、新たなナノボディ濃度が注入される前）、１００μｌ／分で１０秒間の１０ｍＭグリシン ｐＨ１．５注入で全ての表面を再生させた。
センサーグラムの加工およびデータ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。１）参照フローチャネルへの非特異的結合および２）特定のフローチャネルに対する２回のＨＢＳ−ＥＰ＋注入の平均値を差し引くことによる二重参照の後に、ナノボディの結合を示すセンサーグラムを得た。モデル「Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」を使用したフィッティングによって、加工された曲線を評価した。
この実施例は、二重特異性抗ヒトＰＤ１／ＬＡＧ−３ナノボディＦ０２３７００９３１およびＦ０２３７００９２４が、同様のアフィニティーでヒトアルブミンおよびアカゲザルアルブミンの両方に結合することを実証した。
表Ｇ．異なる種のアルブミンに対する配列最適化された多重特異性ヒトＰＤ−１／ＬＡＧ−３の、表面プラスモン共鳴によるアフィニティー測定
Figure 0006817302

Claims (14)

  1. 配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を含むＰＤ１に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むＰＤ１結合性物質であって、更に、１１位および８９位のアミノ酸が、それぞれアミノ酸ＶおよびＬへの置換を有し、
    ここで前記残基番号はＫａｂａｔ残基番号である、前記ＰＤ１結合性物質。
  2. 前記ＩＳＶＤが、
    アミノ酸配列ＩＨＡＭＧ（配列番号３）またはＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧ（配列番号６）を含むＣＤＲ１；
    アミノ酸配列ＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４；ここでＸはＷまたはＶである）またはＶＩＴＸＳＧＧＩＴＹ（配列番号７；ここでＸはＷまたはＶである）を含むＣＤＲ２；および
    アミノ酸配列ＤＫＨＱＳＳＸＹＤＹ（配列番号５、ここでＸはＷまたはＦである）を含むＣＤＲ３
    を含む、請求項１に記載のＰＤ１結合性物質。
  3. 前記ＩＳＶＤが、以下のアミノ酸配列：
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳ
    ＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶ ＩＴＷＳＧＧＩＴＹＹ
    ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹ ＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤ
    ＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫ ＨＱＳＳＷＹＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
    （配列番号５７、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）；
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＷＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９９、またはＥ１Ｄ変異を含むその配列）；
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０３、またはＤ１Ｅおよび／またはＮ７３Ｓ変異を含むその配列）；
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＱＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０４、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）；または
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＰＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０５、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）、または
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＰＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１３のアミノ酸１−１１９、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）；または
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＱＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７のアミノ酸１−１１９、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）；または
    ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＶＳＧＧＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＧＤＫＨＱＳＳＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２１のアミノ酸１−１１９、またはＤ１Ｅ変異を含むその配列）、を有するＩＳＶＤを提供するように、アミノ酸置換を更に含み、
    そして、半減期エクステンダーおよび／またはＣ末端エクステンダーを含んでもよい、請求項２に記載のＰＤ１結合性物質。
  4. ＰＤ１結合性物質が、Ｃ末端において、配列番号５９のアミノ酸配列を含む半減期エクステンダーに結合している、請求項１に記載のＰＤ１結合性物質。
  5. 更にＣ末端エクステンダーを含む請求項１または４に記載の結合性物質であって、ここでＣ末端エクステンダーがアラニンである、前記ＰＤ１結合性物質。
  6. 請求項１に記載のＰＤ１結合性物質を含む、注入装置または容器。
  7. 請求項１に記載のＰＤ１結合性物質をコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 請求項７のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  9. 請求項７〜８のいずれか一項のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞。
  10. 結合性物質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記結合性物質の発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして、前記宿主細胞および／または前記培地から結合性物質を精製することを含んでもよい、請求項１に記載のＰＤ１結合性物質を作成する方法。
  11. 対象において免疫応答を増強するための医薬の調製のための、請求項１に記載のＰＤ１結合性物質の使用。
  12. ヒト対象においてがんまたは感染性疾患を治療または予防するための医薬の調製のための、請求項１に記載のＰＤ１結合性物質の使用。
  13. がんが、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんまたは胃がんである、請求項１２に記載の使用。
  14. 感染性疾患が、細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症である、請求項１２に記載の使用。
JP2018525608A 2015-11-18 2016-11-17 Ｐｄ１および／またはｌａｇ３結合性物質 Active JP6817302B2 (ja)

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