PT1687338E - Anticorpos de domínio único vhh de camelídeos direccionados para o receptor do factor de crescimento epidérmico e suas utilizações - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO VHH DE CAMELÍDEOS DIRECCIONADOS PARA O RECEPTOR DO FACTOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO E SUAS UTILIZAÇÕES"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona anticorpos de domínio único de acordo com a reivindicação 1. A presente invenção refere-se, adicionalmente, à sua utilização no diagnóstico e terapia. Tais anticorpos podem ter uma sequência estrutural com elevada homologia para as sequências estruturais humanas. São descritas composições compreendendo anticorpos apenas para o receptor do factor de crescimento epidérmico ou em combinação com outros fármacos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O EGFR faz parte da família de receptores ERBB, a qual tem quatro membros intimamente relacionados - EGFR (ERBB1), HER2 (ERBB2), HER3 (ERBB3) e HER4 (ERBB4) - que consistem num domínio extracelular de ligação ao ligando, um domínio transmembranar e um domínio intracelular de tirosina cinase (Yarden et ai. 2001, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 127-137). O primeiro passo na estimulação mitogénica das células epidérmicas é a ligação específica dos ligandos tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF) ou a transformação do factor alfa (TGFa) numa glicoproteína de membrana conhecida como o receptor do factor de crescimento epidérmico (receptor EGF). (Carpenter et al. 1979, Epidermal Growth Factor, Annual Review Biochem., Vol. 48, 193-216). O receptor EGF é composto por 1.186 aminoácidos que estão divididos numa porção extracelular de 621 resíduos e uma porção citoplasmática de 542 resíduos 2 ligados por um segmento transmembranar hidrófobo de 23 resíduos. (Ullrich, et al., 1986, Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-425). A porção externa do receptor EGF pode ser subdividida em quarto domínios. Foi demonstrado que os domínios I e III, flanqueados pelos dois domínios ricos em cisteína, são prováveis de conter o local de ligação do EGF ao receptor. (Ogiso et al., 2002. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell 110, 775-787. Garrett et al., 2002. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 110. 763-773). A ligação do EGF monovalente aos domínios I e III leva à iniciação das respostas pleiotrópicas que conduzem à síntese do ADN e à proliferação e diferenciação celular. A ligação do ligando monovalente ao EGFR causa uma alteração conformacional do domínio II do ectodomínio do receptor, conduzindo à dimerização do receptor que activa a actividade da tirosina cinase no domínio intracelular. Isto leva à transfosforilação do receptor e à iniciação de uma miríade de cascatas de transdução de sinal. A activação do EGFR tem sido implicada nos processos envolvidos no crescimento e progressão do tumor, incluindo a proliferação celular, angiogénese, metástases, inibição da apoptose e resistência à rádio e quimioterapia. O EGFR é expresso numa larga variedade de tumores de origem epitelial, incluindo >40% do CPNPC (cancro do pulmão de não-pequenas células), >95% do cancro da cabeça e pescoço, >30% do cancro pancreático, >90% do carcinoma renal, >35% do cancro do ovário, >40% do glioma e >31% do cancro da bexiga (Salomon et al., 1995. Crit. Review Oncol. Hematol., 19, 183-232). 3
Aparentemente, níveis elevados da expressão do EGFR estão associados com a progressão da doença, Com o aumento da metástase e um prognóstico pobre, fornecendo uma filosofia forte no que diz respeito ao desenvolvimento de anticorpos eficazes, direccionados ao EGFR, para o tratamento de vários tumores sólidos. Foi verificado em vários tipos de células humanas de tumor, que estas células são caracterizadas por uma desregulação da sinalização do receptor EGFR devido à sobre-expressão do receptor e à presença de heterodímeros EGFR constitutivamente sinalizadores ou formas mutantes do EGFR. As células do cancro da mama exibem uma correlação positiva entre a densidade do receptor EGFR e a dimensão do tumor e uma correlação negativa com a extensão da diferenciação. (Sainsbury et al., 1985, Epidermal Growth Factor Receptors and Oestrogen Receptors in Human Breast Câncer, Lancet, Vol. 1, 364-366; Sainsbury et al., 1985, Presence of Epidermal Growth Factor Receptor as an Indicator of Poor Prognosis in Patients with Breast Câncer, J. Clin. Path., Vol. 38, 1225-1228; Sainsbury et al., 1987, Epidermal
Growth Factor Receptor Status as Predictor of Early Recurrence and Death From Breast Câncer, Lancet, Vol. 1, 1398-1400) . Como os fibroblastos e os queratinócitos sinoviais são tipos de células que também expressam o receptor EGF, estas células são células alvo candidatas para o tratamento d artrite inflamatória e da psoríase, respectivamente. O EGFR também foi implicado em várias outras doenças, tais como a artrite inflamatória (US 5906820, US 5614488) e a hipersecreção do muco nos pulmões (US 6566324, US 6551989) .
Muitos dos anticorpos direccionados ao EGFR, tais como o IMC-C225 (Erbitux, Imclone), EMD72000 (Merck Darmstadt), 4 ABX-EGF (Abgenix), h-R3 (theraCIM, YM Biosciences) e Humax-EGFR (Genmab) foram isolados como anticorpos que previnem a ligação de um ligando ao receptor. No entanto, nenhum destes anticorpos nem os fármacos actualmente disponíveis são completamente eficazes para o tratamento do cancro e a maioria está limitada pela toxicidade severa. Adicionalmente, é extremamente difícil e um processo longo para desenvolver uma nova entidade química (NCE) com potência suficiente e selectividade para tal sequência alvo. 0 objectivo primário no tratamento de tumores é a morte de todas as células do tumor. Um agente terapêutico que mata a célula é definido como sendo citotóxico. Um agente terapêutico que previne meramente as células de se replicarem, ao invés de as matar, é definido como um agente citostático. A terapêutica com base em anticorpos conhecidos que se ligam ao receptor EGF, previne meramente as células de se replicarem e consequentemente tais anticorpos convencionais actuam como um agente citostático (EP 667165, EP 359282, US 5844093).
Por outro lado, os anticorpos oferecem um potencial significativo como fármacos pois têm uma especificidade extraordinária para os seus alvos e uma toxicidade inerente reduzida. Adicionalmente, o tempo de desenvolvimento pode ser reduzido consideravelmente quando comparado com o desenvolvimento de novas entidades químicas (NCEs). No entanto, os anticorpos convencionais são difíceis de levantar contra proteínas multiméricas em que o domínio de ligação ao receptor do ligando está embebido numa fenda ou numa interfase entre as duas subunidades, tal como no caso do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. Os anticorpos de cadeia pesada descritos na invenção, que são derivados de Camelidae, são conhecidos como tendo propensão para ligação à cavidade (WO 97/49805; Lauwereys et al., 5 EMBO J. 17, 5312, 1998)). Portanto, tais anticorpos de cadeia pesada são inerentemente adequados à ligação com os domínios de ligação ao receptor de tais ligandos como o RGF e podem, portanto, operar via um mecanismo de acção diferente para originar um efeito citotóxico nas células tumorais. Adicionalmente, tais anticorpos são conhecidos cornos sendo estáveis por longos períodos de tempo, aumentando assim o seu prazo de validade (Perez et ai., Biochemistry, 40, 74, 2001). Adicionalmente, tais fragmentos de anticorpo de cadeia pesada podem ser produzidos em massa em fermentadores usando sistemas de expressão pouco dispendiosos, quando comparados com a fermentação de cultura de células de mamíferos, tais como leveduras ou outros microrganismos (EP 0 698 097). O uso de anticorpos derivados de fontes tais como rato, ovelha, cabra, coelho, etc. e seus derivados humanizados, como um tratamento para condições que exigem um efeito citostático ou citotóxico nas células tumorais, é problemático por várias razões. Os anticorpos tradicionais não são estáveis à temperatura ambiente e têm de ser refrigerados para a preparação e armazenamento, necessitando de equipamento de laboratório, armazenamento e transporte refrigerados, os quais contribuem para o consumo de tempo e despesa. A refrigeração não é, por vezes, viável nos países em desenvolvimento. Adicionalmente, a produção ou produção em pequena escala dos referidos anticorpos é dispendiosa pois os sistemas celulares dos mamíferos necessários à expressão dos anticorpos intactos e activos requerem níveis elevados de suporte em termos de tempo e equipamento e os produtos são muito reduzidos. Adicionalmente, a larga dimensão dos anticorpos convencionais restringiriam a penetração nos tecidos, por exemplo, no local de um tumor sólido. Adicionalmente, os 6 anticorpos tradicionais têm uma actividade de ligação que depende do pH e portanto são inadequados para o uso em ambientes fora do intervalo de pH fisiológico normal, tal como, por exemplo, no tratamento do cancro colorectal. Adicionalmente, os anticorpos tradicionais são instáveis a um pH baixo ou elevado e portanto não são adequados para a administração oral. No entanto, foi demonstrado que os anticorpos de Camelidae resistem a condições adversas, tais como valores de pH extremos, reagentes desnaturantes e temperaturas elevadas (Ewer S et al., Biochemistry 2002 Mar 19; 41(11):3628-36), tornando-os adequados à distribuição por administração oral. Adicionalmente, os anticorpos tradicionais têm uma actividade de ligação, que depende da temperatura e portanto são inadequados para o uso em ensaios ou kits realizados a temperaturas fora dos intervalos de temperatura biologicamente activos (p.ex., 37 ± 20 °C).
A terapêutica com polipéptidos e, em particular, a terapêutica com base em anticorpos, tem um potencial significativo como fármacos porque eles tem uma especificidade extraordinária para o seu alvo e uma toxicidade inerente reduzida. No entanto, é conhecido pelos especialistas nesta matéria que um anticorpo que tenha sido obtido para um alvo terapeuticamente útil requer modificação adicional de modo a prepará-lo para a terapia em humanos, de forma a evitar uma reacção imunológica indesejada num indivíduo humano aquando da sua administração. O processo de modificação é frequentemente denominado de "humanização". É conhecido pelo especialista na matéria que os anticorpos originados em espécies, além da humana, requerem humanização para tornar o anticorpo terapeuticamente útil em humanos ((1) Transplante das CDR: Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 7 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2)
Folheamento: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Há necessidade de um método para produzir anticorpos que evitem a necessidade de humanização substancial, ou que obvia a necessidade de humanização. Existe a necessidade de uma nova classe de anticorpos que tenham regiões estruturais definidas ou residuos de aminoácidos e que possam ser administrados a um indivíduo humano sem a necessidade de humanização substancial, ou a necessidade de humanização, qualquer que seja.
Outro inconveniente importante dos anticorpos convencionais é o facto de eles serem moléculas grandes, complexas e, portanto, relativamente instáveis e são sensíveis à degradação por proteases. Isto significa que os fármacos de anticorpos convencionais não podem ser administrados oralmente, por via sub-língua, por via tópica, nasal, vaginal, rectal ou por inalação pois eles não são resistentes ao pH reduzido destes locais, à acção das proteases nestes locais e no sangue e/ou devido à sua grande dimensão. Eles têm de ser administrados por injecção (intravenosa, subcutânea, etc.) para ultrapassar alguns destes problemas. A administração por injecção requer um treino especializado de modo a poder usar uma seringa ou agulha hipodérmica de um modo correcto e seguro. Requer, adicionalmente, equipamento estéril, uma formulação líquida do polipéptido terapêutico, embalamento em frascos do referido polipéptido numa forma estéril e estável e, no indivíduo, um local adequado para entrada da agulha. Adicionalmente, os indivíduos experimentam com frequência stress físico e psicológico antes e depois de receber uma injecção. Assim, existe necessidade de um método para a distribuição de polipéptidos terapêuticos que evite a necessidade de injecção, a qual não só seja menos 8 dispendiosa e morosa, mas que também seja mais conveniente e mais confortável para o indivíduo.
OBJECTIVOS DA PRESENTE INVENÇÃO É um objectivo da presente invenção proporcionar polipéptidos compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único que se liguem ao EGFR, homólogos aos referidos polipéptidos, porções funcionais dos homólogos. Os referidos polipéptidos podem i) inibir a ligação do ligando natural ao receptor e/ou, ii) prevenir a homo- e a heterodimerização do receptor e/ou iii) induzir a apoptose em células humanas, modificando assim a actividade biológica do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, aquando da ligação. Tais polipéptidos podem ligar-se na fenda de ligação ao ligando do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou podem não se ligar na fenda de ligação ao ligando. Tais polipéptidos são anticorpos de domínio único. É um objectivo adicional da presente invenção proporcionar anticorpos de domínio único derivados dos anticorpos de 4-cadeia convencionais, anticorpos fabricados e andaimes de domínio único, além dos derivados dos anticorpos. É ainda um objectivo adicional da invenção proporcionar um método de administração dos polipéptidos anti-Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico por via intravenosa, oral, sub-língua, tópica, nasal, vaginal, rectal ou por inalação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a um polipéptido anti-EGFR compreendendo pelo menos um anticorpo de domínio único direccionado contra o EGFR, em que o referido anticorpo de domínio único é derivado de um 9 anticorpo de cadeia pesada desprovido de cadeia leve (VHH) e em que o referido, pelo menos, um anticorpo de domínio único é capaz de internalizar as células EGFR+, em particular o referido polipéptido anti-EGFR obtenível por incubação dos fagos recombinantes que expressam um repertório de VHHs clonados com células EGFR+ sob condições que permitem a internalização dos fagos e subsequente libertação dos fagos internalizados. A célula EGFR+ pode ser seleccionada a partir de células HER-14 e A431.
Mais especificamente, a presente invenção proporciona polipéptidos anti-EGFR tal como discutido acima, em que pelo menos um anticorpo de domínio único corresponde a uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 21, 22 ou a. uma sequência homóloga de qualquer uma das SEQ ID NOs: 21, 22 com uma identidade de sequência de mais de 70%, mais de 80& ou mais de 90% com a sequência progenitora; b. uma porção funcional de qualquer uma das SEQ ID NOs: 21, 22 que mantém a interacção cm o alvo com afinidade de 1 x 10”6 M ou melhor; c. uma porção funcional de qualquer uma das SEQ ID NOs: 21, 22 que compreende uma delecçâo parcial da sequência de aminoácidos completa e ainda mantém os locais de ligação e os domínios proteicos necessários à ligação e interacção com o EGFR. A invenção proporciona, mais particularmente, polipéptidos anti-EGFR tal como descrito acima, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único compete por ou inibe a ligação do ligando natural ao EGFR. O ligando natural pode ser EGF. 10
Numa forma de realização, o polipéptido anti-EGFR como descrito acima compreende pelo menos um anticorpo de domínio único, que é capaz de se ligar ao seu alvo com uma afinidade melhor do que 10“6 M.
Numa forma de realização adicional, o polipéptido anti-EGFR tal como descrito acima pode compreender adicionalmente pelo menos um anticorpo de domínio único direccionado contra uma ou mais proteínas do soro. As proteínas do soro podem ser qualquer uma de albumina do soro, imunoglobulinas do soro, proteína de ligação à tiroxina, transferrina ou fibrinogénio ou um seu fragmento.
Numa forma de realização, o polipéptido anti-EGFR tal como descrito acima compreende pelo menos um anticorpo de domínio único, o qual é um domínio VHH. O referido domínio VHH pode transportar um aminoácido do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, treonina, asparagina ou glutamina na posição 45, de acordo com a numeração de Kabat; ou pode transportar um resíduo de arginina na posição 103, de acordo com a numeração de Kabat.
Numa forma de realização particular, o polipéptido anti-EGFR tal como descrito acima compreende um domínio VHH, no qual o referido domínio VHH é obtido por imunização de um camelo e obtenção do seu hibridoma, ou por clonagem de um conjunto de anticorpos de domínio único, subsequente selecção através do uso da exposição do fago.
Numa forma de realização adicional o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é um VHH humanizado. Ele pode ser humanizado por substituição de um ou mais aminoácidos de Camelidae pelo seu correspondente humano, tal como 11 encontrado na sequência consenso humana. De um modo mais específico, ele pode ser humanizado por substituição de qualquer um dos seguintes resíduos, quer isoladamente, quer em combinação: posições FR1 1, 5, 28 e 30, o aminoácido chave na posição 44 e 45 em FR2, resíduos FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94 e as posições 103, 104, 108 e 111 em FR4; a numeração de acordo com a numeração Kabat.
Numa forma de realização adicional, o polipéptido anti-EGFR, tal como descrito acima, pode compreender adicionalmente, pelo menos um anticorpo de domínio único, seleccionado do grupo que consiste num anticorpo de domínio único anti-IFN-gama, um anticorpo de domínio único anti-TNF-alfa, um anticorpo de domínio único do receptor anti-TNF-alfa e um anticorpo de domínio único do receptor anti-IFN-gama . A invenção proporciona um polipéptido anti-EGFR, tal como descrito acima, em que o número de anticorpos de domínio único direccionados contra o EGFR é, pelo menos, dois. Os dois ou mais anticorpos de domínio único podem ser diferentes em sequência ou idênticos em sequência. Os dois ou mais anticorpos de domínio único podem ser fundidos geneticamente ao nível do ADN. Os anticorpos de domínio único podem ser ligados entre si, directamente. O polipéptido anti-EGFR pode ser uma molécula bivalente, trivalente ou tetravalente. A invenção proporciona adicionalmente um polipéptido anti-EGFR, tal como descrito acima, compreendendo adicionalmente um veículo que potência a transferência através da parede intestinal para a corrente sanguínea. O veículo pode ser um VHH que se liga especificamente a um receptor na parede intestinal. 12 A invenção também proporciona um polipéptido anti-EGFR, tal como descrito acima, compreendendo adicionalmente um veiculo que potência o transporte do polipéptido a partir do lúmen pulmonar para o sangue. 0 veiculo pode ser um VHH que se liga especificamente a um receptor na superfície mucosa. 0 referido receptor pode ser um receptor Fc N (FcRn). A invenção também proporciona um ácido nucleico que codifica para um polipéptido tal como descrito acima, assim como uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico.
Num aspecto adicional, a invenção proporciona uma composição compreendendo um polipéptido tal como descrito acima, ou um ácido nucleico tal como descrito acima e um veículo farmacêutico adequado. A composição pode ser adaptada à via de administração escolhida, i.e., por via oral, vaginal, rectal, parentérica, intra-nasal, por inalação, sub-língua, intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea, de um modo específico, pode ser adequada para injecção ou infusão. A invenção também proporciona uma composição terapêutica compreendendo um polipéptido anti-EGFR em combinação com um agente anti-neoplásico ou quimioterapêutico, o qual numa forma de realização pode ser para administração separada dos componentes. com processos A invenção proporciona adicionalmente o polipéptido anti-EGFR, o ácido nucleico, ou composição tal como descrita acima para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios relacionados 13 inflamatórios, ou tendo efeitos citostáticos ou citotóxicos em tumores;
Ou para o uso no tratamento, prevenção e/ou alivio dos cancros epiteliais, tais como os carcinomas do pulmão, fígado, sistema nervoso central, ossos, sangue e sistema linfático, cólon, mama, próstata, recto, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, testículos, pancreático e das células escamosas,
Ou para o uso no tratamento, prevenção e/ou alívio das doenças autoimunes, tais como a doença de Addison (adrenal), doenças autoimunes do ouvido (ouvido), doenças autoimunes do olho (olho), hepatite autoimune (fígado), parotidite autoimune (glândulas parótidas), doença de Crohn (intestino), Diabetes Tipo I (pâncreas), Epididimite (epididymis) , glomerulonefrite (rins), doença de Graves (tiróide), síndroma de Guillain-Barre (células nervosas), doença de Hashimoto (tiróide), anemia hemolítica (glóbulos vermelhos), Lupus eritematoso sistémico (tecidos múltiplos), infertilidade masculina (esperma), esclerose múltipla (células nervosas), Myasthenia Gravis (junção neuromuscular), Pênfigo (primariamente na pele), Psoríase (pele), febre reumática (coração e articulações), artrite reumatóide (alinhamento das articulações) , sarcoidose (tecidos e orgãos múltiplos) , escleroderma (pele e tecidos conjuntivos), Síndroma de Sjogren (glândulas exócrinas e outros tecidos), espondiloartropatias (esqueleto axial e outros tecidos) , tiroidite (tiróide), vasculite (vasos sanguíneos).
De um modo mais específico, a invenção proporciona o uso de um polipéptido ou um constructo polipeptídico ou de um ácido nucleico, tal como definido acima, para a preparação 14 de um medicamento para o tratamento de distúrbios relacionados com processos inflamatórios e cancro,
Ou para a preparação de um medicamento para o tratamento de condições que requerem o bloqueio da acção EGFR, o bloqueio da ligação do ligando ao EGFR, a prevenção da dimerização do EGFR e/ou a indução da apoptose,
Ou para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alivio dos cancros epiteliais, tais como os carcinomas do pulmão, figado, sistema nervoso central, ossos, sangue e sistema linfático, cólon, mama, próstata, recto, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, testículos, pancreático e das células escamosas,
Ou para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio das doenças autoimunes, tais como a doença de Addison (adrenal), doenças autoimunes do ouvido (ouvido), doenças autoimunes do olho (olho), hepatite autoimune (fígado), parotidite autoimune (glândulas parótidas), doença de Crohn (intestino), Diabetes Tipo I (pâncreas), Epididimite (epididymis), glomerulonefrite (rins), doença de Graves (tiróide), síndroma de Guillain-Barre (células nervosas), doença de Hashimoto (tiróide), anemia hemolítica (glóbulos vermelhos), Lupus eritematoso sistémico (tecidos múltiplos), infertilidade masculina (esperma), esclerose múltipla (células nervosas), Myasthenia Gravis (junção neuromuscular), Pênfigo (primariamente na pele), Psoríase (pele), febre reumática (coração e articulações), artrite reumatóide (alinhamento das articulações), sarcoidose (tecidos e orgãos múltiplos), escleroderma (pele e tecidos conjuntivos), Síndroma de Sjogren (glândulas exócrinas e outros tecidos), 15 espondiloartropatias (esqueleto axial e outros tecidos), tiroidite (tiróide), vasculite (vasos sanguíneos). A invenção proporciona adicionalmente um método para a produção de um polipéptido tal como descrito acima compreendendo; a cultura de células hospedeiras, compreendendo ácidos nucleicos capazes de codificar para os referidos polipéptidos ou constructos polipeptídicos sob condições que permitem a expressão do polipéptido e a recuperação do polipéptido produzido a partir da cultura. 0 método pode envolver células hospedeiras que são células bacterianas, células de levedura, células de mamíferos ou células de insecto, mais especificamente, células bacterianas ou células de levedura, em particular células de E. coli, células de S. cerevisiae ou células de P. pastoris.
Adicionalmente, a invenção também proporciona um método para diagnosticar um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR, compreendendo os passos de: fazer contactar uma amostra com um polipéptido tal como descrito acima, detecção da ligação do referido polipéptido com a referida amostra e comparação da ligação detectada no passo (b) com um padrão, em que a diferença na ligação relativa à referida amostra é diagnóstico de um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR. A invenção também proporciona um kit para a análise de um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR, compreendendo um polipéptido de acordo com a invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E TABELAS
Figura 1. ELISA para detectar os títulos específicos de anticorpo A431 em soro de lama. 16
Figura 2. Detecção de títulos de anticorpos específicos para EGFR em soro de lama.
Figura 3. Detecção de títulos de anticorpos específicos para EGFR em soro de lama 024 e 025 (painel A) e de lama 026 e 027 (painel B).
Figura 4. Resposta do fago a EGFR.
Figura 5. Alinhamento dos aminoácidos de 31 clones identificados pelo procedimento de selecção por eluição do epítopo específico.
Figura 6. ELISA de fagos em células (painel A) ou em EGFR imobilizados em fase sólida (painel B) dos 20 clones específicos de EGFR únicos, identificados através do procedimento de selecção por eluição do epítopo específico.
Figura 7. Internalização do EGFR-IIIa42 com Her-14 (painel A) e 3T3 (painel B) .
Tabela 1. Calendário de imunização e colecções de tecidos.
Tabela 2. Perspectiva global sobre as bases de dados construídas.
Tabela 3. Perspectiva global sobre o procedimento de selecção por eluição do epítopo específico.
Tabela 4. Perspectiva global sobre a "internalização" do procedimento de selecção. 17
Tabela 5. Sequências de aminoácidos dos domínios variáveis dos anticorpos específicos para EGFR.
Tabela 6. Tabela de identificação das sequências iniciadoras.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção refere-se a um polipéptido Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico (EGFR), compreendendo pelo menos um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1, o qual é direccionado para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. A invenção também se refere a ácidos nucleicos capazes de codificar para os referidos polipéptidos.
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido Receptor Do Factor de Crescimento Epidérmico, em que pelo menos um anticorpo de domínio único corresponde a uma sequência correspondente a qualquer uma das SEQ ID NOs: 21 ou 22, tal como apresentado na Tabela 5. As referidas sequências são derivadas de anticorpos de cadeia peada Câmelidae (VHHs), os quais são direccionados para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico.
Os anticorpos de domínio único são anticorpos cujas regiões determinantes complementares são parte de um polipéptido de domínio único. De acordo com a invenção, os anticorpos de domínio único, tal como são aqui usados, são anticorpos de domínio único que ocorrem naturalmente, conhecidos como anticorpos de cadeia pesada desprovidos de cadeias leves. Tais anticorpos de domínio único são divulgados no documento WO 94/04678 a título de exemplo. Por motivos de clareza, este domínio variável derivado de um anticorpo de cadeia pesada, naturalmente desprovido de cadeia leve, é 18 aqui conhecido como um VHH ou nanocorpo para o distinguir do VH convencional com imunoglobulinas de quatro cadeias. Uma tal molécula VHH pode ser derivada de anticorpos originários em espécies de Camelidae, por exemplo do camelo, dromedário, lama, vicunha, alpaca e guanaco. Outras espécies, além dos Camelidae, podem produzir anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeia leve; tais VHHs estão compreendidos no âmbito da invenção.
Os VHHs, de acordo com a presente invenção, e tal como é conhecido dos peritos, são domínios variáveis de cadeia pesada, derivados de imunoglobulinas naturalmente desprovidas de cadeias leves, tais como aquelas derivadas de Camelidae, tal como descrito no documento WO 94/04678 (e referido aqui seguidamente como domínios VHH ou nanocorpos). As moléculas VHH são cerca de lOx mais pequenas que as moléculas IgG. Elas são polipéptidos singulares e muito estáveis, resistindo a condições extremas de pH e temperatura. Além disso, elas são resistentes à acção de proteases, o que não é o caso para os anticorpos convencionais. Adicionalmente, a expressão in vitro dos VHHs produz VHHs funcionais devidamente dobrados, com rendimento elevado. Adicionalmente, os anticorpos gerados em Camelídeos reconhecem epítopos além dos reconhecidos pelos anticorpos gerados in vitro através do uso de bases de dados de anticorpos ou através da imunização de mamíferos, além dos Camelídeos (WO 9749805). Como tal, os VHHs anti-EGFR podem interactuar de um modo mais eficiente com o EFGR, do que os anticorpos convencionais, bloqueando assim a sua interacção com os ligandos EGFR de um modo eficiente. Desde que se sabe que os VHHs se ligam em epítopos "invulgares" tais como cavidades ou sulcos (WO 97/49805), a afinidade de tais VHHs pode ser mais adequada para o tratamento terapêutico. 19
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, de acordo com a reivindicação 1, consistindo numa sequência correspondente aquela de um VHH de Camelidae, direccionado para EGFR ou um membro da família intimamente relacionado. A invenção também se refere a uma sequência homóloga, uma porção de função ou uma porção funcional de uma sequência homóloga do referido polipéptido. A invenção também se refere a ácidos nucleicos capazes de codificar para os referidos polipéptidos.
Um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1 da presente invenção é direccionado contra EGFR ou um membro da família intimamente relacionado. 0 EGFR é um alvo principal de acordo com a invenção. De acordo com a invenção, e tal como discutido abaixo, um constructo de polipéptido pode compreender adicionalmente anticorpos de domínio único, direccionados contra outros alvos, tais como, por exemplo, a albumina do soro. Um anticorpo de domínio único direccionado contra um alvo significa um anticorpo de domínio único que é capaz de se ligar ao referido alvo com uma afinidade superior a 10~6 M.
Os alvos também podem ser fragmentos dos referidos alvos. Assim, um alvo é também um fragmento do referido alvo, capaz de desencadear uma resposta imunitária. Um alvo é também um fragmento do referido alvo, capaz de se ligar a um anticorpo de domínio único criado contra o alvo com o comprimento total.
Um fragmento, tal como aqui usado, refere-se a menos de 100% da sequência (p.ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, etc.), mas compreende 5, 6, 7, 8, 9, 20 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais aminoácidos. Um fragmento tem comprimento suficiente para que a interacção de interesse seja mantida com afinidade de 1 x 10“6 M ou superior.
Um fragmento, tal como aqui usado, também se refere a inserções opcionais, delecções e substituições de um ou mais aminoácidos que não alteram substancialmente a capacidade do alvo para se ligar a um anticorpo de dominio único criado contra o alvo wild type. O número de inserções, delecções ou substituições de aminoácidos é, preferencialmente, acima . de 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 , 8, 9, O i—1 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, τ—1 42, 43, 44, 45, 4 6, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63 , 64, , 65 , 66 , 67 , 88 , 69 ou 70 aminoácidos. A presente invenção relaciona-se adicionalmente com um polipéptido Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, de acordo com a reivindicação 1, em que um anticorpo de dominio único é um VHH pertencente a uma classe contendo sequências semelhantes às humanas.
Uma tal classe é caracterizada por os VHHs transportarem um aminoácido do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, treonina, asparagina ou glutamina na posição 45, tal como por exemplo L45 e um triptofano na posição 103, de acordo com a numeração de Kabat. Uma tal sequência semelhante a humana é representada pela SEQ ID N° 13. Como tal, os polipéptidos pertencentes a esta classe apresentam uma elevada homologia da sequência de aminoácidos com as regiões estruturais VH 21 humanas e os referidos polipéptidos podem ser administrados a um ser humano directamente sem expectativa de uma consequente resposta imunitária indesejada e sem o inconveniente de uma humanização adicional.
Outra classe semelhante a humana de anticorpos de domínio único de Camelidae foi descrita no documento WO 03/035694 e contém os resíduos FR2 hidrófobos tipicamente encontrados nos anticorpos convencionais de origem humana ou de outras espécies, mas compensando esta perda em hidrofilicidade pelo resíduo de arginina carregado na posição 103 que substitui o resíduo de triptofano conservado, presente na VH de anticorpos com cadeia dupla. Como tal, os péptidos pertencentes a estas duas classes apresentam uma elevada homologia da sequência de aminoácidos com as regiões estruturais VH humanas e os referidos péptidos podem ser administrados a um ser humano directamente sem expectativa de uma consequente resposta imunitária indesejada e sem o inconveniente de uma humanização adicional. A invenção também se refere a ácidos nucleicos capazes de codificar para os referidos polipéptidos. A SEQ ID No.: 13 apresenta mais de 90% de homologia na sequência de aminoácidos para as regiões estruturais VH humanas e consequentemente as referidas VHH podem ser administradas a pacientes directamente sem a expectativa de uma consequente resposta imunitária indesejada e sem o inconveniente adicional da humanização. Portanto, um aspecto da presente invenção permite a administração directa do polipéptido compreendendo a SEQ ID No.: 13.
Qualquer um dos VHHs do Receptor do Factor de Crescimento Anti-Epidérmico aqui divulgado pode ser da classe tradicional ou da classe de anticorpos de Camelidae 22 semelhantes aos humanos. Os referidos anticorpos podem ser direccionados contra todo o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico ou um seu fragmento, ou um fragmento de uma sua sequência homóloga. Estes polipéptidos incluem os anticorpos de Camelidae com todo o seu comprimento, nomeadamente os domínios Fc e VHH.
Os VHH anti-albumina podem interactuar de um modo mais eficiente com a albumina do soro, que é conhecida por ser uma proteína transportadora. Como proteína transportadora que é, alguns dos epítopos da albumina do soro podem estar inacessíveis pelas proteínas, péptidos e pequenos compostos químicos ligados. Como os VHHs são conhecidos por se ligarem a epítopos "invulgares" ou não convencionais, tais como cavidades (WO 97/49805), a afinidade de tais VHHs para a albumina circulante pode ser mais adequada para o tratamento terapêutico. A presente invenção refere-se assim à verificação de que um polipéptido anti-EGFR da invenção compreendendo adicionalmente um ou mais anticorpos de domínio único direccionados contra uma ou mais proteínas do soro num indivíduo, as quais surpreendentemente têm um período de vida significativamente prolongado na circulação do referido indivíduo quando comparado com o período de vida do VHH anti-alvo quando não faz parte do referido polipéptido anti-EGFR.
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente, pelo menos, um anticorpo de domínio único direccionado contra uma proteína do soro, o referido polipéptido anti-EGFR compreendendo uma sequência 23 correspondente a qualquer uma representada pela SEQ ID No.: 27 a 40 (Tabela 5).
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um anticorpo de domínio único de uma proteína anti-soro corresponde a uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.: 23 a 26 e 41 a 53, tal como apresentado na Tabela 5. A proteína do soro pode ser qualquer proteína adequada, encontrada no soro de um indivíduo, ou seu fragmento. Num aspecto da invenção, a proteína do soro é a albumina do soro, imunoglobulinas do soro, proteína d e ligação à tiroxina, transferrina ou fibrinogénio. Dependendo do uso pretendido, tal como o período de vida requerido para o tratamento e/ou compartimentalização eficaz do antigénio alvo, o VHH-parceiro pode ser direccionado para uma das proteínas do soro acima.
Adicionalmente, verificou-se que os referidos constructos exibem as mesmas propriedades favoráveis dos VHH, tais como estabilidade elevada, permanecendo intactas em ratos, resistência a pH extremos, estabilidade elevada à temperatura e elevada afinidade para o alvo.
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento Anti-Epidérmico multivalente, tal como aqui divulgado, compreendendo pelo menos dois anticorpos de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, direccionados contra o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. Tais polipéptidos multivalentes do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico têm a vantagem de ter uma 24 afinidade funcional invulgarmente elevada para o alvo, apresentando propriedades inibidoras muito superiores às esperadas, quando comparadas com os seus correspondentes monovalentes.
Os polipéptidos multivalentes do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico têm afinidades funcionais que são superiores em várias ordens de grandeza aos progenitores polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. Os inventores verificaram que as afinidades funcionais destes polipéptidos multivalentes são muito superiores às registadas no estado da técnica para anticorpos bivalentes e multivalentes. Surpreendentemente, os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da presente invenção ligados entre si, directamente ou através de uma sequência ligante mais curta, apresentam as afinidades funcionais elevadas esperadas teoricamente com os anticorpos de quatro cadeias convencionais multivalentes.
Os inventores verificaram que tais actividades funcionais largamente aumentadas podem ser detectadas preferencialmente com antigénios compostos por proteínas multiméricas e de multidomínio, quer em ensaios de ligação lineares ou em ensaios funcionais, p.ex., ensaios de citotoxicidade.
Um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico multivalente, como aqui usado, refere-se a um polipéptido compreendendo dois ou mais polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico de acordo com a reivindicação 1, os quais foram covalentemente ligados. Os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico podem ser idênticos em 25 sequência ou podem ser diferentes em sequência mas direccionados contra o mesmo alvo ou antigénio. Dependendo do número de polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico ligados, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico pode ser bivalente (2 polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico), trivalente (3 polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico), tetravalente (4 polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico) ou têm moléculas com valência superior.
De acordo com um aspecto da presente invenção, os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico são ligados entre si directamente, sem uso de um ligante. De acordo com outro aspecto da presente invenção, os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico são ligados entre si através de uma sequência de ligação peptidica. Tal sequência de ligação pode ser uma sequência que ocorre naturalmente ou uma sequência que não ocorre naturalmente. Espera-se que a sequência de ligação seja não imunogénica no indivíduo ao qual são administrados os polipéptidos do receptor do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. A sequência de ligação pode proporcionar flexibilidade suficiente ao polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico multivalente, sendo ao mesmo tempo resistente à degradação proteolítica. Um exemplo não limitante de uma sequência de ligação é tal que possa ser derivado da região articulada dos VHHs descritos no documento WO 96/34103. É um aspecto da invenção o facto de os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico multivalente divulgados acima poderem ser usados em vez de 26 ou assim como os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico de unidade singular, em terapias e métodos de distribuição, tal como aqui mencionado.
Os anticorpos de domínio único podem ser unidos para formar qualquer um dos polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico aqui divulgados, compreendendo mais do que um anticorpo de domínio único, usando métodos conhecidos na técnica ou qualquer método futuro. Eles podem ser unidos não-covalentemente (p.ex., usando a combinação estreptavidina/biotina, combinação anticorpo/marcador) ou covalentemente. Eles podem ser fundidos por ligação química reticulada, fazendo reagir resíduos de aminoácidos com um agente derivatizante orgânico, tal como descrito por Blattler et ai., Biochemistry 24, 1517-1524; EP294703. Alternativamente, o anticorpo de domínio único pode ser fundido geneticamente ao nível do ADN, i.e., o polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico formado que codifica para o polipéptido completo, compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. É divulgado um método para produzir polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico bivalentes ou multivalentes no pedido de patente PCT WO 96/341103. Um modo de juntar anticorpos VHH é através da via genética por ligação de um anticorpo VHH que codifica para sequências, quer directamente ou através de um ligante peptídico. Por exemplo, a extremidade C-terminal do anticorpo VHH pode ser ligada à extremidade N-terminal do anticorpo seguinte com domínio único. 27
Este modo de ligação pode ser estendido de modo a ligar anticorpos adicionais de domínio único, para a construção e produção de constructos tri-, tetra-, etc. funcionais.
De acordo com um aspecto da presente invenção, os anticorpos de domínio único são ligados entre si através de uma sequência de ligação peptídica. Tal sequência de ligação pode ser uma sequência que ocorre naturalmente ou uma sequência que não ocorre naturalmente. Espera-se que a sequência de ligação seja não imunogénica no indivíduo ao qual foi administrado o polipéptido anti-IFN-gama. A sequência de ligação pode proporcionar flexibilidade suficiente ao polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, sendo ao mesmo tempo resistente à degradação proteolítica. Um exemplo não limitante de uma sequência de ligação é aquela que pode ser derivada da região articulada dos VHHs descritos no documento WO 96/34103. O polipéptido aqui divulgado pode ser concebido por um perito, de acordo com os métodos conhecidos na técnica ou qualquer método futuro. Por exemplo, os VHHs podem ser obtidos usando métodos conhecidos na técnica, tais como a imunização de um camelo e obtenção dos seus hibridomas, ou por clonagem de um banco de anticorpos de domínio único, usando técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica e a subsequente selecção por ELISA com clones individuais de bases de dados não seleccionadas ou por utilização da apresentação dos fagos.
De acordo com um aspecto da invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico pode ser uma sequência homóloga de um polipéptido de um Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico com comprimento 28 total, de acordo com a reivindicação 1. De acordo com outro aspecto da invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico pode ser uma porção funcional de um polipéptido de um Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico com comprimento total, de acordo com a reivindicação 1. De acordo com outro aspecto da invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico pode ser uma porção funcional de uma sequência homóloga de um polipéptido de um Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico com comprimento total, de acordo com a reivindicação 1. De acordo com um aspecto da invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico pode compreender uma sequência de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, de acordo com a reivindicação 1.
De acordo com um aspecto da invenção, um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1, usado para formar um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, pode ser um anticorpo de domínio único completo (p.ex., um VHH) ou uma sua sequência homóloga. De acordo com outro aspecto da invenção, um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1, usado para formar um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, pode ser uma porção funcional de um anticorpo de domínio único completo. De acordo com outro aspecto da invenção, um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1, usado para formar um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, pode ser uma sequência homóloga de um anticorpo de domínio único completo. De acordo com outro aspecto da invenção, um anticorpo de domínio único de acordo com a reivindicação 1, usado para formar um polipéptido do 29
Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, pode ser uma porção funcional de uma sequência homóloga de um anticorpo de domínio único completo.
Tal como aqui usada, uma sequência homóloga da presente invenção pode compreender adições, delecções ou substituições de um ou mais aminoácidos, que não alteram substancialmente as características funcionais dos polipéptidos da invenção. Para os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, o número de delecções ou substituições de aminoácidos é preferencialmente até 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, Csl Csl 1-1 CNJ , 23, , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 , 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, , 63 , 64 , 65 i, 66, 67, 68, 69 ou 70 aminoácidos.
Uma sequência homóloga de acordo com a presente invenção pode ser uma sequência modificada pela adição, deleção ou substituição de aminoácidos, a referida modificação não alterando substancialmente as características funcionais, quando comparadas com o polipéptido não modificado.
Uma sequência homóloga de acordo com a presente invenção pode ser uma sequência que existe noutras espécies de Camelidae, tais como, por exemplo, camelo, dromedário, lama, vicunha, alpaca e guanaco.
Sempre que uma sequência homóloga indique identidade de sequência, significa que uma sequência que apresente uma elevada identidade de sequencia (mais de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência) com a sequência progenitora e é preferencialmente caracterizada 30 por propriedades semelhantes às da sequência progenitora, nomeadamente afinidade, sendo a referida identidade calculada usando métodos conhecidos.
Alternativamente, uma sequência homóloga pode também ser qualquer sequência de aminoácidos resultante de substituições permitidas em qualquer número de posições da sequência progenitora, de acordo com a fórmula abaixo:
Ser substituído por Ser , Thr, Gly e Asn; Arg substituído por um de entre Arg, His, Gin, Lys, e Glu; Leu substituído por um de entre Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, e Vai; Pro substituído por um de entre Pro, Gly, Ala, e Thr; Thr substituído por um de entre Thr , Pro, Ser, Ala, Gly, His, e Gin; Ala substituído por um de entre Ala, Gly, Thr, e Pro; Vai substituído por um de entre Vai, Met, Tyr, Phe, Ile, e Leu; Gly substituído por um de entre Gly, Ala, Thr, Pro, e Ser; Ile substituído por um de entre Ile, Met, Tyr, Phe, Vai, e Leu; Phe substituído por um de entre Phe , Trp, Met, Tyr, Ile, Vai, e Leu; Tyr substituído por um de entre Tyr , Trp, Met, Phe, Ile, Vai, e Leu; His substituído por um de entre His, Glu, Lys, Gin, Thr, e Arg; Gin substituído por um de entre Gin , Glu, Lys, Asn, His, Thr, e Arg; Asn substituído por um de entre Asn, Glu, Asp, Gin, e Ser; Lys substituído por um de entre Lys, Glu, Gin, His, e Arg; Asp substituído por um de entre Asp, Glu, e Asn; 31
Glu substituído por um de entre Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His, e Arg;
Met substituído por um de entre Met, Phe, Ile, Vai, Leu, e Tyr.
Uma sequência de nucleótidos homóloga de acordo com a presente invenção pode referir-se a sequências de nucleótidos com mais de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 ou 1000 nucleótidos capazes de hibridar com a sequência de nucleótidos complementar inversa, capaz de codificar para sequência patente, sob condições de hibridação estringentes (tais como aquelas descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, New York.
Tal como aqui utilizada, uma porção funcional refere-se a uma sequência de um anticorpo de domínio único que tenha tamanho suficiente, de tal modo que a interacção de interesse seja mantida com uma afinidade de 1 x 10“6 M ou melhor.
Alternativamente, uma porção funcional compreende uma deleção parcial da sequência de aminoácidos completa e a qual mantém os locais de ligação e os domínios da proteína necessários à ligação e interacção com o Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico.
Tal como aqui usada, uma porção funcional como tal refere-se à sequência de polipéptido e um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico refere-se a menos de 100% da sequência (p.ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, etc.) mas compreendendo 5 ou mais aminoácidos ou 15 ou mais nucleótidos. 32
Uma forma de realização da presente invenção refere-se a um método para preparar polipéptidos modificados com base nos anticorpos de lama por determinação dos resíduos de aminoácidos do domínio variável do anticorpo (VHH) , o qual pode ser modificado sem diminuição da afinidade nativa do domínio para o antigénio e enquanto reduz a sua imunogenicidade relativamente a uma espécie heteróloga; o uso de VHHs contendo modificações nos resíduos identificados, os quais são úteis para administração a espécies heterólogas; e ao VHH assim modificado. De um modo mais específico, a invenção refere-se à preparação dos VHHs modificados, os quais são modificados para administração a seres humanos, os próprios VHH resultantes e o uso de tais VHHs "humanizados" no tratamento de doenças em humanos. 0 termo humanizado significa mutado de forma a que a imunogenicidade aquando da administração em pacientes humanos seja mínima ou inexistente. A humanização de um polipéptido, de acordo com a presente invenção, compreende o passo de substituição de um ou mais aminoácidos de Camelídae pelo seu correspondente humano, tal como encontrado na sequência consenso humana, sem que o polipéptido perca o seu carácter típico, i.e., a humanização não afecta significativamente a capacidade de ligação ao antigénio do polipéptido resultante. Tais métodos são conhecidos pelos peritos na técnica. A humanização de anticorpos de domínio único de Camelídae requer a introdução e a mutagénese de uma quantidade limitada de aminoácidos numa única cadeia polipeptídica. Isto está em contraste com a humanização do scFv, Fab', (Fab')2 e IgG, que requer a introdução de variações dos aminoácidos em duas cadeias, a cadeia leve e a cadeia pesada e a conservação da agregação de ambas as cadeias. 33
Como exemplo não limitante, o polipéptido da SEQ ID 13 contendo resíduos semelhantes a humanos em FR2, foi humanizado. A humanização requer a mutagénese dos resíduos em FR1 nas posições 1 e 5, as quais foram introduzidas pela sequência iniciadora usada para clonagem do repertório e não ocorrem naturalmente na sequência do lama. A mutagénese desses resíduos não resultou na perda de ligação e/ou da actividade de inibição. A humanização também requereu a mutagénese dos resíduos em FR3 nas posições 74, 76, 83, 84, 93. A mutagénese desses resíduos não resultou na perda dramática de ligação e/ou actividade de inibição (dados não apresentados) . A combinação das mutações de FR1 e FR3 não afectaram, portanto, a ligação e/ou actividade de inibição (dados não apresentados). A humanização também requereu a mutagénese dos resíduos em FR4 na posição 108. A mutagénese do Q108L resultou num nível de produção inferior em Escherichia coli. A posição 108 é exposta ao solvente no VHH de camelídeo, enquanto em anticorpos humanos esta posição está enterrada na interface VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). Nos VHHs isolados a posição 108 está exposta ao solvente, a introdução de uma Leu hidrófoba não polar em vez de uma Gin não carregada polar, pode ter um efeito drástico no arranjo intrínseco/estabilidade da molécula.
Como exemplo não limitante, o polipéptido representado na SEQ ID 6 contendo resíduos marcadores de camelídeos nas posições 37, 44, 45 e 47 com características hidrófilas, foi humanizado. A substituição dos resíduos hidrófilos por resíduos hidrófobos humanos nas posições 44 e 45 (E44G e R45L), não tiveram efeito na ligação e/ou inibição. No entanto, a perda de ligação e/ou actividade de inibição foi observada quando o F37V e o F47W foram introduzidos. Os 34 dados de modelação confirmaram o resíduo crítico 37 para conservar a integridade da conformação em laço do CDR3 e portanto da actividade (dados não apresentados; toda a numeração de acordo com Kabat) .
Uma forma de realização da presente invenção é um método para a humanização de um VHH compreendendo os passos de substituição de qualquer um dos seguintes resíduos, quer isoladamente, quer em combinação: FR1 posição 1, 5, 28 e 30, O aminoácido marcador na posição 44 e 45 em FR2, FR3 resíduos 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94, e posições 103, 104, 108 e 111 em FR4; (numeração de acordo com a numeração de Kabat).
Uma forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, ou um ácido nucleico capaz de codificar para o referido polipéptido para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios relacionados com os processos inflamatórios, ou tendo efeitos citostáticos ou citotóxicos nos tumores.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de um VHH do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, ou um ácido nucleico capaz de codificar para o referido polipéptido, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio relacionado com processos inflamatórios e cancro. O Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico está envolvido nos processos inflamatórios e o bloqueio do 35
Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico pode ter um efeito anti-inflamatório, o qual é altamente desejável em certos estados de doença, tais como, por exemplo, a artrite inflamatória ou a psoriase. Adicionalmente, o bloqueio do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico pode inibir o crescimento dos tumores humanos. Os nossos exemplos demonstram que os VHHs de acordo com a invenção se ligam ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico e, além disso, bloqueiam a ligação de ligandos ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, previnem a (hetero-)dimerização do receptor e/ou induzem a apoptose.
Os polipéptidos e o método da presente invenção são aplicáveis em cancros epiteliais, tais como os carcinomas do pulmão, figado, sistema nervoso central, ossos, sangue e sistema linfático, cólon, mama, próstata, recto, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, testículos, pancreático e das células escamosas. A lista de cancros humanos pretende ser exemplificativa ao invés de inclusiva. 0 método da presente invenção é aplicável a doença autoimunes, tais como a doença de Addison (adrenal), doenças autoimunes do ouvido (ouvido), doenças autoimunes do olho (olho), hepatite autoimune (figado), parotidite autoimune (glândulas parótidas), doença de Crohn (intestino), Diabetes Tipo I (pâncreas), Epididimite (epididymis) , glomerulonefrite (rins), doença de Graves (tiróide), síndroma de Guillain-Barre (células nervosas), doença de Hashimoto (tiróide), anemia hemolítica (glóbulos vermelhos), Lupus eritematoso sistémico (tecidos múltiplos), infertilidade masculina (esperma) , esclerose múltipla (células nervosas), Myasthenia Gravis (junção neuromuscular), Pênfigo (primariamente na pele), Psoriase (pele), febre reumática (coração e articulações), artrite 36 reumatóide (alinhamento das articulações), sarcoidose (tecidos e orgâos múltiplos), escleroderma (pele e tecidos conjuntivos), Síndroma de Sjogren (glândulas exócrinas e outros tecidos), espondiloartropatias (esqueleto axial e outros tecidos), tiroidite (tiróide), vasculite (vasos sanguíneos). Entre parêntesis encontra-se o tecido afectado pela doença. Esta listagem de doenças autoimunes pretende ser exemplificativa ao invés de inclusiva. A presente invenção proporciona uma composição terapêutica compreendendo um VHH do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico de acordo com a reivindicação 1, o qual inibe ou mata as células tumorais humanas através da ligação do referido VHH ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico humano das referidas células tumorais, quer isoladamente ou em combinação com agentes anti-neoplásicos ou quimioterapêuticos. Os agentes anti-neoplásicos ou quimioterapêuticos tais como a doxorubicina e a cisplatina são bem conhecidos na técnica.
Os polipéptidos e os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser administrados a um indivíduo por vias convencionais, tais como por via intravenosa. No entanto, uma propriedade especial dos polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da invenção é o facto de serem suficientemente pequenos para penetrar através de barreiras, tais como as membranas de tecido e/ou tumores e actuarem localmente e continuarem a actuar localmente e serem suficientemente estáveis para suportar ambientes extremos tais como o do estômago. Assim, outro aspecto da presente invenção diz respeito à distribuição dos polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. 37
Um indivíduo de acordo com a invenção pode ser qualquer mamífero susceptível ao tratamento por polipéptidos terapêuticos. A distribuição oral dos polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da invenção resulta no fornecimento de tais moléculas numa forma activa em locais definidos que são afectados pelo distúrbio. Os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico que se ligam ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico podem neutralizar o receptor localmente, evitando a distribuição através de todo o corpo e assim limitando os efeitos secundários negativos. Os microrganismos geneticamente modificados tais como o Micrococcus lactis são capazes de secretar fragmentos de anticorpo. Tais microrganismos modificados podem ser usados como veículos para a produção e distribuição local de fragmentos de anticorpo no intestino. Através do uso de uma estirpe que produz o fragmento de anticorpo neutralizante do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, a inflamação e certos cancros podem ser tratados.
Outro aspecto da invenção envolve a distribuição dos polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico através do uso da expressão de superfície ou da secreção de bactérias não invasivas, tais como organismos hospedeiros Gram-positivos tais como a espécie Lactococcus, usando um vector tal como o descrito no documento WO 00/23471.
Uma forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos 38 distúrbios susceptiveis de modulação por um antagonista do EGFR, que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem que o polipéptido seja inactivado.
Os exemplos desses distúrbios são cancros e outros que causem inflamação, incluindo mas não se limitando a artrite reumatóide e psoríase. Como é conhecido dos peritos na técnica, uma vez na posse do referido Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, pode ser aplicada a tecnologia de formulação para libertar uma quantidade máxima de polipéptido no local correcto (no estômago, no cólon, etc.). Este método de distribuição é importante no tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de distúrbios cujos alvos se localizam no sistema digestivo.
Um aspecto da invenção é um método para o tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de um distúrbio susceptivel aos moduladores do EGFR que sejam capazes de atravessar o ambiente gástrico sem ser inactivados, por administração oral a um indivíduo de um Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios susceptiveis aos moduladores do EGFR que são capazes de atravessar o ambiente gástrico sem serem inactivados.
Um aspecto da invenção é um método para a distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo, sem o composto ser inactivado, por administração oral a um 39 indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de
Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Um aspecto da invenção é um método para distribuir um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo sem o composto ser inactivado, por administração oral a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de
Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado, para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios susceptíveis aos moduladores do EGFR, distribuído no tracto vaginal e/ou rectal.
Os exemplos dos distúrbios são cancros e outros que causem inflamação, incluindo mas não se limitando à artrite reumatóide e psoríase. Num exemplo não limitante, uma formulação de acordo com a invenção compreende um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único, direccionados contra o EGFR, na forma d e um gel, creme, supositório, filme ou na forma de uma esponja ou de um anel vaginal que liberta lentamente o ingrediente activo ao longo do tempo (tais formulações são descritas nos documentos EP 707473, EP 684814, US 5629001) .
Um aspecto da invenção é um método para tratar, prevenir e/ou aliviar os sintomas dos distúrbios susceptíveis aos moduladores do EGFR distribuídos no tracto vaginal e/ou rectal, por administração vaginal e/ou rectal a um 40 indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é a utilização de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios susceptíveis a modulação por um fragmento de ligação do EGFR, distribuído no tracto vaginal e/ou rectal.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido, para o uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR no tracto vaginal e/ou rectal sem que o referido modulador seja inactivado, por administração no tracto vaginal e/ou rectal de um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido, para o uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo sem que o referido modulador seja inactivado, por administração no tracto vaginal e/ou rectal de um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado, para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbio susceptíveis aos moduladores do EGFR distribuídos no nariz, tracto respiratório superior e/ou pulmão. 41
Os exemplos de distúrbios são cancros e outros que causam inflamação, incluindo mas não se limitando à artrite inflamatória e psoriase. Num exemplo não limitante, uma formulação de acordo com a invenção compreende um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, como aqui divulgado, direccionado contra o EGFR na forma de um vaporizador nasal (p.ex., um aerossol) ou inalador. Como o polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico é pequeno, pode atingir o seu alvo de um modo muito mais eficaz do que as moléculas IgG terapêuticas.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido, para uso num método para o tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas dos distúrbios susceptiveis aos moduladores do EGFR distribuídos no tracto respiratório superior e no pulmão, por administração a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico tal como aqui divulgado, por inalação através da boca ou do nariz.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios susceptiveis a modulação por um fragmento de ligação ao EGFR distribuído no nariz, tracto respiratório superior e/ou pulmão, sem que o referido polipéptido seja inactivado.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para o uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR no nariz, tracto respiratório superior e pulmão sem inactivação, por administração no nariz, tracto 42 respiratório superior e/ou pulmão de um indivíduo, de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para o uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo sem inactivação, por administração no nariz, tracto respiratório superior e/ou pulmão de um indivíduo, de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Uma forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado para o uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptíveis aos moduladores do EGFR distribuídos na mucosa intestinal, em que o referido distúrbio aumenta a permeabilidade da mucosa intestinal. Devido ao seu tamanho reduzido, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, pode passar através da mucosa intestinal e atingir a corrente sanguínea de um modo mais eficiente, em indivíduos que sofrem de distúrbios que causam um aumento na permeabilidade da mucosa intestinal, por exemplo, a doença de Crohn.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como o aqui definido para uso num método para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptíveis a moduladores do EGFR distribuídos na mucosa intestinal, em que o referido distúrbio aumenta a permeabilidade da mucosa intestinal, por administração oral a um indivíduo de um 43 polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Este processo pode mesmo ser adicionalmente melhorado por um aspecto adicional da presente invenção - o uso de veículos transportadores activos. Num aspecto da invenção, o VHH é fundido com um veículo que melhora a transferência através da parede intestinal, para a corrente sanguínea. Num exemplo não limitante, este "veículo" é um segundo VHH que é fundido com o VHH terapêutico. Tais constructos de fusão são constituídos usando métodos conhecidos na técnica. 0 "veículo" VHH liga-se especificamente a um receptor na parede intestinal, o qual induz uma transferência activa através da parede.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptíveis aos moduladores do EGFR distribuídos na mucosa intestinal, em que o referido distúrbio aumenta a permeabilidade da mucosa intestinal.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido, para uso num método para distribuição de um modulador do EGFR na mucosa intestinal sem ser inactivado, por administração oral a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único direccionados contra o EGFR.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido, para uso num método para distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo sem 44 ser inactivado, por administração oral a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único direccionados contra o EGFR.
Este processo pode mesmo ser adicionalmente melhorado por um aspecto adicional da presente invenção - o uso de veículos transportadores activos. Neste aspecto da invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui descrito, é fundido com um veículo que melhora a transferência através da parede intestinal para a corrente sanquínea. Num exemplo não limitante, este "veículo" é um VHH que é fundido com o referido polipéptido. Tais constructos de fusão são constituídos usando métodos conhecidos da técnica. 0 "veículo" VHH liqa-se especificamente a um receptor na parede intestinal que induz uma transferência activa através da parede.
Uma forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas dos distúrbios susceptíveis a um modulador do EGFR que é capaz de passar através dos tecidos sob a língua, de um modo eficaz. Uma formulação do referido polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, por exemplo, um comprimido, vaporizador, rebuçado, é colocado sob a língua e adsorvido através das membranas mucosas para a rede capilar por baixo da língua.
Um aspecto da invenção é um polipéptido, tal como aqui definido, para o uso num método para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios 45 susceptíveis de modulação por um composto terapêutico que é capaz de passar através dos tecidos sob a lingua de um modo eficaz, por administração sub-lingual a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptíveis a um modulador do EGFR, que seja capaz de passar através dos tecidos sob a língua.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR nos tecidos sob a língua, sem ser inactivado, por administração sub-lingual a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo, sem ser inactivado, por administração oral a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Uma forma de realização da presente invenção é um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, para uso no tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptíveis a um modulador do EGFR que seja capaz de passar através da pele, de um modo eficaz. 46
Exemplos de distúrbios são cancros e outros que causem inflamação, incluindo mas não se limitando a artrite reumatóide e psoriase. Uma formulação do referido polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, por exemplo, é um creme, filme, vaporizador, adesivo, sendo colocado na pele e atravessando-a.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para uso num método para o tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de distúrbios susceptiveis a um modulador do EGFR que seja capaz de passar através da pele de um modo eficaz, por administração tópica a um indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Outra forma de realização da presente invenção é o uso de polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgados, para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de distúrbios susceptiveis de modulação por um modulador do EGFR que seja capaz de passar através da pele de um modo eficaz.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR na pele, sem ser inactivado, por administração tópica num indivíduo de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Um aspecto da invenção é um polipéptido tal como aqui definido para uso num método para a distribuição de um modulador do EGFR na corrente sanguínea de um indivíduo, por administração tópica a um indivíduo de um polipéptido 47 do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado.
Numa outra forma de realização da presente invenção, um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, de acordo com a reivindicação 1 compreende adicionalmente um veículo anticorpo de domínio único (p.ex., VHH) que actua como um veículo transportador activo para o transporte do referido polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, do lúmen pulmonar para o sangue.
Exemplos de distúrbios são cancros e outros que causem inflamação, incluindo mas não se limitando a hipersecreção de muco pulmonar, artrite reumatóide e psoríase. 0 polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico compreendendo adicionalmente um veículo que se liga especificamente a um receptor presente na superfície da mucosa (células epiteliais dos brônquios), resultando no transporte activo do polipéptido do lúmen pulmonar para o sangue. 0 veiculo anticorpo de dominio único pode ser fundido com o polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. Tais constructos de fusão são constituídos usando métodos conhecidos da técnica e são aqui descritos. 0 "veículo" anticorpo de domínio único liga-se especificamente a um receptor na superfície da mucosa que induz uma transferência activa através da superfície. É também descrito um método para determinar quais os anticorpos de domínio único (p.ex., VHHs) que são transportados activamente para a corrente sanguínea aquando da administração nasal. De um modo semelhante, um banco de fagos VHH virgens ou imunes, pode ser administrado por via 48 nasal e em diferentes tempos pós-administração, o sangue ou os órgãos podem ser isolados para resgatar os fagos que foram transportados activamente para a corrente sanguínea. Um exemplo não limitante de um receptor para o transporte activo do lúmen pulmonar para a corrente sanguínea é o receptor N (FcRn) do Fc. Um aspecto da invenção inclui as moléculas VHH identificadas pelo método. Tais VHH podem então ser usadas como um veículo VHH para a distribuição de um VHH terapêutico no alvo correspondente, na corrente sanguínea aquando da administração nasal.
Num aspecto da invenção, pode ser usado um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgado, de modo a detectar agentes que modulam a ligação do referido polipéptido ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. Quando identificado num ensaio que mede a ligação ou apenas o deslocamento do referido polipéptido, os agentes terão de ser sujeitos a testes funcionais para determinar se eles modulam a acção do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico in vivo. Os exemplos de ensaios de detecção são dados abaixo, primariamente no que diz respeito à SEQ ID No.: 3, embora qualquer polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, tal como aqui divulgado, possa ser apropriado.
Num exemplo de uma experiência de deslocamento, o fago ou as células que expressam o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico são incubados num tampão de ligação com, por exemplo, um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3, o qual foi marcado, na presença ou ausência de concentrações crescentes de um modulador candidato. Para validar e calibrar o ensaio, podem ser realizadas as reacções de competição de controlo usando as concentrações crescentes do referido polipéptido, o qual não é marcado. Após a incubação, as células são extensivamente lavadas e 49 ligadas, o polipéptido marcado é medido de acordo com o apropriado para um determinado marcador (p.ex., contagem de cintilação, fluorescência, etc.). Um decréscimo de, pelo menos, 10% na quantidade do polipéptido marcado ligado na presença do modulador candidato indica o deslocamento da ligação pelo modulador candidato. Os moduladores candidatos são considerados como se ligando especificamente neste e noutros ensaios aqui descritos se deslocarem 50% do polipéptido marcado (dose de polipéptido sub-saturante) a uma concentração de 1 μΜ ou menor.
Alternativamente, a ligação ou o deslocamento da ligação pode ser monitorizada por ressonância do plasmão de superfície (SPR). Os ensaios de ressonância do plasmão de superfície podem ser usados como um método quantitativo para medir a ligação entre duas moléculas pela alteração na massa perto de um sensor imobilizado, causada pela ligação ou perda da ligação, por exemplo, o polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3 da fase aquosa para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento imobilizado na membrana do sensor. Esta alteração na massa é medida como unidades de ressonância versus tempo após a injecção ou remoção do referido polipéptido ou modulador candidato e é medida usando um Biosensor Biacore (Biacore AB) . O Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento pode ser, por exemplo, imobilizado num chip do sensor (por exemplo, o chip com grau de pesquisa CM5; Biacore AB) numa membrana lipídica em filme fino, de acordo com os métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sei. 24:213-219, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência). Sarrio et al. demonstrou que a SPR pode ser usada para detectar a ligação do ligando ao receptor adenosina GPCR A(l) imobilizado numa 50 camada lipídica no chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174, aqui incorporado por referência). As condições para a ligação da SEQ ID No.: 3 ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento num ensaio SPR, podem ser afinadas por um perito na técnica, usando as condições registadas por Sarrio et al. como ponto iniciador. A SPR pode avaliar moduladores no que se refere à ligação de, pelo menos, duas formas. Primeiro, um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3, por exemplo, pode ser pré-ligado ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico imobilizado, ou um seu fragmento, seguido da injecção do modulador candidato num intervalo de concentração desde 0,1 nM a 1 μΜ. O deslocamento do polipéptido ligado pode ser quantificado, permitindo a detecção da ligação do modulador. Alternativamente, o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico ou um seu fragmento pode ser pré-incubado com um modulador candidato e desafiado com, por exemplo, um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3. Uma diferença na afinidade da ligação entre o referido polipéptido e o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou seu fragmento, pré-incubado com o modulador, comparada com aquela entre o referido polipéptido e o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou seu fragmento na ausência do modulador, irá demonstrar a ligação ou deslocamento do referido polipéptido na presença do modulador. Em qualquer ensaio, um decréscimo de 10% ou mais na quantidade do referido polipéptido ligado na presença do modulador candidato indica que o modulador candidato inibe a interacção do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou seu fragmento e o referido polipéptido. 51
Outro método para detectar a inibição da ligação de, por exemplo, um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3, ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, usar transferência ressonante da energia de fluorescência (FRET). A FRET é um fenómeno da mecânica quântica que ocorre entre um dador de fluorescência (D) e um aceitador de fluorescência (A) em intima proximidade entre si (normalmente < 100 A de separação) se o espectro de emissão de D se sobrepor com o espectro de excitação de A. As moléculas a serem testadas, p.ex., um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3 e um Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, são marcadas com um par complementar de fluoróforos dador e aceitador. Enquanto se ligam intimamente pela interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico:polipéptido, a fluorescência emitida aquando da excitação do fluoróforo dador terá um comprimento de onda diferente do emitido em resposta ao comprimento de onda de excitação, quando o referido polipéptido e o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento não estão ligados, possibilitando a quantificação de moléculas ligadas versus não ligadas, por medição da intensidade da emissão a cada comprimento de onda. Os fluoróforos dadores com os quais se marca o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, são bem conhecidos na técnica. São de particular interesse as variantes de A. Victoria GFP conhecidas como Ciano FP (CFP, Dador (D)) e Amarelo FP (YFP, Aceitador (A)). Como um exemplo, a variante YFP pode ser feita como uma proteína de fusão com o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento. Os vectores para a expressão das variantes GFP como fusões (Clontech) assim como os reagentes marcados com fluoróforos (Sondas Moleculares) são conhecidos na técnica. A adição de um modulador candidato à mistura de um polipéptido marcado 52 fluorescentemente e um Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico-YFP resultará numa inibição da transferência de energia evidenciada por, por exemplo, um decréscimo na fluorescência YFP relativa à amostra sem o modulador candidato. Num ensaio usando FRET para a detecção da interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico:polipéptido, um decréscimo de 10 % ou superior na intensidade da emissão de fluorescência no comprimento de onda aceitador nas amostras contendo um modulador candidato, relativamente a amostras sem o modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe a interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico: polipéptido.
Uma amostra, tal como aqui usada, pode ser qualquer amostra biológica contendo o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, tal como as amostras clinicas (p.ex., fracções de células, sangue total, plasma, soro, tecido, células, etc.), derivadas de amostras clinicas, de agricultura, Forenses, de pesquisa ou outras possíveis. As amostras clínicas podem ter origem humana ou animal. A amostra analisada pode ser líquida ou sólida na natureza. É evidente quando são usados materiais sólidos, que estes são primeiro dissolvidos numa solução adequada.
Uma variação da FRET usa a extinção da fluorescência para monitorizar as interacçóes moleculares. Uma molécula no par de interacção pode ser marcada com um fluoróforo e a outra com uma molécula que extingue a fluorescência do fluoróforo quando colocada na oposição próxima deste. Uma alteração na fluorescência aquando da excitação é indicativa de uma alteração na associação das moléculas marcadas com o par fluoróforo: agente de extinção. Geralmente, um aumento na fluorescência do Receptor do Factor de Crescimento 53
Epidérmico marcado, ou de um seu fragmento, é indicativo de que o polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico que comporta o agente de extinção foi deslocado. Para os ensaios de extinção, um aumento de 10% ou superior na intensidade da emissão fluorescente em amostras contendo um modulador candidato, relativamente a amostras sem o modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe a interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico: polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico.
Além dos métodos de ressonância do plasmão de superfície e FRET, a medição da polarização da fluorescência é útil para quantificar a ligação. O valor da polarização da fluorescência para uma molécula marcada fluorescentemente depende do tempo de correlação rotacional ou da velocidade da queda. Os complexos, tais como aqueles formados pelo Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, associados a um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico marcado fluorescentemente, têm valores de polarização mais elevados que o polipéptido marcado, não complexado. A inclusão de um inibidor candidato da interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico: polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico resulta num decréscimo da polarização da fluorescência, relativo a uma mistura sem o inibidor candidato, se o inibidor candidato disrompe ou inibe a interacção do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento com o referido polipéptido. A polarização da fluorescência é bem adequada para a identificação de pequenas moléculas que disrompem a formação dos complexos Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico: polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico. Um decréscimo de 10% ou mais 54 na polarização da fluorescência em amostras contendo um modulador candidato, relativo à polarização da fluorescência numa amostra desprovida do modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe a interacção Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico: polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico.
Outra alternativa para a monitorização das interacções Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico:polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico usa foram descritos um ensaio com biosensor. Os biosensores ICS foram descritos a técnica (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, and Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 387, 580) . Nesta tecnologia, a associação do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento e de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico está acoplada ao fecho dos canais iónicos facilitados pela gramacidina em bicamadas suspensas e assim a uma alteração mensurável na admitância (semelhante a impedância) do biosensor. Esta abordagem é linear ao longo de seis ordens de grandeza da alteração da admitância e é idealmente adequada para a escala industrial, elevada produção da detecção de bases de dados combinatórias de pequenas moléculas. Uma alteração de 10% ou superior (aumento ou decréscimo) na admitância numa amostra contendo um modulador candidato, relativo à admitância de uma amostra desprovida do modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe a interacção do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento e do referido polipéptido. É importante notar que em ensaios que testam a interacção do Receptor do Factor de 55
Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento como um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, é possível que um modulador da interacção não necessite de interactuar directamente com o(s) domínio(s) das proteínas que interactuam fisicamente com o referido polipéptido. Também é possível que um modulador interactue num local removido do local de interacção e cause, por exemplo, uma alteração conformacional no Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. Os moduladores (inibidores ou agonistas) que actuam deste modo não são mais do que agentes de interesse para modular a ligação do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico ao seu receptor.
Qualquer um dos ensaios de ligação descritos pode ser usado para determinar a presença de um agente numa amostra, p.ex., uma amostra de tecido, que se liga ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, ou que afecta a ligação de, por exemplo, um polipéptido representado pela SEQ ID No.: 3 ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento. Para o concretizar, um Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, é feito reagir com o referido polipéptido na presença ou ausência da amostra e a ligação do polipéptido é medida de acordo com o apropriado para o ensaio de ligação a ser usado. Um decréscimo de 10% ou mais na ligação do referido polipéptido indica que a amostra contém um agente que modula a ligação do referido polipéptido ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou a um seu fragmento.
Claro que os métodos acima generalizados podem facilmente ser aplicados à detecção de moduladores candidatos, os quais alteram a ligação entre qualquer polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da 56 invenção e o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento.
Uma célula que é útil de acordo com a invenção é preferencialmente seleccionada do grupo que consiste em células bacterianas tais como, por exemplo, E. coli, células de levedura tais como, por exemplo, S. cerevisae, P. pastoris, células de insecto ou células de mamífero.
Uma célula que é útil de acordo com a invenção pode ser qualquer célula dentro da qual uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipéptido compreendendo um Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da invenção, uma sua sequência homóloga, uma sua porção funcional, uma porção funcional de uma sua sequência homóloga ou uma sua variante mutante de acordo com a invenção, pode ser introduzida de tal modo que o polipéptido seja expresso em níveis naturais ou acima de níveis naturais, como aqui definido. Preferencialmente, um polipéptido da invenção que é expresso numa célula exibe uma farmacologia normal ou próxima da normal, tal como aqui definido. De um modo mais preferido, um polipéptido da invenção que é expresso numa célula compreende a sequência de nucleótidos capaz de codificar para qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas na Tabela 5 ou capaz de codificar para uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 5.
De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, uma célula é seleccionada do grupo que consiste nas células COS7, uma célula CHO, uma célula LM (TK-) , uma célula NIH-3T3, uma célula HEK-293, uma célula K-562 ou uma 57 célula astrocitoma 1321 Nl mas também outras linhas celulares transfectáveis.
De um modo geral, uma "quantidade terapeuticamente eficaz", "dose terapeuticamente eficaz" e "quantidade eficaz" significam a quantidade necessária para atingir o resultado ou resultados desejado(s) (modulação da ligação do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico; tratamento ou prevenção do cancro ou inflamação). Um perito na técnica reconhece que o potencial e, portanto, uma "quantidade eficaz" pode variar para os vários compostos que modulam a ligação do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico usado na invenção. Um perito na técnica pode avaliar prontamente o potencial do composto.
Tal como aqui usado, o termo "composto" refere-se a um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico da presente invenção, ou um ácido nucleico capaz de codificar para o referido polipéptido ou um agente identificado de acordo com o método de detecção aqui descrito ou o referido polipéptido compreendendo um ou mais aminoácidos derivatizados.
Por "farmaceuticamente aceitável" pretende-se referir a um material que não é biologicamente, ou de outro modo, indesejável, i.e., o material pode ser administrado a um indivíduo juntamente com o composto sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interactuar de um modo prejudicial com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica na qual está contido.
Os polipéptidos de uma classe de VHHs semelhantes a humanos, tal como aqui divulgados, são úteis para tratar ou prevenir as condições num indivíduo e compreende a 58 administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto ou composição.
Os polipéptidos da presente invenção são úteis no tratamento ou prevenção de condições relacionadas com o cancro, artrite reumatóide e psoríase num indivíduo e compreendem a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto ou composição que se liga ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico.
Os polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, tal como aqui divulgados, são úteis no tratamento ou prevenção de condições relacionadas com o cancro, artrite reumatóide e psoríase num indivíduo e compreendem a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da combinação do composto com outro, tal como, por exemplo, a doxorubicina. A presente invenção não se limita à administração de formulações compreendendo um só composto da invenção. Está compreendido do âmbito da invenção proporcionar tratamentos combinatórios em que é administrada uma formulação a um paciente em necessidade da mesma, que compreende mais do que um composto da invenção.
As condições mediadas pelo Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico incluem, mas não se limitam a, cancro, artrite reumatóide e psoríase.
Um composto útil na presente invenção pode ser formulado como composições farmacêuticas e administrado a um hospedeiro mamífero, tal como um paciente humano ou um animal doméstico numa variedade de formas adaptadas à via de administração escolhida, i.e., oralmente ou 59 parentericamente, por via intranasal através da inalação, intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea.
Um composto da presente invenção também pode ser administrado usando métodos de terapia genética para a distribuição. Ver, p.ex., o documento de Patente US N° 5,399,346, o qual é incorporado como referência na sua totalidade. Usando um método de terapia genética para a distribuição, as células primárias transfectadas com o gene para o composto da presente invenção pode adicionalmente ser transfectado com promotores específicos do tecido para órgãos, tecidos, enxertos, tumores ou células alvo específicos e podem adicionalmente ser transfectados com sequências sinalizadoras e estabilizantes para a expressão subcelular localizada.
Assim, o presente composto pode ser administrado sistemicamente, p.ex., oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um diluente inerte ou um veículo digerível assimilável. Eles podem ser englobados em cápsulas de gelatina duras ou moles, podem ser prensados em forma de comprimido, ou podem ser incorporados directamente nos alimentos que constituem a dieta dos pacientes. Para a administração terapêutica oral, o composto activo pode ser combinado com um ou mais excipientes e usado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e semelhantes. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% do composto activo. A percentagem de composições e preparações pode, evidentemente, ser variada e pode, de um modo conveniente, estar compreendida entre 2 e cerca de 60% do peso de uma dada forma de dosagem unitária. A quantidade do composto 60 activo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que um nivel de dosagem eficaz será obtido.
Os comprimidos, pastilhas, pilulas, cápsulas e semelhantes podem também conter o seguinte: agentes ligantes tais como a goma tragacante, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como o fosfato de di-cálcio; um agente desintegrante tal como o amido de milho, amido de batata, ácido alginico e semelhantes; um lubrificante tal como o estearato de magnésio; e um agente edulcorante, tal como a sacarose, frutose, lactose ou aspartame ou um agente aromatizante tal como a menta, óleo de gaultéria ou aroma de cereja podem ser adicionados. Quando a forma da unidade de dosagem é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veiculo liquido tal como um óleo vegetal ou um polietilenoglicol. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou, por outro lado, modificar a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, os comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e semelhantes. Um xarope ou elixir pode conter o composto activo, sacarose ou frutose como agente edulcorante, metilo e propilparabenos como agentes conservantes, um corante e aromatizante tal como o aroma de cereja ou laranja. Claro que qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. Adicionalmente, o composto activo pode ser incorporado nas preparações e dispositivos de libertação controlada. O composto activo pode também ser administrado por via intravenosa ou intraperitoneal, por infusão ou injecção. As soluções do composto activo ou dos seus sais podem ser 61 preparadas em água, opcionalmente misturadas com um tensioactivo não tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, triacetina e suas misturas e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um agente conservante para prevenir o crescimento de microrganismos.
As formas de dosagem farmacêuticas adequadas para a injecção ou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis compreendendo o ingrediente activo, que são adaptados à preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis, injectáveis ou para infusão, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem em última análise deve ser estéril, fluida e estável sob as condições de produção e armazenamento. 0 veículo ou transportador líquido pode ser um solvente ou meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicóis líquidos e semelhantes), óleos vegetais, ésteres de glicerilo não tóxicos e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção da dimensão de partícula necessária no caso das dispersões ou pelo uso de tensioactivos. A prevenção da acção dos microrganismos pode ser conseguida pelos vários agentes antibacterianos e anti-fungicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida pelo uso de agentes que atrasam a absorção, nas 62 composições, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
As soluções injectáveis estéreis são preparadas por incorporação do composto activo na quantidade necessária no solvente adequado com vários dos outros ingredientes acima enumerados, tal como requerido, seguida por esterilização por filtração. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são as técnicas de desidratação por vácuo e por congelação, as quais originam um pó do ingrediente activo acrescido de qualquer ingrediente adicional desejado, presente nas soluções previamente esterilizadas por filtração.
Para a administração tópica, o presente composto pode ser aplicado na forma pura, í.e., quando são líquidos. No entanto, é geralmente desejável administrá-los na pele como composições ou formulações, em combinação com um veículo dermatologicamente aceitável, o qual pode ser um sólido ou um líquido.
Os veículos sólidos úteis incluem sólidos divididos, tais como o talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alúmina e semelhantes. Os veículos líquidos úteis incluem água, hidroxialquilos ou glicóis ou misturas água-álcool/glicol, nos quais o composto presente pode ser dissolvido ou disperso em níveis eficazes, opcionalmente com o auxílio de tensioactivos não tóxicos. Os adjuvantes tais como fragrâncias e agentes antimicrobianos adicionais podem ser adicionados para optimizar as propriedades para um dado uso. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas a partir de almofadas não absorventes, usadas para impregnar bandas e outros revestimentos ou vaporizadas 63 na área afectada, usando vaporizadores do tipo bomba ou aerossol.
Os agentes espessantes, tais como os polímeros sintéticos, ácidos gordos, sais e ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados podem ser empregues com veículos líquidos, para formar pastas espalháveis, géis, unguentos, sabonetes e semelhantes, para aplicação directamente na pele do utilizador.
Os exemplos de composições dermatológicas úteis que podem ser usadas para distribuir o composto na pele são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559, 157) e Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508).
As dosagens úteis do composto podem ser determinadas por comparação da sua actividade in vitro e da actividade in vivo em modelos animais. Os métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em ratos e noutros animais, para humanos, são conhecidos na técnica; por exemplo, ver o documento de Patente US 4,938,949.
Geralmente, a concentração do(s) composto(s) numa composição líquida, tal como uma loção, será desde cerca de 0,1-25% pt, preferencialmente desde cerca de 0,5-10% pt. A concentração numa composição semi-sólida ou sólida, tal como um gel ou um pó, será cerca de 0,1-5% pt, preferencialmente cerca de 0,5-2,5% pt. A quantidade do composto ou de um sal activo ou derivado, necessário para o uso no tratamento, vai variar não só com 64 o sal particular seleccionado mas também com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada e a idade e condição do paciente e será, em última análise, alvo da discrição pelo médico ou clinico assistente. Também a dosagem do composto varia, dependendo da célula, tumor, tecido, enxerto ou órgão alvo. A dose desejada pode ser convenientemente apresentada numa dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A própria sub-dose pode ser adicionalmente dividida, p.ex., num número de administrações discretas largamente espaçadas; tais como múltiplas inalações a partir de um insuflador ou por aplicação de uma pluralidade de gotas no olho.
Um regime de administração pode incluir tratamento diário, a longo prazo. Por "longo prazo" pretende-se referir a pelo menos duas semanas e, preferencialmente, várias semanas, meses ou anos de duração. As modificações necessárias neste intervalo de dosagem podem ser determinadas por um perito na técnica, usando apenas a experimentação de rotina, dados os ensinamentos aqui inclusos. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dose também pode ser ajustada pelo médico, em caso de qualquer complicação.
Moduladores candidatos É também descrito um agente que é um modulador das interacções entre o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico e o seu ligando. 0 agente candidato pode ser um agente sintético, ou uma mistura de agentes, ou pode ser um produto natural (p.ex., 65 um extracto de planta ou sobrenadante de cultura). Um agente candidato inclui uma molécula pequena que pode ser sintetizada, um extracto natural, péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, etc.
Os agentes moduladores candidatos de grandes bases de dados de agentes sintéticos ou naturais, podem ser detectados. São usados de um modo corrente vários meios para a síntese aleatória e direccionada de agentes baseados em sacarídeos, péptidos e ácidos nucleicos. As bases de dados de agentes sintéticos estão disponíveis comercialmente a partir de várias companhias, incluindo a Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), and Microsource (New Milford, CT) . Está disponível um banco químico raro na Aldrich (Milwaukee, WI) . Estão disponíveis bases de dados combinatórias e podem ser preparadas. Alternativamente, as bases de dados de agentes naturais na forma de extractos de bactérias, fungos, plantas e animais, estão disponíveis em, p.ex., Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (NC), ou são prontamente produzíveis por métodos bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, as bases de dados e os agentes produzidos natural e sinteticamente são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais.
Os agentes úteis podem ser encontrados em numerosas classes químicas. Os agentes úteis podem ser agentes orgânicos, ou pequenos agentes orgânicos. Os agentes orgânicos pequenos têm um peso molecular superior a 50, embora menos de cerca de 2.500 daltons, preferencialmente menos de cerca de 750, mais preferencialmente menos de cerca de 350 daltons. As classes exemplificativas incluem heterociclos, péptidos, sacarídeos, esteróides e semelhantes. Os agentes podem ser 66 modificados para melhorar a eficácia, estabilidade, compatibilidade farmacêutica e semelhantes. A identificação estrutural de um agente pode ser usada para identificar, gerar ou detectar agentes adicionais. Por exemplo, onde são identificados agentes peptidicos, eles podem ser modificados de várias maneiras para melhorar a sua estabilidade, tal como usando um aminoácido não natural, tal como um D-aminoácido, particularmente a D-alanina, por funcionalização da terminação amino ou carbólica, p.ex., para o grupo amino, acilação ou alquilação e para o grupo carboxilo, esterificação ou amidificação ou semelhantes.
Para a detecção primária, uma concentração útil de um agente candidato de acordo com a invenção é desde cerca de 10 mM a cerca de 100 μΜ ou mais (í.e., 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M, etc.). A concentração da detecção primária será usada como um limite superior, juntamente com nove concentrações adicionais, em que as concentrações adicionais são determinadas por redução da concentração de detecção primária em intervalos semi-logaritmicos (p.ex., para mais 9 concentrações) para detecções secundárias ou para gerar curvas de concentração.
Kit de detecção com elevada produtividade
Um kit de detecção com produtividade elevada, tal como aqui descrito, compreende todos os meios e ferramentas necessários para realizar a detecção de um agente que modula as interacções Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico/ligando por interacção com o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento na presença de um polipéptido, preferencialmente numa concentração num intervalo de 1 μΜ a 1 mM. 67 0 kit compreende o seguinte. Células recombinantes compreendendo e expressando a sequência nucleotidica que codifica para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, as quais são crescidas de acordo com o kit num suporte sólido, Tal como uma placa de microtitulação, mais preferencialmente uma placa de microtitulação de 96 poços, de acordo com os métodos bem conhecidos do perito na técnica, especialmente como descrito no documento WO 00/02045. Alternativamente, o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico ou um seu fragmento, é fornecido numa forma purificada para ser imobilizado sobre, por exemplo, uma placa de microtitulação com 96 poços pelo perito na técnica. Alternativamente, o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento, é fornecido no kit, pré-imobilizado sobre, por exemplo, uma placa de microtitulação com 96 poços. O Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico pode ser o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico inteiro ou um seu fragmento.
Os agentes moduladores, a concentrações desde cerca de 1 μΜ a 1 mM ou mais, são adicionados a poços definidos a presença de uma concentração apropriada de um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico de acordo com a reivindicação 1, uma sua sequência homóloga, uma sua porção funcional ou uma porção funcional de uma sua sequência homóloga, a referida concentração do referido polipéptido no intervalo de 1 μΜ a 1 mM. Os kits podem conter um ou mais polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico (p.ex., um ou mais polipéptidos representados por uma das SEQ ID N°s: 1 a 15 ou outros polipéptidos do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, uma sua sequência homóloga, uma sua porção 68 funcional ou uma porção funcional de uma sua sequência homóloga).
Os ensaios de ligação são realizados de acordo com os métodos já aqui divulgados e os resultados são comparados com o nivel basal de, por exemplo, o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento que se liga a um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento anti-Epidérmico, uma sua sequência homóloga, uma sua porção funcional ou uma porção funcional de uma sua sequência homóloga, mas na ausência de um agente modulador adicionado. Os poços que apresentam, pelo menos, 2 vezes, preferencialmente, 5 vezes, mais preferencialmente, 10 vezes e ainda mais preferencialmente, 100 vezes ou mais um aumento ou decréscimo na ligação Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico - polipéptido (por exemplo), quando comparada com o nivel de actividade na ausência do modulador, são seleccionados para análise adicional.
Outros Kits Úteis
Também são descritos kits úteis para detectar moduladores da ligação Receptor do Factor de Crescimento
Epidérmico/ligando, assim como kits úteis para o diagnóstico de distúrbios caracterizados pela disfunção da sinalização do Receptor do Factor de Crescimento
Epidérmico. Também são descritos kits úteis para detectar moduladores de distúrbios, assim como kits para o seu diagnóstico, os referidos distúrbios caracterizados por um ou mais processos envolvendo o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico. Os kits úteis podem incluir um
Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico isolado, ou um seu fragmento. Alternativamente, ou adicionalmente, um kit pode compreender células transformadas para expressar o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu 69 fragmento. Um kit pode compreender um polinucleótido que codifica para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento. Um kit pode compreender os iniciadores específicos, úteis para a amplificação do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou de um seu fragmento. Os kits úteis podem compreender um polipéptido do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico isolado, um seu homólogo ou uma sua porção funcional. Um kit pode compreender células transformadas para expressar o referido polipéptido. Os kits podem conter mais do que um polipéptido. Um kit pode compreender um polinucleótico que codifica para o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico ou para um seu fragmento. Um kit pode compreender os iniciadores específicos úteis para a amplificação de uma macromolécula tal como, por exemplo, o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, ou um seu fragmento. Todos os kits compreendem os itens citados ou combinações dos itens e materiais de embalagem associados. Os kits também incluem as instruções para o uso.
EXEMPLOS A invenção é ilustrada pelo seguinte exemplo, não limitante. 70
Exemplol: Imunização
Após a aprovação do Comité de Ética da Faculdade de Medicina Veterinária (Universidade de Ghent, Bélgica), 4 lamas (024, 025, 026 e 027) foram imunizados com o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) para o antigénio tumoral, de acordo com todos os regulamentos vigentes no âmbito do bem estar dos animais. Para gerar uma resposta imunitária dependente de anticorpos (tabela 1), dois animais foram injectados com células de carcinoma escamoso vulvar humano (A431, ATCC CRL 1555), expressando o EGFR na sua superfície celular, enquanto os extractos de membrana derivados da A431 foram administrados aos dois outros lamas (026 e 027) . Cada animal recebeu sete doses de antigénios administrados por via subcutânea em intervalos semanais (tabela 1) . Quando se imuniza com células intactas, cada dose consistia em 108 células A431 acabadas de colher. A dose para a imunização com extractos de membrana consistiram em vesículas preparadas a partir de 108 células A431. As vesículas foram preparadas de acordo com Cohen e colegas (Cohen S, Ushiro H, Stoscheck C, Chinkers M, 1982. A native 170,000 epidermal growth factor receptor kinase complex from shed plasma membrane vesicles. J. Biol. Chem. 257:1523-31). As vesículas foram armazenadas a -80 °C antes da administração. Duas injecçóes extra de oito microgramas de EGFR purificado (Sigma) numa emulsão com o adjuvante Stimune (CEDI Diagnostics B.V., Lelystad, The Netherlands) foram administradas por via intramuscular ao lama 025 (tabela 1) .
Exemplo 2: Avaliação da resposta imunitária
Ao dia 0, 28 e 42, foram colhidos 10 mL de sangue pré-imune e o soro foi usado para avaliar a indução das respostas imunitárias nos 4 animais. Foi realizado um primeiro ELISA para verificar se os animais tinham gerado anticorpos que 71 reconhecessem os epítopos A431. Após revestir uma placa de 96 poços, tratada para cultura de tecidos, com gelatina (0,5% em PBS durante 10 minutos), o excesso de gelatina foi removido e as células A431 foram crescidas durante a noite nos micropoços até à confluência. As células foram fixas com paraformaldeido 4% em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, o fixador foi bloqueado com glicina 100 mM em PBS durante 10 minutos, seguido do bloqueio dos poços com uma solução de leite desnatado - PBS a 4%, novamente durante 10 minutos. As diluições do soro dos animais imunizados foram aplicadas e foram detectados os anticorpos específicos das A431 com um antisoro policlonal anti-lama desenvolvido em coelho, seguido de um conjugado secundário de peroxidase de rábano anti-coelho de cabra (HRP) (Dako, Dinamarca). Para todos os quatro animais, a imunização com células intactas ou vesículas membranares resultou na indução de um título de anticorpo específico da A431 significativo (figura 1). Para verificar se os anticorpos de lama induzidos foram específicos para o EGFR, os títulos de anticorpo no soro foram avaliados em fibroblastos de rato que expressaram o EGFR humano (Her-14) e comparados com o clone 2.2 (3T3) da linha celular NIH3T3 de fibroblastos de rato progenitores, realizado de um modo semelhante ao descrito acima (figura 2). Novamente, o título do soro de anticorpos a ligarem-se ao Her-14 foi superior quando comparado com o título para as células 3T3 progenitoras, indicando que os anticorpos do soro circulantes foram específicos para o EGFR.
Finalmente, a resposta do soro em animais imunizados foi verificada em fase sólida revestida com EGFR purificado. O EGFR purificado (Sigma) e o antigénio carcinoembrionário irrelevante (CEA, Scripps), ambos a 1 μς/πΛ, foram imobilizados durante a noite a 4 °C numa placa Maxisorp de 72 96 poços (Nunc). Os poços foram bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS) . Após a adição das diluições do soro, as imunoglobulinas especificamente ligadas foram detectadas usando um antisoro de coelho anti-lama, seguido um conjugado de fosfatase alcalina de cabra anti-coelho (Sigma), mostrando que para todos os animais foi induzido um anticorpo significativo dependente da resposta imunitária contra o EGFR (figura 3).
Exemplo 3: Clonagem do repertório de fragmentos de anticorpo (VHH) de cadeia pesada.
Como não é conhecido muito sobre a ontogenia das imunoglobulinas dos camelídeos, os tecidos contendo células B de origem distinta e em diferentes pontos no tempo foram recolhidos para cada animal (tabela 1). Após a colheita dos tecidos, o ARN total foi isolado de acordo com o procedimento descrito por Chomczynski e Sacchi. (Chomczynski P and Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162:156-159). 0 procedimento para clonar o repertório VHH é baseado num método descrito no pedido de patente WO 03/054016. O cADN foi preparado no ARN total com Transcriptase Inversa MMLV (Invitrogen) usando oligonucleótidos oligo d(T) (de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, de Bruine AP, Arends JW, Hoogenboom HR. 1999. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J. Biol. Chem. 4:18218-30). As quantidades de ARN dos tecidos distintos usados para a síntese do cADN estão listadas na tabela 2. O cADN foi purificado com uma extracção fenol/clorofórmio, seguida de uma precipitação com etanol e subsequentemente usado como molde para amplificar o repertório VHH. Num primeiro PCR, o repertório 73 de ambos os segmentos de gene do anticorpo de cadeia convencional (1,6 kb) e cadeia pesada (1,3 kb), foi amplificado usando um iniciador especifico lider (ABL002) e ABL010, um oligo d(T) iniciador (para uma lista de iniciadores, ver a tabela 6) . Os fragmentos de ADN resultantes foram separados por electroforese em gel de agarose. 0 fragmento de 1,3 kb amplificado, codificando para os segmentos de anticorpo de cadeia pesada, foi purificado a partir de um gel de agarose e usado como molde numa PCR com iniciadores internos, usando uma mistura dos iniciadores FR1 (ABL037-ABL043) e ABL010. Os produtos da PCR foram digeridos com Sfíl (introduzida no iniciador FR1) e BstEII (que ocorre naturalmente em FR4). Segue-se uma electroforese em gel, o fragmento de ADN com aproximadamente 400 pares de bases foi purificado a partir do gel e 330 ng do repertório VHH amplificado foi ligado nos correspondentes locais de restrição de um micrograma do fagemideo pAX004 para obter um banco após a electroporação de Escherichia coli TG1. O pAX004 permite a produção de partículas fágicas, expressando os VHHs individuais como uma proteína de fusão com o produto gene III. A dimensão das bases de dados obtidas dos tecidos distintos colhidos dos lamas imunizados está descrita na tabela 2. Como controlo de qualidade, foi realizada uma PCR da colónia usando a M13 inversa e um iniciador do gene III para 24 colónias picadas aleatoriamente, de cada banco e foi calculada a percentagem dos clones contendo uma inserção com a dimensão correcta (tabela 2).
Exemplo 4: avaliação do repertório clonado
Num ELISA do fago policlonal, a especificidade do repertório fágico clonado foi avaliada relativamente ao EGFR e a um antigénio irrelevante (TNFa). Para gerar viriões recombinantes a expressarem o repertório VHH como 74 proteínas de fusão com o produto gene III, o banco foi crescido a 37 °C em 10 mL de meio 2xTY contendo glucose 2% e 100 μg/mL de ampicilina, até a OD60onm alcançar 0,5. Os fagos M13K07 (1012) foram adicionados e a mistura foi incubada a 37 °C durante 2 x 30 minutos, primeiro sem agitação, depois com agitação a 100 rpm. As células foram centrifugadas durante 5 minutos a 4,500 rpm à temperatura ambiente. O sedimento bacteriano foi resuspenso em 50 mL de meio 2xTY contendo 100 μg/mL de ampicilina e 25 μg/mL de kanamicina e incubadas durante a noite a 37 °C com agitação vigorosa a 250 rpm. As culturas incubadas durante a noite foram centrifugadas durante 15 minutos a 4.500 rpm a 4 °C e 0 sobrenadante foi usado para concentrar os fagos. Os fagos foram precipitados com PEG (20% de polietilenoglicol e NaCl 1,5 M) durante 30 minutos em gelo e centrifugados durante 20 minutos a 4.500 rpm. O sedimento foi resuspenso em 1 mL de PBS. Os fagos foram novamente precipitados em PEG durante 10 minutos em gelo e centrifugados durante 10 minutos a 14.000 rpm e 4 °C. O sedimento foi dissolvido em 1 mL de PBS. Um μρ/ηιΒ de EGFR ou TNFa foi imobilizado numa placa Maxisorp de 96 poços (Nunc) e incubado durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas 5 vezes com PBS/0,05% de Tween 20 e os poços foram bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS) e foram adicionadas diluições do fago durante 2 horas à temperatura ambiente. Os fagos ligados foram detectados usando o anticorpo monoclonal conjugado anti-M13 gpVIII-HRP (Amersham Biosciences) e ABTS/H202 como substrato. As placas foram lidas a 405 nm após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente. Um exemplo de uma resposta de um fago, de um pool de fagos resgatados de bases de dados PBL1 dos animais 024 e 025, é apresentado na figura 4. 75
Exemplo 5: Estratégias de selecção múltipla para identificar os nanocorpos específicos EGFR
Os bancos foram resgatados por crescimento das bactérias até à fase logarítmica (OD600=0,5), seguido por infecção com o fago auxiliar para obter fagos recombinantes a expressar o repertório dos VHHs clonados na ponta do fago como proteína de fusão gplll (como descrito no exemplo 4) . Quando se seleccionaram anticorpos específicos para o EGFR, foram seguidas duas estratégias de selecção distintas.
Selecção por eluição do epítopo específico Uma primeira estratégia de selecção foi baseada no facto do EGFR poder ser purificado por cromatografia de afinidade através da eluição do ligando. Foram realizadas quatro condições de eluição diferentes, aplicando um excesso de moléculas que competem para o local de ligação do ligando ou sobrepondo epítopos(s) (tabela 3). Quando a selecção foi realizada em células A431 ou Her-14, os fagos recombinantes não seleccionados foram misturados durante 20 minutos a 4 °C com 6 x 108 células sanguíneas (essencialmente monócitos, células T- e B-) ou 2 x 107 3T3s, respectivamente, para esgotar os fagos recombinantes que reconhecem os epítopos comuns, não específicos, do EGFR. Os fagos não ligados foram então incubados com células de selecção EGFR+ durante 2 horas, seguida de 6 lavagens com PBS gelado. Os fagos foram subsequentemente eluídos com um excesso de ligando EGF, monoclonal de rato 2e9 (Defize LH, Moolenaar WH, van der Saag PT, de Laat SW 1986. Dissociation of cellular responses to epidermal growth factor using anti-receptor monoclonal antibodies. EMBO J. 5:1187-92) ou anticorpos antagonistas de EGFR 225 e 528 (Sato JD, Kawamoto T, Le AD, Mendelsohn J, Polikoff J, Sato GH 1983. Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors. Mol. 76
Biol. Med. 1:511-529). Todos os passos de selecção foram realizados a 4 °C para evitar a internalização do fago mediada pelo receptor. A E. coli TG1 crescida logaritmicamente foi infectada com os fagos eluidos e
crescidos durante a noite a 37 °C em meio selectivo 2 x TY
AplOO e glucose 2%. As células foram raspadas e usadas na cultura seguinte, sempre que necessário. Duas ou três culturas subsequentes foram realizadas para um enriquecimento em fagos recombinantes específicos para o EGFR (tabela 3) . Sempre que foi usado antigénio purificado para a selecção (tabela 3) , o EGFR foi imobilizado a 1 μρ/Γη]1 em placas de microtitulação Maxisorp.
Selecção para fragmentos VHH internalizantes Uma segunda estratégia de selecção foi baseada na observação de que após a ligação do ligando ao receptor, a sinalização celular mediada pelo EGFR pode ser subregulada pelo mecanismo da internalização do receptor. Para identificar os fagos recombinantes que são capazes de internalizar através de moléculas de superfície celular, foi seguido o protocolo descrito por Poul e colegas (Poul MA, Becerril B, Nielsen UB, Morisson P, Marks JD. 2000. Selection of tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries. J. Mol. Biol. 301:1149-61). Os fagos recombinantes não seleccionados foram adicionados a aproximadamente 2 x 107 fibroblastos de rato 3T3s durante 30 minutos a 4 °C em meio de ligação gelado (DMEM tamponado com bicarbonato; Soro Fetal de Vitela 10%; Hepes 25 mM) , suplementado com leite desnatado a 2% para esgotar os VHHs não específicos. Os fagos não ligados foram subsequentemente incubados com células de selecção EGFR+ pré-arrefecidas (Her-14 ou A431) no meio de ligação durante 1,5 horas a 4 °C, seguido de seis lavagens com PBS gelado para remover fagos não ligados. As células foram cobertas 77 com meio de ligação pré-aquecido e imediatamente transferidas a 37°C durante 20 minutos, para permitir a internalização. Subsequentemente, as células foram arrefecidas até 4 °C e foram incubadas com ácido fraco (NaCl 500 nM; glicina 100 mM pH 2,5) durante 10 minutos para remover os fagos recombinantes ligados à superfície. As células foram libertadas da matriz extracelular por tripsinizaçâo. As células resuspensas foram então lisadas durante 4 minutos com TEA 100 mM a 4 °C para libertar os fagos internalizados. A E. coli TG1 crescida logaritmicamente foi infectada com os fagos eluídos e crescida durante a noite a 37 °C em meio selectivo (2xTY AplOO com glucose 2%) . Os bancos usados para uma única ronda de selecção em células A431 e em paralelo em células Her-14, são resumidos na tabela 4.
Exemplo 6: caracterização dos nanocorpos específicos para o EGFR
Para verificar a especificidade dos clones individuais para o EGFR após o procedimento de cultura por eluição do epitopo especifico, foi realizado um ELISA do fago em clones individuais. Foram crescidos 47 clones colhidos aleatoriamente por cada processo de selecção (1, 2, 3, 4, Ia e Illa; tabela 3) até à fase logarítmica (OD6oo=0,5), seguida de infecção com fago auxiliar para obter fagos recombinantes de acordo com o descrito no exemplo 4. Foi realizado um ELISA do fago na fase sólida revestida com EGFR (comparando com o poço não revestido) e em células HEr-14 revestidas com gelatina (comparando com 3T3). A presença de VHH específico para o EGFR foi verificada através do uso de aproximadamente 109 partículas do fago recombinante de cada clone antes da detecção com um anticorpo monoclonal conjugado anti-M13 gpVIII-HRP. Com clones que se classificaram como positivos no ELISA dos 78 fagos e/ou em EGFR imobilizado em fase sólida (tabela 3), foi realizada uma análise para impressão digital Hinfl (dados não apresentados). A sequência de nucleótidos foi determinada para um clone representativo de cada impressão digital distinta, resultando em 5, 8, 3, 4, 7 e 4 sequências diferentes para as condições 1, Ia, 2, Illa, 3 e 4, respectivamente. 0 alinhamento da sequência de aminoácidos destes 31 ligantes (figura 5) indicou que 20 deles são únicos (listados na tabela 5) . A especificidade para o EGFR dos 20 clones únicos no ELISA dos fagos (ambos nas células e em EGFR revestido na fase sólida) são apresentados na figura 6.
Para a selecção de acordo com o protocolo de internalização, foi realizado um ELISA dos fagos em células com um total de 84 clones individuais, de um modo semelhante ao dos clones identificados pelo procedimento de selecção por eluição do epitopo especifico. Após a análise de impressão digital Hinfl, a determinação da sequência de nucleótidos e o alinhamento da sequência de aminoácidos para o painel acima descrito de 20 ligantes únicos (dados não apresentados), 2 novos clones anti-EGFR, EGFR-Bll e clone EGFR-Fll, foram identificados (tabela 5) . A especificidade do EGFR de ambos os clones no ELISA dos fagos é apresentada na figura 6, painel A.
Exemplo 7: Internalização de nanocorpos mediada pelo receptor EGF
As células Her-14 e 3T3 foram crescidas durante a noite em lamelas de vidro, lavadas com meio de ligação (ver exemplo 5) e arrefecidas a 4 °C durante 20 minutos. Os fagos foram preparados do nanocorpo EGFRIIIa42 tal como descrito no exemplo 4 e aproximadamente 1012 viriões recombinantes, diluidos no meio de ligação suplementado com leite 79 desnatado a 2%, foram adicionados as células geladas durante 1 hora a 4 °C As células foram lavadas uma vez com PBS gelado para remover os fagos não ligados. Subsequentemente, as células foram removidas para 37 °C durante 20 minutos para permitir a internalização dos fagos e novamente arrefecidas até 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com PBS. Seguidamente, os fagos ligados à superfície celular foram removidos por duas lavagens ácidas com tampão de lavagem (NaCl 150 mM, HAc 125 mM) durante sete minutos à temperatura ambiente. Após duas lavagens com PBS, as células foram fixas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente e novamente lavadas duas vezes com PBS. As células fixas foram então permeabilizadas em Triton x-100 0,2% em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de duas lavagens com PBS e o que permaneceu fixo foi bloqueado com glicina 100 mM em PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS-gelatina 0,5% (p/v) e o fago internalizado foi visualizado por marcação com um anti-M13 gpVIII-FITC (Amersham Biosciences) seguido por um anticorpo monoclonal marcado com FITC anti-rato e a subsequente visualização por microscopia de fluorescência. A figura 7 demonstra que o EGFRIIIa42 é capaz de internalizar a Her-14 (painel A) mas não as células 3T3 (painel B).
TABELAS
Tabela 1
Dia Lama 024 Lama 025 Lama 026 Lama 027 0 células intactas células intactas vesículas vesículas 7 células intactas células intactas vesículas vesículas 14 células intactas células intactas vesículas vesículas 21 células intactas células intactas vesículas vesículas 28 células intactas células intactas vesículas vesículas 35 células intactas células intactas vesículas vesículas 42 células intactas células intactas vesículas vesículas 46 150 mL de amostra de sangue (PBLl) 150 mL de amostra de sangue (PBLl) 150 iriL de amostra de sangue (PBLl)do nódulo linfático 150 iriL de amostra de sangue (PBLl)do nódulo linfático 80
Dia Lama 024 Lama 025 Lama 026 Lama 027 47 nódulo linfático baço medula óssea 49 EGFR purificado 150 mL de amostra de sangue (PBL2) 150 mL de amostra de sangue (PBL2) 55 EGFR purificado 59 150 mL de amostra de sangue (PBL2) 60 nódulo linfático baço medula óssea
Tabela 2
Animal Tecido RNA (pg) Dimensão (xlO8) % Inserção Lama 024 PBL1 200 0,25 83 Lama 024 nódulo linfático ileo 40 2,3 78 Lama 024 nódulo linfático arco 150 0,17 100 Lama 024 Medula óssea 97 1,5 83 Lama 024 Baço 160 0,16 95 Lama 025 PBL1 200 0,06 95 Lama 025 Nódulo linfático (íleo + arco) 200 0,8 96 Lama 025 Medula óssea 200 0,045 88 Lama 025 Baço 200 2 86 Lama 025 PBL2 200 0,13 83 Lama 026 PBL1 + nódulo linfático 100 + 200 2,46 85 Lama 027 PBL1 + nódulo linfático 100 + 200 1,08 92
Tabela 3
Condição de eluiçâo Molécula de eluiçâo Selecção: formato do antigénio $ELISA Her-14 $ELISA EGFR Famílias ligantes Ia ronda 2a ronda 3a ronda 1 Ia EGF A431 Her-14 EGFR — 1/47 5/47 24/47 23/47 6 8 2 Illa 2e9 A431 Her-14 EGFR — 2/47 11/47 32/47 32/47 5 4 3 225 A431 A431 Her-14 EGFR 8/47 20/47 28/47 31/47 5 4 528 A431 A431 Her-14 16/47 10/47 5 81 EGFR 22/47 29/47
Tabela 4
Banco Células de selecção Fragmento do anticorpo seleccionado Pool de nódulo linfático, medula óssea, baço e PBL1 (024+025) Her-14 A2 Pool de medula óssea (024+025) A431 A4, A9, Bll Pool PBL1 (024+025) A431 Fll
Tabela 5
Seq ID Nome Sequência 1 EGFR-1.4 EVQLVESGGGWGAGGSLRLSCAASGRTFSNYVMGWFRQAPGKERDFW G2GRSGGDNTYYADSVKGRFTISWDHAKKTMYLGMHSLKPEDTAVYYCA ASTYSRDTX FTKWAISYNYMGQÔTQVWSS 2 EGFR-1.9 QVQLQESGGGLVKAGGSIiRLSCAASGKTPSSYVMGWFRQAPGKEREFVG AII^SGGRTYyADSVKGRFTISSDNAKRFfLYLQMKSLKPEDTAVYYCAA SRIIYSYVNYVNPGBYDYKGQGTQVTVSS 3 EGFR- 1.33 BVQLVESGGGLVQPÕGSLRLSCAASGFTFSSHYMSiiíFRQAlPGKBRBFVA MTeSSRraTEGVRGRFTISI^RAKÍITVYIiQMNSliKSEDTAVYYCAAt» RTFYGSTV3SKYDYRGOGTOVTVSS 4 EGFR- 1.34 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSKYAMGWFRQAPGKEREFVS AISWSDGSTYYADSVKGRFTXSRDHAKHTVYl.QWSLKPEDTAVYYCaA T YLVDWAVHVPIRPYEYDYWGQGTQVTVS S 5 EGFR- 1.38 QVQLQDSGGGLVGAGDSLRLSCAASGRSFGGYAMGWFRÇAPGKEREFVA AI SWSGG S TYYADS LKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAL YYCAA GLRPSPKYWHER3YDYWGQGTQVTVSS 6 EGFR-Ial QVQLQBSGGGLVQAGGSLLLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAFGKEREFVA AINWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMÍJSLKPBDTAAFYCAA TYMPYSRDHYF prmttfydywgqgtqvtvss 7 EGFR-Ia7 qvqlqesggrlvotggslrlscaasggtfgtyalgwfrqapgkerefva AI SRFGSTYYADSVKGRFTISRDNANNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAAR EGVALGLPJSfDANYWGOGTQyTVSS 8 EGFR- Ial5 QVQLODSGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFROAPGfCBREFVA AIGLKTYYADSVKGRFTISRDKARNTVYLQfINSLKFEDTAVYYCAARTS GWGGTPKRYDYVJGOGTQVTVSS 9 EGFR- Ia26 QVQL·QESGGGSVQAGGSL·KLSGAASGRGFSRYA^{G«FRQAPδGDREFVA TISWTNSTDYADSVKGRFAISRDNAKETAYLQMNSLKPEDTAVYYCAAD KWAS STRSIDYDYWGQGIQVTVSS 10 EGFR-2.6 GVQLQESGGGLVGAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWPRQAPGKEREFVA AI!3WGGGISTYYADSVKGRPTISRDMAKNTVYIíQMNSXiÍCPEDTAVYYÇAA SBWGGSDYDHDYDYWGQGTQVTV8S 11 EGFR- 2.20 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSSYAMAWFROAPGKEREFVA AX SWGGGSTYYAVSVKGRFTISRDNAKOTVYLQMNSLKFEDTARYYCAA ríETFHSSAYGlYEYWGQÔTQWSS 12 EGFR- IIIa5 EVQLVE S GGGLV QAGGS LRLS CTASGRl FSS YM1GW FRQTPGKERE FVA AXTSSGGSTYYABSVKGRFTISRJDÍSIAKSMEQMDSLMLDDTSVYYCAA OSSRPQYSDSALRRILSLSííSYPYWGQGTQVTVSS 82
Seg ID Nome Sequência 13 EGFR- 3.18 bvqlvesggglvqpggslrlscvasgftpadyamswvroapgkglowvs SXSYWGDTTYYAESMKDRmSRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAS 3GSYYPGHFBSWGQGTQVTVS S 14 EGFR- 3.32 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSGYAMGWFRQAPGEEREFVA AISWRGTS TYYGDSAKGRFTISRD$AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA GSHSDYAPDYDYWGQGTQVTVSS 15 EGFR- 3.34 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSeAASGRTFSSYAIGWFRQAPGKEREFVA AI SWGGSMTYYADSVKGRFTISRDIÍAKRP/YLQMHSLKPEDTAVYYCAÂ GEVSNSDYAYEYDYWGQGTQVTVS S 16 EGFR- 3.39 QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRYIMGWFRQAPGKEREFVAGISR sgastayadsvkdrftisrdsalntvylqmhslkaedtawfcaaalai RLGIPRGETE YEYWGQGTQVTVSS 17 EGFR- 3.40 QVKLEESGGGLVQAGGS LRLS CSASGLTFSNYAHAWFRQAPGKERB FVA TIS QRGGMR HYX.DS VKD RFTI SRDNAKBIVYLQMHSLKPDDTAVYY CAA DDM YGVDRR YDYTíGRGTQVTVS S 18 EGFR- 4.11 QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRSFSSITMGWFRQAPGKERQFVS AI NS NGflR YYADSVKGRFT Ϊ S RDNAKHTWLQMM S LKP EDTAVYYCAAV QAYSSSSDYYSQBGAYDYWGQGTOWVSS 19 EGFR- 4.21 SVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTPSSMGWFRQAPGREREFVATI MLSGDRTDYADSVKGRFTISRDNPKNrVYLGMDSLEPEDSAVYYCAGTS L YP SNLRYYTL PGTYADWGQGTQVTV S S 20 EGFR- 4.22 QVKLBESGGGLVQAGGSERLSCAASGSIFSIMAMGWYRQAPGKQRELVA RITGTGTGITGAV S TNYAD S VKGR FTIS RDNARíFrVYLQMHS LKPEDTA VYYCAADRSRTXWPDYWGQGTOVTVSS 21 EGFR- Bll QVQLQDSGGGLVQAGGSLRLSCAASRPSSAQYAIGWFRGAPGKEREGVS YITFSGGPTGYADSVKGRFTVSRDKAKimrYLQWSliKPEDTAVyYCAA RPYTRPGSMWVS SLYDJWÍKX3TGVTVSS 22 EGFR- Fll QVQLQESGGRltVQAGGSIíRIíSCAASEHTFRGYAIGWFRQAJPGKEREFVS SITYDGTLTNYADSVTGRFTISRDMMCNTVYLQMKSLKPEDTAVYVCAA GYS YRYTTLMQYDSWGGGTGVTYSS Albumina do soro anti-rato 23 MSA21 QVQLQESGGGIjVQPGGSLRIiSCEASGFTPSRFGMTWRGAPGKGVBWS GISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDKfAKinXYLQMKSLKPEDTAVYYCTI GGSLNPGGQGTQVTVSS 24 MSA24 Q¥QLQESGGGL¥QPGiíSljRI.SCAASGFTFRHFGMSWVRGAPGKEPEWS SI SGSGSNTIYADSVICDRFTI SRDHAKBTDYlíQMMSLKPEOTAVYYCTI GGSLSRSSQGTQYTYSS 25 MSA210 Q VQAQE SGGG LVQPGGS LRLTCTASGFT F S S FGM5 WVRQAPGKGLEWV S AISSDSGTKNYADSVKGRFTISRDWAKKMLFLGMNSLRPEDTAVYYCVI GRGSPSSQGTQVTVSS 83
Seq ID Nome Sequência 26 MSA212 qvqloesogolvopggslrltctasgftfrsfgmswvrqapgkglewvs AISADGSDKRYADSVKGRFTISRDNGKKMLTLDMNSLKPfíDTAVYYCVI GRGS PASQGTQVTVSS 41 MSAcl6 avqlvesggglvqagdslrlscwsgttfssaamgwfrqapgkersfvg AIKWSGTSTYY TDSVKGRFTISRDNVKSTVYIjQMNNLKPEDTGVYTCAADRDRYRDRMGP MTTTDFRFWGQ GTQVTVSS 42 MSAcll2 QVKLRRSGGGIJVQTGGSX1RXiSCAASGRTFSSFAMGWFRQAPGRBREFVA SIGSSGOTNY ADSVKGRFTISRDNAKfJTVYLQMNSLKPEDTGLCYCAVNRYGiPYRSGT QYQNWGQGTQV TVSS 43 MSAcllO J^LEESGGGLVQPGGSIáiLSCAASGfcTFKDYAMGraQAPGKERDMVA TISXGGRTYYA DSVKGRFTX S RDNAKKTVYLQKN S ItKPEDTAI YY CVAHRQTWRGPYLL WGQGTQVTVSS 44 MSAcll4 QVQLVESGGKLVQAGGSLRl.SCAASGRTFSMYAMGWFRQAPGKEREFVA GSGRSRSYKYY SDSVKGRFTISRDNAKOTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASmWPRORKL YAYWGQGTQVT vss 45 MSAcll6 EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRSLGXYRMGWPRQVPGKEREFVA AXSWSGGTTRY LDSVKGRFT X SRDSTKNAVyLQMNSLKPEDTAVYYCAVDSSGRLYWTLS TSYDYWGQGTQ VTVSS 46 MSAcll9 QVQLVBFGGGLVQAGDSLRLSCAASGRSLGIYKPSAWFRQVPGKEREFVA AXSWSGGTTRY IDSVKGRFTliSRDfTriKWMVYltQMNSIíKPDDTAVYYCAVDSSGRLYWTLS TSYDYWGQGTQ VTVSS 47 MSAcl5 EVQI.VESGGGLVQAGGSLSLSCAASGRTFSPYTMGWFRQAPGKEREFIA GVTWSGSSTFY GDSVKGRFTASRDSAKNTVTtiBMlíSXjNPEDTAVYYCAAAYGGGXiYRDFR SYDYWGRGTQV TVSS 48 MSAcll1 AVQLVESGGGLVQAGGSLRDSCAASGFTDDAWPIAWFRQAPGKEREGVS CXRDGTTYYAD SVKGRFTISSDRANWTVYLQTNSLKPEDTAVYYCAAPSGPATGSSHTFG IYWHLRDDYDN WGQGTQVTVSS 49 MSAcll5 EVQWESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDHYTIGWFRQVPGKEREGVS CXSSSDGSTYY ADSVKGRFTXSSDNAKNTVYLQÍ4KTLEPDDTAWYCAAGGLLLRVEELQ ASDYDYWGQGI QVTVSS 84
Seq ID Nome Sequência 50 MSAcl8 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCT&SGFTLDyYAIGWFRQAPGKEREGVA CXSNSDGSTYY GDÊVKGRFTISRDNAKTTVYLQMMSLKPEDTAVYYCATADRHYSASHHP FADFAFNSWGQ GTQVTVSS 51 MSAC17 BVQLVESGGGLVOAGGSLRLSCAAYGLTFWRAAMAWFRSAPGKERELW ARNWQDG8TRY ADSVKGRFTISITONAKNTTOLQPíSLKPSmAVYYCAAVRTYGSATYDI WGQGTQVTVSS 52 MSAcl2 0 EVQLVESGGGLVQDGGSLRIiSCIFSGRTFANYAMGMFRQAFGKEREFVA AX33HHÇGTTNY ADAI»KGRFTISRDNTKNTAFLQMNSLKP0DTAVYYCAAREWPFSTIPSG WRYWGQGTQVT vss 53 MSAcl4 DVQkVESGGGWVQPGGSLRLSCAASGPTASSHAIGWFRQAPGKEREFW GXNRGGVTRDY adsvkgrfavsrdnvkktvylqmrrlkpedsai yi caarpeys ftamsk gdmdywgkgtl vtvss Albumina do soro anti-rato/anti EGFR 27 MSA21/EG FR-1.4 QVQLQBSGGGLVOPGGSLRLSCEASGFTFSRPGMTWVRQAPGKGVEWVS GISSLGDSTLYADSVKGRFTXSRDRAKNTÍjYLQMRSIjKPBDTAVYYCTI GGSLNPGGQGTQVrVSSEPKTFKPQPAAAEVQLVESGGGLVQAGGSLRL SCAASGRTFSííYVMGWFRQAPGKERDFWGIGRSGGD«TYYADSVKGRF TI SWDKAKKTMYLQMNSLKPEDTA^/YYC.AASXYS RDTIFTKWANYKYWG QGTQVTVSS 28 MSA24/EG FR-1 .9 QVQLQESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRNFGMSWVRQAPGKEPS^/S SISGSGSNTX YADSVKDRFTX SRDJ3AKSTLYLQ®ÍSIjKPEDTAVYYCTI ggslsrssqgtqvtvssepktpkpqpaaaqvqlqesggglvkaggslrl SCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVGAIHWSGGRTYYADSVKGRFT ISSD^AKOTIíYLQMNStKPEDTAVYYCAASRilYSyWmrPGEYDYííG QGTQVTVSS 29 MSA21/EG FR-1.33 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRF(^WVRQAPGKGVSWVS Gi SSlíGDSTLYADSVKGRFTl SRBHAKKTLYLÇPNSLKPEDTAVYYCTI GGStiNPGGQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAAEVQLVESGGGLVQPGGSliRL SCAASGFTFfíSHYMSWFRQAPGKBREFVAAITSSSRTYYTESVKGRFTI SRDNAKKTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAADRTFYGSTWSKYDYRGQGTQV TVSS 30 MSA24/EG FR-1.33 QVQLQESGGGLVQ PGN SÍjRLSCAASGFTFRNFGMSWVRQAPGKE pewvs SISGSGSMTIYADSVKDRFTISRDNAKSTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTI GGS LSRSSQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAARVQI.VS:SGGGLVQPGGS LRL SCAASGFTFSSHYMSWFRQAPGKEREFVAAITSSSRTYYTESVKGRFTI SRDNAKSTVYEQPCíSLKSBDTAVYYCAADRTFYGSTWSKYDYRGQGTQV TVSS 85
Seq ID Nome Sequência 31 MSA210/E GFR-1.33 QVQLQESGGGLVQPGGSLRIíTCTÃSGFTFS S FGHSWVRQAPGKGLEWVS AISSDSGTKNYADSVKGRFTISRDNAKKMLFLQMNSLRFEDTAVryCVI GRGSPSSQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAAEVOIiVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSSHYMSWFRQAPGKEREFVAAl TSSSRTYYTESVKGRFTIS rdnakntvylqmnslksedtavyycaãdrtfygsi^skydyrgqgtqvt vss 32 MSA212/E GFR-1.33 GVQLQESGGGL·VQPGGSLRL·TCTASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGI.EVfVS AI SADGSDKRYADSVKGRFTI SRDNGKKMLTXiDMNSLKPEDTAVYYCVI GRGSPASQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAAEVQLVFSGGGI.VQPGGSLRLS CAASGFTFSSHYMSWFRQAPGKEREFVAAITS S SRTYYTBSVKGRFTIS RDSJAKNTVYJuQMNSXiKSEDTAVYYCMDRTFYGSTWSKYDYRGQGTQVT vss 33 MSA21/EG FR-Ial QVQLOESGGGX.VOPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVS GI SSLGDSTLyADSVKGRFT I SRDNAK&TLYLQMNStiKPEDTAVYYCTI GGSERPGGQGTGVTVSSBPKTPKPQPAÃAQVQIíQSSGGGLVQAGGSELÍ. SCAASGRTFSSYAfôGWFRQAPGKBREFVAAINWSGGSTSYADSVKGRPT ISRDNTKUTVYLQMNSLKPEDTAAFYCAATYWPYSRDHYFPRMTTEYDY WGQGTQVTVSS 34 MSA21/EG FR-Ia7 QVQLQESGGGÍ.VlQFGGSIjRLSClASGFrfSRFGMTWFRQAFGKGVEWS GISSLGDSTLYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTI SCAASGGTFGTYALGWFRQAPGKEREFVAAXSRFGSTYYADSVKGRFTI SRDKJWNTWLEMNSLKPEDTAVTYCAAREGVALGTRMDMfYWGQGTQV TVSS 35 MSA21/EG FR-Ial5 QVQUJBSGCX3LVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVS GISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDSAKNTLYLQMIíSIíKPEDTAVYYCTI GGSLNPGGQGTQVYVSSEPKTPKPQPAAAQVQLQDSGGGLVQAGGSLRL SCAASGGTFSSYAI*IGWPRQAPGKERE?VAAIGLFTYYADSVKGRFTISR DNAKKTVYLOMKSLKPEDTAVYYCAARTSGWGGTPKRYDYWGQGTQVT VSS 36 MSA21/EG FR-Ia26 QVQIjQESGGGIiVQPGGSXjRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVS GISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDNAKNTIiYLQMNSLKFEDTAVYYCTI GGSUí PGGÇGTQVTVS SEPKTPKPQ PAAAQVQLQESGGGS VQAGG SI»KL SCAASGRGFSRYAMGWFRQAPGQDREFVATISWTOSTDYADSVKGRPAI SRDNAKNTAYIiQMNSLKPEDTAVYYCAADKWASSTRSIDYDYWGQGIQV TVSS 37 MSA21/EG FR-2.6 QVQLQSSGGGItVQPGGSLRLS C £ASGFT F SRPGMTWVRQAPGKGVSWV S GI SSLGDSTLYADSVKGRFTI SRDHMKTliYLQMIíSLKPEDTAVYYCTI GGS LNPGGQGTQVTVS S E PKTP K PQ PA&AQVQLQESGGGLVQAGGS LRL scaasgrtfsnyakgwfrqafgkerefvaaikwgggntyyadsvkgrft ISRDNAKNTVYLQMKSLKPEDTAVyYCAASEWGGSDYDRDYDYWGGGTQ VTVSS 38 MSA21/EG FR-4.22 QVQLQESGGGIiVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVS GIS S LGGS TLYAD S VKGR PT ISRDH AKSTLYLQMMS liKPE DTAVYY CTI GGSLNPGGQGTOVTVSSEPKTPKPQPAAAQVRLEESGGGLVQAGGSIjRL SCAASGSIFSIHAMGWYRQAPGKQRELVARITGTGTGITGAVSTNYADS VKGRFTISRDKARNTVYLQMKSLKPEDTAVYYCAADRSRTIVVPDYWGG GTQVTVSS 86
Seq ID Nome Sequência 39 MSA21/EG FR-B11 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTmmQAPGKGVEWVS GGSLNPGGQGTQWVSSEPKTPKPQPAAAQVQLQDSGGGLVQAGGSLRL SCAASRFSSAQYAIGWFRQAPGKEREGVSYITFSCSGPTGYADSVKGRFT V SRDNAKHTVXLQHN 3LKPEDTA.VYY CAAR PYTR P GSMWV SSLYDHWGQ GTQVTVSS 40 MSA21/EG FR-F11 ÔVQI^gSGGGLVQPGGSLRLSCEASGPTFSRFGMTWVRQÃSHSKÍ^WVS GIS SLGDSTLYADSVKGRFTISRDKAOTLYLQMMSLKPEDTAJ/YY CTI GGELNPGGQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAAGVQLQESGGRLVQAGGSLRL SCAASEBTFRGYAIGWFRQAPGKEREFVSSITYDGTLTNYADSVTGRFT ΐεΕΟΝΑΚΙίΤΙ^ΙΟΜΚδΡΚΡΕΟΤΑΙ/ΥνϋΑΑΟΥβΥΕΥΤΤΒΝΟΥΒ^^βΟΟΤΟ VTVSS
Tabela 6
Seq ID Nome Sequência 5' - 3' 54 ABL002 GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT 55 ABL010 AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT 56 ABL037 CATGCCATGACTCGCGGCCC^GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGA GTCTGG 57 ABL038 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGA GTCTGG 58 ABL039 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCIGGTGGA GTCTGG 59 ABL040 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGA TTCTGG 60 ABL041 ovtgccatgactcgcggcc-gagccggccatggcccaggtgcagctggtgga GTCTGG 61 ABL042 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCOlGGTACAGCTGGTGGA GTCTGG 62 ABL043 catgccatgactcgcggcccagccggccatggcccaggtaaagctggagga GTCTGG 63 genelll CCACAGACAGCCCTCATAG 64 M13 rev GGATAACAATTTCACACAGG
Lisboa, 13 de Janeiro de 2011
Claims (4)
1 ,#
1 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido anti-EGFR compreendendo pelo menos um anticorpo de domínio único direccionado contra o EGFR, em que o referido anticorpo de domínio único é derivado de um anticorpo de cadeia pesada naturalmente desprovido de cadeia leve (VHH) e em que o referido anticorpo de domínio único é capaz de internalizar EGFR em células EGFR+.
2. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 1, obtenível por incubação dos fagos recombinantes que expressam um repertório de VHHs clonados com células EGFR+ sob condições para permitir a internalização dos fagos e subsequente libertação dos fagos internalizados.
3. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que a célula EGFR+ é seleccionada das células HER-14 e A431.
4. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único corresponde a uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 ou a) uma sequência homóloga de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 com uma identidade de sequência de mais de 70% com a sequência progenitora; b) uma porção funcional de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 que mantém a interacção com o alvo com afinidade de 1 x 10"6 ou melhor; 2 c) uma porção funcional de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 que compreende uma delecção parcial da sequência de aminoácidos completa e ainda mantém os locais de ligação e os domínios proteicos necessários à ligação e à interacção com o EGFR.
5. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que pelo menos um anticorpo de domínio único corresponde a uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 ou a uma sequência homóloga de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 com uma identidade de sequência e mais de 80% com a sequência progenitora.
6. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que pelo menos um anticorpo de domínio único corresponde a uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 ou a uma sequência homóloga de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 21, 22 com uma identidade de sequência de mais de 90% com a sequência progenitora.
7. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que pelo menos um anticorpo de domínio único compete para, ou inibe, a ligação do ligando natural ao EGFR.
8. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 7, em que o referido ligando natural é o EGF.
9. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que pelo menos um anticorpo de domínio único é capaz de se ligar ao seu alvo com uma afinidade de, ou melhor que, 10~6 M. 3
10. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, compreendendo adicionalmente pelo menos um anticorpo de dominio único direccionado contra uma ou mais proteínas do soro.
11. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 10, em que o referido, pelo menos um, anticorpo de domínio único direccionado contra uma ou mais proteínas do soro é direccionado contra qualquer albumina do soro, imunoglobulinas do soro, proteína de ligação à tiroxina, transferrina ou fibrinogénio ou um seu fragmento.
12. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é um domínio VHH.
13. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 12, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é um domínio VHH transportando um aminoácido do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, treonina, asparagina, ou glutamina na posição 45 de acordo com a numeração de Kabat.
14. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 12, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é um domínio VHH que transporta um resíduo de arginina na posição 103 de acordo com a numeração de Kabat.
15. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que o referido domínio VHH é obtido por imunização de um camelo e obtenção do seu 4 hibridoma, ou por clonagem de um banco de anticorpos de domínio único e subsequente selecção através do uso da exposição fágica.
16. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é um VHH humanizado.
17. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 16, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é humanizado pela substituição de um ou mais dos aminoácidos Camelidae pelo seu correspondente humano, tal como encontrado na sequência consenso humana.
18. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, em que o, pelo menos um, anticorpo de domínio único é humanizado por substituição de qualquer um dos resíduos seguintes, quer isoladamente quer em combinação: posições FRl 1, 5, 28 e 30, o aminoácido marcador na posição 44 e 45 em FR2, resíduos 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94 em FR3 e as posições 103, 104, 108 e 111 em FR4; numeração de acordo com a numeração de Kabat.
19. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, compreendendo adicionalmente pelo menos um anticorpo de domínio único seleccionado do grupo que consiste num anticorpo de domínio único anti-IFN-gama, anticorpo de domínio único anti-TNF-alfa, anticorpo de domínio único do receptor anti-TNF-alfa e o anticorpo de domínio único do receptor anti-IFN-gama . 5
20. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que o número de anticorpos de domínio único direccionados contra o EGFR é, pelo menos, dois.
21. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 20, em que os dois ou mais anticorpos de domínio único são diferentes em sequência.
22. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 20, em que os dois ou mais anticorpos de domínio único são idênticos em sequência.
23. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, em que os dois ou mais anticorpos de domínio único são fundidos geneticamente ao nível do ADN.
24. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 23, em que os anticorpos de domínio único são ligados entre si directamente.
25. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, o qual é uma molécula bivalente, trivalente ou tetravalente.
26. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, compreendendo adicionalmente um transportador que melhora a transferência através da parede intestinal para a corrente sanguínea.
27. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 26, em que o referido transportador é um VHH que se liga especificamente a um receptor na parede intestinal. 6
28. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, compreendendo adicionalmente um transportador que melhora o transporte do polipéptido do lúmen pulmonar para o sangue.
29. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 28, em que o referido transportador é um VHH que se liga especificamente a um receptor na superfície da mucosa.
30. Polipéptido anti-EGFR de acordo com a reivindicação 29, em que o referido receptor é o receptor Fc N (FcRn). 31. Ácido nucleico que codifica para um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
32. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31.
33. Composição compreendendo um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31 e um veículo farmacêutico adequado.
34. Composição de acordo com a reivindicação 33 adaptada à via de administração escolhida, í.e., pelas vias oral, vaginal, rectal, parentérica, intra-nasal, por inalação, sub-lingual, intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea.
35. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 ou 34, adequada à injecção ou infusão. 7
36. Composição terapêutica compreendendo um polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 em combinação com o agente anti-neoplásico ou quimioterapêutico.
37. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 36 para a administração separada dos componentes.
38. O polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37 para uso no tratamento e/ou prevenção dos distúrbios relacionados com os processos inflamatórios.
39. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37 para uso no tratamento e/ou prevenção dos cancros epiteliais, tais como os carcinomas do pulmão, fígado, sistema nervoso central, ossos, sangue e sistema linfático, cólon, mama, próstata, recto, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, testículos, pancreático e das células escamosas.
40. Polipéptido anti-EGFR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37 para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes tais como a doença de Addison (adrenal), doenças autoimunes do ouvido (ouvido), doenças autoimunes do olho (olho), hepatite autoimune (fígado), parotidite autoimune (glândulas parótidas), doença de Crohn (intestino), Diabetes Tipo 8 I (pâncreas), Epididimite (epididymis), glomerulonefrite (rins), doença de Graves (tiróide), síndroma de Guillain-Barre (células nervosas), doença de Hashimoto (tiróide), anemia hemolítica (glóbulos vermelhos), Lupus eritematoso sistémico (tecidos múltiplos), infertilidade masculina (esperma), esclerose múltipla (células nervosas), Myasthenia Gravis (junção neuromuscular), Pênfigo (primariamente na pele), Psoríase (pele), febre reumática (coração e articulações), artrite reumatóide (alinhamento das articulações), sarcoidose (tecidos e orgãos múltiplos), escleroderma (pele e tecidos conjuntivos), Síndroma de Sjogren (glândulas exócrinas e outros tecidos), espondiloartropatias (esqueleto axial e outros tecidos), tiroidite (tiróide), vasculite (vasos sanguíneos).
41. Uso de um polipéptido ou constructo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio relacionado com processos inflamatórios e cancro.
42. Uso de um polipéptido ou constructo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de cancros epiteliais, tais como os carcinomas do pulmão, fígado, sistema nervoso central, ossos, sangue e sistema linfático, cólon, mama, próstata, recto, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, testículos, pancreático e das células escamosas. 9
43. Uso de um polipéptido ou constructo polipeptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes, tais como a doença de Addison (adrenal), doenças autoimunes do ouvido (ouvido), doenças autoimunes do olho (olho), hepatite autoimune (figado), parotidite autoimune (glândulas parótidas), doença de Crohn (intestino), Diabetes Tipo I (pâncreas), Epididimite (epididymis), glomerulonefrite (rins), doença de Grave (tiróide), sindroma de Guillain-Barre (células nervosas), doença de Hashimoto (tiróide), anemia hemolitica (glóbulos vermelhos), Lupus eritematoso sistémico (tecidos múltiplos), infertilidade masculina (esperma), esclerose múltipla (células nervosas), Myasthenia Gravis (junção neuromuscular), Pênfigo (primariamente na pele), Psoriase (pele), febre reumática (coração e articulações), artrite reumatóide (alinhamento das articulações), sarcoidose (tecidos e orgãos múltiplos), escleroderma (pele e tecidos conjuntivos), Síndroma de Sjogren (glândulas exócrinas e outros tecidos), espondiloartropatias (esqueleto axial e outros tecidos), tiroidite (tiróide), vasculite (vasos sanguíneos).
44. Método de produção de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, compreendendo: a) cultura das células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico capaz de codificar para um polipéptido ou constructo polipeptídico de acordo com as reivindicações 1 a 30, sob condições que permitem a expressão do polipéptido e 10 b) recuperação do polipéptido produzido a partir da cultura.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que as referidas células hospedeiras são células bacterianas, células de levedura, células de mamífero ou células de insecto.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que as referidas células hospedeiras são células bacterianas ou células de levedura.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que as referidas células hospedeiras são células de E. coli, células de S. cerevisiae ou células de P. pastoris.
48. Método de diagnóstico de um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR compreendendo os passos de: a) contacto de uma amostra com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, b) detecção da ligação do referido polipéptido à referida amostra, e c) comparação da ligação detectada no passo (b) com um padrão, em que a diferença na ligação relativa à referida amostra é o diagnóstico de um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR.
49. Kit para a detecção de um distúrbio caracterizado pela disfunção do EGFR compreendendo um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30. Lisboa, 13 de Janeiro de 2011 1/9
Figura 1 2/9
Figura 2-1 3/9
Figura 2-2 4/9 análise do soro 024 e 025
lama 024dia0EGFR lama 024 dia28 EGFR lama 024 dia42 EGFR ···♦·· lama 025 d iaO EGFR —lama 025 dia28 EGFR —lama 025 dia42 EGFR ------lama 024 diaO CEA - —— lama 024 dia28 CEA -lama 024 dia42 CEA ····-· lama 025 diaO CEA lama 025 dia28 CEA —— lama 025 dia42 CEA análise do soro 026 e 027
100000 1000 10000 diluição do soro •*••026 --*--026 —*—026 ••♦•••027 •-*--027 —*—027 -----026 ---026 -026...... 027 -•--027 ——027 diaO EGFR dia28EGFR dia42EGFR diaO EGFR dia28EGFR dia42EGFR diaO CEA dia28CEA dia42CEA diaO CEA dia28 CEA dia42 CEA Figura 3
Figura 4 6/9
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Figura 6 9/9
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Figura 7
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