JP6747974B2 - Rna誘導型遺伝子ドライブ - Google Patents
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Description
本願は、2014年1月8日に提出された米国仮特許出願第61/924,735号、および2014年7月15日に提出された米国仮特許出願第62/024,642号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入まれる。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること;
ここで、1種類または複数種類のガイドRNAが、生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に存在し、第1の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、第2の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に位置し、外来核酸配列によって切断および置換される配列のうちの少なくとも1つのコピーが、生物の生存または生存可能な子の産生のために必要である、
第1の外来核酸配列を発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、ゲノムDNAの第1の染色体上およびゲノムDNAの第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムDNAの第1の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムDNAの第2の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第1の外来核酸配列を、ゲノムDNAの染色体対の第1の染色体中に切断部位で挿入し、第1の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第2の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に位置し、外来核酸配列によって切断および置換されて遺伝的荷重(genetic load)を生じる配列が、その生物が生存または生殖可能な子を産生するためにもはや必要でない発生段階で、上記発現および挿入ステップを行うこと。
Cas9遺伝子ドライブ
図1Aは、標的DNAへのガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼの共局在を示す模式図である。標的DNA部位は、ガイドRNAの「スペーサー」とマッチする「プロトスペーサー」配列、およびCas9結合に必要な短いプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含む。図1Aに示される例示的なCas9遺伝子ドライブは、RNA誘導型Cas9ヌクレアーゼ、隣接必須遺伝子内など、1つまたは複数の標的DNA部位に相補的な1種類または複数種類のガイドRNA、および隣接配列を少なくともコードする、本明細書に記載の外来核酸配列(「カセット」と呼ばれることがあり、この用語は当業者に理解されている)である。カセットはさらに、任意のカーゴ遺伝物質、例えば、カーゴ遺伝物質が挿入される生殖系列細胞によって発現される1種類または複数種類の遺伝子、またはその細胞の子によって発現される1種類または複数種類の遺伝子を含み得る。Cas9遺伝子ドライブを発現させてCas9および1種類または複数種類のガイドRNAを産生させ、これらは次に、染色体対の第1の染色体上の1つまたは複数の標的DNA部位で共局在して、そこでCas9は部位特異的に第1の染色体上の標的DNAを切断して二本鎖切断が形成される。次に、Cas9によって誘導される二本鎖切断の相同性修復により、Cas9遺伝子ドライブが第1の染色体の切断部位に挿入される。ある態様によれば、次に、挿入されたCas9遺伝子ドライブが発現されてCas9および1種類または複数種類のガイドRNAが産生され、これらは次に、染色体対の第2の染色体上の1つまたは複数の標的DNA部位で共局在して、そこで、標的DNAを部位特異的に切断して二本鎖切断が形成される。Cas9により誘導される二本鎖切断の相同性修復は、無傷のCas9ドライブ含有染色体を鋳型として利用し、これによりCas9ドライブが染色体対の第2の染色体に挿入されて、Cas9遺伝子ドライブについてホモ接合型の染色体対が作成される。これを図1Bに示す。
複数の内在性座位の編集および制御
本開示のある態様によれば、RNA誘導型遺伝子ドライブは、それぞれの野生型アレルを標的とする複数のガイドRNAを組み込むことにより、ドライブ自体の遠位(distal)に存在する複数の内在性アレルを編集することができる。図2Aに示されるように、複数の遺伝子配列のために、すなわち遺伝子Aの野生型(WT)、遺伝子Bの野生型、および必須遺伝子の野生型のために、複数のガイドRNAが提供される。複数のガイドRNAおよびCas9タンパク質の発現により、それぞれの遺伝子がCas9によって改変される。ある態様によれば、Cas9ドライブは、転写調節因子が遺伝子を制御できるように標的DNA部位に共局在可能な転写調節因子と共に、関連ガイドRNAおよび1種類または複数種類の直交ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質をさらに含んでよい。図7参照。図2Bに示されるように、以前のCas9ドライブによって予めなされた改変をアップデートするために、更なる後続のCas9ドライブを用いることができる。例えば、特定のドライブが予想外の副作用を引き起こす場合、アップデートとして放出される第2のドライブが、第1のドライブによってコードされる1つまたは全ての改変を上書きすることができる。この態様によれば、第2のドライブは、既存の挿入されているドライブを除去して、染色体中に自身を挿入するようにデザインすることができる。さらに、以前のRNA誘導型遺伝子ドライブによって改変された1種類または複数種類の遺伝子は、除去されて所望の遺伝子で置換され得る。同様に、図2Cに示されるように、第3の回復ドライブにより、回復ドライブを拡散するために必要なCas9およびガイドRNAの存在を除き、全ゲノム位置の野生型配列を回復することができる。このようにして、集団を改変してその野生型に復帰させることができる。したがって、本開示の態様は、本明細書に記載の方法を用いて、予め改変された細胞に第2のRNA誘導型Cas9遺伝子ドライブを導入することによる、予め挿入されたRNA誘導型Cas9遺伝子ドライブの改変または置換に関する。第2の遺伝子ドライブは、第1の遺伝子ドライブによってなされた改変を超えるその他の改変を行うように、または第1の遺伝子ドライブによってなされた改変を除去するようにデザインされる。
拡散の制御
ある態様によれば、単一の標的種または亜集団に関連する固有の遺伝子または配列多型を標的とすることにより、RNA誘導型遺伝子ドライブの拡散を単一の標的種、または亜集団にさえも限定することができる。ドライブは固有配列のみを切断できるので、非標的集団中には拡散しない。したがって、本開示の態様は、固有の遺伝子配列または配列多型に特異的なRNA誘導型遺伝子ドライブをデザインおよび使用する方法に関する。このようにして、固有の遺伝子配列または配列多型に相補的になるように1種類または複数種類のガイドRNAがデザインされる。このようにして、固有の遺伝子配列または配列多型に局在するようにDNA結合タンパク質が制限される。
人為的種分化の誘導
ある態様によれば、2つの集団間に遺伝的不適合を生じさせることにより遺伝子流動を阻止するための、RNA誘導型遺伝子ドライブの使用方法が提供される。この態様によれば、図3に示されるように、異なるガイドRNAを用いて同じ必須遺伝子内の異なる配列を標的とする2つの遺伝子ドライブが、2つの集団中に放出される。各集団内で必須遺伝子の各コピーが喪失することにより、2つの集団は不適合になる。この種類のドライブを集団中に放出することにより、ドライブの数だけ集団が人為的に分割されることになる。例示的な図3に示されるように、ドライブAは必須遺伝子X内の配列1、2、3、および4を切断する。ドライブAが拡散する際、ドライブAは遺伝子Xを配列1、2、3、および4が再コード化されたバージョンで置換するので、これらはこれらは切断されない。ドライブBは遺伝子X内の配列5、6、7、および8を切断し、このバージョンの遺伝子Xはこれらの配列が再コード化されているため、これらは切断されない。ドライブAを有する雄がドライブBを有する雌と交雑すると、ドライブAおよび1/2/3/4が再コード化された遺伝子Xを有する1つの染色体ならびにドライブBおよび5/6/7/8が再コード化された遺伝子Xを有する1つの染色体を受け継いだ子孫が生じる。第2のコピーは部位1/2/3/4が再コード化されておらず、5/6/7/8のみが再コード化されているので、ドライブAは遺伝子Xの第2のコピーを部位1/2/3/4で切断する。同様に、第1のコピーは部位5/6/7/8が再コード化されておらず、1/2/3/4のみが再コード化されているので、ドライブBは遺伝子Xの第1のコピーを部位5/6/7/8で切断する。この生物は最終的に、遺伝子Xの両方のコピーが切断される。遺伝子Xは必須であり、生物はこれらを修復するために用いる遺伝子Xの無傷のコピーを有さないので、生物は死滅する。したがって、ドライブAおよびドライブBは不適合である。
集団の抑制および絶滅
ある態様によれば、RNA誘導型ヌクレアーゼにより、集団制御に有用であり得る、複数の異なった形態の性別バイアス化遺伝子ドライブ(sex-biasing gene drive)を作り出すことができる。図4Aに示されるように、雄減数***中にのみX染色体を標的とするCas9およびガイドRNAの発現により、自然界に存在するものと類似した古典的な「減数***」Yドライブが生じる。減数***遺伝子ドライブにより、減数***中に競合する性染色体が除去され、バイアスのかかった配偶子プールが生じる。ドライブ発現は前減数***期に厳密に制限されなければならず、さもなければドライブは致死性になる。この種類のドライブは、XY、ZW、およびより低い程度でXOの性決定系を使用する生物の配偶子をいずれかの性別に有利なようにバイアスをかけることができる。さらに図4Aに関して、RNA誘導型遺伝子ドライブが***細胞のY染色体に導入されている。RNA誘導型遺伝子ドライブには、X染色体上の複数の標的配列に相補的な複数のガイドRNAが含まれる。RNA誘導型遺伝子ドライブが発現される場合、ガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼはX染色体に共局在し、そこでCas9ヌクレアーゼは二本鎖切断を形成してX染色体を作働不能(inoperable)にする。減数***後、Y染色体を有する***のみが生存可能となる。
応用例
本明細書に記載の遺伝子ドライブは、感染症の根絶および侵入種の制御において特に実用的である。そのようなRNA誘導型Cas9遺伝子ドライブは、例えば両生類などの絶滅危惧種または準絶滅危惧種を通じて、保護的アレルを急速に拡散するために用いられ得る。そのようなRNA誘導型Cas9遺伝子ドライブは、ドライブによって運ばれる外来種由来のRNAi機構を有するRNAウイルスおよびCas9でdsDNAウイルスを標的化することにより、一般的にヒトウイルスの保有宿主となる野生集団を免疫化するために用いることもできる。本明細書に記載のYドライブ、すなわちX染色体の伝播を阻害するRNA誘導型Cas9遺伝子ドライブを用いて、疾患媒介生物を、病原体を獲得できないように改変するか、または排除することができる。同様に、Yドライブを用いて、侵入的および生態破壊的な有害生物を局所的に制御するまたは根絶することができる。生態学的ダメージを最小限に抑えるため、ならびに避難所および救出機関の必要を減らするために制御される、関連する野生種および野生化した集団に、家畜が遺伝子を供与することを防止することができる。同様に、絶滅の危機に瀕している絶滅危惧種を、個体数の多い近縁種または侵入的な近縁種から、遺伝子希釈(genetic dilution)により分離することができるように、トランスジェニック作物およびトランスジェニック動物をそれらの未改変対応物から遺伝的に分離することができる。最後に、遺伝子ドライブを用いて、自然環境における遺伝子、性比、および種分化の進化的および生態学的重要性に関する仮説を直接試験することができる。
農業上の安全性および持続可能性
本開示の態様は、農業に関連する雑草および有害生物を制御、低減、または排除するための、本明細書に記載のCas9方法の使用に関する。有害生物とは通常、ヒトまたは農業もしくは家畜生産などのヒトの事業に有害な植物または動物を指す。有害生物という用語には、植物または動物、ヒトまたはヒトの事業、家畜、ヒトの構造、野生の生態系などにとって、侵入的または多産の、有害な(detrimental)、厄介な(troublesome)、侵害性の(noxious)、破壊的な、迷惑な(nuisance)、任意の生きている生物が含まれ得る。有害生物という用語にはさらに、害虫(vermin)、雑草、植物および動物の寄生生物(parasite)、ならびに病原体が含まれ得る。本開示に係る雑草とは、特定の状況で望ましくないと考えられる植物を指し得る。広義には、雑草は、植物である有害生物と考えることができる。例としては通常、農場、庭、芝生、および公園などのヒトにより制御された状況における望まれない植物が挙げられる。「雑草」という用語にはさらに、活発(aggressive)に成長もしくは繁殖するか、またはその生息環境以外で侵入的(invasive)である、任意の植物が含まれ得る。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である感作核酸を含む第1の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること;
ここで、1種類または複数種類のガイドRNAが、生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に存在し、第1の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、第2の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
第1の外来核酸配列を発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、ゲノムDNAの第1の染色体上およびゲノムDNAの第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムDNAの第1の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムDNAの第2の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第1の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第1の染色体中に切断部位で挿入し、第1の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第2の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする感作核酸を発現させること。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である第2の感作核酸配列を含む第2の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること;
ここで、1種類または複数種類のガイドRNAが、第1の感作遺伝子ドライブを含む生殖系列細胞の染色体対の第1の感作遺伝子ドライブを含む第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、第2の外来核酸配列のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に存在し、第1の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、第2の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
第2の外来核酸配列を発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、ゲノムDNAの第1の染色体上およびゲノムDNAの第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムDNAの第1の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、ゲノムDNAの第2の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断して、第1の外来核酸配列が除去される、
第2の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第1の染色体中に切断部位で挿入し、第2の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第2の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を第2の外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする第2の感作核酸配列を発現させること。
ある態様によれば、生じた生物と野生型生物の子孫が第2の感作核酸配列を含むように、生じた生物を野生型集団中に導入する。ある態様によれば、生物は雑草または有害生物である。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である第2の感作核酸配列を含む第2の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること;
ここで、1種類または複数種類のガイドRNAが、第1の感作遺伝子ドライブを含む生殖系列細胞の染色体対の第1の感作遺伝子ドライブを含む第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、第2の外来核酸配列のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、第1の隣接配列と第2の隣接配列との間に存在し、第1の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、第2の隣接配列が、ゲノムDNAの第1の染色体上または第2の染色体上の標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
第2の外来核酸配列を発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、ゲノムDNAの第1の染色体上およびゲノムDNAの第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムDNAの第1の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムDNAの第2の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第2の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第1の染色体中に切断部位で挿入し、第2の外来核酸配列をゲノムDNAの染色体対の第2の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を第2の外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする第2の感作核酸配列を発現させること。
ある態様によれば、生じた生物と野生型生物との子孫が第2の感作核酸配列を含むように、生じた生物を野生型集団中に導入する。ある態様によれば、生物は雑草または有害生物である。
プラスミドおよびゲノムカセット
遺伝子ドライブカセットをgBlocks(Integrated DNA Technologies社、アイオワ州コーラルビル)から合成し、以下のようにしてCas9を介したゲノム改変によりSK1細胞に挿入した。各ドライブのガイドRNAを、SNR52プロモーターによって発現がドライブされるp416−Cas9含有プラスミドにクローニングした。DiCarlo, J. E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013) 参照。標的座位に対する60塩基対のホモロジーアームを遺伝子ドライブカセットの両末端にPCRによって付加し、5μgのPCR産物をp416−Cas9−gRNAプラスミドと同時形質転換した。正確に組み込まれた遺伝子ドライブをシークエンシングにより確認し、5−フルオロオロチン酸(FOA)選択を用いてp416−Cas9−gRNAプラスミドを除去(cure)した。
二倍体細胞を選択するためのマーカーとしてヒスチジン原栄養性を付与した。株の遺伝子型を以下の表1に示す。
酵母接合実験
一倍体ドライブ含有SK1酵母および正反対の接合型の一倍体野生型株をYPAD液体培地中で等量混合し、一晩インキュベートした。生じた二倍体を滅菌水中で洗浄し、両方の親の遺伝子型の選択培地上にプレーティングした。以下の表2に具体的な交雑を詳述する。
胞子形成および四分子解剖
URA3機能に対する選択
解剖した胞子を合成完全(SC)培地中で成長させた後、SC培地およびウラシルを含まないSC培地にスポットした。赤色を増強するために、プレートイメージに用いた全てのSC固体培地に0.5×ヘミ硫酸アデニン(最終濃度0.08mM)を含ませた。
定量的PCR
各ドライブ、またはドライブによって置換された野生型配列、および対照としてのACT1遺伝子に特異的な短い領域を増幅するように、候補プライマー対をデザインした。全ての配列は、補足情報に含まれている。Looke et al. (31) に記載の方法Aを用いてゲノムDNAを抽出した。
計算
3つの技術的複製物の結果を平均して計算した。PCR増幅前のアレルの比率を直接計算するために、種々のプライマー対の効率を最初に決定した。段階希釈物(106のオーダー)のqPCRランから以下のように効率を計算した:
EaおよびEbは、各プライマー対の効率であり、
Ct,a、およびCt,bは、各サンプルのCt値である。
酵母におけるCRISPR/Cas9遺伝子ドライブの効率
酵母におけるCRISPR/Cas9遺伝子ドライブの効率を直接測定するために、ADE2遺伝子の機能的コピーを欠いた酵母中に蓄積される赤色を用いてシステムを構築した。Chamberlain, N., Cutts, N. S. & Rainbow, C. The formation of pigment and arylamine by yeasts. J. Gen. Microbiol. 7, 54-60 (1952) 参照。図13Aに示されるように、赤いADE2−一倍体をクリーム色の野生型一倍体と接合させた場合、生じるヘテロ接合型二倍体は1つの機能的コピーを受け継ぎ、したがってクリーム色になる。これらの二倍体が減数***して胞子形成により生殖する場合、生じる一倍体の半分は破壊されたコピーを受け継ぐので赤色であり、残りの半分は無傷のコピーを受け継ぐのでクリーム色である(図13A)。
本発明の態様は以下を含む。
付記1
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を、前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第1の外来核酸配列を、前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記2
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる、付記1に記載の方法。
付記3
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼがCas9である、付記1に記載の方法。
付記4
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが一本鎖切断を生じさせる、付記1に記載の方法。
付記5
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼがCas9ニッカーゼである、付記1に記載の方法。
付記6
少なくとも1つの標的位置が必須遺伝子内に存在し、前記外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、付記1に記載の方法。
付記7
前記第1の外来核酸が相同組換えにより挿入される、付記1に記載の方法。
付記8
前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、付記1に記載の方法。
付記9
前記RNAが約10〜約250ヌクレオチドを含む、付記1に記載の方法。
付記10
前記RNAが約20〜約100ヌクレオチドを含む、付記1に記載の方法。
付記11
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、関連するガイドRNAと共に複数の関連する標的位置に共局在して、前記第1の染色体または前記第2の染色体のいずれかを複数の切断部位で切断する、付記1に記載の方法。
付記12
前記複数の切断部位での切断により、DNA配列が除去されるとともに相同組換えによって前記第1の外来核酸配列で置換される、付記11に記載の方法。
付記13
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップをさらに含む、付記1に記載の方法。
付記14
前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させて前記第1の外来核酸配列を有する染色体対の第1の染色体を含む子生殖系列細胞を産生させるステップをさらに含む、付記13に記載の方法。
付記15
前記第1の外来核酸配列が前記子生殖系列細胞によって発現されて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAが産生され、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記染色体対の第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第1の外来核酸配列を前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して前記子生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記14に記載の方法。
付記16
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップおよび前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させるステップを繰り返して、前記第1の外来核酸配列についてホモ接合型である同じ生物種の生物集団を作り出す、付記15に記載の方法。
付記17
前記第1の外来核酸配列が1種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含む、付記1に記載の方法。
付記18
前記第1の外来核酸配列が1種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含み、前記1種類または複数種類の選択された遺伝子配列が、前記生物集団内の生物のゲノム内に存在する、付記16に記載の方法。
付記19
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第2の外来核酸配列をそのゲノム内に含む改変生物を、前記生物集団に導入し、
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、前記第1の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、前記第2の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記改変生物が、前記生物集団のメンバーと交配して、前記第2の外来核酸配列および前記第1の外来核酸配列を含む子生殖系列細胞を産生し、
前記子生殖系列細胞が、前記第2の外来核酸配列を発現して前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第1の外来核酸配列を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第2の外来核酸配列が前記生殖系列細胞のゲノム中に前記切断部位で挿入されて前記子生殖系列細胞を前記第2の外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記16に記載の方法。
付記20
改変野生型生物が、前記第1の外来核酸配列が前記改変野生型生物のゲノムに侵入しないよう、前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記1つまたは複数の標的位置に非相補的となり、且つ前記1つまたは複数の標的位置と結合できないように、ゲノムDNA上の前記1つまたは複数の標的位置が改変された前記集団に導入される、付記16に記載の方法。
付記21
前記改変野生型生物が、前記第1の外来核酸配列に共局在して前記第1の外来核酸配列を切断部位特異的に切断して再コード化アレルを生じさせる、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードする第2の外来核酸配列の発現によって改変される、付記20に記載の方法。
付記22
さらに以下を含む、付記1に記載の方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記1つまたは複数の標的位置に相補的である、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記第1の外来核酸配列を除去する、および
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記23
前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記22に記載の方法。
付記24
前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、付記23に記載の方法。
付記25
少なくとも1つの標的位置が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるように前記外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入されるが、前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記1つまたは複数の標的位置に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変される、付記1に記載の方法。
付記26
以下を含む、真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質および関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入すること;
前記挿入された外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAを前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入して前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記27
以下を含む、ある生物種の2つの集団を、生存可能な子孫を産生できないようにする方法。
前記生物種の第1の集団を、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類の第1のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を含むように改変すること;
ここで、前記1種類または複数種類の第1のガイドRNAが、必須遺伝子上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記1つまたは複数の標的配列に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記生物種の第2の集団を、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類の第2のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第2の外来核酸配列を含むように改変すること;
ここで、前記1種類または複数種類の第2のガイドRNAが、前記1種類または複数種類の第1のガイドRNAの前記標的位置とは異なる前記必須遺伝子上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記1種類または複数種類の第2のガイドRNAが前記1つまたは複数の標的位置に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記第1の集団を前記第2の集団と交配させて生殖系列細胞を産生させること;
ここで、前記第1の外来核酸配列が発現されて、第2の親から与えられた前記必須遺伝子を切断し、前記第2の外来核酸配列が発現されて、前記第1の親から与えられた前記必須遺伝子を切断する。
付記28
以下を含む、標的核酸配列中に変異を有する真核生殖系列細胞中のアレルを置換する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記複数のガイドRNAが、アレル上の変異に隣接する染色体のゲノムDNA上の複数の標的位置に相補的であり、前記変異により、対応するガイドRNAが前記ゲノムDNAに結合することが妨げられ、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記複数の標的位置で切断部位特異的に切断して、前記変異を含む前記ゲノムDNAの一部を除去する、および
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記29
全ての標的位置を除去する欠失が起こると非常に有害であり自然選択により前記集団から除かれることになるように、前記標的位置の少なくとも1つが必須遺伝子などの前記生物の適応度に重要な遺伝子内に存在する、付記28に記載の方法。
付記30
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子に対応する1種類または複数種類の更なる外来核酸配列と共に前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記複数のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムDNA中の複数の遺伝子上の1つまたは複数の標的位置に相補的な1種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドRNAを含み、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置のうちの1つの第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の同じ標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記1種類または複数種類の核酸配列の各々が、残りの標的位置の第1の部分および第2の部分に対応する第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、および
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記31
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記複数のガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記複数の標的位置に相補的である、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記関連する標的位置で切断部位特異的に切断して前記第1の外来核酸配列を除去する、および
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること
をさらに含む、付記30に記載の方法。
付記32
前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記31に記載の方法。
付記33
前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、付記32に記載の方法。
付記34
以下を含む、2つの集団を、互いの間で子を産生できないようにする方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第1セットのガイドRNA群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、第1の生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記第1セットのガイドRNA群が、染色体のゲノムDNA上の第1セットの標的位置群に相補的であり、
前記第1セットの標的位置群が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第1セットのガイドRNA群が前記1つまたは複数の標的位置に非相補的であるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第1の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第1セットのガイドRNA群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第1の外来核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第1セットのガイドRNA群を産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNA群が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の関連する第1セットの標的位置群に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記第1セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須遺伝子内の前記ゲノムDNAの一部を除去する、および
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること;および
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第2セットのガイドRNA群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む、第2の外来核酸配列を、第2の生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記第2セットのガイドRNA群が、染色体のゲノムDNA上の第2セットの標的位置群に相補的であり、
前記第2セットの標的位置群が、前記第1セットの標的位置群と同じ必須タンパク質コード遺伝子内に存在するが、前記第1セットの標的位置群のいずれとも同じでなく、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第2セットのガイドRNA群が前記第2セットの標的位置群に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第2の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第2セットのガイドRNA群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第2の外来核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第2セットのガイドRNA群を産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連する第2セットのガイドRNA群が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第2セットの関連する標的位置群に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記第2セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須内の前記ゲノムDNAの一部を除去する、および
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること;
ここで、前記第1セットのガイドRNA群が、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第2の外来核酸配列内の前記第1セットの標的位置群を切断させ、前記第2セットのガイドRNA群が、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第1の外来核酸配列内の前記第2セットの標的位置群を切断させる場合に、前記第1の生殖系列細胞および前記第2の生殖系列細胞から生じる生物の相互間の子孫が生存可能できない。
付記35
以下を含む、***細胞からY染色体***のみを産生する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、前記***細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記***細胞のX染色体上の1つまたは複数の標的位置および前記***細胞のY染色体上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記Y染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記Y染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼと、前記***細胞の前記X染色体上の1つまたは複数の標的位置と前記***細胞の前記Y染色体上の1つまたは複数の標的位置とに相補的な前記1種類または複数種類のRNAとを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Y染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、前記Y染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Y染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記Y染色体中に前記切断部位で挿入すること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記X染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、前記X染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記X染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記X染色体を作働不能(inoperable)にする。
付記36
***細胞からY染色体***のみを産生させる方法であって、
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAを、対応するプロモーター配列を用いて前記Y染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記***細胞のX染色体上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記X染色体上の1種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドRNAが、前記X染色体上の前記1つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記X染色体を前記1つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記X染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記37
***細胞からX染色体***のみを産生させる方法であって、
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAを、対応するプロモーター配列を用いて前記X染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記***細胞のY染色体上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Y染色体上の1種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドRNAが、前記Y染色体上の前記1つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Y染色体を前記1つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Y染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記38
***細胞からY染色体含有***のみを産生させる方法であって、
第1の外来核酸配列および第2の外来核酸配列をコードするようにY染色体を改変することを含み、
ここで、前記第1の外来核酸配列が、第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、第1セットのガイドRNA群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第2の外来核酸配列が、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、第2セットのガイドRNA群、対応するプロモーター配列、ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列をコードし、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第2の核酸配列および前記第2セットのガイドRNA群をコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第2セットのガイドRNA群を認識できず、前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第1セットのガイドRNA群を認識できず、
前記第1セットのガイドRNA群が、性染色体ではない染色体のゲノムDNA上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記第1の外来核酸配列が減数***前に前記生殖系列中で発現されて前記第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第1セットのRNA群が産生され、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNA群が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第1セットの関連する標的位置群に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第2の外来核酸配列が前記Y染色体から前記ゲノムDNAの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記第1セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムDNAの前記染色体上に位置する前記第2の外来核酸配列の前記コピーが、減数***より前または減数***中に発現されて前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質および前記第2セットのガイドRNA群が産生され、
前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記X染色体上の1つまたは複数の標的位置に相補的な前記第2セットのガイドRNA群が、前記X染色体上の前記1つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記X染色体を前記1つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記X染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記39
***細胞からX染色体含有***のみを産生する方法であって、
第1の外来核酸配列および第2の外来核酸配列をコードするようにX染色体を改変することを含み、
ここで、前記第1の外来核酸配列が、第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第1セットのガイドRNA群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第2の外来核酸配列が、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第2セットのガイドRNA群、および対応するプロモーター配列、ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列をコードし、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第2の核酸配列および前記第2セットのガイドRNA群をコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第2セットのガイドRNA群を認識できず、前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第1セットのガイドRNA群を認識できず、
前記第1セットのガイドRNA群が、性染色体ではない染色体のゲノムDNA上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記第1の外来核酸配列が減数***の前に前記生殖系列中で発現されて前記第1のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第1セットのRNA群が産生され、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNA群が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第1セットの関連する標的位置群に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第2の外来核酸配列が前記X染色体から前記ゲノムDNAの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記第1セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムDNAの前記染色体上に位置する前記第2の外来核酸配列の前記コピーが減数***の前または減数***中に発現されて、前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質および前記第2セットのガイドRNA群が産生され、
前記第2のRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Y染色体上の1つまたは複数の標的位置に相補的な前記第2セットのガイドRNA群が、前記Y染色体上の前記1つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Y染色体を前記1つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Y染色体を作働不能にする。
付記40
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼと、***のY染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な1種類または複数種類のガイドRNAと、***のX染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な1種類または複数種類のガイドRNAと、第1の隣接配列と、第2の隣接配列とをコードする第1の外来核酸配列を有する改変X染色体を有する、雄子孫を排除するための雌子孫を産生する方法であって、
前記第1の外来核酸配列を卵母細胞中で発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Y染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列と前記X染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な1種類または複数種類のガイドRNAを産生させ、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記X染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記X染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記第1の外来核酸配列を発現させてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Y染色上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列と前記X染色体上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な1種類または複数種類のガイドRNAを産生させ、
Y染色体を有する野生型***と前記改変X染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼと前記Y染色体を標的とする前記1種類または複数種類のガイドRNAとが前記Y染色体上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Y染色体を切断して前記卵母細胞の雄生物へのその後の発生を作働不能にし、
X染色体を有する野生型***と前記改変X染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記X染色体上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記X染色体を切断し、そこで前記第1の外来核酸配列が前記X染色体中に挿入される、
前記方法。
付記41
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼと、発生に必須の遺伝子内に位置する前記X染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な1種類または複数種類のガイドRNAとをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を有する改変Y染色体を有する、雌子孫を排除するための雄子孫を産生する方法であって、
前記第1の隣接配列が、前記X染色体上の前記必須遺伝子の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記X染色体上の前記必須遺伝子の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、前記改変Y染色体が、前記1種類または複数種類のガイドRNAによって認識される前記1つまたは複数の標的位置が1種類または複数種類の前記ガイドRNAによって認識される前記配列と非相補的になるように改変された前記X染色体上の前記必須遺伝子をコードする第2の核酸配列をさらに含み、その結果、野生型X染色体を有する卵母細胞が前記改変Y染色体を有する***と結合した場合に前記第1の外来核酸配列が発現されてRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記X染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な1種類または複数種類のガイドRNAが産生され、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記X染色体上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記X染色体を切断して前記必須遺伝子を除去してそこに前記第1の核酸配列を挿入し、前記Y染色体上の前記必須遺伝子の前記の追加のコピーのために生存可能なままである改変X染色体が作られ、
野生型X染色体を有する卵母細胞と前記改変X染色体を有する***が結合すると、前記第1の外来核酸配列が発現されて、RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記X染色体上の1種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な1種類または複数種類のガイドRNAが産生され、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記X染色体上の前記1種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記X染色体を切断して前記必須遺伝子を除去し、前記第1の外来核酸配列を前記X染色体中に挿入し、その結果、前記接合体が前記必須X染色体遺伝子を欠くことになる、
前記方法。
付記42
生殖可能な雄および生殖不能の雌を作製する方法であって、付記41に記載の方法が、その遺伝子を欠いた生物が生殖不能となるように、前記X染色体上の前記必須遺伝子が生殖能にのみ必須である点で改変されている、方法。
付記43
前記第1の核酸配列が、第3の隣接配列および第4の隣接配列をさらに含み、
前記第3の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第1の部分と同じ配列である第3の配列を含み、
前記第4の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第2の部分と同じ配列である第4の配列を含み、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第3の隣接配列と前記第4の隣接配列との間に位置し、前記第1の核酸配列が、前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する1種類または複数種類の標的配列に相補的な第2セットのガイドRNA群をさらに含み、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第2セットのガイドRNA群が発現し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAが前記生殖能に必須の遺伝子内の前記1種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記生殖能に必須の遺伝子を切断してそこに前記第1の核酸配列を挿入する、付記41に記載の方法。
付記44
制御された集団抑制の方法であって、付記43に記載のY染色体を抑制対象の集団中に放出し、付記43に記載のY染色体に利用される前記ガイドRNAに非相補的となるが前記遺伝子によりコードされるタンパク質が同じアミノ酸配列を保持するように、付記43に記載のY染色体によって標的とされた前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する前記1種類または複数種類の標的配列を改変する付記30に記載のRNA誘導型遺伝子ドライブを、前記Y染色体が、前記抑制対象の集団中で息子のみを産生し、保護対象の集団中に放出された前記RNA誘導型遺伝子ドライブにより改変された雌と交配した場合には生殖可能な息子および生殖不能な娘を産出するように、前記保護対象の集団中に放出する、方法。
付記45
抑制または根絶する対象の集団中に付記44に記載のY染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記46
標的集団中に性別にバイアスをかける染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記47
以下を含む、改変生物から同じ生物種の野生型生物への遺伝子流動を阻止する方法。
最初に、前記生物が生存可能であるためには2つの機能的なコピーとして存在しなければならない遺伝子(以後、必須遺伝子と呼ぶ)の中央部の配列に対応する配列が、前記遺伝子の野生型コピーの遠位に存在する染色体の別の領域中に挿入されるように、前記野生型生物のゲノムを改変すること;および次に、
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列、第1の隣接配列、第2の隣接配列、第3の隣接配列、第4の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列(以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ)を含む第1の外来核酸配列を、前記改変生物の生殖系列に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記染色体の前記遠位領域中に挿入された前記1つまたは複数の標的位置および前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、前記1種類または複数種類のガイドRNA、前記第3の隣接配列、前記第4の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列とが、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記第3の隣接配列が、前記必須遺伝子の第3の部分と同じ配列である第3の配列を含み、
前記第4の隣接配列が、前記必須遺伝子の第4の部分と同じ配列である第4の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の1つまたは複数の標的位置と前記必須遺伝子内の前記1種類または複数種類の標的配列とに相補的な前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域中に挿入すること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、前記野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第3の隣接領域と前記第4の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊して、
その結果、前記改変生物が、前記染色体の遠位領域中に前記必須遺伝子の2つの再コード化コピーを有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の野生型コピーが破壊されること。
付記48
前記必須遺伝子が、前記X染色体上に位置し、生存能に2コピーが必要であり;前記遠位領域も前記X染色体上に存在し;雄の生殖能または生存能に必要な遺伝子(以後、雄必須遺伝子と呼ぶ)が、コードされている雄必須タンパク質のアミノ酸配列を保存するようその核酸配列中に再コード化されるように、前記生物の前記第1の改変により前記Y染色体がさらに改変され;非機能的である前記雄必須遺伝子の更なるコピーが前記雄必須遺伝子の前記再コード化コピーの隣に挿入され;前記第1の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第5の部分と同じ配列である第5の配列を含む第5の隣接配列も含み;前記第1の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第6の部分と同じ配列である第6の配列を含む第6の隣接配列も含み;前記第1の核酸配列が、前記遺伝子を非機能的にするように再コード化された前記野生型雄必須遺伝子内の配列に対応する第2セットのガイドRNA群も含み;前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記ガイドRNA、前記第3の隣接配列、前記第4の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在する前記第5の隣接配列と前記第6の隣接配列との間に存在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼは前記再コード化遺伝子または前記非機能的雄必須遺伝子を切断せず、前記改変Y染色体は前記改変X染色体上の前記必須遺伝子を切断しないので、改変Y染色体を有する雄と交配した2つの改変X染色体を有する雌が、生存可能な雄の子を生じ;野生型Y染色体を有する***と受精した、2つの改変X染色体を有する雌に由来する卵母細胞の場合は、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型雄必須遺伝子を切断してその場所に前記第5の隣接配列と前記第6の隣接配列との間の配列をコピーして、生殖不能または生存不能な雄が生じ;改変Y染色体を有する***と受精した、野生型雌に由来する卵母細胞の場合は、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記必須遺伝子を切断して、生存不能な雄の子孫が生じ;改変X染色体および野生型X染色体を共に含む***と卵が結合すると、前記再コード化必須遺伝子をコピーすることなく前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型必須遺伝子を切断して、1つの改変X染色体および1つの破壊されたX染色体を有するハイブリッド雌子孫が生じ;野生型雄と交配させたこれらのハイブリッド雌が、生存不能もしくは生殖不能な雄またはハイブリッド雌を産生し;ハイブリッド雌と改変Y染色体を有する雄との雄子孫の半数が生存可能である、付記47に記載の方法。
付記49
以下を含む、固有の遺伝的多型を有する亜集団から野生型集団の残りへの遺伝子流動を阻止する方法。
前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間の標的位置中に固有の多型を有する集団中でのみ拡散でき、さらに前記染色体の遠位領域中に前記標的部位を挿入する、付記30に記載のRNA誘導型遺伝子ドライブを放出すること;
ここで、前記RNA誘導型遺伝子ドライブが、前記固有多型領域中に前記RNA誘導型遺伝子ドライブを挿入するための前記第1および第2の隣接配列をコードし、且つ前記遠位領域中に前記標的部位を挿入するための第3および第4の隣接配列をコードする、および次に、
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、第2セットのガイドRNA群、および第3セットのガイドRNA群をコードし、且つ対応するプロモーター配列、第5の隣接配列、第6の隣接配列、第7の隣接配列、第8の隣接配列、第9の隣接配列、第10の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列(以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ)を含む、第2の外来核酸配列を最初に上記のように改変された生物の生殖系列に導入することによって二次的に改変した生物を放出すること;
ここで、前記第2セットのガイドRNA群が、前記染色体の前記遠位領域に挿入された前記第1セットの標的位置群およびさらに前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記第3セットのガイドRNA群が、前記第1セットの核酸配列内に固有に存在する標的配列群に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記1種類または複数種類のガイドRNA、前記第7の隣接配列、前記第8の隣接配列、前記第9の隣接配列、前記第10の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第5の隣接配列と前記第6の隣接配列との間に存在し、
前記第5の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第5の部分と同じ配列である第5の配列を含み、
前記第6の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第6の部分と同じ配列である第6の配列を含み、
前記第7の隣接配列が、前記必須遺伝子の第7の部分と同じ配列である第7の配列を含み、
前記第8の隣接配列が、前記必須遺伝子の第8の部分と同じ配列である第8の配列を含み、
前記第9の隣接配列が、前記第1の隣接配列の第9の部分と同じ配列である第9の配列を含み、
前記第10の隣接配列が、前記第2の隣接配列の第10の部分と同じ配列である第10の配列を含む、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の前記第2セットの標的位置群と前記必須遺伝子内の前記第2セットの標的配列群とに相補的な前記第2セットのRNA群を産生させること;、
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域に挿入すること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドRNAが、野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第7の隣接領域と前記第8の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の前記野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊すること;
前記第1の核酸配列内に固有に位置する配列に相補的な前記第3セットのガイドRNA群を発現させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第1の核酸配列内の配列に相補的な関連するガイドRNAが、前記第1の核酸配列内の標的配列に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第1の核酸配列内の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第1の核酸配列を、前記第9の隣接領域と前記第10の隣接領域との間の配列で置換し、
その結果、前記改変生物が、前記第1の核酸配列のコピーを有さず、2つの前記必須遺伝子の再コード化コピーを前記染色体の遠位領域中に有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の前記野生型コピーが破壊されること。
付記51
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む外来核酸配列を含む生殖系列細胞であって、
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記生殖系列細胞。
付記52
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸(sensitizing nucleic acid)を含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸を発現させること。
付記53
前記感作核酸の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、付記52に記載の方法。
付記54
前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸を子孫に移行させて、前記感作核酸を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、付記52に記載の方法。
付記55
前記生物が雑草または有害生物である、付記52に記載の方法。
付記56
前記感作核酸が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子である、付記52に記載の方法。
付記57
前記感作遺伝子が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、付記56に記載の方法。
付記58
前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、付記56に記載の方法。
付記59
前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、付記52に記載の方法。
付記60
前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A、もしくはVIPによって産生されるBt毒素、2,4−D、またはグリホサートのいずれかである、付記59に記載の方法。
付記61
前記感作遺伝子が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子を置換する、付記56に記載の方法。
付記62
前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作遺伝子が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする、付記52に記載の方法。
付記63
前記酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと5−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとCB1954である、付記62に記載の方法。
付記64
感受性遺伝子ドライブが、特定の化学物質、化合物、または条件の存在する場合に、雑草または有害生物集団を毒性に対して脆弱にする、感受性遺伝子ドライブを雑草または有害生物の集団のゲノム中に含む、前記雑草または有害生物の集団を制御する方法であって、
前記雑草もしくは有害生物を死滅させる、前記雑草もしくは有害生物の増殖を低減する、または前記雑草もしくは有害生物を生殖不能にして増殖を阻害するのに有効な量の前記化学物質、化合物、または条件と前記雑草または有害生物集団を接触させることを含む、前記方法。
付記65
前記化学物質または化合物が、除草剤、農薬、または殺真菌剤である、付記64に記載の方法。
付記66
以下を含む、第1の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第2の感作核酸配列を含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第1の感作遺伝子ドライブを含む第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第2の外来核酸配列の前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して、前記第1の外来核酸配列が除去される、
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第2の外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第2の感作核酸配列を発現させること。
付記67
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第2の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記66に記載の方法。
付記68
前記生物が雑草または有害生物である、付記66に記載の方法。
付記69
以下を含む、第1の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第2の感作核酸配列を含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第1の感作遺伝子ドライブを含む第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第2の外来核酸配列の前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含む、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第2の外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第2の感作核酸配列を発現させること。
付記70
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第2の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記69に記載の方法。
付記71
前記生物が雑草または有害生物である、付記69に記載の方法。
付記72
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび1種類または複数種類のガイドRNAをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第1の隣接配列および第2の隣接配列を含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記1種類または複数種類のガイドRNAをコードする核酸配列が、前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に存在し、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の前記標的位置の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記外来核酸配列によって切断および置換される前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に位置する配列の少なくとも1個のコピーが、前記生物が生存するためまたは生存可能な子を産生するために必要である、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記1種類または複数種類のRNAを産生させること;
ここで、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
前記第1の隣接配列と前記第2の隣接配列との間に位置し、前記外来核酸配列によって切断および置換されて遺伝的荷重を生じる配列が、その生物が生存または生殖可能な子を産生するためにもはや必要ない発生段階で、前記発現および挿入ステップを行うこと。
付記73
RNA誘導型遺伝的荷重ドライブを標的集団中に放出することを含む、付記1〜72のいずれか一項記載の標的集団の抑制または絶滅のための方法。
Claims (29)
- 以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、1種類または複数種類のガイドRNAをコードする配列、および前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記1種類または複数種類のガイドRNAとを発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第1の隣接配列および第2の隣接配列の間に含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記1つまたは複数の標的部位が前記第1の部分と前記第2の部分の間に位置する、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を該標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を、前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第1の外来核酸配列を、前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること;
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、1種類または複数種類のガイドRNAをコードする配列、および前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記1種類または複数種類のガイドRNAとを発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第3の隣接配列および第4の隣接配列の間に含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記第2の外来核酸配列にコードされる前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記1つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第3の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第3の部分と同じ配列である第3の配列を含み、
前記第4の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第4の部分と同じ配列である第4の配列を含み、
前記第1の外来核酸配列によって改変された前記1つまたは複数の標的部位が前記第3の部分と前記第4の部分の間に位置する、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列によって改変されており且つ該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記第1の外来核酸配列によって改変された該標的部位で切断部位特異的に切断して前記第1の外来核酸配列を除去する、および
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。 - 前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせる、請求項1に記載の方法。
- 前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼがCas9である、請求項1に記載の方法。
- 前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼがCas9ニッカーゼである、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的部位が必須遺伝子内に存在し、前記第1の外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の外来核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項1に記載の方法。
- 前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の外来核酸配列にコードされる前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよびガイドRNAの共局在が、2種以上のガイドRNAにより複数の標的部位で起こり、前記第1の染色体または前記第2の染色体を複数の切断部位で切断する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の切断部位での切断により、DNA配列が除去され、相同組換えによって前記第1の外来核酸配列で置換される、請求項8に記載の方法。
- 前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、複数のガイドRNAをコードする配列、およびII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記複数のガイドRNAとを発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第1の隣接配列および第2の隣接配列の間に含む第1の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子中に挿入されるための1種類または複数種類の外来核酸配列Aと共に前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記複数のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムDNA中の複数の遺伝子上の1つまたは複数の標的部位に相補的な1種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドRNAを含み、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
少なくとも1つの標的部位が前記第1の部分と前記第2の部分の間に位置し、
前記1種類または複数種類の外来核酸配列Aの各々が、前記ゲノムDNAの前記染色体上の第3の部分と同じである第3の隣接配列および第4の部分と同じである第4の隣接配列を含み、
外来核酸配列Aが複数種類存在する場合、それぞれの外来核酸配列Aの第3の隣接配列同士は互いに独立した配列であり、かつ、それぞれの外来核酸配列Aの第4の隣接配列同士も互いに独立した配列であり、
少なくとも1つの標的部位が前記第3の部分と前記第4の部分の間に位置し、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記複数の遺伝子上の該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列および前記1種類または複数種類の外来核酸配列Aを前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記複数の切断部位で挿入すること;
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、複数のガイドRNAをコードする配列、および前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記複数のガイドRNAとを発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第5の隣接配列および第6の隣接配列の間に含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記第2の外来核酸配列にコードされる前記複数のガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列および前記1種類または複数種類の外来核酸配列Aによって改変された前記複数の標的部位に相補的であり、
前記第5の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記ゲノムDNAの前記染色体上の第5の部分と同じ配列である第5の配列を含み、
前記第6の隣接配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記ゲノムDNAの前記染色体上の第6の部分と同じ配列である第6の配列を含み、
少なくとも1つの標的部位が前記第5の部分と前記第6の部分の間に位置する、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記第1の外来核酸配列によって改変されており且つ該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記染色体を前記第1の外来核酸配列によって改変された該標的部位で切断部位特異的に切断して前記第1の外来核酸配列を除去する、および
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。 - 前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第2の外来核酸配列が、前記第1の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、1種類または複数種類のガイドRNAをコードする配列、前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸(sensitizing nucleic acid)配列、および前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記1種類または複数種類のガイドRNAと前記感作核酸配列とを発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第1の隣接配列および第2の隣接配列の間に含む第1の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記生殖系列細胞の染色体対の第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記1つまたは複数の標的部位が前記第1の部分と前記第2の部分の間に位置する、
前記第1の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第1の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸配列を発現させること。 - 前記感作核酸配列の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、請求項15に記載の方法。
- 前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸配列を子孫に移行させて、前記感作核酸配列を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸配列が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、請求項15に記載の方法。
- 前記生物が雑草または有害生物である、請求項15に記載の方法。
- 前記感作核酸配列が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子をコードする配列である、請求項15に記載の方法。
- 前記感作遺伝子配列が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、請求項19に記載の方法。
- 前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、請求項19に記載の方法。
- 前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、請求項15に記載の方法。
- 前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A、もしくはVIPによって産生されるBt毒素、2,4−D、またはグリホサートのいずれかである、請求項22に記載の方法。
- 前記感作遺伝子配列が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子の配列を置換する、請求項19に記載の方法。
- 前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作核酸配列が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする配列である、請求項15に記載の方法。
- 前記プロドラッグ変換酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと5−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとCB1954である、請求項25に記載の方法。
- 以下を含む、第1の感作遺伝子ドライブを含むヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、1種類または複数種類のガイドRNAをコードする配列、前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第2の感作核酸配列、および前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記1種類または複数種類のガイドRNAと前記第2の感作核酸配列を発現させるための1つまたは複数のプロモーター配列を、第1の隣接配列および第2の隣接配列の間に含む第2の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること;
ここで、前記1種類または複数種類のガイドRNAが、前記第1の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第1の感作遺伝子ドライブを含む第1の染色体のゲノムDNA上および第2の染色体のゲノムDNA上の1つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第1の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第1の部分と同じ配列である第1の配列を含み、
前記第2の隣接配列が、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上または前記第2の染色体上の第2の部分と同じ配列である第2の配列を含み、
前記1つまたは複数の標的部位が前記第1の部分と前記第2の部分の間に位置する、
前記第2の外来核酸配列を発現させて前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAを産生させること;
ここで、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記1種類または複数種類のガイドRNAに含まれるガイドRNAが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体上および前記ゲノムDNAの前記第2の染色体上の該ガイドRNAに相補的な標的部位に共局在し、前記II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムDNAの前記第1の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムDNAの前記第2の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第1の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第2の外来核酸配列を前記ゲノムDNAの前記染色体対の前記第2の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第2の外来核酸配列についてホモ接合型にすること;および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第2の感作核酸配列を発現させること。 - 前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第2の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、請求項27に記載の方法。
- 前記生物が雑草または有害生物である、請求項27に記載の方法。
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