CN106133141A

CN106133141A - Rna引导的基因驱动

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Publication number: CN106133141A
Application number: CN201580012610.6A
Authority: CN
Inventors: K·M·埃斯弗特; A·L·斯密德勒
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2035-01-08
Also published as: WO2015105928A9; EP3092310A1; AU2015204784A1; US20160333376A1; AU2021202590A1; WO2015105928A1; AU2015204784B2; CA2936312A1; SG10201805815YA; EP3092310A4; JP2021003112A; JP6747974B2; EP3092310B1; JP7187508B2; ZA201604874B; CN106133141B; SG11201605550QA; JP2017511685A; BR112016015958A2; US10526618B2

Abstract

公开了RNA引导的Cas9基因驱动及其使用方法。本发明的实施方式是基于使用RNA引导的DNA结合蛋白与引导RNA在靶DNA位点处共定位并发挥基因驱动的作用。本发明范围内包括的DNA结合蛋白包括由RNA引导的那些，在本文中称为引导RNA。DNA结合包括天然产生的具有核酸酶活性的DNA结合蛋白，如Cas9蛋白。根据一个方面，本发明的酶，如Cas9展开DNA双链体并且检索与cdRNA匹配的序列以切割。

Description

RNA引导的基因驱动

相关申请信息

本申请要求2014年1月8日提交的美国临时专利申请第61/924,735号和2014年7月15日提交的美国临时专利申请第62/024,642号的优先权，所述专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

背景

基因驱动一般称为使天然优势倾斜以有利于它们被遗传并通过后代传递的遗传元件。示例包括将自身复制到缺少它们的染色体中的寻靶核酸内切酶基因、有丝***期间破坏竞争染色体的分离畸变、将自身拷贝***基因组中其他位置的转座子、消除没有遗传Medea元件的竞争同胞的Medea元件、和母体可遗传的微生物如诱导胞质不相容以有利于感染个体传播的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。由于它们绕开了自然选择的正常规律，所有这些元件被认为是能够通过昆虫媒介传播工程改造修饰以阻断疾病传播的潜在“基因驱动”***。已经提出基于寻靶核酸内切酶的基因驱动是一种遗传控制疟蚊种群的手段。参见Windbichler等，Nature，doi：10.1038/nature09937(2011)。已经提出位点特异性自私基因是天然种群的控制和遗传工程改造的工具。参见Burt，Proc.R.Soc.Lond.B(2003)270，921-928(2003)。然而，这种提出的基因驱动受限于它们的位点特异性或者难以在各种生物体中表达。在此需要开发可靶向任意需要基因并且可在广谱生物体之间使用的基因驱动。

发明概述

本发明的方面涉及RNA引导的基因驱动，并且具体地，涉及稳定地导入所需生物体的种系细胞(germline cell)的外来核酸序列。本文所述术语外来核酸序列和术语RNA引导的基因驱动可在本文中互换使用。可从种系细胞中开发所得的转基因生物体。然后，所得的转基因生物体可导入野生种群中，并且通过转基因生物体与野生型生物体的交配，外来核酸序列被传递至所得的后代或子代。由此，本发明的方法涉及生产具有来自原始转基因生物体和野生型生物体的所需性状的转基因生物体种群。当转基因生物体被导入野生种群中并与野生型生物体交配时，所得的子代可被称为改变的野生型种群。由于外来核酸序列稳定地进入转基因后代或转基因子代的基因组中，转基因后代或转基因子代可具有由外来核酸的表达所产生的一种或多种所需性状。根据某些方面，本文所述的方法可用于产生转基因生物体的改变的野生种群，其中转基因生物体显示出由外来核酸表达所产生的一种或多种所需性状。

根据某些方面，外来核酸序列编码至少RNA引导的DNA结合蛋白，如以下的一种或多种：RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶、RNA引导的DNA结合蛋白缺刻酶或无核酸酶的RNA引导的DNA结合蛋白、和多种引导RNA(核糖核酸)中的一种或多种。引导RNA与DNA(脱氧核糖核酸)，如种系细胞的基因组中的靶DNA互补。外来核酸序列也编码至少一个或多个启动子，使得种系细胞可表达RNA引导的DNA结合蛋白和引导RNA或任何其他核酸序列或基因，其可以在外来核酸序列中。基于本发明和特定种系细胞，本领域技术人员能易于鉴定合适的启动子。外来核酸序列也可包括本领域技术人员已知的由种系细胞表达外来核酸序列所需的任意其他核酸序列。外来核酸序列也可包括需要被种系细胞表达的任意其他基因序列。这种基因序列可被称为“货物DNA”。应理解，本领域技术人员能易于根据技术人员希望由种系细胞或由该种系细胞发展出的生物体在该细胞表达外来核酸序列时所显示的所需性状来鉴定一种或多种基因序列。外来核酸序列也编码至少2种侧接序列，其侧接至少RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种引导RNA。如本领域技术人员所知，侧接序列至于特定核酸序列的相反末端，使得特定核酸序列位于侧接序列之间。根据一个方面，侧接序列至少包括与选择的染色体上的对应序列相同的序列。根据一个方面，这类侧接序列使得能使用熟知机制，如同源重组或非同源末端连接在细胞的基因组DNA中的切割处***外来核酸序列。

根据某些方面，当由种系细胞表达外来核酸序列时，产生一种或多种RNA引导的DNA结合蛋白以及一种或多种或几种引导RNA。RNA引导的DNA结合蛋白和引导RNA产生RNA引导的DNA结合蛋白、引导RNA和双链DNA靶序列的复合物。在这一方面，RNA据说将DNA结合蛋白引导至双链DNA靶序列以与之结合。本发明的这一方面可被称为RNA和DNA结合蛋白共定位至双链DNA或与双链DNA共定位。

本发明范围内的DNA结合蛋白可包括产生双链断裂的那些(其可被称为DNA结合蛋白核酸酶)，产生单链断裂的那些(称为DNA结合蛋白缺刻酶)或没有核酸酶活性但另外结合至靶DNA的那些(称为无核酸酶的DNA结合蛋白)。通过这种方式，可使用DNA结合蛋白-引导DNA复合物以在靶DNA位点处产生双链断裂，以在靶DNA位点处产生单链断裂、或使可由细胞表达的转录调控子蛋白或结构域在靶DNA位点处定位以调控靶DNA的表达。根据某些方面，外来核酸序列可编码一种或多种DNA结合蛋白核酸酶、DNA结合蛋白缺刻酶或无核酸酶DNA结合蛋白。外来核酸序列也可编码一种或多种转录调控蛋白或结构域或者一种或多种供体核酸序列，其旨在被***基因组DNA。根据一个方面，编码RNA引导的无核酸酶的DNA结合蛋白的外来核酸序列还编码与RNA引导的无核酸酶的DNA结合蛋白融合的转录调控子蛋白或结构域。根据一个方面，编码一种或多种RNA的外来核酸序列还编码RNA-结合结构域的靶标，并且编码转录调控子蛋白或结构域的外来核酸还编码与转录调控子蛋白或结构域融合的RNA-结合结构域。

因此，种系细胞表达外来核酸序列可导致双链断裂、单链断裂和/或基因组DNA的转录活化或抑制。供体DNA可通过细胞机制如同源重组或非同源末端连接在断裂位点处***。应理解，本文所述的外来核酸序列的表达可在靶基因组DNA，根据需要，包括一个或多个或几个基因序列上的多个位置导致多个双链断裂或单链断裂。

本发明的方面涉及使用外来核酸序列作为基因驱动。基因驱动的概念为本领域技术人员所知并且指代外来核酸序列，其在表达时能够将自身***其已经引入的细胞的基因组中。基因驱动的概念在Windbichler等，Nature，doi：10.1038/nature09937(2011)和Burt，Proc.R.Soc.Lond.B(2003)270，921-928(2003)中提供，其各自通过引用全文纳入本文。

根据本发明的一个方面，本文所述的外来核酸序列在导入种系细胞时作用是基因驱动。在一个方面中，种系细胞表达外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白和引导RNA。引导RNA与染色体上的靶DNA序列互补。RNA引导的DNA结合蛋白和引导RNA共定位至靶DNA，并且以位点特异性的方式切割靶DNA。靶DNA可以是在染色体对的一个或两个染色体上的靶DNA位点。然后，例如，通过同源重组将外来核酸序列在靶DNA切割位点处***基因组DNA。如果各染色体已经以位点特异性的方式被RNA引导的DNA结合蛋白切割，则外来核酸序列可在染色体对的一个或两个染色体处***基因组DNA。如果***染色体对的2个染色体，则种系细胞对于外来核酸序列而言是纯合的。在另一个实施方式中，将外来核酸序列***染色体对的第一染色体中。***的外来核酸序列然后由细胞表达并且RNA引导的DNA结合蛋白以及引导RNA共定位于或共定位至染色体对的第二染色体，其然后以位点特异性的方式被切割，如第一染色体那样。第二染色体中的切割的靶DNA然后被修复，例如没通过同源重组，使用第一染色体作为模板。通过这种方式，第二染色体经修复包含外来核酸序列，产生对外来核酸序列纯合的种系细胞，即，外来核酸序列同时存在于染色体对的第一染色体和第二染色体中。细胞修复被破坏、切割或剪切的基因组DNA的机制为本领域所熟知。本发明的方面利用这些细胞机制与DNA结合蛋白核酸酶或缺刻酶组合以产生具有***细胞的基因组DNA的所需外来遗传物质的基因驱动，其中该细胞变为对外来遗传物质而言纯合。然后外来遗传物质传到子代以产生具有一个或多个所需性状的转基因生物体。

使用本文所述的外来核酸序列的概念作为基因驱动(gene drive)，提供了将外来基因物质纳入生物体的野生种群的方法。提供了制备对外来遗传物质而言纯合的细胞的方法。提供了将遗传修饰在生物体的野生种群中扩散的方法。提供了将人为设计的遗传修饰在生物体的野生种群中扩散的方法。提供了通过将人为设计的遗传修饰在生物体的野生种群中扩散来进行全基因组工程改造的方法。提供了编辑野生物种基因组的方法。提供了编辑生物体基因组DNA的多个基因座的方法。提供了对基因组基因座进行多重编辑的方法。提供了可逆编辑生物体基因组DNA的一个或多个基因座的方法。

基于本文所述的基因驱动的所需功能，提供了控制基因流通过生物体的野生种群的方法。提供了抑制生物体的靶种群扩张的方法。提供了减少或清除生物体的靶种群的方法。提供了增加生物体的靶种群的方法。提供了降低或清除通过媒介传播的疾病，如疟疾的方法。提供了降低由靶生物体，如昆虫媒介种群传播疾病的方法。提供了破坏负责由靶生物体传播疾病的基因的方法。提供了破坏种系细胞中Y染色体的方法。提供了破坏种系细胞中X染色体的方法。提供了控制入侵害虫的方法。提供了保护受到生态变化威胁的物种的方法。

根据某些方面，提供了阻断基因从经工程改造的生物体向野生种群的流动的方法，其包括1)在编码野生型拷贝的同一染色体的远端区中***基因的重编码拷贝，该基因的表型在被破坏时是显性阴性致死的，和2)***自私遗传元件，即本文所述的RNA引导的基因驱动，并且如本领域技术人员所理解的术语基因驱动，其在同一基因的野生型形式中复制自己，使得在自私遗传元件替换野生型拷贝之后，来自经工程改造的生物体和经工程改造的生物体的任意后代含有重编码的基因的2个功能性拷贝，而来自经工程改造的生物体和野生型生物体的后代仅含有重编码的基因的单个拷贝，并且无法将重编码的基因拷贝到野生型染色体上。

根据某些方面，提供了阻断含独特序列的亚群和其余种群之间的基因流动的方法，包括1)释放第一自私遗传元件，其使用独特序列排他性地扩散并且***基因的部分，在基因组的其他地方，该基因的表型在被破坏时是显性阴性的，2)释放第二自私遗传元件，其使用部分基因序列排他性地扩散并且***基因的重编码形式同时破坏基因的野生型拷贝，使得1)来自含第一自私遗传元件的生物体与含第二遗传元件的生物体之间交配产生的所有后代都含有第二自私遗传元件，其中基因的2个野生型拷贝都被破坏但被基因组中其他地方的重编码拷贝所替换，并且2)含第二自私遗传元件的生物体与野生型生物体之间的任意杂交不会产生后代，因为基因的野生型拷贝丢失并且不会被重编码拷贝所替换。

根据某些方面，提供了使后代的性别比例偏移的方法，包括使用一种或多种染色体，其一起1)编码在减数***前期间排他性表达的RNA引导的核酸酶并且2)表达使核酸酶靶向以切割在性染色体之一上发现的独特序列的引导RNA，使得与未修饰的生物体的一般情况相比，活配子含有较少概率的靶染色体。

根据某些方面，提供了使种群的性别比例偏移的方法，包括使用编码RNA-引导的核酸酶并且也编码引导RNA的性染色体，该RNA-引导的核酸酶在减数***前期间排他性地表达，并且，该引导RNA使核酸酶靶向以切割相对性染色体上发现的独特序列，使得活配子主要含有编码RNA-引导的核酸酶的性染色体。

根据某些方面，提供了使后代的性别比例向异配性别(例如XY)偏移的方法，包括使用由通常在X染色体上存在的必要基因拷贝和自私遗传元件工程改造的染色体，该自私遗传元件将本身拷贝到X染色体上的野生型必要基因的位置上，使得雌性子代由于缺少必要基因而没有发育活力，而雄性子代由于经工程改造的染色体上的拷贝而存活。

根据某些方面，提供了使种群的性别比例向异配性别(例如XY)偏移的方法，包括使用由通常在X染色体上存在的必要基因拷贝和自私遗传元件工程改造的Y染色体，该自私遗传元件将本身拷贝到X染色体上的野生型必要基因的位置上，使得雌性子代由于缺少必要基因而没有发育活力，而雄性子代由于经工程改造的染色体Y上的拷贝而存活。

根据某些方面，使后代的性别比例向同配性别(例如哺乳动物中的XX)偏移的方法包括使用一个或多个染色体，其一起1)编码RNA-引导的核酸酶并且2)表达使核酸酶靶向以切割在异配性染色体(例如，哺乳动物中的XY)中发现的独特序列的引导RNA，使得任何通常将发育成异配性别(例如，哺乳动物中的雄性)的后代的异配性染色体被破坏。

根据某些方面，使种群的性别比例向同配性别(例如哺乳动物中的XX)偏移的方法包括使用同配性染色体，其1)编码RNA-引导的核酸酶并且2)表达使核酸酶靶向以切割在异配性染色体(例如，哺乳动物中的XY)中发现的独特序列的引导RNA，使得任何通常将发育成异配性别(例如，动物中的雄性)的后代的异配性染色体被破坏。

根据某些方面，使种群的性别比例向雄性偏移的方法包括释放经工程改造的雄性，其编码自私遗传元件，其在雌性生育所需的基因位置上拷贝自身。根据一个方面，在Y染色体上编码自私遗传元件。根据一个方面，Y染色体也编码靶向X染色体上存在的必要基因的自私遗传元件。

根据某些方面，提供了种群控制的方法，包括向待去除的种群中释放含有Y染色体的经工程改造的雄性生物体，该Y染色体编码1)在雌性生育所需的基因位置上拷贝自身的自私遗传元件，和2)在X染色体上的必要基因的位置上拷贝自身的第二自私遗传元件，使得雌性子代无法存活，并且向待保护的种群释放编码第三自私遗传元件的生物体，该第三自私遗传元件改变X染色体上必要基因的序列，使得在含有第一和第二自私遗传元件的雄性与含有第三自私遗传元件的雌性之间交配的后代产生有生育力的雄性，然而无生育力的雌性后代。

根据某些方面，提供了改变真核生物体种系细胞的方法，包括将编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包括相应的启动子序列和第一侧接序列以及第二侧接序列的第一外来核酸序列导入种系细胞，其中一种或多种引导RNA与种系细胞的染色体对的第一染色体和第二染色体的遗传DNA上的一个或多个靶位置互补，其中编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列和编码一种或多种引导RNA的核酸序列在第一侧接序列和第二侧接序列之间，其中，所述第一侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体或第二染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中所述第二侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体或第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，其中被切割并被外来核酸序列替换的位于第一侧接序列和第二侧接序列之间的序列的至少一个拷贝是生物体存活或产生活后代所需的，表达第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位至基因组DNA的第一染色体和基因组DNA的第二染色体上的相关靶位置，并且RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置上切割基因组DNA的第一染色体，并以切割位点特异性的方式在靶位置上切割基因组DNA的第二染色体，将第一外来核酸序列在可切割位点处***基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将第一外来核酸序列在可切割位点处***基因组DNA的染色体对的第二染色体中以赋予种系细胞对外来核酸序列而言的纯合，并且在发育阶段进行上述表达和***步骤，在该阶段中位于第一侧接序列和第二侧接序列之间的被切割并被外来核酸序列替换以产生遗传负荷的序列不再是该生物体存活或产生有生育力的后代所需要的。

根据某些方面，按照本文所述的方法来进行靶向种群抑制或灭绝的方法包括向靶向种群中释放RNA-引导的遗传负荷驱动。

本文所用术语遗传负荷可指种群中理论最优基因型的适应性(fitness)与种群中观察到的平均基因型的适应性之间的差异。术语遗传负荷也可指，与最大适应性相比种群平均适应性的降低。

本发明的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图的简要说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1A是标准RNA-引导的Cas9基因驱动的示意图，显示Cas9和引导RNA的表达，共定位，切割靶基因以产生断裂并且将RNA引导的Cas9基因驱动通过同源重组在切割位点处***靶基因。图1B显示了基因驱动遗传的染色体视图。图1C显示了阻止Cas9和引导RNA的共定位以阻止靶DNA的切割和基因驱动***的突变。图1D显示了使用多种引导RNA和切割位点以避免突变阻止基因驱动的***。图1E显示了NHEJ删除了所有识别位点以产生抗驱动等位基因。图1F显示NHEJ产生了不利地破坏必要基因的抗驱动等位基因。

图2A显示通过包含合适的引导RNA使用单个驱动来编辑多个远端位点。图2B显示使用后续驱动来更新由第一驱动产生的变化。图2C显示使用恢复性驱动以使所有变化回到野生型，仅留下Cas9基因和引导RNA。

图3显示使用采用不同引导RNA靶向相同必要基因的2个基因驱动，其在杂交时由于都是2个拷贝而变得不相容。向种群中释放该类型的驱动将会使其人工***成有多少驱动就有多少物种。

图4A显示使用减数***基因驱动来在减数***期间消除竞争性染色体，产生偏移的配子集合。驱动表达限于减数***前以防止驱动致死。图4B显示可使用2种正交Cas9核酸酶来避免减数***性染色体沉默。Cas9A导致编码Cas9B的盒在发育早期从性染色体拷贝到常染色体，在那里其无法在减数***期间消除竞争性染色体。图4C显示合子X-驱动可靶向Y染色体来在受精卵中进行破坏，产生排他性的雌性子代。图4D显示合子Y-驱动可编码通常在X染色体上发现的必要基因并且使用基因驱动盒来消除来自X的基因。该驱动将其本身从父系X拷贝到母系X，留下没有任何必要基因拷贝的雌性受精卵。

图5A显示使用双功能Y-驱动的种群抑制，其中还含有无生育力的雌性子代能力的A Y-驱动(Y-驱动-SD)作用为野生种群中的合子驱动，其可导致灭绝。图5B显示在遇到重编码的必要基因的标准驱动之后，Y-驱动-SD将不再驱动。无生育力雌性子代效果将防止突变驱动入侵直至入侵种群瓦解。

图6A显示了控制低迁移性和高迁移性入侵物种的方法，其中入侵栖息地如密西西比河中释放的Y-驱动雄性亚洲鲤鱼可用于根除亚洲鲤鱼种群。在有意人为运输Y-驱动雄性的事件中，可用保护性重编码驱动来保护亚洲种群。图6B显示在入侵大鼠种群中释放Y-驱动-SD雄性大鼠将引发局部根除，而标准驱动保护性地重编码欧亚大陆的天然大鼠种群。Y-驱动-SD构建体将从大多数岛屿和许多大陆区域中去除入侵大鼠。偷渡介导的基因流动将受到重编码的种群中Y-驱动-SD的无生育力雌性子代的限制。一旦偷渡者成功入侵无大鼠栖息地，可用新驱动重复该过程。

图7显示驱动介导的内源性基因调控，其中RNA-引导的转录调控子可调节远端基因的活性而不编辑它们的序列。在驱动的寿命期间，调控将在进化上是稳定的，如果驱动核酸酶需要调控子来进行合适表达。

图8显示了来自未修饰的野生种群的诱导形态。靶向含有独特等位基因(显示为独特基因)的亚群的2个连续基因驱动可诱导与其余野生种群的遗传不相容。第一驱动使用独特等位基因扩散并且重编码在破坏时显示显性致死表型的基因。第二驱动使用重编码的基因扩散并且消除第一驱动。与野生型生物体的任意交配将导致第二驱动破坏野生型拷贝，导致所有后代死亡。

图9显示本文所述的方法，其中驱动1重编码Y染色体上的雄性必要基因(如果存在)和X染色体上的隐性必要基因，同时将其自身***邻接独特基因(即，Cas9和引导RNA表达后，通过细胞机制如同源重组***，并且Cas9和引导RNA定位至靶核酸序列)。驱动2在修饰的X染色体上扩散，从常染色体上消除驱动1，并且可跳入修饰的Y染色体(如果存在)。在与野生型生物体交配后，驱动2从X或Y染色体中消除必要基因。唯一活的后代是杂合雌性，其在X染色体上保留隐性必要基因的单个重编码拷贝。这些可与已经用驱动2修饰的雄性自由交配，使野生型基因扩散到经工程改造的种群中。与野生型雄***配近产生更多的杂合雌性，防止基因流回野生种群。

图10显示制备本文所述的合子Y-驱动的方法。

图11A显示制备清除了雌性生育所需基因的无生育力雌性子代Y染色体的方法。Y染色体(Y-SD)不适真正驱动，但是纳入优先的基因驱动机制，其用驱动替换雌性生育的必要基因。图11B显示在Y-SD雄性的雌性子代中，驱动类似替换雌性生育基因的母系拷贝，导致无生育力。如果雌性生育特异性基因都不是已知的，两种性别所需的生育基因可被靶向并且与Y染色体上其他地方的额外拷贝互补。

图12A显示制备包括无生育力雌性子代能力的Y-驱动(Y-驱动-SD)的方法((Y-驱动+无生育力雌性子代Y染色体)。在与野生型雌***配后，Y-驱动-SD替换或破坏必要基因和雌性生育基因。雄性由于在Y-驱动-SD上的额外拷贝的互补而存活。如图12B所示，在雄性后代中，驱动类似地替换母系拷贝，留下胚胎期不能存活的雌性子代。因此，Y-驱动-SD显示驱动。如图12C所示，用保护性驱动修饰的雌性具有侧接重编码的必要基因的位点。Y-驱动-SD可仅替换生育基因。如图12D所示，雌性后代仍然活着，但是缺少任何生育基因拷贝并且因此无生育力。因为雄性没有从缺少雌性同胞中获得任何适应性益处，Y-驱动-SD将不会在受保护的种群中驱动。然而，其唯一的适应性代价是由驱动本身引起，使得其仅缓慢地从种群中去除。雌性生育产出的缺失将导致有力的种群抑制。因此，受保护的个体将发现难以入侵其中Y-驱动-SD常见的种群。类似地，Y-驱动-SD将不能入侵受保护的种群。

图13A是显示在酿酒酵母(S.cerevisiae)中易于观察到偏移的ADE2遗传。由于红色颜料形成，ADE2的突变在腺嘌呤限制培养基上生成红色表型。将红色突变单倍体与野生型单倍体交配产生米色的二倍体，其在孢子形成后产生50％红色和50％米色后代。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中易于观察到偏移的ADE2遗传。图13B是显示当具有靶向ADE2的基因驱动的二倍体与野生型二倍体在Cas9存在下交配时，ADE2的切割和后续替换或破坏将产生红色二倍体，其产生排他性的红色后代。图13C是酿酒酵母集落的图像。通过在没有Cas9的情况下使野生型和ADE2：：sgRNA基因驱动二倍体交配产生的二倍体产生米色集落或者当通过重编码去除靶位点时，只有两者都存在时有均匀的红色集落，证明野生型ADE2拷贝的Cas9-依赖性破坏。图13D是来自15个多裂四分体的孢子的图像，其在腺嘌呤限制的平板上产生均匀的红色集落，确认从野生型患者遗传的ADE2基因的破坏。在没有靶位点或Cas9的情况下，观察到正常的2∶2分离。

图14A是显示ADE2-靶向基因驱动经修饰携带作为货物基因的URA3的示意图。图14B是通过将野生型URA3^-二倍体酵母与编码携带URA3的基因驱动的二倍体交配产生的二倍体的图像，其形成配子并且四分体裂化成从单个孢子产生的分离集落。所有这些在复制物接种到缺少尿嘧啶的平板上时生长，证明该驱动成功地在所有二倍体中拷贝URA3。图14C是显示ABD1-靶向基因驱动切割并重编码必要ABD1基因的尾末端的示意图。基因驱动和货物基因在拷贝后保持完整并且可通过同时靶向非必要和必要基因来扩散。

图15A是显示基因驱动监测所选择的野生型菌株之间关系的进化树。经准许，改变于麦克米伦出版公司(Macmillan Publishers Ltd)：Nature 458：337-341，版权2009。图15B显示在多个酵母菌株中遗传偏移程度的定量PCR结果，表明从携带基因驱动的SK1二倍体与多个野生型二倍体株之间交配产生的二倍体中野生型和含驱动等位基因的相对丰度。“无Cas9”和“无靶标”是指在没有Cas9的情况下与野生型二倍体交配的含ADE2驱动元件的二倍体细胞，或在防止切割的靶序列中有突变的野生株。“第二代”是指较早交配的二倍体后代。

发明详述

本发明的实施方式是基于使用RNA引导的DNA结合蛋白与引导RNA在靶DNA位点处共定位并发挥基因驱动的作用。本领域技术人员易于知道这类DNA结合蛋白结合DNA用于各种目的。这种DNA结合蛋白可以是天然产生的。本发明范围内包括的DNA结合蛋白包括由RNA引导的那些，在本文中称为引导RNA。根据一个方面，引导RNA在约10至约500个核苷酸之间。根据一个方面，该RNA在约20至约100个核苷酸之间。根据该方面，引导RNA和RNA引导的DNA结合蛋白在DNA处形成共定位复合物。

具有核酸酶活性的DNA结合蛋白为本领域技术人员所知，并且包括具有核酸酶活性的天然产生的DNA结合蛋白，例如在II型CRISPR***中存在的Cas9蛋白。这种Cas9蛋白和II型CRISPR***在本领域中充分记载。参见Makarova等，Nature Reviews，Microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477页，包括所有补充信息，通过引用全文纳入本文。

细菌和古细菌CRISPR-Cas***依赖于与Cas蛋白负荷的短引导RNA以引导入侵外来核酸内存在的互补序列的直接降解。参见Deltcheva，E.等，通过反式编码小RNA和宿主因子RNA酶III的CRISPR RNA突变(CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNAand host factor RNase III).Nature 471，602-607(2011)；Gasiunas，G.，Barrangou，R.，Horvath，P.和Siksnys，V.Cas9-crRNA核蛋白蛋白复合物介导细菌的获得性免疫的特异性DNA切割(Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavagefor adaptive immunity in bacteria).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 109，E2579-2586(2012)；Jinek，M.等，获得性细菌免疫中可编程的双RNA-引导的DNA内切核酸酶(A programmable dual-RNA-guidedDNA endonuclease in adaptive bacterial immunity).Science 337，816-821(2012)；Sapranauskas，R.等，嗜热链球菌CRISPR/Cas***提供大肠杆菌中的免疫(TheStreptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichiacoli).Nucleic acids research 39，9275-9282(2011)；和Bhaya，D.，Davison，M.和Barrangou，R.细菌和古细菌中的CRISPR-Cas***：获得性防御和调节的通用小RNA(CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea：versatile small RNAs for adaptivedefense and regulation).Annual review of genetics 45，273-297(2011)。最近的酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR***的体外重建证明与正常反式编码tracrRNA融合的crRNA(“CRISPR RNA”)(“反式-作用CRISPR RNA”)足够引导Cas9蛋白序列特异性切割匹配cdRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9招募以及靶DNA降解。参见H.Deveau等，对嗜热链球菌中CRISPR编码的抗性的噬菌体响应(Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus).Journal of Bacteriology190，1390(2008年2月)。

三类CRISPR***一般已知并且称为I类、II类或III类。根据一个方面，II型所共有的本发明特别有用的切割dsDNA的酶是单一效应酶Cas9。参见K.S.Makarova等，CRISPR-Cas***的进化和分类(Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems).Nature reviews.Microbiology 9.467(2011年6月)，通过引用全文纳入本文。在细菌内，II型效应***由从含间隔子的CRISPR基因座转录的长前-crRNA、多功能Cas9蛋白、和对于gRNA处理而言重要的tracrRNA组成。tracrRNA与分隔前-crRNA的间隔子的重复区杂交，引发内源性RNA酶III的dsRNA切割，之后通过Cas9在各间隔子内的第二切割事件，产生保持与tracrRNA和Cas9结合的成熟crRNA。

根据一个方面，本发明的酶，如Cas9展开DNA双链体并且检索与cdRNA匹配的序列以切割。靶识别在检测靶DNA中的“原型间隔子(protospacer)”序列与crRNA中的剩余间隔子序列之间的互补性之后出现。重要的是，Cas9仅在正确的原型间隔子-相邻基序(PAM)也在3’末端处存在的情况下切割DNA。根据某些方面，可使用不同的原型间隔子-相邻基序。例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)***需要NGG序列，其中N可以是任意核苷酸。嗜热链球菌(S.thermophilus)II型***分别需要NGGNG(参见P.Horvath，R.Barrangou，CRISPR/Cas，细菌和古细菌的免疫***(the immune system of bacteria and archaea).Science 327，167(2010年1月8日)，通过引用全文纳入本文，和NNAGAAW(参见H.Deveau等，针对嗜热链球菌中CRISPR-编码的抗性的噬菌体响应(Phage response to CRISPR-encoded resistancein Streptococcus thermophilus).Journal of bacteriology 190，1390(2008年2月)，通过引用全文纳入本文)，同时不同的变形链球菌(S.mutans)***耐受NGG或NAAR(参见J.R.van der Ploeg，变形链球菌中CRISPR的分析表明针对M102-样噬菌体的感染的获得性免疫的出现频率(Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequentoccurrence of acquired immunity against infection by M102-likebacteriophages).Microbiology 155，1966(2009年6月)，通过引用全文纳入本文。生物信息学分析已经在多种细菌中生成CRISPR基因座的广泛数据库，其也可用于鉴定其他有用的PAM并扩展CRISPR-可靶向序列组(参见M.Rho，Y.W.Wu，H.Tang，T.G.Doak，Y.Ye，人类微生物中进化的不同CRISPR(Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes).PLoSgenetics 8，e1002441(2012)和D.T.Pride等，对来自人唾液的链球菌CRISPR的分析显示对象内和对象之间随时间的显著序列多样性(Analysis of streptococcal CRISPRs fromhuman saliva reveals substantial sequence diversity within and betweensubjects over time).Genome research 21，126(2011年1月))，各自通过引用全文纳入本文。

具有核酸酶活性的示例性DNA结合蛋白的功能是切开或切割双链DNA。这种核酸酶活性可来自具有显示核酸酶活性的一个或多个多肽序列的DNA结合蛋白。这类示例性DNA结合蛋白可具有2个分开的核酸酶结构域，各结构域负责切割或切开双链DNA的特定链。本领域技术人员已知的具有核酸酶活性的示例性多肽序列包括McrA-HNH核酸酶相关结构域和RuvC-样核酸酶结构域。因此，示例性的DNA结合蛋白是天然含有一个或多个McrA-HNH核酸酶相关结构域和RuvC-样核酸酶结构域的那些。

在酿脓链球菌(S.pyogenes)中，Cas9通过由蛋白质中的以下2个催化结构域介导的过程在原型间隔子-相邻基序(PAM)上游3bp处生成钝末端双链断裂：切割DNA的互补链的HNH结构域和切割非互补链的RuvC-样结构域。参见Jinke等，Science 337，816-821(2012)，通过引用全文纳入本文。已知Cas9蛋白存在于许多II型CRISPR***，包括Makarova等，Nature Reviews，Microbiology，卷9，2011年6月，第467-477页的补充信息中所鉴定的以下***：海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)C7；白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)；高效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)YS-314；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 Kitasato；谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032 Bielefeld；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R；果聚糖棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)DSM 44385；脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)ATCC 19977；皮诺卡氏菌(Nocardia farcinica)IFM10152；红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR4；红球菌(Rhodococcus jostii)RHA1；混浊红球菌(Rhodococcus opacus)B4 uid36573；解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)11B；氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)A6；黄克里布所菌(Kribbellaflavida)DSM 17836uid43465；弯曲热单孢菌(Thermomonospora curvata)DSM 43183；齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)Bd1；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)DJO10A；还原天芥菜碱斯奈克氏菌(Slackia heliotrinireducens)DSM 20476；海皮尔氏菌(Persephonella marina)EX H1；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC 9434；黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)DSM 7271；嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)JIP0286；黏液阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA 835；卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)DSM 13941；玫瑰弯菌(Roseiflexus)RS1；集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803；小迷踪菌(Elusimicrobium minutum)Pei191；未培白蚁1组细菌种系Rs D17；产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)S85；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987；无害利斯特氏菌(Listeria innocua)；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG；唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)UCC118；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)A909；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)NEM316；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)2603；停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae equisimilis)GGS 124；马链球菌(Streptococcus equi zooepidemicus)MGCS10565；鸡链球菌(Streptococcusgallolyticus)UCN34 uid46061；格氏链球菌(Streptococcus gordonii)Challis substCH1；变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 uid46353；变异链球菌(Streptococcusmutans)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)M1 GAS；酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS5005；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS2096；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS9429；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS10270；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS6180；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS315；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SSI-1；酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS10750；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)NZ131；嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)CNRZ1066；嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)LMD-9；嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)LMG 18311；肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)A3Loch Maree；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)B Eklund 17B；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)Ba4657；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)F Langeland；解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10；微小微单胞菌(Finegoldia magna)ATCC29328；直肠假杆菌(Eubacterium rectale)ATCC 33656；鸡败血枝原体(Mycoplasmagallisepticum)；运动枝原体(Mycoplasma mobile)163K；穿透枝原体(Mycoplasmapenetrans)；关节液枝原体(Mycoplasma synoviae)53；念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)DSM 12112；慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)BTAi1；汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)X14；血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB18；血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB5；食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)DS-1；恒雄芝氏沟鞭玫瑰杆属(Dinoroseobactershibae)DFL 12；固氮葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)Pal5FAPERJ；固氮葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)Pal 5JGI；固氮螺菌(Azospirillum)B510 uid46085；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC 11170；絮凝剂产生菌(Diaphorobacter)TPSY uid29975；蚯蚓虫肾杆菌(Verminephrobactereiseniae)EF01-2；脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)053442；脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)alpha14；脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)Z2491；需盐脱硫弧菌(Desulfovibrio salexigens)DSM 2638；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni doylei)26997；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)81116；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)RM2100；肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)；产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)；甲苯单胞(Tolumonas auensis)DSM 9187；交替假单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c；希瓦氏菌(Shewanella pealeana)ATCC 700345；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Paris；产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)130Z；多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)；新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis novicida)U112；土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种(Francisella tularensis holarctica)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)FSC 198；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)WY96-3418；和齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)ATCC 35405。在文献中，本领域技术人员可将Cas9蛋白称为Csn1。示例性的酿脓链球菌Cas9蛋白序列如下所示。参见Deltcheva等，Nature 471，602-607(2011)，通过引用全文纳入本文。

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAE

ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG

NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSD

VDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN

LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI

LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYA

GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELH

AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE

VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL

SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI

IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWG

RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL

HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER

MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDH

IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL

TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS

KLVSDFRKUFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRK

MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF

ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA

YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK

YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE

QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGA

PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

根据一个方面，gRNA-引导的Cas9切割的特异性用作基因组工程改造的机制和驱动基因。根据一个方面，对于该酶识别gRNA/DNA杂合体并影像切割而言，gRNA的杂交不必是100％。可出现一些脱靶活性。例如，酿脓链球菌***在体外耐受20bp的成熟间隔子序列的前6个碱基中的错配。根据一个方面，当潜在脱靶位点错配(最后的14bp)NGG存在于gRNA的人参照基因组中时，更大的严谨性在体内有益。

根据某些方面，可改善特异性。当gRNA-DNA杂合体的熔点对干扰敏感时，富AT的靶序列可能有较少的脱靶位点。小心选择靶位点以避免在基因组其他地方的至少14bp个错配序列的假位点可改善特异性。使用需要更长的PAM序列的Cas9变体可降低脱靶位点的频率。定向进化可改善Cas9的特异性至足够完全排除脱靶活性的水平，理想地需要与最小PAM的完美20bp的gRNA匹配。因此，Cas9蛋白的修饰是本发明的代表性实施方式。可用于本发明的CRISPR***描述于R.Barrangou，P.HorVath，CRISPR：噬菌体抗性和菌株鉴定中的新视界(CRISPR：new horizons in phage resistance and strainidentincation).Annualreview of food science and technology 3，143(2012)和B.Wiedenheft，S.H.Sternberg，J.A.Doudna，细菌和古细菌中RNA-引导的遗传沉默***(RNA-guidedgenetic silencing systems in bacteria and archaea).Nature 482，331(Feb 16，2012)，其各自通过引用全文纳入本文。

根据某些方面，DNA结合蛋白经改变或修饰以使得核酸酶活性灭活。这类改变或修饰包括改变一个或多个氨基酸以使核酸酶活性或核酸酶结构域灭活。这类修饰包括去除显示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域，使得DNA结合蛋白上没有显示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域。基于本发明，灭活核酸酶活性的其他修饰将对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，无核酸酶的DNA结合蛋白包括经修饰以灭活核酸酶活性或去除一个或多个多肽序列以灭活核酸酶活性的多肽序列。无核酸酶DNA结合蛋白保留了结合至DNA的能力，即使核酸酶活性已经被灭活。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可缺少显示核酸酶活性的一个或多个或全部核酸酶序列。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可具有显示灭活的核酸酶活性的一个或多个或全部核酸酶序列。

根据一个方面，具有2个或更多个核酸酶结构域的DNA结合蛋白可经修饰或改变以使除了核酸酶结构域之一以外的全部核酸酶结构域灭活。这种经修饰或改变的DNA结合蛋白被称为DNA结合蛋白缺刻酶，该DNA结合蛋白仅切割或切开双链DNA的一条链。当由RNA引导至DNA时，DNA结合蛋白缺刻酶被称为RNA引导的DNA结合蛋白缺刻酶。

示例性的DNA结合蛋白是II型CRISPR***的RNA引导的DNA结合蛋白酶，如Cas9蛋白或修饰的Cas9或者Cs9的同源物。示例性的DNA结合蛋白是Cas9蛋白缺刻酶。示例性的DNA结合蛋白是II型CRISPR***的RNA引导的DNA结合蛋白，其缺少核酸酶活性。示例性的DNA结合蛋白是无核酸酶的Cas9蛋白。

根据本文所述的RNA引导的基因组调控方法的某些方面，改变Cas9来降低、显著降低或消除核酸酶活性。根据一个方面，通过改变RuvC核酸酶结构域或HNH核酸酶结构域来降低、显著降低或消除Cas9核酸酶活性。根据一个方面，灭活RuvC核酸酶结构域。根据一个方面，灭活HNH核酸酶结构域。根据一个方面灭活RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域。根据另一个方面，提供了Cas9蛋白，其中灭活RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域。根据另一个方面，提供了无核酸酶的Cas9蛋白，其中灭活RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域。根据另一个方面，提供Cas9缺刻酶，其中灭活RuvC核酸酶结构域或HNH核酸酶结构域，从而保留其余核酸酶结构域的核酸酶活性。通过这种方式，仅双链DNA的一条链被切割或切开。

根据另一个方面，提供了无核酸酶的Cas9蛋白，其中Cas9中的一个或多个氨基酸被改变或者去除以提供无核酸酶的Cas9蛋白。根据一个方面，氨基酸包括D10和H840。参见Jinke等，Science 337：816-821(2012)。根据另一个方面，氨基酸包括D839和N863。根据一个方面，D10、H840、D839和H863中的一个或多个或全部被氨基酸取代，该氨基酸降低、显著降低或消除核酸酶活性。根据一个方面，D10、H840、D839和H863中的一个或多个或全部被丙氨酸取代。根据一个方面，D10、H840、D839和H863中的一个或多个或全部被降低、显著降低或消除核酸酶活性的氨基酸如丙氨酸取代的Cas9蛋白被称为无核酸酶Cas9或Cas9N并且显示出降低的或消除的核酸酶活性，或者在检测水平内没有或基本没有核酸酶活性。根据该方面，使用已知试验可能无法检测到Cas9N的核酸酶活性，即低于已知试验的检测水平以下。

根据一个方面，Cas9蛋白、Cas9蛋白缺刻酶或无核酸酶Cas9包括其同源物和直向同源物，其保留蛋白结合至DNA并且受RNA引导的能力。根据一个方面，Cas9蛋白包括天然产生的来自酿脓链球菌的Cas9所述的序列和与之具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的蛋白质序列，并且是DNA结合蛋白，如RNA引导的DNA结合蛋白。

根据一个方面，提供了经工程改造的Cas9-gRNA***，其使得能够通过将转录活性结构域系连至无核酸酶的Cas9或引导RNA在细胞中进行RNA-引导的基因组调控。根据本发明的一个方面，一个或多个转录调控蛋白或结构域(这类术语互换使用)接合或连接至核酸酶缺陷型Cas9或者一种或多种引导RNA(gRNA)。转录调控结构域对应于靶向基因座。因此，本发明的方面包括通过将这类结构域融合、连接或接合至Cas9N或gRNA来将转录调控结构域定位至靶向基因座的方法和材料。根据某些方面，提供了使用Cas9N、一个或多个gRNA以及转录调控蛋白或结构域调控内源性基因的方法。根据一个方面，内源性基因可以是任何所需基因，在本文中称为靶基因。

根据一个方面，提供了能够进行转录活化的Cas9N-融合蛋白。根据一个方面，VP64活化结构域(Zhang等，Nature Biotechnology 29，149-153(2011)，通过引用全文纳入本文)接合、融合、连接或系连至Cas9N的C末端。根据一个方法，通过Cas9N蛋白向靶基因组DNA的位点提供转录调控结构域。根据一个方法，提供了在细胞内与转录调控结构域融合的Cas9N，其伴随一种或多种引导RNA。具有与之融合的转录调控结构域的Cas9N在靶基因组DNA处或附近结合。一种或多种引导RNA在靶基因组DNA处或附近结合。转录调控结构域调控靶基因的表达。根据一个具体方面，Cas9N-VP64融合在与启动子附近的gRNA靶向序列结合时激活报告构建体的转录，从而显示RNA-引导的转录活化。

根据一个方面，提供了能够进行转录活化的gRNA-融合蛋白。根据一个方面，VP64活化结构域接合、融合、连接或系连至gRNA。根据一个方法，通过gRNA向靶基因组DNA的位点提供转录调控结构域。根据一个方法，在细胞内提供了与转录调控结构域融合的gRNA与Cas9N蛋白。Cas9N在靶基因组DNA处或附近结合。具有与之融合的转录调控结构域的一种或多种引导RNA在靶基因组DNA处或附近结合。转录调控结构域调控靶基因的表达。根据一个具体方面，与转录调控结构域融合的Cas9N蛋白和gRNA激活报告构建体的转录，从而显示RNA-引导的转录活化。

根据一个方面，转录调控子蛋白或结构域是转录活化物。根据一个方面，转录调控子蛋白或结构域上调靶核酸的表达。根据一个方面，转录调控子蛋白或结构域是转录抑制物。根据一个方面，转录调控子蛋白或结构域下调靶核酸的表达。基于本发明，本领域技术人员可容易地鉴定转录活化物和转录抑制物。

根据一个方面，外来核酸序列编码2个或更多个引导RNA，各RNA与DNA靶核酸中的相邻位点互补并且还编码至少一个RNA引导的DNA结合蛋白缺刻酶并受2个或更多个RNA的引导，其中2个或更多个RNA以及至少一个RNA引导的DNA结合蛋白缺刻酶被表达并且其中至少一个RNA引导的DNA结合蛋白缺刻酶与2个或更多个RNA共定位至DNA靶核酸并且切开DNA靶核酸产生2个或更多个相邻切口。根据某些方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的同一条链上。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的同一条链上并且导致同源重组。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并且产生双链断裂。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并且产生双链断裂，导致非同源末端接合。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并且互相补偿。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并且互相补偿并产生双链断裂。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并且互相补偿并产生双链断裂，导致非同源末端接合。根据一个方面，2个或更多个相邻切口在双链DNA的不同链上并产生双链断裂，导致靶核酸的片段化，从而防止靶核酸表达。

根据某些方面，可根据本文所述的方法增加RNA引导的DNA接合蛋白的结合特异性。根据一个方面，在基因组编辑的方法中使用补偿切口。大部分的切口很少导致NHEJ事件(参见Certo等，Nature Methods 8，671-676(2011)，通过引用全文纳入本文)，因此使脱靶切口的影响最小化。相反，诱导补偿切口以生成双链断裂(DSB)在诱导基因破坏上是高度有效的。根据某些方面，与3’突出端相反，5’突出端生成更明显的NHEJ事件。类似地，3’突出端相比NHEJ更倾向HR事件，虽然HR事件的综述明显低于生成5’突出端时。因此，提供了使用切口进行同源重组并且使用补偿切口生成双链断裂以最小化脱靶Cas9-gRNA活性效果的方法。

本发明的种系细胞包括其中可如本文所述导入并表达外来核酸的任何种系细胞。应理解，本文所述的本发明的基本概念并不受到细胞类型的限制。本发明的种系细胞包括真核种系细胞、原核种系细胞、动物种系细胞、哺乳动物种系细胞、植物种系细胞、昆虫种系细胞、真菌种系细胞、古细菌种系细胞、真细菌种系细胞等。此外，种系细胞包括其中有益或需要导入本文所述的外来核酸序列的任意细胞。

靶核酸包括可使用本文所述的共定位复合物来切割、切开或调控的任意核酸序列。靶核酸包括基因。出于本发明的目的，DNA，如双链DNA可包括靶核酸并且共定位复合物可结合至或以DNA共定位在靶核酸处或与之相邻或其附近，并且是以共定位复合物对靶核酸具有所需效果的方式。这类靶核酸可包括内源性(或天然产生)核酸和外源性(或外来)核酸。基于本发明，本领域技术人员将能易于鉴定或涉及引导RNA和Cas9蛋白，其共定位至包括靶核酸的DNA。本领域技术人员还能够鉴定转录调控子蛋白或结构域，其类似地共定位至包括靶核酸的DNA。DNA包括基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA或外源性DNA。

外来核酸(即，不是细胞的天然核酸组成的那些)可使用本领域技术人员已知的用于这种导入的任何方法导入细胞。这类方法包括转染、转导、病毒转导、微注射、脂质转染、核转染、纳米颗粒轰击、转化、偶联等。使用易于鉴定的文献来源，本领域技术人员将易于理解和接受这类方法。

基于本发明和特定种系细胞，本领域技术人员可易于鉴定作为转录活化物或转录抑制物的转录调控子蛋白或结构域。

以下实施例是本发明的代表。这些实施例并不构成对本发明范围的限制，因为这些和其他等价实施方式将对于本发明、附图和所附权利要求而言是显而易见的。

实施例1

Cas9基因驱动

图1A是显示引导RNA和Cas9核酸酶共定位至靶DNA的示意图。靶DNA位点包括“原型间隔子”序列，其与引导RNA的“间隔子”和Cas9结合所需的短原型间隔子-相邻基序(PAM)匹配。图1A所示的示例性Cas9基因驱动是本文所述的外来核酸序列(其可被称为“盒”，因为该术语为本领域技术人员所知)，其编码至少RNA引导的Cas9核酸酶、一种或多种与一个或多个靶DNA位点互补的引导RNA(如在相邻必要基因内)、以及侧接序列。该盒也可包含任何货物遗传物质，如其中待***货物遗传物质的由种系细胞表达或由该细胞的后代表达的一种或多种基因。表达Cas9基因驱动来产生Cas9和一种或多种然后共定位在染色体对的第一染色体上的一个或多个靶DNA位点处的引导RNA并且其中Cas9然后以位点特异性的方式切割第一染色体上的靶DNA产生双链断裂。Cas9-诱导的双链断裂的同源导向修复然后在切割位点处将Cas9基因驱动***第一染色体。根据某些方面，然后表达***的Cas9基因驱动来产生Cas9和一种或多种然后共定位在染色体对的第二染色体上的一个或多个靶DNA位点处的引导RNA，并且然后以位点特异性的方式切割靶DNA产生双链断裂。Cas9-诱导的双链断裂的同源导向修复使用完成的含Cas9驱动的染色体作为模板从而将Cas9驱动***染色体对的第二染色体中以产生对Cas9基因驱动而言纯合的染色体对。这显示于图1B中。

图1C显示在靶DNA位点处的突变可能阻止单个Cas9蛋白的切割。因此，图1D所示的本发明的方面提供了针对多个靶DNA位点的多个引导RNA。通过这种方式，RNA-引导的基因驱动能通过靶向多个相邻序列使得没有单一突变能赋予抗性来克服抗性等位基因。靶位点将不会由于突变而切割的概率极大降低，因为靶DNA位点将可能被切割成多个位置，从而提供其中可***RNA引导的基因驱动的切割位点。如图1E所示，使用交替非同源末端接合(NHEJ)途径修复可删除所有的识别位点，产生胜过该驱动的驱动抗性等位基因。图1F显示破坏必要基因的NHEJ事件是高度有害的并且将以与有利于驱动对立的方式被选择。选择必要基因内的靶位点确保了不正确的修复事件不能通过删除所有靶向序列来产生抗性等位基因。非同源性末端接合可在修复的连接处产生小的***或删除，其可防止引导RNA和Cas9结合至修复位点。结果，RNA引导的基因驱动可能不能被***染色体上的该位点，如果只有针对在RNA引导的基因驱动中编码的该位点的单个引导RNA。然而，使RNA引导的基因驱动编码靶向多个位点并因此产生多个切割位点的多个引导RNA将增加RNA引导的基因驱动将被***染色体的几率。此外，本发明的方面涉及靶向必要基因内的Cas9的多个位点作为改善将RNA引导的基因驱动***染色体的效率的方法。

实施例2

编辑和调控多个内源性基因座

根据本发明的某些方面，RNA-引导的基因驱动可通过纳入靶向相应野生型等位基因的引导RNA编辑驱动本身远端的多个内源性等位基因。如图2A所示，提供了针对多个基因序列的多个引导RNA，即，基因A WT、基因B WT和必要基因WT。多个引导RNA和Cas9蛋白的表达导致由Cas9来修饰各基因。根据一个方面，Cas9驱动也可包括一个或多个正交无核酸酶Cas9蛋白和相关引导RNA以及转录调控子，其可定位于靶DNA位点使得转录调控子可调控基因。参见图7。如图2B所示，可使用其他后续Cas9驱动来更新之前已经由在先的Cas9驱动造成的变化。例如，如果特定驱动导致意料之外的副作用，释放作为更新的第二驱动可重写由第一驱动编码的一个或多个修饰。根据该方面，可设计第二驱动来去除现有***驱动，然后将其自身***染色体中。另外，已由在先RNA引导的基因驱动修饰的一个或多个基因可被去除或被所需的基因替换。类似地，如图2C所示，除了存在扩散恢复性驱动所需的Cas9基因和引导RNA以外，第三恢复性驱动可在所有基因组位置上恢复野生型序列。通过这种方式，种群可经修饰来将其恢复回野生型。因此，本发明的方面涉及通过使用本文所述的方法将第二RNA引导的Cas9基因驱动导入之前修饰的细胞来对之前***的RNA引导的Cas9基因驱动进行修饰或替换。第二基因驱动经设计产生超过由第一基因驱动产生的修饰的其他修饰或消除由第一基因驱动产生的修饰。

实施例3

控制扩散

根据某些方面，RNA-引导的基因驱动的扩散可通过靶向独特基因与单一靶物质或亚群相关的序列多态性限制到单一靶物质甚至亚群。因为驱动可仅切割独特序列，其并不在非靶种群中扩散。因此，本发明的方面涉及设计并使用RNA引导的基因驱动的方法，该基因驱动对于独特基因序列或序列多态性而言是特异性的。通过这种方式，一种或多种引导RNA经设计与独特基因序列或序列多态性互补。通过这种方式，DNA结合蛋白被限制为定位于独特基因序列或序列多态性。

实施例4

诱导人工形态

根据某些方面，提供了使用RNA-引导的基因驱动通过导致2个种群之间的遗传不相容来阻断基因流动的方法。根据这一方面并且如图3所示，使用不同引导RNA靶向相同必要基因内的不同序列的2个基因驱动在2个种群中释放。这2个种群由于各种群中缺少必要基因的各拷贝而变得不相容。向种群中释放该类型的驱动将种群人工***成与驱动一样多的种类。如示例性的图3所示，驱动A切割必要基因X内的序列1、2、3和4。随着驱动A的扩散，其用具有经重编码使其不能被切割的序列1、2、3和4的形式替换基因X。驱动B切割基因X内的序列5、6、7和8，并且基因X的形式具有经重编码使其不能被切割的这些序列。具有驱动A的雄性与具有驱动B的雌***配产生遗传一个具有驱动A和重编码1/2/3/4的基因X的染色体，以及一个具有驱动B和重编码5/6/7/8的基因X的染色体的后代。驱动A在位点1/2/3/4处切割基因X的第二拷贝，因为第二拷贝并没有在这些位点处重编码，其仅仅重编码5/6/7/8。类似地，驱动B在位点5/6/7/8处切割基因X的第一拷贝，因为第一拷贝并没有在这些位点处重编码，其仅仅重编码1/2/3/4。该生物体随着基因X的2个拷贝都被切割而终结。因为基因X是必要的并且该生物体缺少完整拷贝的基因X来修复它们，该生物体死亡。因此，驱动A和驱动B是不相容的。

根据这一方面，各驱动编码不同形式的必要基因-第一外来核酸序列和第二外来核酸序列-其各自保留了该基因所编码的必要蛋白的氨基酸序列，但是具有不同的重编码的靶位置组-第一驱动具有与引导1/2/3/4不互补的重编码位点1/2/3/4，而第二驱动具有与引导5/6/7/8不互补的重编码位点5/6/7/8。当驱动杂交时，第一驱动在1/2/3/4处切割必要基因的第二驱动拷贝，因为其在这些位点没有重编码，而第二驱动在5/6/7/8处切割必要基因的第一驱动拷贝，因为其在这些位点没有重编码。

更复杂的基因驱动可阻断经工程改造的亚群和野生种群之间的基因流动而不修饰后者(参见图8)。该障碍甚至可以是单向的，使得经工程改造的种群接受但不向野生种群贡献遗传物质(参见图9)。可使用这些或相关的设计来阻止其他基因驱动或遗传修饰扩散到相同或相关物种的未修饰成员。根据这一方面，2个种群中仅一个被修饰并且使用2个分开的RNA引导的基因驱动。第一驱动产生了供于第二驱动的***位点。第二驱动1)包括必要基因的拷贝，使得其在扩散时将基因拷贝到由第一驱动产生的***位点中，和2)杀死必要基因的野生型拷贝。当具有第二驱动的生物体与具有第一驱动的生物体交配时，第二驱动被拷贝到由第一驱动产生的***位点中，加入必要基因拷贝并去除野生型拷贝。必要基因的净变化为0，因此细胞是活的。当具有第二驱动的生物体与野生型生物体交配时，不能将该驱动及其必要基因***野生型染色体，因为其缺少***位点。然而，第二驱动仍然杀死野生型拷贝。必要基因的净变化为-1，因此细胞死亡。因此，含有第二驱动的生物体与野生型生物体之间的任意交配不产生后代。本发明的这一方面提供产生与野生种群不相容的转基因生物体以阻止转基因扩散的方法。

实施例5

种群抑制和灭绝

根据某些方面，RNA-引导的核酸酶和产生几种不同形式的性别偏移的基因驱动，其可用于种群控制。如图4A所示，在雄性减数***期间排他性地表达Cas9和靶向X染色体的引导RNA将产生与自然中发现的那些类似的典型的“减数***”Y-驱动。减数***驱动在减数***期间消除了竞争性性染色体，产生了偏移的配子集合。驱动表达必须严格限制在减数***前，或者该驱动将是致死的。这种类型的驱动将使得采用XY、ZW的生物体的配子偏移，并且在较低程度上使XO性别决定***产生有利于任意性别的偏移。还参考图4A，将RNA引导的基因驱动导入***细胞的Y染色体中。RNA引导的基因驱动包括多个与X染色体上的靶序列互补的引导RNA。当表达RNA引导的基因驱动时，引导RNA和Cas9核酸酶定位于X染色体处，其中Cas9核酸酶产生使X染色体无用的双链断裂。减数***后，仅具有Y染色体的***将存活。

重要的是，正交Cas9核酸酶应该能够避免减数***染色体沉默。本发明的方面涉及在Y染色体上使用本文所述的第一RNA引导的基因驱动以在生成***之前用合适的引导RNA表达Cas9，其中表达的Cas9和合适的引导RNA切割常染色体并且编码第二Cas9和合适的引导RNA的第二RNA引导的基因驱动被***常染色体中。在***发生期间，常染色体中第二RNA引导的基因驱动经表达并且表达的第二Cas9和合适的引导RNA切割X染色体，从而使其无用。该方法能够真实在***发生期间不表达X和Y染色体的物种中切割X染色体。如图4B所示，Cas9导致编码Cas9B的盒在发育早期从性染色体拷贝到常染色体，在那里其无法在减数***期间消除竞争性染色体。根据一个方面，在使该种群偏向的性染色体上提供针对特定性别偏移的RNA引导的基因驱动。例如，哺乳动物中的雄性具有Y染色体，因此使种群偏向雄性的驱动必须在Y染色体上，使其然后辅助Y染色体产生更多的自身拷贝。由于哺乳动物性染色体并不在减数***(形成***和卵)期间表达，可使用Cas9的2个拷贝来促进驱动恰当地***染色体中，其在表达时将产生会切割性染色体的Cas9。第一Cas9在发育早期，刚好在***形成之前发挥作用，并且其切割常染色体(没有在减数***期间不被沉默的性染色体)，从而使得编码第二Cas9的RNA引导的基因驱动***常染色体。第二Cas9在***形成期间从常染色体表达并切割X染色体，从而确保最有活力的***含有Y染色体。上述方法因此使用2个RNA引导的基因驱动，在性染色体不能在减数***期间表达基因的情况下，其中一个***可表达的常染色体以使种群偏向雄性。

如图4C所示，“受精卵的”性别偏移驱动在受精或受精后阶段期间消除了相反性别的同胞(参见Rice和Friberg 2008，其通过引用全文纳入本文)。重要的是，它们并不需要高度特异性的表达特征来发挥功能。X-驱动通过简单靶向Y染色体上的位点来消除雄性受精卵(图4C)。在Y-驱动中，基因驱动盒在X染色体上的必要基因处拷贝自身，其缺失在雄性中通过在驱动的Y染色体上的其他位置上***拷贝来补偿(图4D)。可能需要调节移植的必要基因的表达来解决一些物种中的剂量补偿。

参考图4C，野生型***细胞产生具有X染色体的野生型***和具有Y染色体的野生型***。提供具有RNA引导的基因驱动的***，该驱动具有一种或多种与Y染色体互补的引导RNA，其被称为“X驱动***”。当具有Y染色体的野生型***与***结合时，表达RNA引导的基因驱动，引导RNA和Cas9核酸酶共定位至Y染色体，其中Cas9核酸酶在Y染色体中产生双链断裂，使Y染色体无用并因此产生无用的受精卵。相反，当具有X染色体的野生型***与***结合时，表达RNA引导的基因驱动，与X染色体和Cas9核酸酶互补的引导RNA共定位至X染色体，其中Cas9核酸酶在X染色体中产生双链断裂，其通过同源重组修复，从而将RNA引导的基因驱动***X染色体，赋予受精卵对X染色体的纯合性。X染色体的这一拷贝保持存活，因为双链断裂在RNA引导的基因驱动被拷贝时修复。所得的后代都是雌性，因为雄性由于缺失Y染色体而没有存活。这些雌性比不编码RNA引导的基因驱动其他雌性有优势，因为它们不必与雄性同胞竞争资源。因此，具有RNA引导的基因驱动的X染色体具有适应性优势。参考图4D，合子Y-驱动编码通常在X染色体上发现的必要基因并且使用基因驱动盒来消除来自X的必要基因。Y驱动从父系X染色体拷贝到母系X染色体，留下没有任何必要基因拷贝的雌性受精卵。具体地，提供了具有来自X染色体的必要基因和编码与X染色体上的必要基因互补的一种或多种引导RNA的RNA引导的基因驱动的Y染色体的***细胞。***细胞的X染色体还包括相同的RNA引导的基因驱动。***细胞产生具有Y染色体的***和具有X染色体的***。具有Y染色体的***与具有带必要基因的X染色体的野生型***结合。当表达RNA引导的基因驱动时，一种或多种引导RNA将Cas9核酸酶共定位至X染色体，其中Cas9核酸酶从X染色体上切去必要基因。然而，由于来自X染色体的必要基因存在于Y染色体上，该受精卵将存活。相反，当具有包含RNA引导的基因驱动的X染色体的***与具有X染色体的野生型***结合时，表达的一种或多种引导RNA与Cas9核酸酶共定位至X染色体，其中Cas9核酸酶从X染色体上切去必要基因。由于必要基因不再存在于***中，***不会存活。

受精卵驱动的适应性益处将根据同胞竞争的程度、后代中的亲代投入、和成人中的交配动态而变化。所有的合子Y-驱动应该产生与竞争性野生型Y染色体至少一样(如果没有更多)的雄性子代，并且这些子代都不必与雌性同胞竞争。与其他驱动类型不同，可通过确保与特定风险相关物种或非靶向亚群的交配无生育力来限制合子Y-驱动的宿主范围。这可通过纳入切割X染色体上的独特序列以消除杂合雄性的引导RNA来完成。

如果能够阻断驱动的突变不在X染色体或常染色体之一上迅速产生，则释放Y-驱动将使当地种群灭绝。该驱动可停止并最终通过释放含有对切割免疫的性染色体的生物体来消除。密切监视和控制可防止完全灭绝。

RNA-引导的核酸酶也可产生侵略性较低的“无生育力雌性子代”Y染色体，其可抑制种群但不像驱动那样扩散(图10A)。靶向雌性生育力而非生存必要的X连锁基因的Y染色体上的Cas9拷贝将消除雌性后代的繁殖潜力，但不会给雄性子代带来优势。由于Cas9活性的较低代价，无生育力雌性子代Y将最终被野生型Y染色体战胜，但是不会在导致严重的种群抑制之前，如果以足够大量导入。该方法与雌性特异性致死密切相关并且正在开发去生育力方法以控制昆虫和鱼类种群，但由于其位于Y上，其构建可能更直接并且在进化上更稳定。

用于种群控制的杂交方法可能将Y-驱动与无生育力雌性子代方法的优点结合(图5A-B)。例如，同时靶向必要基因和雌性生育基因的Y染色体将迅速在种群中快速驱动本身，因为其是Y驱动。然而，其将在遇到随后释放的X染色体上重编码必要基因，而不是雌性生育基因的标准基因驱动后丧失其适应性优势。杂合雌性将长成无生育力的而不是在胚胎期死亡，导致持续抑制而没有灭绝。

与种群控制相关的方法使用RNA-引导的基因驱动来破坏一个或多个基因，其1)为生育或存活所需，但2)一个完整拷贝很大程度上满足该功能。在需要靶基因功能之后的任何时间，这种驱动可能会切割并替换生物体的种系细胞中的靶基因，该生物体在遗传驱动的一个拷贝和野生型基因的一个拷贝。例如，可刚好在减数***之前用RNA引导的基因驱动切割并替换性腺发育和后续生育所需的基因。因为仅遗传一个拷贝的生物体将已经经过正确的性腺发育(由于野生型拷贝满足这一目的)，其通常有正常生育能力。然而，大多数或所有后代将由于刚好在***和/或卵产生之前的驱动拷贝而遗传驱动。这种设计使得驱动在稀少时在种群中扩散，因为大多数交配事件将产生更多遗传一个拷贝驱动和一个拷贝野生型的个体。之后，2个携带驱动的个体之间的交配将产生无生育力的后代，导致种群锐减。这种情形已经被广泛建模，如以下所述：Burt，A.位点特异性自私基因作为天然种群的控制和遗传工程改造的工具(Site-specific selfish genes as tools for the control andgenetic engineering of natural populations).Proc.Biol.Sci.270，921-928(2003).Deredec，A.，Burt，A.和Godfray，H.C.J.在媒介和害虫管理中使用寻靶核酸内切酶基因的种群基因组学(The population genetics of using homing endonuclease genes invector and pest management).Genetics 179，2013-2026(2008).North，A.，Burt，A.&Godfray，H.C.J.对寻靶核酸内切酶基因在蚊子种群中空间扩散的建模(Modelling thespatial spread of a homing endonuclease gene in a mosquito population).J.Appl.Ecol.50，1216-1225(2013)，其各自通过引用全文纳入本文。将基因表达限于种系细胞和/或将时间限于减数***之前的方法是本领域技术人员已知的。

实施例6

应用

本文所述的基因驱动在根除传染性疾病和控制入侵物种中有特别的实用性。这类RNA引导的Cas9基因驱动可用于在受威胁或濒临威胁的物种如两栖动物中快速扩散保护性等位基因。这类RNA引导的Cas9基因驱动也可通过用由驱动携带的外来物种RNAi机制靶向RNA病毒和用Cas9靶向dsRNA病毒来免疫通常用作人类病毒储库的野生种群。疾病媒介可经工程改造而无法获取病原体或可使用本文所述的Y驱动来清除，即，RNA引导的Cas9基因驱动，其抑制X染色体增殖。类似地，可使用Y-驱动局部控制或清除入侵和破坏生态的害虫。可防止家养动物向控制的相关的野生型物种和未驯服种群提供基因以最小化生态破坏并降低对收容和救助机构的需要。类似地，可将转基因作物和动物与它们未经修饰的同族物种在遗传上分离，如濒危物种由较高丰度或入侵亲缘物种的遗传稀释而濒临灭绝那样。最后，基因驱动可用于直接检验关于自然环境中的形态、性别比、以及基因的进化和生态重要性的假设。

本文所述的基因驱动对于通过媒介传播的疾病有特别的实用性。由于媒介传播的传染性疾病的死亡人数是惊人的。仅疟疾每年就杀死650000人，大多数是儿童，同时由于虚弱发烧而影响超过2亿人，对他们的社会造成经济破坏。登革热、黄热病、锥虫病、利什曼病、美洲锥虫病、和莱姆病是由其他使用媒介传播的病原体所引起。所有这些可通过驱动媒介中的阻止传播的变化而减少或甚至清除。科学家已经鉴定到了干扰疟疾(Ito等，Nature2002，PMID：12024215；Dong等，PloS Pathogens 2012，PMID：22216006；Isaacs等，PNAS2012，PMID：22689959)和其他充分研究的疾病(Franz等，PNAS 2006，PMID：16537508)传播的几种候选基因破坏或***基因，但对于许多其他病原体则没有。因此，本发明的方面涉及直接用Y-驱动清除媒介物种。在疟疾的情况中，该策略针对出现的蚊子媒介是特别有希望的，蚊子喜欢在室外叮咬和休息，这些行为对于现有的聚焦于在室内周围喷洒杀虫剂和蚊帐的控制策略而言是高度抗性的。虽然所有的媒介物种必定在给定区域内被靶向以停止传播，但是如果刚空出的生态环境被竞争性的非媒介物种所充满，则将永久性地清除该疾病。很明显，这种策略需要少量或不需要对媒介的分子生物学的理解，但是不可避免地需要局部或可能全球性地消灭媒介物种。

本文所述的基因驱动对于控制入侵物种有特别的实用性。全球经济活动中最有环境危险性的结果之一是入侵生物的运输，其通常导致生态破坏和天然物种灭绝。隔离的生态***，如小岛上的那些是特别脆弱的。Cas9Y-驱动具有通过在单个小岛或者可能整个大陆上控制或者甚至清除这些物种来促进生物多样性的巨大潜力。设计对于入侵物种而言独特的驱动序列、纳入将降解风险近亲的X染色体的引导RNA、并使用形态驱动来赋予靶物种与其近亲的遗传不相容性将该驱动靶向所选物种并且降低跨物种转移的风险，而不直接修饰所有相关物种。可通过释放重编码Y-驱动功能所需位点的物种特异性标准基因驱动来保护相关物种。Y-驱动可从入侵种群扩散回到天然栖息地的风险对于仅通过故意人类活性入侵的物种，如淡水鱼或蔗蟾蜍而言是可忽略的，但是Y-驱动传播对于大鼠和其他入侵的偷渡者而言是几乎是一定的。天然种群总可通过释放X-重编码驱动或者甚至抗性X染色体受保护免于灭绝。例如，低迁移性物种的入侵种群如亚洲鲤鱼是通过Y-驱动直接清除的出色候选物。(图6A)因为基因流动将需要有意的人类引导，局部清除可能是永久性且可实现的，而不用强制重编码天然种群。相反，除非物种完全灭绝，大鼠和其他高迁移性入侵物种不能被永久性地清除。然而，他们可通过定期在天然种群中释放标准重编码驱动和在入侵种群中具有无生育力雌性子代效果的Y-驱动(Y-驱动-SD)来控制(图6B)。

实施例7

农业安全和可持续性

本发明的方面涉及使用本文所述的Cas9方法来控制、减少或清除与农业相关的杂草和害虫。害虫一般是指对人或农业或家畜生产的人类企业有害的植物或动物。术语害虫可包括任何活的生物体，其对植物或动物、人或人类企业、家畜、人结构、野生生态等是入侵性的或众多的、有害的、制造麻烦的、有毒的、有破坏性的。术语害虫也可包括害兽、杂草、植物和动物寄生虫以及病原体。本发明的杂草可以指在特定情况中认为不需要的植物。广义上，杂草可被认为是害虫(植物)。常见的示例是在人类控制的环境，如农场、花园、草坪和公园中不想要的植物。术语“杂草”也可包括在其天然栖息地以外疯狂生长或繁殖，或有入侵性的任意植物。

根据本发明的一个实施方式，可使用Cas9方法来将一种或多种RNA-引导的“敏化驱动”***杂草或害虫的种系细胞的基因组中。敏化驱动是本文所述的基因驱动并且也可称为“敏化基因驱动”。因此，“敏化驱动”是***基因组DNA并被传至后代并赋予后代对外来刺激的敏感性的基因驱动。根据一个方面，RNA-引导的“敏化驱动”通过纳入基因组DNA赋予杂草或害虫对化合物或化学物的有害敏感性，如毒性。通过这种方式，可通过使杂草或害虫接触通常对杂草或害虫无毒的化合物或化学物或条件来控制杂草或害虫的生长和繁殖。通过这种方式，由于将基因驱动***种系细胞并传至后代，已经通过敏化基因驱动改变了杂草或害虫的表型。通过这种方式，杂草或害虫的参考可能是指由在种系细胞中初始***敏化基因驱动并与野生种***配产生的种群。所得的种群可被称为改变的种群或敏化种群或遗传改变的种群。

根据本发明，术语“敏感性”在涉及杂草或害虫时表示对于杂草或害虫所接触的化合物或化学物或条件的有害反应，如毒性。敏化驱动是本文所述的基因驱动，其改变基因组DNA以响应杂草或害虫所接触的化合物、化学物或条件产生有害反应，如毒性。在化学物、化合物或条件由于基因组中存在敏化驱动或毒性驱动而对杂草或害虫而言有毒性的情况下，“敏化驱动”在本文中还可称为“毒性驱动”或“毒性基因驱动”。根据一个方面，向种系生物体外源性地加入敏化驱动或毒性驱动。通过这种方式，敏化基因驱动或毒性基因驱动是外来核酸，虽然，根据某些应用，其可包括对杂草或害虫物种而言天然但在其所引入的种系细胞中不存在的序列。根据一个方面，敏化驱动或毒性驱动是外来核酸，其使用本文所述的RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA外源性地加入种系生物体。

根据一个方面，杂草或害虫可对特定的除草剂或杀虫剂有抗性，或者杂草或害虫可随时间发展出对特定除草剂或杀虫剂的抗性。杂草或害虫相对于除草剂或杀虫剂的进化是农业上的主要问题。本文所述的方法使用RNA引导的“敏化驱动”来赋予生物体对之前对该生物体无毒或低毒性的化学物、化合物或条件的敏感性，使得该生物体的后代将对该化学物、化合物或条件敏感，并且该生物体将死于毒性或繁殖将被减少，或者该生物体将失去生育能力使其无法繁殖。通过这种方式，敏化基因驱动内的核酸序列由该生物体，如杂草或害虫表达，并且核酸的表达改变了生物体的表型，使其对化学物、化合物或条件易感。

根据另一个方面，使用一种或多种敏化驱动来用原始(或非突变)等位基因替换他们的抗性等位基因(如具有抗性突变的那些)以恢复敏感性。因此，已经通过等位基因的突变发展出对除草剂或杀虫剂的抗性的生物体可通过去除具有抗性的突变体形式的等位基因并用具有敏感性的非突变体形式将其替换来赋予对除草剂或杀虫剂的敏感性。通过这种方式，非突变体形式的等位基因对于生物体或生物体种群而言是外来的，因为其包括突变体形式的等位基因。因此，敏化基因驱动可逆转赋予对现有杀虫剂或除草剂的抗性的已知突变。可使用RNA-引导的驱动来逆转已经在生物体种群中扩散的基因组改变。根据这一方面，释放第二驱动可重写由第一驱动产生的一个或所有变化，如本文所述。通过这种方式，通过第一基因驱动和赋予表型如毒性的第一核酸序列来表征生物体种群，其被首先引入种系细胞以在后代中产生该表型并且然后传至后代。然而，通过突变或其他手段，该表型丢失。在这种情况下，具有赋予相同表型的第二核酸序列的第二基因驱动被导入第一核酸去除或未去除的种系细胞中，并且第二核酸序列被携带到后代中。通过这种方式，由第二基因驱动核酸重写第一基因驱动核酸，例如，以通过逆转突变产生的抗性来产生毒性。

根据另一个方面，敏化驱动可携带前药转化酶，其可赋予前药分子对表达该酶的生物体的毒性。通过这种方式，产生酶并且如果该生物体与前药接触，该酶将前药转化成对生物体如杂草或害虫有毒性的化合物或化学物。基于本发明，各种前药/酶的组合对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

根据另一个方面，敏化驱动可将必要基因替换为受特定小分子强烈抑制的形式。因此，基因的表达将受抑制或者基因的表达产物将受抑制。这种抑制可导致生物体死亡或更低的繁殖。因为，在一些实施方式中，敏化驱动在没有其相关分子的情况下将无效-并且在一些情况中反之亦然-它们可以最小的生态风险获得地理和种群抑制程度上非常精细的控制。

根据一个示例性方面，使用敏化驱动来逆转突变使玉米根叶甲抗Bt毒素(参见Gassman等，PNAS，卷111，14期，第5141-5146页，doi：10.1073/pnas.1317179111(2014)，通过引用全文纳入本文)或大乍蓬和藜抗除草剂草甘膦(参见Gaines，T.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.107，1029-1034(2010)和Ge，X.，d’Avignon，D.A.，Ackerman，J.J.和Sammons，R.D.Pest Manag.Sci.66，345-348(2010)，各自通过引用全文纳入本文)，一种现在对环境可持续免耕农业必要的除草剂。根据这一方面，向野生种群中释放具有敏化驱动的生物体，其单个生物体可能有或没有抗性，并且敏化驱动被携带到后代中，结果是降低后代种群的抗性(其中野生种群中存在抗性)并增加后代种群对特定除草剂或杀虫剂的抗性(其中，抗性存在于野生种群中)。应理解野生种群中只有一些成员具有抗性，但是敏化驱动在野生种群的敏感和抗性成员中同时扩散，产生具有敏化驱动的后代种群。根据一个方面，包含一个或多个敏化驱动的生物体将释放到不用除草剂或杀虫剂处理的区域中，从而产生敏化驱动的储库，其可扩散到用除草剂或杀虫剂处理的相邻区域中。

根据一个方面，提供了其中使用一个或多个敏化驱动来对抗导致抗性的突变的方法。根据这一方面，初始或随着后续的时间段向由于一种或多种突变而发展出对杀虫剂或除草剂的抗性的野生种群的基因组中导入这类敏化驱动逆转了一种或多种突变提供抗性的效果并赋予种群杀虫剂毒性或除草剂毒性。这类方法能够无限使用任何给定的除草剂或杀虫剂，因为赋予抗性的突变被阻止或替换，从而“击退(roll back)”可能出现的任何抗性。

根据另一个方面，可通过在其基因组(以及因此其后代)中包含一个或多个敏化驱动来赋予植物或动物对化学物或化合物或条件的易感性，该敏化驱动赋予化学物、化合物或条件对植物或动物，如杂草或害虫的毒性。因此，可被认为对人类安全的化合物可能由于在植物或动物的基因组中包含一个或多个敏化驱动从而赋予化学物或化合物对植物或动物的毒性而对植物或动物是有毒的。根据这一方面，被认为安全和/或有效的现有化合物可针对现在对它们并不易感的生物体施加，如果敏化驱动是将敏化基因从受影响的物种或实验室分离株递送或用敏感基因替换对适应性而言重要的基因。

根据另一个方面，提供了其中使用敏化驱动来赋予害虫种群对分子、化合物或化学物的易感性的方法，该分子、化合物或化学物对其他生命形式无害。而现有的杀虫剂和除草剂-甚至以“有机”命名的那些-根据它们对害虫和杂草的毒性选择，它们通常伤害非害虫物种或者甚至人类，因为受影响的通路在物种间是保守的。根据本发明，提供了其中递送一个或多个赋予生物体对正常无害分子的敏感性的基因的方法。导入敏感基因驱动有效地将该分子转化成对由该驱动修饰的特定害虫或杂草有高度特异性的杀虫剂或除草剂。驱动和分子的组合对生物体是致命的。一个示例性的实施方式是使用酶/前药组合，其中酶导入生物体的基因组并表达。当生物体接触前药时，酶将前药转化成活性除草剂或杀虫剂。证明本发明的这一方面原理的类似候选物是抗病毒或抗癌疗法，其中局部产生的病毒或肿瘤特异性酶活化前药。示例包括胞嘧啶脱氨酶/5-溴尿嘧啶对和硝基还原酶/CB1954对。在敏化驱动的情况中，可通过基因驱动向靶物种递送酶，使前药变成特异性杀虫剂。另一个示例性的对包括经改变受到特定化学物强烈抑制的原代代谢酶。例如，经工程改造的转化酶可能在大多数生物惰性的外源性化学物如三氯蔗糖或相关的卤化多糖的存在下变得没有功能。敏化驱动将用经工程改造的形式替换生物体的天然转化酶基因，赋予其对其他大多数惰性化合物的敏感性。基于本文所述的敏化驱动，本领域技术人员能容易鉴定适用于该目的的可用酶/化学物对。

本领域技术人员能容易鉴定本发明范围内的杂草包括对农作物有害的那些杂草植物。在联邦或州法律中，这类杂草可能或可能不命名为“有害杂草”。例如，大乍蓬和藜被认为是对农作物有害的杂草，但可能不被称为有害杂草。被USDA称为有害杂草的示例性杂草包括以下。

水生

寄生

拉丁名	通用名
		Aeginetia spp.	物种间不同
Alectra spp.	物种间不同
		Cuscuta spp.(天然除外)	菟丝子(Dodders)
Orobanche spp.(天然除外)	内苁蓉(Broomrapes)
		Striga spp.	独脚金(Witchweeds)

陆生

本发明范围内的其他杂草包括榆钱草(Atriplex，Spreading)；毛三叶草(Beggarsticks，Nodding)；旱雀麦(Brome，Downy)；野胡萝卜(Carrot，wild)；洋甘菊(Chamomile，scentless)；繁缕(Chickweed，common)；刺黄瓜(Cucumber，bur)；蒲公英(Dandelion)；加拿大飞蓬(Fleabane，Canada)；播娘蒿(Flixweed)；臭草(Grass，Stink)；画眉草(Grass，Tufted love)；地樱桃(Groundcherry，Smooth)；光叶水苏(Hedge-nettle，Marsh)；水苏(Horse-nettle)；马尾(Horsetail，Field)；刺生菜(Lettuce，Prickly)；三子山靛(Mercury，Three-seeded)；乱子草(Muhly，Wire-stemmed)；稻槎菜(Nipplewort)；小糠草(Redtop)；蒺藜草(Sandbur，Long-spined)；荨麻(Smartweed，Swamp)；一年生苦苣菜(Sow-thistle，Annual)；多年生苦苣菜(Sow-thistle，Perennial)；直立婆婆纳(Speedwell，Corn)；丛生草藤(Vetch，Tufted)；堇菜(Violet，Field)；水麻(Waterhemp，Common)；酢浆草(Wood-sorrel species)；狗牙草(Bermuda grass)；旋花草(Bindweed)；大车前(Broadleaf plantain)；牛蒡(Burdock)；灰菜(Common lambsquarters)；锦葵(Creeping Charlie)；蒲公英(Dandelion)；一枝黄花(Goldenrod)；日本紫菀(JapaneseKnotweed)；野葛(Kudzu)；乳浆草(Leafy spurge)；水飞蓟(Milk thistle)；毒葛(Poisonivy)；豚草(Ragweed)；酸模(Sorrel)；独脚金(Striga)；金丝桃(St John′s wort)；漆树(Sumac)；臭椿(Tree of heaven)；野胡萝卜(Wild carrot)；酢浆草(Wood sorrel)和油莎草(Yellow nutsedge)。

由学名鉴定的其他杂草包括三子山靛(Acalypha rhomboidea Raf.)；麦仙翁(Agrostis gigantea Roth)；苋菜(Amaranthus rudis L.)；滨藜(Atriplex patula L.)；俯垂鬼针草(Bidens cernua L.)；早雀麦(Bromus tectorum L.)；蒺藜草(Cenchruslongispinus Hack.)；小白酒草(Conyza Canadensis)；胡萝卜(Daucus carota L.)；播娘蒿(Descurainia sophia L.)；问荆(Equisetium arvense L.)；画眉种(Eragrostis spp.)；莴苣(Lactuca scariola L.)；欧洲稻槎菜(Lapsana communis L.)；无味母菊(Matricariaperforata Merat.)；乱子草(Muhlenbergia frondosa Poir.)；酢浆草(Oxallis dilleniiJacq)；酸浆(Physalis virginiana Mill.)；蓼(Polygonum coccineum Muhl.)；刺黄瓜(Sicyos angulatus L.)；茄(Solanum carolinense L)；苦荬菜(Sonchus arvensis L.)；苦苣菜(Sonchus oleraceus L.)；沼生水苏(Stachys palustris L.)；繁缕(Stellariamedia)；达边蕨(Taraxacum officinale Weber.)；直立婆婆纳(Veronica avensis L.)；广布野豌豆(Vicia cracca L.)；和耕地堇菜(Viola avensis L)。

应理解本发明范围内的其他杂草可通过本领域技术人员容易获得的来源鉴定。

杂草抗性或发展抗性针对的常用除草剂包括以下。基于本发明，本领域技术人员将能容易地鉴定针对特定杂草物种有毒性的除草剂。

应理解本发明范围内的其他除草剂可通过本领域技术人员容易获得的来源鉴定。

本发明范围内与玉米相关的害虫包括以下。

本发明范围内与棉花相关的害虫包括以下。

本发明范围内与橡树相关的害虫包括以下。

本发明范围内与松树相关的害虫包括以下。

本发明范围内与小谷物相关的害虫包括以下。

本发明范围内与大豆相关的害虫包括以下。

本发明范围内与葡萄相关的害虫包括以下。

本发明范围内与棕榈相关的害虫包括以下。

本发明范围内与茄科植物相关的害虫包括以下。

本发明范围内与核果相关的害虫包括以下。

其他农业害虫包括以下孢囊线虫。

其他农业害虫包括以下外来木材蛀虫或树皮甲虫。

其他农业害虫包括以下软体动物。

其他农业害虫包括以下蛾。

应理解本发明范围内的其他害虫可通过本领域技术人员容易获得的来源鉴定。

本发明范围内的一般常用杀虫剂(害虫可对其有抗性或发展抗性)包括：杀藻剂、抗污剂、抗微生物剂、引诱剂、生物杀虫剂、杀生物剂、消毒剂、杀真菌剂、熏蒸剂、杀昆虫剂、杀螨剂、微生物杀虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、信息素、驱虫剂和灭鼠剂。

以下杀虫剂可用于本发明的范围：草甘膦、莠去津、威百亩、甲氧毒草安-S、乙草胺、二氯丙烯、2，4-D、甲基溴、氯化苦、二甲灵(Pendimenthalin)、乙烯利、百菌清、威百亩钾、毒死蜱、氢氧化铜、硫酸铜、西玛津、氟乐灵、敌稗、代森锰锌、涕灭威(Aldicarb)、乙酰甲胺磷(Acephate)、敌草隆(Diuron)、MCPA、百草枯、二甲噻草胺、甲萘威、MCPP、MSMA、除虫菊酯、马拉息昂、麦草畏、壬酸、磺酰氟、绿草定、对二氯苯、萘、毒死蜱、二溴磷、百治磷、亚胺硫磷、甲拌磷、二嗪农、乐果、甲基谷硫磷、和N，N-二乙基-间-甲苯酰胺(昆虫排斥)。本领域技术人员将易于使用公开的数据库信息来鉴定其他杀虫剂，例如，万维网iaspub.epa.gov/apex/pesticides/f？p＝chemicalsearch：1上可得的注射杀虫剂EPA列表，并参考EPA所编辑并在万维网www.epa.gov/opp00001/pestsales/上可得的的美国农业、家庭和庭院、工业、商业和政府市场部门中最常用的常规杀虫剂活性成分。

基于本发明，本领域技术人员将能容易地鉴定针对特定害虫物种有毒性的杀虫剂。

因此，本发明的方面涉及一种改变生物体的真核种系细胞的方法，包括向该种系细胞导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种引导RNA，并且包含相应的启动子序列和第一侧接序列以及第二侧接序列，并且包含敏化核酸(其表达在该生物体接触化学物、化合物或条件时对该生物体有害)的第一外来核酸序列，其中一种或多种引导RNA与种系细胞的染色体对的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，其中编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码一种或多种引导RNA的核酸序列在第一侧接序列和第二侧接序列之间，其中第一侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表达该第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种RNA，其中RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于基因组DNA的第二染色体和基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且该RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第一染色体并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第二染色体，将第一外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将第一外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第二染色体中，以使该种系细胞对外来核酸序列纯合，并且表达敏化核酸赋予所得生物体对化学物、化合物或条件的敏感性，使得所得的生物体在接触该化学物、化合物或条件时死亡或者无生育力。

根据一个方面，敏化核酸的表达增加了化学物、化合物或条件对生物体的毒性。根据一个方面，种系细胞生长成生物体并且敏化核酸被传至后代以产生包含敏化核酸的生物体种群，其中敏化核酸增加了化学物、化合物或条件对生物体的毒性。根据一个方面，生物体是杂草或害虫。根据一个方面，敏化核酸是替换现有基因的敏化基因。根据一个方面，敏化基因是野生种群中现有突变基因的精确或密码子改变的祖先形式，使得现有的突变形式被祖先形式替换。根据一个方面，现有基因获得了产生对杀虫剂、除草剂或杀真菌剂的抗性的突变。根据一个方面，化学物或化合物是杀虫剂、除草剂或杀真菌剂。根据一个方面，杀虫剂、除草剂或杀真菌剂是以下之一：由Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A或VIP产生的Bt毒素，2，4-D或草甘膦。根据一个方面，敏化基因替换现有基因，生物体存活或繁殖需要该现有基因的功能。根据一个方面，化学物是前药并且敏化基因编码相应的前药-转化酶。根据一个方面，酶/化学物对是胞嘧啶脱氨酶/5-溴尿嘧啶或硝基还原酶/CB1954。

根据本发明的某些方面，提供了控制杂草或害虫种群，包括在杂草或害虫种群的基因组中包含敏感基因驱动，其中该敏感基因驱动使该杂草或害虫种群在化学物、化合物或条件存在时对毒性易感的方法，其包括使杂草或害虫种群接触对于杀死杂草或害虫、降低杂草或害虫的繁殖、或使杂草或害虫无生育力以抑制繁殖而言有效量的化学物、化合物或条件。根据一个方面，化学物或化合物是除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。

根据本发明的某些方面，提供了一种改变包含敏化基因驱动的生物体的真核种系细胞的方法，包括向该种系细胞导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种引导RNA，并且包含相应的启动子序列和第一侧接序列以及第二侧接序列，并且包含第二敏化核酸序列(其表达在该生物体接触化学物、化合物或条件时对该生物体有害)的第二外来核酸序列，其中一种或多种引导RNA与包含第一敏化基因驱动的种系细胞的染色体对的包含第一敏化基因驱动的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，其中编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码一种或多种引导RNA的核酸序列在第一侧接序列和第二侧接序列之间，其中第一侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表达该第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种RNA，其中RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于基因组DNA的第二染色体和基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且该RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第一染色体并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第二染色体，其中第一外来核酸序列被去除，将第二外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将第二外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第二染色体中，以使该种系细胞对第二外来核酸序列纯合，并且表达第二敏化核酸序列赋予所得生物体对化学物、化合物或条件的敏感性，使得所得的生物体在接触该化学物、化合物或条件时死亡或者无生育力。根据一个方面，向野生种群中导入所得生物体，使得所得生物体与野生型生物体的后代包含第二敏化核酸序列。根据一个方面，生物体是杂草或害虫。

根据本发明的某些方面，提供了一种改变包含敏化基因驱动的生物体的真核种系细胞的方法，包括向该种系细胞导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种引导RNA，并且包含相应的启动子序列和第一侧接序列以及第二侧接序列，并且包含第二敏化核酸序列(其表达在该生物体接触化学物、化合物或条件时对该生物体有害)的第二外来核酸序列，其中一种或多种引导RNA与包含第一敏化基因驱动的种系细胞的染色体对的包含第一敏化基因驱动的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，其中编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码一种或多种引导RNA的核酸序列在第一侧接序列和第二侧接序列之间，其中第一侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二侧接序列包含与基因组DNA的第一染色体和第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表达该第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及一种或多种RNA，其中RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于基因组DNA的第二染色体和基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且该RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第一染色体并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割基因组DNA的第二染色体，将第二外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将第二外来核酸序列在切割位点处***基因组DNA的染色体对的第二染色体中，以使该种系细胞对第二外来核酸序列纯合，并且表达第二敏化核酸序列赋予所得生物体对化学物、化合物或条件的敏感性，使得所得的生物体在接触该化学物、化合物或条件时死亡或者无生育力。根据某些方面，向野生种群中导入所得生物体，使得所得生物体与野生型生物体的后代包含第二敏化核酸序列。根据某些方面，生物体是杂草或害虫。

实施例1

质粒和基因组盒

从gBlocks(爱荷华州克拉威尔的集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies)合成基因驱动盒，并如下通过Cas9-介导的基因组修饰***SK1细胞。将各驱动的引导RNA克隆到含p416-Cas9的质粒中，通过SNR52启动子驱动表达。参见DiCarlo，J.E.等，使用CRISPR-Cas***在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行基因组工程改造(Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems)，Nucleic Acids Res.41，4336-4343(2013)。通过PCR向基因驱动盒的2个末端加入针对靶基因座的60个碱基对的同源臂并且用p416-Cas9-gRNA质粒共转染5μg的PCR产物。通过测序验证正确整合的基因驱动并且使用5-氟乳清酸(FOA)选择来固化p416-Cas9-gRNA质粒。

为了产生含URA3的ADE2基因驱动，将ADE2基因驱动克隆到pAG60中紧接白色念珠菌(Candida albicans)URA3。完整的URA3盒和基因驱动经PCR扩增并使用Cas9-介导的基于泥足修饰***单倍体SK1细胞的ADE2基因座。

ABD1基因的重编码C-末端和相应基因驱动按照gBlock合成以去除同源性并且通过同义变化在种子序列中生成突变。在TEF1终止子在重编码ABD1基因的3’端在该基因和gRNA之间***，使得ABD1与VHCl基因共用终止子。使用Cas9-介导的基因组修饰来将完整盒整合到单倍体SK1基因组中。

p416-Cas9-gRNA质粒(赋予尿嘧啶原养型)是之前所述的p414-Cas9-gRNA质粒(赋予色氨酸原养型)的变体(参见DiCarlo，J.E.等，使用CRISPR-Cas***在酿酒酵母中进行基因组工程改造(Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cassystems).Nucleic Acids Res.41，4336-4343(2013))(Addgene#43802)。在各配对实验中使用一个或另一个。将pRS413载体转化到选择细胞系中以赋予组氨酸原养型作为选择二倍体细胞的标志物。菌株表型列于下表1。

表1

实施例2

酵母配对实验

单倍体含驱动SK1酵母和相反配对型的单倍体野生型株在YPAD液体培养基中以等量混合，并孵育过夜。所得的二倍体在无菌水中洗涤并接种到针对2种亲本表型的选择性培养基中。下表2详细显示了具体杂交。

表2

实施例3

孢子形成和四分体裂化

在液体YPAD中配对和在选择平板上选择二倍体之后，将选择平板刮擦到10mL选择性培养基中并在30℃下过夜生长。然后接种到5mL的新鲜YPAD培养物中并且OD＝0.1并且在30℃下生长4-5小时。然后在10mL水中洗涤整个培养物2次，接种到2mL孢子形成培养基(1％乙酸钠)中，并且在室温下孵育3天或直到可看到孢子。形成孢子的细胞在50μL的裂解酶储液(1M山梨醇中50μg/mL)中悬浮，并且在30℃下孵育5分钟，转移到冰上，用150μL冷H₂O稀释，使用蔡司四分体裂化显微镜进行微解剖，并分离的孢子在YPAD平板上生长。

实施例4

URA3功能选择

解剖的孢子在合成完全(SC)培养基上生长，然后在SC培养基以及不含尿嘧啶的SC培养基上点样。为了增强红色，所有用于平板图像的SC固体培养基含0.5X硫酸腺嘌呤(终浓度0.08mM)。

实施例5

定量PCR

涉及候选引物对来扩征针对各驱动有特异性的短区或被驱动替换的野生型序列，以及用作对照的ACT1基因。所有序列都包含在补充信息中。如Looke等，31所述使用方法A来提取基因组DNA。

使用KAPA SYBR FAST qPCR主混合物(2X)和25ng的基因组DNA一起进行qPCR反应。通过分别扩增来自野生型和驱动单倍体的基因组DNA的稀释物来测量各引物对的扩增效率和相对特异性，并且选择最佳实施和良好匹配的对来使用(参见下文所有使用的引物)。在从各亲本单倍体以及从三个独立交配事件中产生的二倍体分离的基因组DNA上进行定量PCR反应。在罗氏公司(Roche)的LightCycler 96机上每个样品进行三次反应(技术重复)。

实施例6

计算

来自三个技术重复的结构针对计算取平均。为了直接计算PCR扩增之前等位基因比率，首先确定了不同引物对的效率。从对连续稀释物(6个数量级)的qPCR轮次来计算效率：

效率＝10^-1/斜率

R²值在除了一对(ade2：：URA3+sgRNA)以外的所有情况中都高于0.99。

计算等位基因比率：

x_a.E_a ^Ct，a＝x_b.E_b ^Ct，b

x_a/x_b＝E_b ^Ct，b/E_a ^Ct，a

x_a和x_b是驱动和野生型DNA的初始浓度，

E_a和E_b是相应引物对的效率，并且

Ct，a和Ct，b是各样品的Ct值。

实施例7

酵母中CRISPR/Cas9基因驱动的效率

为了直接测量酵母中CRISPR/Cas9基因驱动的效率，使用在缺少ADE2基因的功能性拷贝的酵母中构成的红色来开发***。参见Chamberlain，N.，Cutts，N.S.和Rainbow，C.酵母形成染料和芳胺(The formation of pigment and arylamine bv yeasts).J.Gen.Microbiol.7，54-60(1952)。如图13A所示，如果红色ADE2^-单倍体与米色野生型单倍体交配，所得的杂合二倍体遗传了一个功能拷贝并且因此是米色的。当这些二倍体经过减数***并通过形成孢子繁殖时，一半的所得单倍体遗传了断裂拷贝并因此是红色的；另一半遗传了完整拷贝并且是米色的(图13A)。

如图13B所示，如果红色单倍体编码切割并替换从野生型亲本中遗传的完整ADE2基因座的功能性基因驱动，则它们的二倍体后代将是红色的。因为这些红色二倍体将具有2个ADE2的断裂拷贝，它们所有形成孢子的单倍体后代将遗传断裂拷贝并且最终也将是红色的。因此，可通过简单地接种二倍体并计算红色的比例来评价靶向并替换ADE2的基因驱动的切割效率。

制备了靶向ADE2的基因驱动构建体。为了防止基因驱动意外逃逸到野外，Cas9和引导RNA分开以避免产生自身充分的遗传偏移盒。因此，构建体编码靶向ADE2的引导RNA，同时从附加体质粒中提供Cas9。在存在或不存在质粒的情况下，红色单倍体与相反配对型的野生型酵母交配，并接种在针对二倍体选择的培养基上。如图13C所示，在质粒存在下，几乎所有的集落都是红色的，表明对从野生型亲本遗传的ADE2拷贝的切割是非常高效的。在没有Cas9的情况中，没有观察到红色二倍体集落，证明了该驱动仅可在提供其的实验室酵母种群中扩散。

为了衍生来自野生型亲本的ADE2等位基因丢失，交配的二倍体形成孢子并且检验了它们所得的单倍体后代。如图13D所示，在解剖18cas9+质粒后，观察到红色∶米色单倍体的完美4∶0比率，确认ADE2基因座的所有拷贝都被破坏。相反，18个米色cas9-二倍体产生2∶2的红色∶米色比率，表明灭活的驱动和野生型等位基因的正常遗传。

为了证明红色二倍体中ADE2破坏是否由通过同源重组的驱动元件的成功拷贝所致，对来自解剖的cas9+二倍体的72个单倍体进行测序。所有测序的集落含有完整的驱动而没有其他突变，表明驱动移动是高效的并且以高保真率发生。

ADE2基因驱动如图14A所示进行修饰以含有顺式URA3等位基因，其使得实验室修饰的酵母株在没有尿嘧啶补充的情况下生长。测试了该驱动元件在拷贝到靶基因座中时“携带”相关货物元件的基因驱动稳定性。含URA3驱动的二倍体与野生型二倍体在存在附加体Cas9质粒的情况下交配，二倍体经选择(其全部为红色)并形成孢子，并且18个四分体裂化。如原始ADE2基因驱动的情况那样，所有形成孢子的单倍体细胞形成红色集落。如图14B所示，当重复接种到尿嘧啶缺陷型培养基上时全都正常生长，表明该驱动高效拷贝URA3货物元件。

靶向并重编码必要基因的基因驱动甚至在大种群中可避免驱动抗性，因为修饰靶位点的错误倾向修复事件将导致死亡。可类似地编辑非必要但仍然重要的基因，因为由NHEJ事件产生的体变体将仍然比驱动本身适应度低。为了测试驱动***期间的必要基因重编码，构建了图14C所示的靶向ABD1的第三基因驱动。参见Mao，X.，Schwer，B.和Shuman，S.酿酒酵母ABD1基因的突变分析：帽甲基转移酶对细胞生长是必要的(Mutational analysisof the Saccharomyces cerevisiae ABD 1gene：cap methyltransferase activity isessential for cell growth)，Mol.Cell.Biol.16，475-480(1996)。

在靶向天然ABD1编码序列的引导RNA上游的重编码ABD1等位基因的单倍体株在Cas9存在下与野生型细胞交配。选择二倍体，它们中的18个形成孢子。对72个隔离体进行测序。全部都含有重编码ABD1基因座和引导RNA，从而证明基于必要基因重编码的基因驱动。

将基因驱动从实验室株中拷贝到天然酿酒酵母株的不同群中。含ADE2驱动单倍体与6个***发生和表型多样性的单倍体酿酒酵母野生型株交配。参见Liti，G.等，家养和野生酵母的种群基因组(Population genomics of domestic and wild yeasts)，Nature458，337-341(2009)。也可参见图15A。为了对各杂交的基因驱动拷贝的效率进行定量测量，使用针对驱动特异的一组引物和设计扩增野生型或NHEJ-破坏等位基因的另一组引物来进行定量PCR。如使用BoxPlot生成的图15B所示(参见Spitzer，M.，Wildenhain，J.，Rappsilber，J.和Tyers，M.BoxPlotR：生成盒图的网络工具(a web tool for generationof box plots).Nat.Methods 11，121-122(2014))，无论哪种野生型亲本，含ADE2基因驱动的二倍体染色体的比例超过99％，证明在多样性背景中使用驱动。添加URA3货物基因没有明显改变这种效率。ABD1驱动以相等的速率拷贝。

研究了驱动在后续拷贝事件中的稳定性。如图15B所示，第一轮ADE2基因驱动二倍体的几个单倍体后代与含Cas9-表达质粒的野生型单倍体交配。所有第二代基因驱动构建体以相同的效率偏移遗传，证明有性繁殖种群中在多代中的持续扩散能力。

提供了以下基因组修饰引物和gBlock序列。

Claims

1.一种改变生物体的真核种系细胞的方法，包括

向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，

其中，所述一种或多种引导RNA与所述种系细胞的染色体对的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述一种或多种引导RNA的核酸序列在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，

其中，所述第一侧接序列包含与所述基因组DNA的第一染色体或第二染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与所述基因组DNA的第一染色体或第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，

表达所述第一外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于所述基因组DNA的第二染色体和所述基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第一染色体，并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第二染色体，

将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第二染色体中，以赋予所述种系细胞对所述外来核酸序列的纯合性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶产生双链断裂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引导的DNA结合蛋白是Cas9。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶产生单链断裂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引导的DNA结合蛋白是Cas9缺刻酶。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个靶位置在必要基因内，并且所述外来核酸序列相邻地***并替换所述必要基因的部分。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过同源重组来***所述第一外来核酸。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种系细胞是真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，RNA包含约10至约250个核苷酸。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，RNA包含约20至约100个核苷酸。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶与相关引导RNA共定位于多个相关靶位置处，以在多个切割位点处切割第一染色体或第二染色体。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述多个切割位点处的切割去除了通过同源重组被第一外来核酸序列替换的DNA序列。

13.如权利要求1所述的方法，还包括使所述种系细胞生长成生物体的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，还包括使所述生物体与相同物种的野生型生物体交配以产生包含带有第一外来核酸序列的染色体对的第一染色体的后代种系细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，由所述后代种系细胞表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于染色体对的第二染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述靶位置处切割第二染色体，并且，

将所述第一外来核酸序列在所述切割位点处***染色体对的第二染色体中以赋予所述后代种系细胞对外来核酸序列的纯合性。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，重复使种系细胞生长成生物体并将所述生物体与相同物种的野生型生物体交配的步骤以产生相同物种的对第一外来核酸序列纯合的生物体的种群。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一外来核酸序列包含一个或多个选择的基因序列。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一外来核酸序列包含一个或多个选择的基因序列并且所述一个或多个选择的基因序列在生物体的种群内的生物体的基因组内。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，将改变的生物体导入生物体种群中，并且改变的生物体的基因组中包含编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并包含相应的启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第二外来核酸序列，

其中，所述一种或多种引导RNA与所述第一外来核酸序列上的一个或多个靶位置互补，并且其中所述第一侧接序列包含与所述第一外来核酸序列上的靶位置的第一部分相同的第一序列，并且其中所述第二侧接序列包含与所述第一外来核酸序列的靶位置的第二部分相同的第二序列，

其中，所述改变的生物体与生物体种群的成员交配以产生包含第二外来核酸序列和第一外来核酸序列的后代种系细胞，

其中，所述后代种系细胞表达所述第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述第一外来核酸序列上的相关靶位置，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述靶位置处切割第一染色体，并且，

其中，将所述第二外来核酸序列在切割位点处***所述种系细胞的基因组中以赋予后代种系细胞对所述第二外来核酸序列的纯合性。

20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，将改变的野生型生物体导入在基因组DNA的一个或多个靶位置上改变的种群中，使得所述一种或多种引导RNA与所述一个或多个靶位置不互补，并且防止其与所述一个或多个靶位置结合，使得所述第一外来核酸序列不进入所述改变的野生型生物体的基因组。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，通过表达第二外来核酸序列来改变所述改变的野生型生物体，所述第二外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，其共定位于第一外来核酸序列，以切割位点特异性的方式切割第一外来核酸序列，产生重编码的等位基因。

22.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第二外来核酸序列，

其中，所述一种或多种引导RNA与由所述第一外来核酸序列改变的所述一个或多个靶位置互补，

表达所述第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述靶位置处切割所述基因组DNA的染色体，以去除所述第一外来核酸序列，并且

将所述第二外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体中。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第二外来核酸序列包含与所述第一外来核酸序列不同的遗传修饰。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第二外来核酸序列包含经所述第一外来核酸序列修饰的所述染色体的野生型序列。

25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个靶位置在必要蛋白-编码基因内，并且所述外来核酸序列被***所述必要基因中，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留，但是所述基因的核苷酸序列被改变，使得一种或多种引导RNA与所述一个或多个靶位置不互补。

26.一种改变真核种系细胞的方法，包括

向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的外来核酸序列，

其中，所述第一侧接序列包含与所述基因组DNA的第一染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与所述基因组DNA的第一染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，

表达所述外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述靶位置处切割所述基因组DNA的第一染色体，

将所述外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第一染色体中，

表达***的外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的第二染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述靶位置处切割所述基因组DNA，

将所述外来核酸序列在所述切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第二染色体中以赋予所述种系细胞对所述外来核酸序列的纯合性。

27.一种使物种的两个种群不能产生存活后代的方法，包括

改变所述物种的第一种群以包含第一外来核酸序列，所述第一外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种第一引导RNA，并且包含相应的启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列，其中一种或多种第一引导RNA与必要基因上的一个或多个靶位置互补，并且所述必要基因的核苷酸序列已经改变，使得所述一种或多种引导RNA与所述一个或多个靶位置不互补，但是编码的必要蛋白的氨基酸序列被保留，

改变所述物种的第二种群以包含第二外来核酸序列，所述第二外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种第二引导RNA，并且包含相应的启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列，其中一种或多种第二引导RNA与必要基因上的与所述一种或多种第一引导RNA的靶位置不同的一个或多个靶位置互补，并且所述必要基因的核苷酸序列已经改变，使得所述一种或多种第二引导RNA与所述一个或多个靶位置不互补，但是编码的必要蛋白的氨基酸序列被保留，

使所述第一种群与所述第二种***配以产生种系细胞，其中表达所述第一外来核酸序列以切割来自第二亲本的必要基因，并且表达所述第二外来核酸以切割来自第一亲本的必要基因。

28.一种替换在靶核酸序列中有突变的真核种系细胞中的等位基因的方法，包括

向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，

其中，所述多个引导RNA与和等位基因上的突变相邻的染色体的基因组DNA上的多个靶位置互补，其中所述突变防止相应的引导RNA与基因组DNA结合，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述多种引导RNA的核酸序列在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，

其中，所述第一侧接序列包含与所述基因组DNA的染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与所述基因组DNA的染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，

表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在多个靶位置处切割基因组DNA的第一染色体，以去除包含所述突变的基因组DNA的部分，并目

将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体中。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，靶位置中的至少一个位于对生物体的适应性而言重要的基因，如必要基因中，使得去除所有靶位置的缺失事件是高度有害的，并且将通过自然选择从种群中去除。

30.一种在多个基因处改变生物体的真核种系细胞的方法，包括

向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，以及对应于多个基因的一种或多种其他外来核酸序列，

其中，所述多种引导RNA包含一种或多种基因特异性引导RNA，其与所述种系细胞的染色体的基因组DNA中的多个基因上的一个或多个靶位置互补，

其中，所述第一侧接序列包含与所述基因组DNA的染色体上的靶位置之一的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与所述基因组DNA的染色体上的相同靶位置的第二部分相同的第二序列，

其中，所述一个或多个核酸序列各自含有对应于其余靶位置的第一部分和第二部分的第一侧接序列和第二侧接序列，

表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在多个基因处切割所述基因组DNA的第一染色体，并且

31.如权利要求30所述的方法，其还包括向所述种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第二外来核酸序列，

其中，所述多种引导RNA与由所述第一外来核酸序列改变的所述多个靶位置互补，

表达所述第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和多种引导RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述相关靶位置处切割所述基因组DNA的染色体，以去除所述第一外来核酸序列，并且

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二外来核酸序列包含与所述第一外来核酸序列不同的遗传修饰。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二外来核酸序列包含经所述第一外来核酸序列修饰的所述染色体的野生型序列。

34.一种使两个种群不能互相产生后代的方法，包括

向所述第一种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第一组引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，

其中，所述第一组引导RNA与染色体的基因组DNA上的第一组靶位置互补，

其中，所述第一组靶位置位于必要蛋白-编码基因内，并且将所述第一外来核酸序列***必要基因，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留，但是所述基因的核苷酸序列被改变，使得所述第一组引导RNA与一个或多个靶位置不互补。

其中编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码第一组引导RNA的核酸序列和保留必要蛋白的氨基酸序列的第一外来核酸序列在所述第一侧接序列和第二侧接序列之间，

表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第一组引导RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的第一组相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在第一组靶位置处切割基因组DNA的第一染色体，以去除必要基因内的基因组DNA的部分，并且

将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体中，并且

向所述第二种系细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第二组引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第二外来核酸序列，

其中，所述第二组引导RNA与染色体的基因组DNA上的第二组靶位置互补，

其中，所述第二组靶位置处于与所述第一组靶位置所处相同的必要蛋白-编码基因内，但与第一组靶位置中的任何一个均不同，并且将所述第二外来核酸序列***所述必要基因，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留但是所述基因的核苷酸序列被改变，使得所述第二组引导RNA与所述第二组靶位置不互补，

其中编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码第二组引导RNA的核酸序列和保留必要蛋白的氨基酸序列的第二外来核酸序列在所述第一侧接序列和第二侧接序列之间，

表达所述第二外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第二组引导RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于所述基因组DNA的染色体上的第二组相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在第二组靶位置处切割基因组DNA的第一染色体，以去除必要基因内的基因组DNA的部分，并且

将所述第二外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体中，

其中，从第一种系细胞和第二种系细胞产生的生物体的多个成熟后代不会存活，其中第一组引导RNA导致RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述第二外来核酸序列内的第一组靶位置，并且所述第二组引导RNA导致RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述第一外来核酸序列内的第二组靶位置。

35.一种从***细胞仅产生Y染色体***的方法，包括

向所述***细胞中导入编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，

其中，所述一种或引导RNA与所述***细胞的X染色体上的一个或多个靶位置以及所述***细胞的Y染色体上的一个或多个靶位置互补，

其中，所述第一侧接序列包含与Y染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与Y染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，

表达所述第一外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及与所述***细胞的X染色体上的一个或多个靶位置和所述***细胞的Y染色体上的一个或多个靶位置互补的一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与Y染色体上的靶位置互补的相关引导RNA共定位于Y染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割Y染色体，

将所述第一外来核酸序列在切割位点处***Y染色体中，并且

其中，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与X染色体上的靶位置互补的相关引导RNA共定位于X染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割X染色体，以使所述X染色体无用。

36.一种从***细胞仅产生Y染色体***的方法，包括

使用相应启动子序列从位于Y染色体上的序列表达RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，

其中，所述一种或多种引导RNA与所述***细胞的X染色体上的一个或多个靶位置互补，

其中，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与X染色体上的一个或多个靶位置互补的相关引导RNA共定位于X染色体上的一个或多个相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述一个或多个靶位置处切割X染色体以使所述X染色体无用。

37.一种从***细胞仅产生X染色体***的方法，包括

使用相应启动子序列从位于X染色体上的序列表达RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，

其中，所述一种或多种引导RNA与所述***细胞的Y染色体上的一个或多个靶位置互补，

其中，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与Y染色体上的一个或多个靶位置互补的相关引导RNA共定位于Y染色体上的一个或多个相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述一个或多个靶位置处切割Y染色体以使所述Y染色体无用。

38.一种从***细胞仅产生含Y染色体***的方法，包括

修饰Y染色体以编码第一外来核酸序列和第二外来核酸序列，

其中，所述第一外来核酸序列编码第一RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第一组引导RNA以及相应启动子序列，

其中，所述第二外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第二组引导RNA，以及相应启动子序列与第一侧接序列和第二侧接序列，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的第二核酸序列与编码第二组引导RNA的核酸序列在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，

其中，所述第一RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶无法识别所述第二组引导RNA并且所述第二RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶无法识别所述第一组引导RNA，

其中，所述第一组引导RNA与非性染色体的染色体的基因组DNA上的多个靶位置互补，

其中，在减数***之前，在种系中表达所述第一外来核酸序列以产生第一RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第一组RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于基因组DNA的染色体上的第一组相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在第一组靶位置处切割基因组DNA的染色体，使得细胞修复机制将第二外来核酸序列从Y染色体拷贝到基因组DNA的染色体上，

其中在减数***前或减数***期间表达位于基因组DNA的染色体上的第二外来核酸序列的拷贝，以产生第二RNA引导的DNA结合蛋白和第二组引导RNA，

其中，所述第二RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与X染色体上的一个或多个靶位置互补的第二组引导RNA共定位于X染色体上的一个或多个相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述一个或多个靶位置处切割X染色体，以使所述X染色体无用。

39.一种从***细胞仅产生含X染色体***的方法，包括

修饰X染色体以编码第一外来核酸序列和第二外来核酸序列，

其中，在减数***之前，在种系中表达所述第一外来核酸序列以产生第一RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第一组RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关引导RNA共定位于基因组DNA的染色体上的第一组相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在第一组靶位置处切割基因组DNA的染色体，使得细胞修复机制将第二外来核酸序列从X染色体拷贝到基因组DNA的染色体上，

其中，所述第二RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与Y染色体上的一个或多个靶位置互补的第二组引导RNA共定位于Y染色体上的一个或多个相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在所述一个或多个靶位置处切割Y染色体，以使所述Y染色体无用。

40.一种用修饰的X染色体产生雌性后代排除雄性后代的方法，所述X染色体具有编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与***的Y染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA以及与***的X染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，与第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，在***中表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与Y染色体上的一个或多个靶核酸序列以及X染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，其中编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述一种或多种引导RNA的核酸序列在所述第一侧接序列和第二侧接序列之间，其中所述第一侧接序列包含与基因组DNA的X染色体上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中所述第二侧接序列包含与基因组DNA的X染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表达所述第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与Y染色体上的一个或多个靶核酸序列以及X染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，其中将具有Y染色体的野生型***与含修饰的X染色体的***结合导致将所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶与靶向Y染色体的一种或多种引导RNA共定位于Y染色体上的一个或多个靶核酸序列，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割Y染色体使***不能后续发育成雄性生物体，并且

将具有X染色体的野生型***与含有修饰的X染色体的***结合导致将所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种引导RNA共定位至X染色体上的一个或多个靶核酸序列，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述X染色体并且将所述第一外来核酸序列***所述X染色体。

41.一种用修饰的Y染色体产生雄性后代排除雌性后代的方法，所述Y染色体具有编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与位于发育必要的基因内的X染色体上的一种或多种靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，并且包含相应的启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的第一外来核酸序列，其中所述第一侧接序列包含与X染色体上的必要基因的第一部分相同的第一序列，其中所述第二侧接序列包含与X染色体上的必要基因的第二部分相同的第二序列，并且修饰的Y染色体还包含编码X染色体上的必要基因的第二核酸序列，其经改变使得由所述一种或多种引导RNA识别的一个或多个靶位置与一个或多个引导RNA识别的序列不互补，使得具有野生型X染色体的***与具有修饰的Y染色体的***结合导致表达所述第一外来核酸序列，产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与X染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，将所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种引导RNA共定位至X染色体上的一个或多个靶核酸序列，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割X染色体以去除必要基因并向其中***第一核酸序列，产生由于Y染色体上必要基因的额外拷贝而保留活力的修饰的X染色体，并且

将具有野生型X染色体的***与具有修饰的X染色体的***结合，导致表达第一外来核酸序列以产生RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与X染色体上的一个或多个靶核酸序列互补的一种或多种引导RNA，将所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种引导RNA共定位于X染色体上的一个或多个靶核酸序列，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割X染色体以去除必要基因并将所述第一外来核酸序列***X染色体，其中受精卵因此缺少必要X染色体基因。

42.一种生成有生育力雄性和无生育力雌性的方法，其中修改权利要求41所述的方法使X染色体上的必要基因仅对生育而言必要，使缺少该基因的生物体无生育力。

43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述第一核酸序列还含有第三侧接序列和第四侧接序列，其中所述第三侧接序列包含与生育力必要基因的第一部分相同的第三序列，其中所述第四侧接序列包含与生育力必要基因的第二部分相同的第四序列，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶位于所述第三侧接序列和所述第四侧接序列之间，并且所述第一核酸序列还含有与位于生育力必要基因内的一个或多个靶序列互补的第二组引导RNA，表达所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第二组引导RNA，将所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种引导RNA共定位至生育力必要基因内的一个或多个靶核酸序列，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述生育力必要基因并且向其中***所述第一核酸序列。

44.一种进行受控种群抑制的方法，其中将权利要求43所述的Y染色体释放到待抑制的种群中并且将权利要求30所述的RNA引导基因驱动释放到待保护的种群中，所述RNA引导的基因驱动改变了被权利要求43所述的Y染色体靶向的生育力必要基因内的一个或多个靶序列，使得它们与权利要求43所述的Y染色体所采用的引导RNA不互补但是所述基因编码的蛋白质保留相同氨基酸序列，使得Y染色体在待抑制的种群中仅产生雄性子代并且在与已经被在待保护的群中释放的RNA引导基因驱动修饰的雌***配后产生有生育力的雄性子代和无生育力的雌性子代。

45.一种进行靶向种群抑制或灭绝的方法，包括向待抑制或灭绝的种群中释放权利要求44所述的Y染色体。

46.一种进行靶向种群抑制或灭绝的方法，包括向靶向种群中释放性别偏移染色体。

47.一种阻断基因从经工程改造的生物体流向相同物种的野生型生物体的方法，包括首先修饰野生型生物体的基因组使得对应于来自基因中间的那些的序列***所述基因的野生型拷贝远端的另一个染色体区，所述基因必须以2个功能性拷贝存在以使生物体存活并被称为必要基因，并且随后

向经工程改造的生物体的种系导入第一外来核酸序列，所述第一外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列和第三侧接序列和第四侧接序列，以及编码与所述必要基因相同的蛋白质但不使用相同核酸序列并且在下文中称为重编码的必要基因的序列，

其中，所述一种或多种引导RNA与***染色体的远端区的一个或多个靶位置互补，并且也与所述必要基因内的序列互补，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述一种或多种引导RNA的核酸序列以及第三侧接序列和第四侧接序列以及重编码的必要基因在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，

其中，所述第一侧接序列包含与染色体的远端区的靶位置的第一部分相同的第一序列，

其中，所述第二侧接序列包含与染色体的远端区的靶位置的第二部分相同的第二序列，

其中，所述第三侧接序列包含与所述必要基因的第三部分相同的第三序列，

其中，所述第四侧接序列包含与所述必要基因的第四部分相同的第四序列，

表达所述第一外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及与所述染色体远端区中的一个或多个靶位置和所述必要基因内的一个或多个靶位置互补的一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与靶位置互补的相关引导RNA共定位至染色体远端区的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在染色体远端区中切割靶序列，

将所述第一外来核酸序列***所述染色体远端区中，

其中，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与靶位置互补的相关引导RNA共定位至野生型必要基因中的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式切割所述野生型必要基因，

在第三侧接区和第四侧接区之间将序列***所述必要基因的野生型拷贝中，从而破坏其功能，使得

经工程改造的生物体在染色体的远端区中有2个重编码拷贝的必要基因并且没有野生型必要基因的功能性拷贝，并且将经工程改造的生物体与野生型生物体杂交导致破坏所述必要基因的野生型拷贝而不将重编码必要基因的其他拷贝***所述染色体远端区。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述必要基因位于X染色体上并且不需要2个拷贝来提供活力，并且所述远端区也位于X染色体上，并且对所述生物体的第一修饰也修饰Y染色体，使得下文中称为雄性必要基因的雄性生育力或活力所需基因以保留编码的雄性必要蛋白的氨基酸序列的方式在其核酸序列上重编码，并且将非功能性的另一拷贝的雄性必要基因相邻***雄性必要基因的重编码拷贝，并且所述第一核酸序列还包含第五侧接序列，所述第五侧接序列包含与所述雄性必要基因的第五部分相同的第五序列，并且所述第一核酸序列还包含第六侧接序列，所述第六侧接序列包含与所述雄性必要基因的第六部分相同的第六序列，并且所述第一核酸序列还包含对应于野生型雄性必要基因内的经重编码以赋予基因非功能性的序列的第二组引导RNA，并且编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列和编码所述引导RNA的核酸序列以及第三侧接序列和第四侧接序列以及重编码的必要基因在所述第五侧接序列和所述第六侧接序列之间，所述第五侧接序列和所述第六侧接序列在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，具有2个修饰的X染色体的雌性与具有修饰的Y染色体的雄***配产生活的雄性后代，因为所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶并不切割重编码或非功能雄性必要基因并且修饰的Y染色体不切割修饰的X染色体上的必要基因，并且来自具有2个修饰的X染色体的雌性的***由具有野生型Y染色体的***受精，导致所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割野生型雄性必要基因并且在第五侧接序列和第六侧接序列之间的位置上拷贝所述序列并产生无生育力或不能存活的雄性，并且由具有修饰的Y染色体的***受精的来自野生型雌性的***导致所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述必要基因并且产生不能存活的雄性后代，共同包含修饰的和野生型X染色体的***和卵的结合导致所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶切割所述野生型必要基因而不拷贝所述重编码的必要基因，产生具有一个修饰的X染色体和一个破坏的X染色体的杂合雌性后代，并且这些杂合雌性与野生型雄***配产生不能存活或无生育力的雄性或杂合雌性，并且杂合雌性和含有修饰的Y染色体的雄性的一半雄性后代存活。

49.一种阻断基因从含有独特遗传多样性的亚群流向其余的野生种群的方法，包括释放权利要求30所述的RNA引导的基因驱动，所述基因驱动仅能在第一侧接序列和第二侧接序列之间的靶位置上含有独特多样性的种群中传播，其还将靶位点***染色体的远端区，其中所述RNA引导的基因驱动编码第一和第二侧接序列用于将所述RNA引导的基因驱动***所述独特多样性区并且其编码第三和第四侧接序列用于将靶位点***远端区，并且随后

释放已经通过将第二外来核酸序列导入第一次修饰的生物体的种系中进行二次修饰的生物体，所述第二外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和第二组引导RNA以及第三组引导RNA，并且包含相应启动子序列和第五侧接序列和第六侧接序列和第七侧接序列和第八侧接序列和第九侧接序列和第十侧接序列以及编码与必要基因相同的蛋白质但不采用相同核酸序列并在下文中称为重编码的必要基因的序列，

其中，所述第二组引导RNA与***染色体的远端区的第一组靶位置互补，并且也与所述必要基因内的序列互补，

其中，所述第三组引导RNA与在第一核酸序列内独特发现的一组靶序列互补，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述一种或多种引导RNA的核酸序列以及第七侧接序列和第八侧接序列和第九侧接序列和第十侧接序列以及重编码的必要基因在所述第五侧接序列和所述第六侧接序列之间，

其中，所述第五侧接序列包含与染色体的远端区的靶位置的第五部分相同的第五序列，

其中，所述第六侧接序列包含与染色体的远端区的靶位置的第六部分相同的第六序列，

其中，所述第七侧接序列包含与所述必要基因的第七部分相同的第七序列，

其中，所述第八侧接序列包含与所述必要基因的第八部分相同的第八序列，

其中，所述第九侧接序列包含与第一侧接序列的第九部分相同的第九序列，

其中，所述第十侧接序列包含与第二侧接序列的第十部分相同的第十序列，

表达所述第二外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以及与所述染色体远端区中的第二组靶位置和所述必要基因内的第二组靶位置互补的第二组RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与靶位置互补的相关引导RNA共定位至染色体远端区的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在染色体远端区中切割靶序列，

将所述第一外来核酸序列***所述染色体远端区中，

在第七侧接区和第八侧接区之间将序列***所述必要基因的野生型拷贝中，从而破坏其功能，

表达与独特地位于所述第一核酸序列内的序列互补的第三组引导RNA，

其中，所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和与第一核酸序列内的序列互补的相关引导RNA共定位于所述第一核酸序列内的靶序列，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式切割所述第一核酸序列内的靶序列，

用第九侧接区和第十侧接区之间的序列替换所述第一核酸序列，使得

经工程改造的生物体在染色体的远端区中没有第一核酸序列的拷贝并且有必要基因的2个重编码拷贝并且没有野生型必要基因的功能性拷贝，并且将经工程改造的生物体与野生型生物体杂交导致破坏所述必要基因的野生型拷贝而不将重编码的必要基因的其他拷贝***所述染色体远端区。

50.一种种系细胞，包含：

编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列的外来核酸序列，

其中，所述一种或多种引导RNA对所述种系细胞的染色体对的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，

其中，所述第二侧接序列包含与所述基因组DNA的第一染色体或第二染色体上的靶位置的第二部分相同的第二序列。

51.一种改变生物体的真核种系细胞的方法，包括

将第一外来核酸序列导入所述种系细胞，所述第一外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列，并且包含敏化核酸，所述敏化核酸的表达在生物体接触化学物、化合物或条件时对所述生物体是有害的，

将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将所述第一外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第二染色体中，以赋予所述种系细胞对所述外来核酸序列的纯合性，并且

表达赋予所得生物体对所述化学物、化合物或条件敏感性的敏化核酸，使得所得生物体在接触所述化学物、化合物或条件时死亡或者无生育力。

52.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述敏化核酸的表达增加了所述化学物、化合物或条件对所述生物体的毒性。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，使所述种系细胞生长成生物体，并且将所述敏化核酸传至后代，以产生包含所述敏化核酸的生物体种群，并且其中所述敏化核酸增加了所述化学物、化合物或条件对所述生物体的毒性。

54.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述生物体是杂草或害虫。

55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述敏化核酸是替换现有基因的敏化基因。

56.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述敏化基因是野生种群中现有突变基因的精确或密码子改变的祖先形式，使得现有的突变形式被祖先形式替换。

57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述现有基因获得了对杀虫剂、除草剂或杀真菌剂产生抗性的突变。

58.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述化学物或化合物是杀虫剂、除草剂或杀真菌剂。

59.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述杀虫剂、除草剂或杀真菌剂是以下之一：由Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A或VIP产生的Bt毒素、2，4-D或草甘膦。

60.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述敏化基因替换现有基因，所述现有基因的功能是生物体存活或繁殖所需的。

61.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述化学物是前药并且所述敏化基因编码相应的前药-转化酶。

62.如权利要求62所述的方法，其特征在于，酶/化学物对是胞嘧啶脱氨酶/5-溴尿嘧啶或硝基还原酶/CB1954。

63.一种控制杂草或害虫种群的方法，所述杂草或害虫种群的基因组中包含敏感基因驱动，其中所述敏感基因驱动在化学物、化合物或条件存在时赋予所述杂草或害虫种群对毒性的易感性，所述方法包括

使所述杂草或害虫种群接触有效量的所述化学物、化合物或条件以杀死所述杂草或害虫、降低所述杂草或害虫的繁殖或者使所述杂草或害虫无生育力以抑制繁殖。

64.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述化学物或化合物是除草剂，或杀虫剂或杀真菌剂。

65.一种改变包含第一敏化基因驱动的生物体的真核种系细胞的方法，包括

将第二外来核酸序列导入所述种系细胞，所述第二外来核酸序列编码RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和一种或多种引导RNA，并且包含相应启动子序列以及第一侧接序列和第二侧接序列，并且包含第二敏化核酸序列，所述第二敏化核酸序列的表达在生物体接触化学物、化合物或条件时对所述生物体是有害的，

其中，所述一种或多种引导RNA对所述包含第一敏化基因驱动的种系细胞的染色体对的包含第一敏化基因驱动的第一染色体和第二染色体的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补，

其中，编码所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶的核酸序列与编码所述所述第二外来核酸序列的一种或多种引导RNA的核酸序列在所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间，

表达所述第二外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于所述基因组DNA的第二染色体和所述基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第一染色体，并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第二染色体，其中去除所述第一外来核酸序列，

将所述第二外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第一染色体中，并且将所述第二外来核酸序列在切割位点处***所述基因组DNA的染色体对的第二染色体中以赋予所述种系细胞对所述第二外来核酸序列的纯合性，并且

表达赋予所得生物体对所述化学物、化合物或条件敏感性的第二敏化核酸序列，使得所得生物体在接触所述化学物、化合物或条件时死亡或者无生育力。

66.如权利要求66所述的方法，其特征在于，向野生种群中导入所得生物体，使得所得生物体与野生型生物体的后代包含所述第二敏化核酸序列。

67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述生物体是杂草或害虫。

68.一种改变包含第一敏化基因驱动的生物体的真核种系细胞的方法，包括

表达所述第二外来核酸序列以产生所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和所述一种或多种RNA，其中所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶和相关的引导RNA共定位于所述基因组DNA的第二染色体和所述基因组DNA的第一染色体上的相关靶位置，并且所述RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第一染色体，并且以切割位点特异性的方式在靶位置处切割所述基因组DNA的第二染色体，

69.如权利要求69所述的方法，其特征在于，向野生种群中导入所得生物体，使得所得生物体与野生型生物体的后代包含所述第二敏化核酸序列。

70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物体是杂草或害虫。

71.一种改变生物体的真核种系细胞的方法，包括

其中，所述生物体需要被外来核酸序列切割并替换的位于所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间的序列的至少一个拷贝来存活或产生活的后代，

在发育阶段进行上述表达和***步骤，在所述阶段中，生物体不再需要被外来核酸序列切割并替换的以产生遗传负荷的位于所述第一侧接序列和所述第二侧接序列之间的序列来存活或产生有生育力的后代。

72.一种按照前述任一项权利要求进行靶向种群抑制或灭绝的方法，其包括向所述靶向种群中释放RNA引导的遗传负荷驱动。