CN108285892A - 一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用 - Google Patents

一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，包括一个稳定表达dCas9‑VP64融合蛋白的宿主细胞，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4‑gRNA。本发明还提供了上述细胞模型的构建方法：以稳定表达转录激活的效应分子dCas9‑VP64融合蛋白的HEK293细胞为宿主细胞，筛选有效的KCNA4特异性引导序列KCNA4‑gRNA，将有效KCNA4‑gRNA序列包装成病毒，感染宿主细胞并筛选阳性克隆，通过在KCNA4启动子区域转录激活内源性人KCNA4基因，增加其蛋白Kv1.4表达，得到稳定表达人内源性Ito，s的细胞模型。

Description

一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与 应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种体外高通量药物筛选的细胞模型，具体 来说是一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型及建立方法与应用。
背景技术
离子通道是细胞膜上的孔道蛋白，是细胞生物电的基础。在离子通道中，钾 离子通道是目前发现的亚型最多、功能最复杂的一类离子通道。电压依赖性钾通 道(Kv)是钾离子通道超家族的重要成员，在调节动作电位阈值、形状、持续时 间和频率及心肌细胞兴奋性、维持心肌细胞正常生理功能中起关键作用。Kv1.4 属于电压依赖性钾通道，广泛分布于哺乳动物的可兴奋组织中(如心脏和大脑)， 编码瞬时外向钾电流(Ito)。
瞬时外向钾电流参与心肌细胞动作电位的复极1期。研究表明，Ito的密度 及其通道动力学特征的改变与多种心脏疾病的发生密切相关，如J波综合征、心 肌梗死、心力衰竭、心房颤动、心肌肥厚等。目前发现的Ito主要有Ito(fast， f)和Ito(slow，s)两种，Ito，f主要由Kv4.2和Kv4.3通道编码，激活快， 失活也快，主要分布于心外膜，Ito，s主要由Kv1.4编码，其失活和恢复均相 对较慢，主要分布于心内膜，Kv1.4表达增加可引起心肌肥大和心力衰竭，因此 深入研究Ito,s通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治 提供新线索。
电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是 否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。利用膜片钳技术记录透过离子通道的 离子电流来反映细胞膜上离子通道的分子活动，能够很好的研究细胞表面离子通 道的作用，广泛应用于药物化合物的筛选。HEK293细胞是来源于人胚肾细胞的 细胞系，其转染效率高，胞体大，广泛应用于细胞电生理的研究。
目前利用人源性细胞进行药物的高通量筛选存在以下问题：1)人的组织样 本来源困难、个体差异大；2)人源性的原代细胞难于维持培养；3)建系的人源 性过表达离子通道蛋白的细胞系，没有经过内源性的基因剪接，缺乏内源性的“转 录-翻译”过程；4)外源过表达质粒形成的通道电流变异度高，无法进行高通量 筛选。因此，需要建立体外稳定表达的人内源性细胞模型，助力药物的稳定高效 筛选。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种稳定表达人内源性 Ito，s电流的细胞模型及建立方法与应用，所述的这种稳定表达人内源性Ito， s电流的细胞模型及建立方法与应用要解决现有技术中难以利用人源性细胞进 行高通量筛选药物的技术问题。
本发明提供了一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，包括一个稳 定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，编码所述dCas9-VP64融合蛋白的基因 序列如SEQ IDNO.1所示，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序 列KCNA4-gRNA，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序 列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述的宿主细胞为HEK293细胞。
本发明还提供了上述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构 建方法，先构建gRNA通用载体，然后再构建KCNA4靶向gRNA载体；筛选含有有 效KCNA4-gRNA序列的载体，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列 KCNA4-gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示；将有效的KCNA4-gRNA载体包装成 慢病毒；将上述的慢病毒感染已稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞并筛 选阳性克隆，编码所述的dCas9-VP64融合蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示， 获得稳定表达人内源性KCNA4的细胞模型。
进一步的，首先构建稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，其方法为： 将dCas9-VP64序列构建到载体上，然后包装成慢病毒，感染HEK293细胞，最后 筛选阳性克隆，即得稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞。
进一步的，建立稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株的步骤包括：
(1)全基因合成dCas9-VP64基因序列，所述的dCas9-VP64基因序列如SEQ ID NO.1所示，将dCas9-VP64序列***到pLVX-Puro载体的Xho I和EcoR I 之间，构建pLVX-dCas9-VP64-Puro载体；
(2)将pLVX-dCas9-VP64-Puro载体包装成慢病毒；
(3)使用慢病毒感染HEK293细胞，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆。
进一步的，所述载体为pLVX-Puro、慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91和慢病毒 包装质粒pCMV-VSV-G。
进一步的，将KCNA4-gRNA连接到载体上的步骤包括：
(1)全基因合成gRNA通用载体序列，所述的gRNA通用载体序列如SEQ ID NO.4所示，将所述的gRNA通用载体序列***到pLVX-shRNA2载体的BamHI 和EcoRI之间，构建pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体；
(2)将候选的KCNA4-gRNA序列***到pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体， 所述的KCNA4-gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示；获得 pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体。
进一步的，将包含有效KCNA4-gRNA序列的载体包装成慢病毒，感染 HEK293-dCas9-VP64宿主细胞的步骤包括：
1)将pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体包装成慢病毒；
2)使用慢病毒感染HEK293-dCas9-VP64宿主细胞，并用绿色荧光蛋白 Zsgreen1筛选出阳性克隆。
本发明还提供了上述的稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型在体外药 物高通量筛选中的应用。
进一步的，所述药物包括治疗心律失常的药物。
本发明的核心在于一种激活人内源性基因KCNA4的表达，激活内源性KCNA4 后，该细胞能够产生Ito,s电流，它有利于药物的高效筛选。
本发明以稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞为宿主细胞，筛选 有效的KCNA4基因的引导序列，激活内源性KCNA4mRNA的表达，增加Kv1.4蛋 白表达，从而产生Ito,s电流。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过将转录激活的效 应分子dCas9-VP64和KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA共同转到HEK293 细胞中，在KCNA4启动子区域转录激活内源性人KCNA4基因，增加Kv1.4蛋白表 达，产生Ito，s电流，在缺乏内源性Ito，s的细胞中激活内源性KCNA4基因表 达从而产生Ito，s电流，为进行体外药物筛选带来了许多便利。
本发明在HEK293-dCas9-VP64细胞株基础上，利用慢病毒感染有效的 KCNA4-gRNA在HEK293细胞中稳定的产生Ito，s电流，建立了体外稳定表达KCNA4 的细胞模型，成功建立了人源性细胞的筛选平台，有利于临床药物筛选。
本发明通过建立gRNA通用载体，为引入其他特异性引导RNA，建立其他基 因的内源性表达提供了基础。
本发明通过检测Zsgreen1绿色荧光，能够快速、高效地筛选内源性激活的 阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的 时间和人力。
附图说明
图1是dCas9-VP64载体和KCNA4-gRNA载体的构建及作用方式。
图2是guide RNA通用载体的构建示意图。
图3是dCas9-VP64/KCNA4-gRNA共转后KCNA4mRNA和蛋白的表达。
图4是dCas9-VP64/KCNA4-gRNA共转后其他离子通道的表达。
图5是手动膜片钳在HEK293细胞上记录到的Ito,s的原始电流图。
图6是手动膜片钳记录到的Ito,s通道的电流-电压关系曲线。
具体实施方式
为了对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图详述描 述如下：
实施例1构建稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株
(一)dCas9-VP64载体构建
1.全基因合成dCas9-VP64(如SEQ ID NO.1所示)，使用重组酶法连接到pLVX-Puro载体的Xho I和EcoR I之间；采用的引物如下：
Forward：
ctaccggactcagatctcgagatgaaaaggccggcggcc(如SEQ ID NO.2所示)
Reverse：
gtaccgtcgactgcagaattctcacagcatgtccaggtcga(如SEQ ID NO.3所示)
2.在50μl的反应体系中，37℃，用Xho I和EcoR I双酶切载体pLVX-Puro， 跑胶纯化。
3.在20μl的反应体系中，37℃，用同源重组酶(II One StepCloning Kit，Vazyme)把dCas9-VP64连接到载体pLVX-Puro上。
4.连接产物转化到DH5α感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB培养基 平板上，37℃培养14h后，挑单克隆进行扩增并测序，挑选阳性克隆。
(二)慢病毒包装及细胞株构建
1.慢病毒包装：
病毒包装采用慢病毒三质粒包装***，由慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91、 pCMV-VSV-G和慢病毒载体pLVX-dCas9-VP64-Puro构成。
(1)质粒的纯化：
将pLVX-dCas9-VP64-Puro和慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G等 3个质粒分别转化到高效感受态细胞中，涂板后37℃培养箱培养16h。挑单个 菌落于含5ml LB培养液的试管中震荡培养8h，鉴定后，接种200μl菌液于 含250ml LB培养液的锥形瓶中震荡培养12h，待OD600值达到0.6时，严格 按照MACHEREY-NAGEL公司试剂盒(NucleoBond XtraMidi，50preps)步骤纯 化质粒。
(2)病毒包装
(a)细胞培养：将293T细胞以1×105cells/ml的密度传代于100mm的培 养皿中，用含10％FBS的DMEM培养液、37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，使其 生长到80％以上汇合度时备用。
(b)包装：将3个质粒pLVX-dCas9-VP64-Puro(20μg)、pCMV-dR8.91(10μ g)、pCMV-VSV-G(5μg)和500μl无血清无双抗的DMEM于1.5ml EP管中混合 均匀，室温静止5min。将500μl质粒混合溶液加到500μl脂质体混合液中， 并轻轻混合均匀，室温孵育20min。将最终的混合液加到8ml无血清无双抗的 DMEM培养液中，混合均匀，再加到细胞汇合度为80％的细胞培养皿中(100mm 培养皿)，37℃、5％CO2培养箱中培养6h，加入1ml血清孵育过夜。第二天除 去培养液，换成10％血清，1％双抗的DMEM培养液，48h收集病毒。将收集的上 清3500r/min离心10min，去除细胞碎片，0.45μm滤器过滤后，再将上清 以26000rpm 4℃离心2h，然后用100μl的PBS重悬，分装后-80℃冷冻保存。
2.细胞株构建
(1)转染前一天，将HEK293细胞消化，计数，以3×105细胞/孔的数量，铺6 孔板，以DMEM+10％FBS培养过夜。
(2)取(二)1.(2)中已包装完成的dCas9-VP64慢病毒，以MOI 100加入HEK293 细胞，37℃过夜培养。
(3)转染12h后对细胞进行换液，转染48h后，将细胞消化，全部转移至100 mm培养皿，用DMEM+10％FBS培养基培养，加入嘌呤霉素进行筛选。
(4)扩增培养，获得稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株 (HEK293-dCas9-VP64细胞株)。
(5)Western Blot验证细胞株
(a)蛋白提取：取90％汇合度的HEK293-dCas9-VP64稳转细胞，吸干含有10％FBS的DMEM培养液，PBS洗两遍；将培养皿置于冰上，向皿内加入已含有PI(Roche) 的RIPA(中)(碧云天生物)裂解混合液250μl,以刮勺刮下所有细胞，转移 至1.5ml EP管中充分震荡，冰上静置15min；13000g 4℃离心15min，吸取上 清转置另一1.5ml EP管中。
(b)蛋白电泳：BCA法测蛋白定量(碧云天)后，以每个上样孔50μg蛋白为 标准，根据测定的蛋白浓度，加入适当上样缓冲液配平。95℃蛋白变性5min。 向预制胶(NuPAGETM10％Bis-Tris Protein Gels,1.5mm,10-well，Invitrogen) 中小心加入样品及蛋白Marker，以120V电压70min电泳。电泳结束后，恒压 100V转膜90min。
(c)蛋白检测：转膜结束后，取出PVDF膜，以4％BSA封闭40min，分别用一 抗anti-Cas9(1:1000)(26758-1-AP，Proteintech)和anti-GAPDH(1:1000) (60004-1-Ig，Proteintech)敷浴，4℃过夜。次日，以二抗Anti-Rabbit和 Anti-Mouse(DyLight 800-Labeled，KPL)敷浴40min后，用Odyssey显影仪曝 光。在170KD处，出现明显条带可检测到dCas9-VP64融合蛋白，证明 HEK293-dCas9-VP64稳转细胞株构建成功。
实施例2
通过特异性KCNA4-gRNA序列引导效应蛋白dCas9-VP64至KCNA4基因启动子 区域，激活内源性KCNA4mRNA转录，增加Kv1.4蛋白表达，从而增强HEK293 细胞中Ito,s的电流(图1)。
(一)质粒载体构建
1.gRNA通用载体构建
为了便于***有效的gRNA片段，构建gRNA通用载体(如图2所示)。
(1)全基因合成通用载体序列片段(如SEQ ID NO.4所示)，
其中，U6promoter序列为：
tttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacga；
EcoRI位点为：gaattc；
Sequence for cloning sgRNA序列为235～241位点的aacaccg、248、249、 256位点的ga、t；
BsmBI酶切位点：gagacg、cgtctc；
在SEQ ID NO.4所示序列中，其中正体下划线部分为同源重组序列，下划线斜 体部分为BsmB I酶切位点，斜体字部分为gRNAscaffold支架序列)。
(2)在50μl的反应体系中，37℃，用BamH I和EcoR I双酶切载体pLVX-shRNA2， 跑胶纯化。
(3)在20μl的反应体系中，37℃，用同源重组酶(ClonExpress II One StepCloning Kit，Vazyme)把通用载体序列连接到载体pLVX-shRNA2的BamH I和 EcoR I之间(图2)。
(4)连接产物转化到DH5α感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB培养 基平板上，37℃14h后，挑单克隆进行菌落PCR，20μl的反应体系，94℃变 性，58℃退火，72℃延伸，30个循环；鉴定，并测序阳性克隆。
(5)大抽gRNA通用载体pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1。
2.候选KCNA4-gRNA载体的构建
(1)在人源性KCNA4基因启动子区域选择3个gRNA序列(表1)。
表1.所用KCNA4-Guide RNA序列
(2)针对每条gRNA序列，合成2条单链oligo DNA，序列如下：
Guide1：
forward-CACCGCTGGAATCGATCCCAGATCC，(如SEQ ID NO.8所示)
Reverse-AAACGGATCTGGGATCGATTCCAGC；(如SEQ ID NO.9所示)
Guide2：
forward-CACCGGGGAGTCGGGGGGCCCAGCC，(如SEQ ID NO.10所示)
reverseAAACGGCTGGGCCCCCCGACTCCCC(如SEQ ID NO.11所示)
Guide3：
forward-CACCGTCTTTGGCTGTGGTCCCCAC(如SEQ ID NO.12所示)
reverse-AAACGTGGGGACCACAGCCAAAGAC；(如SEQ ID NO.13所示)
(3)将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA。退火反应条件如下： 20μl反应体系，上述引物正链\负链(10μM)各取10μl混合，95℃30s； 72℃2min；37℃2min；25℃2min。
(4)在50μl的反应体系中，55℃3h，用BsmB I酶切载体 pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1，跑胶纯化。
(5)将杂交后的双链DNA进行T4DNA Ligase连接反应，反应体系如下：
(6)连接产物转化到DH5α感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB培养 基平板上，37℃培养14h后，挑单克隆进行菌落PCR：20μl的反应体系，94℃ 变性，58℃退火，72℃延伸，30个循环；鉴定，并测序阳性克隆。
3.有效KCNA4-gRNA的确定
(1)细胞培养：将HEK293细胞以1×105cells/ml的密度传代于6-well的培 养皿中，用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养液、37℃、5％CO2培养箱中培 养过夜，使其生长到70％-90％汇合度时备用。
(2)采用Lipofectamine 3000脂质体转染(LipofectamineTM3000，ThermoFisher)，将构建的3个KCNA4-gRNA质粒分别与pLVX-dCas9-VP64-Puro质粒共 转于HEK293细胞中：将5μl的Lipofectamine 3000加入含有100μl的 Opti-MEM(GIBCO公司，美国)的EP管中，轻轻混匀,稀释备用；
将两个质粒pLVX-dCas9-VP64-Puro(0.8μg)和 pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1(1.6μg)加入含有100μl的Opti-MEM的EP 管中，在混合液中加入5μl的P3000，轻轻混匀；将上述液体混合，室温静置 孵育20min；将上述混合液缓慢滴入含有1.5ml 10％FBS的DMEM培养基的细 胞中。8～12h后更换新的含有10％FBS的DMEM培养液。
(3)实时荧光定量PCR分析：
(a)转染48h后裂解细胞提取总RNA，取1500ng RNA于37℃15min，85℃5 s的PCR条件下逆转录成cDNA，4℃备用。
(b)在384孔板中，冰上加入5μl 2×SYBR Green MasterMix(SYBR Green I及TaqMan Assay，TOYOBO)、1μl上述cDNA，加入2μl上下游引物混合液 (终浓度0.4μM)，用ddH2O补齐至10μl。95℃解链，60℃退火，40个循 环。
(c)采用引物hKCNA4引物检测KCNA4的mRNA含量(表2)。通过qPCR检测， 获得最有效的KCNA4-gRNA序列(图3)。
表2.所用RT-PCR引物(如SEQ ID NO.14～33所示)所示)
(4)Western Blot验证Kv1.4的蛋白表达：
(a)蛋白提取：转染48h后吸干含有10％FBS的DMEM培养液，PBS洗两遍； 将培养皿置于冰上，向皿内加入已含有PI(Roche)的RIPA(中)(碧云天生物) 裂解混合液250μl,以刮勺刮下所有细胞，转移至1.5ml EP管中充分震荡， 冰上静置15min；13000g 4℃离心15min，吸取上清转置另一1.5ml EP管 中。
(b)BCA法测蛋白浓度(碧云天)：按照BCA蛋白浓度测定试剂盒配置蛋白测 定液和标准品，每个样本三次重复取平均值，用酶标仪读取吸光值。根据标准品 的吸光值制定蛋白浓度/吸光值标准曲线，依次计算各样本的蛋白浓度。
(c)以每个上样孔50μg蛋白为标准，根据测定的蛋白浓度，加入适当上样缓 冲液配平。95℃蛋白变性5min。
(d)蛋白电泳：向预制胶(NuPAGE 10％Bis-Tris Protein Gels,1.5mm,10-well，Invitrogen)中小心加入样品及蛋白Marker，以120V电压70min电泳。
(e)转膜：电泳结束后，取出凝胶。取事先准备好的滤纸两张，润湿备用；PVDF 膜1张，甲醇浸泡活化；将凝胶、膜与滤纸以滤纸-膜-凝胶-滤纸的顺序叠放好， 置入转膜槽中，恒压100V转膜90min。
(f)封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，以4％BSA封闭40min备用。
(g)分别用一抗anti-Kv1.4(1:1000，19697-1-AP，Proteintech)和anti-GAPDH(1:1000，60004-1-Ig，Proteintech)敷浴，4℃过夜。
(h)次日，回收一抗，以二抗Anti-Rabbit(072-07-15-06，DyLightTM 800-Labeled，KPL)和Anti-Mouse(072-07-18-06,DyLightTM 800-Labeled，KPL) 敷浴40min后，用Odyssey显影仪曝光，显示Kv1.4的表达含量。
4.dCas9-VP64/KCNA4-gRNA质粒共转激活内源性KCNA4基因特异性的确定
(1)设计各离子通道引物(表2)。
(2)选择图3中最有效的KCNA4-gRNA序列，与dCas9-VP64共转HEK293细胞(LipofectamineTM3000，Thermo Fisher)。提取总RNA并逆转录成cDNA；以实 时荧光定量PCR检测cDNA中上述各离子通道的表达量。结果显示，除KCNA4外， 其余各离子通道的表达量均无明显升高(图4)。
(二)慢病毒包装及细胞株构建
1.慢病毒包装：
病毒包装采用慢病毒三质粒包装***，由慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91、 pCMV-VSV-G和慢病毒载体pLVX-KCNA4-gRNA-Zsgreen1构成。
(1)质粒的纯化：
将pLVX-KCNA4-gRNA-Zsgreen1和慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91和 pCMV-VSV-G等3个质粒分别转化到高效感受态细胞中，涂板后37℃培养箱培养 16h。挑单个菌落于含5mlLB培养液的试管中震荡培养8h，鉴定后，接种200 μl菌液于含250ml LB培养液的锥形瓶中震荡培养12h，待OD600值达到0.6 时，严格按照MACHEREY-NAGEL公司试剂盒(NucleoBondXtra Midi，50preps) 步骤纯化质粒。
(2)病毒包装
(a)细胞培养：将293T细胞以1×105cells/ml的密度传代于100mm的培 养皿中，用含10％FBS的DMEM培养液、37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，使其 生长到80％以上汇合度时备用。
(b)包装：将3个质粒pLVX-KCNA4-gRNA-Zsgreen1(20μg)、pCMV-dR8.91(10 μg)、pCMV-VSV-G(5μg)和500μl无血清无双抗的DMEM于1.5ml EP管中 混合均匀，室温静止5min。将500μl质粒混合溶液逐滴加到500μl脂质体 混合液中，并轻轻混合均匀，室温孵育20min。将最终的混合液逐滴加到8ml 无血清无双抗的DMEM培养液中，混合均匀，再加到细胞汇合度为80％的细胞培 养皿中(100mm培养皿)，37℃、5％CO2培养箱中培养6h，加入1ml血清孵育过夜。第二天除去培养液，换成10％血清，1％双抗的DMEM培养液，48h收集 病毒。将收集的上清3500r/min离心10min，去除细胞碎片，0.45μm滤器 过滤后，再将上清以26000rpm 4℃离心2h，然后用100μl的PBS重悬，分 装后-80℃冷冻保存。
2.细胞株构建
(1)采用实施例1中成功构建的dCas9-VP64稳定表达的细胞株 (HEK293-dCas9-VP64细胞)：建立此细胞株是利用慢病毒将dCas9-VP64*** 到HEK293细胞基因组中，能够稳定传代，表达dCas9-VP64融合蛋白。
(2)在dCas9-VP64稳定表达的细胞株基础上，感染pLVX-KCNA4-gRNA-Zsgreen1 病毒，建立稳定表达dCas9-VP64/KCNA4-gRNA的细胞株，方法如下：
(a)转染前一天，将HEK293细胞消化，计数，以3×105细胞/孔的数量，铺6 孔板，以DMEM+10％FBS培养过夜。
(b)取pLVX-KCNA4-gRNA-Zsgreen1慢病毒，以MOI 100加入HEK293-dCas9-VP64 细胞，37℃过夜培养。
(c)转染12h后对细胞进行换液，转染48h后，采用有限稀释法对细胞进行 扩增培养。
(d)利用绿色荧光对细胞进行筛选，选取发出明亮绿色荧光的细胞进行电生理 检测(见下描述)。
(三)细胞株功能验证
电生理检测
电生理检测采用手动全细胞膜片钳(电压钳)的方法，在室温下进行。实验 仪器采用HEKA PATCHMASTER全细胞膜片钳技术记录来自稳定表达 dCas9-VP64/KCNA4-gRNA的HEK293细胞的电压激活Ito通道。拉制的玻璃电极 填充电极内液，细胞孵育在电极外液中，温度约22℃，电极入液后的阻值应达 到2-8MΩ。
其中，细胞外液包含(mmol/l)140NaCl,4KCl,2CaCl2,1MgCl2和10 HEPES(NaOH调pH7.4)。细胞内液包含(mmol/l)110KCl,31KOH,10EDTA, 5.17CaCl2,1.42MgCl2,4MgATP和10HEPES,(KOH调pH 7.2)。细胞完成 封接后的阻值稳定应达到GΩ以上。电压门控的Kv1.4通道采用的细胞钳制电压 为-70mV，从-40mV～+70mV，每次间隔增加10mV，时间为600ms，记录电 流(图5)，并制作I-V曲线(图6)。
通过电生理实验，获得能产生Ito电流信号的HEK293细胞株。
序列表
<110> 上海市东方医院
<120> 一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用
<141> 2018-01-25
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa ggacaagaag 60
tacagcatcg gcctggccat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120
tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 180
aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240
aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300
atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360
ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420
gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480
agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540
cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600
ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660
ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat 720
ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780
agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840
cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900
cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960
atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 1020
tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080
gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140
ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200
ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260
ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320
cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380
accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440
atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500
ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560
gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620
accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680
aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg 1740
aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800
gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860
gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920
ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980
gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040
aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100
tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160
aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220
gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280
gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340
agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400
gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460
cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520
gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccacat cgtgcctcag 2580
agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caaggcccgg 2640
ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700
cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760
agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820
cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880
gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940
gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 3000
cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060
gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120
agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180
tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240
acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300
aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360
ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420
gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480
gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540
gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600
aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660
gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720
gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780
ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 3840
tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900
gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 3960
caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020
aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080
gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140
ctgggaggcg acagcgctgg aggaggtgga agcggaggag gaggaagcgg aggaggaggt 4200
agcggaccta agaaaaagag gaaggtggcg gccgctggat ccggacgggc tgacgcattg 4260
gacgattttg atctggatat gctgggaagt gacgccctcg atgattttga ccttgacatg 4320
cttggttcgg atgcccttga tgactttgac ctcgacatgc tcggcagtga cgcccttgat 4380
gatttcgacc tggacatgct gtga 4404
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaccggact cagatctcga gatgaaaagg ccggcggcc 39
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaccgtcga ctgcagaatt ctcacagcat gtccaggtcg a 41
<210> 4
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga 60
attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 120
tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 180
gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 240
ggagacggac gtctctgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 300
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttga attc 344
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctggaatcga tcccagatcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagtcggg gggcccagcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctttggctg tggtccccac 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccgctgga atcgatccca gatcc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacggatct gggatcgatt ccagc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccggggag tcggggggcc cagcc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacggctgg gccccccgac tcccc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccgtcttt ggctgtggtc cccac 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaacgtgggg accacagcca aagac 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cattgtgtcc gtcctggtca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagttctcca gatggggtgc 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cacgcgttca ctttccttc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catcagccag cttcttcaca 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgattccaac gccaccaatt c 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaggagtcca taggcgatta ct 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgtgcctca gaattgggct 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcaccatgtc accataccct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tctgctttta tcccgggcag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgcagtgcga tttcaggtct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tccgaggtca acagcttcac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgggcattc atccgtgaca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
attcttcggc ttcttcaccc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctcttgccag gcatcggact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtcaatgcca acgaggaggt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcagagccag agccgaagat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgggctccgt ggtcttcatc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gactcgttca ccgcgtcctt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcgagatccc tccaaaatca 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atggttcaca cccatgacga 20

Claims (10)

1.一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型，其特征在于：包括一个稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，编码所述dCas9-VP64融合蛋白的基因序列如SEQ IDNO.1所示，在所述的宿主细胞中含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型，其特征在于：所述的宿主细胞为HEK293细胞。
3.权利要求1所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：先构建gRNA通用载体，然后再构建KCNA4靶向gRNA载体；筛选含有有效KCNA4-gRNA序列的载体，所述的含有KCNA4基因特异性的引导序列KCNA4-gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示；将有效的KCNA4-gRNA载体包装成慢病毒；将上述的慢病毒感染已稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞并筛选阳性克隆，编码所述的dCas9-VP64融合蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，获得稳定表达人内源性KCNA4的细胞模型。
4.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：首先构建稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞，其方法为：将dCas9-VP64序列构建到载体上，然后包装成慢病毒，感染HEK293细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：建立稳定表达dCas9-VP64融合蛋白的HEK293细胞株的步骤包括：
(1)全基因合成dCas9-VP64基因序列，所述的dCas9-VP64基因序列如SEQ ID NO.1所示，将dCas9-VP64序列***到pLVX-Puro载体的Xho I和EcoR I之间，构建pLVX-dCas9-VP64-Puro载体；
(2)将pLVX-dCas9-VP64-Puro载体包装成慢病毒；
(3)使用慢病毒感染HEK293细胞，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆。
6.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：所述载体为pLVX-Puro、慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91和慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G。
7.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：将KCNA4-gRNA连接到载体上的步骤包括：
(1)全基因合成gRNA通用载体序列，所述的gRNA通用载体序列如SEQ ID NO.4所示，将所述的gRNA通用载体序列***到pLVX-shRNA2载体的BamHI和EcoRI之间，构建pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体；
(2)将候选的KCNA4-gRNA序列***到pLVX-U6-BsmBI-gRNA-Zsgreen1载体，所述的KCNA4-gRNA的基因序列如SEQ ID NO.5所示；获得pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体。
8.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型的构建方法，其特征在于：将包含有效KCNA4-gRNA序列的载体包装成慢病毒，感染宿主细胞的步骤包括：
(1)将pLVX-U6-KCNA4-gRNA-Zsgreen1载体包装成慢病毒；
(2)使用慢病毒感染宿主细胞，并用绿色荧光蛋白Zsgreen1筛选出阳性克隆。
9.权利要求1所述的稳定表达人内源性Ito，s电流的细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗心律失常的药物。
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