BR112016015958B1

BR112016015958B1 - Métodos para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano, não vegetal e para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano em uma pluralidade de genes

Info

Publication number: BR112016015958B1
Application number: BR112016015958-6A
Authority: BR
Inventors: Kevin M. Esvelt; Andrea L. Smidler
Original assignee: President And Fellows Of Harvard College
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2024-04-16

Abstract

DRIVES DE GENES GUIADOS PELO RNA. São divulgados drives de gene Caso guiados pelo RNA e método para o uso dos mesmos.

Description

DADOS DE PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

[001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente U.S. Provisório No. 61/924.735, depositado em 8 de janeiro de 2014 e ao Pedido de Patente U.S. Provisório No. 62/024.642, depositado em 15 de julho de 2014 dos quais cada um é incorporado aqui como referência em sua totalidade para todas as finalidades.

FUNDAMENTO

[002] Os drives de genes (gene drives) são geralmente conhecidos como elementos genéticos que desviam vantagens naturais em seu favor de serem herdados e passados a diante pela progênie. Os exemplos incluem genes de endonucleases residentes que se copiam nos cromossomos que não possuem os mesmos, deturpadores da segregação que destroem cromossomos competidores durante a meiose, transposons que inserem cópias deles mesmos em outro lugar no genoma, elementos Medea que eliminam irmãos que competem que não os herdam e micro-organismos que podem ser herdados pela mãe tal como Wolbachia que induzem incompatibilidade citoplasmática para favorecer o espalhamento de indivíduos infectados. Devido ao fato de que evitam as regras normais de seleção natural, todos estes elementos foram considerados como sistemas de “drive de gene” potenciais capazes de espalhar modificações engenheiradas através de populações de vetor de inseto para bloquear o espalhamento de doença. Os drives de genes baseados em endonucleases residentes foram propostos como um meio de controle geneticamente de populações de mosquito da malária. Ver Windbichler e outros, Nature, doi:10.1038/nature09937 (2011). Genes “egoístas” específicos ao sítio foram propostos como ferramentas para o controle e a engenharia genética de populações naturais. Ver Burt, Proc. R. Soc. Lond. B (2003) 270, 921-928 (2003). Entretanto, tais drives de genes propostos são limitados em relação à especificidade a seu sítio ou à dificuldade de expressão em vários organismos. Existe, portanto, uma necessidade de desenvolver drives de genes que podem se direcionar a qualquer gene desejado e podem ser utilizados através de um amplo espectro de organismos.

SUMÁRIO

[003] Os aspectos da presente divulgação são direcionados aos drives de genes guiados pelo RNA e em particular, uma sequência de ácido nucleico estranha que é estavelmente introduzida em uma célula de linhagem germinativa de um organismo desejado. O termo a sequência de ácido nucleico estranha que é descrita aqui e o termo drive de gene guiado pelo RNA podem ser utilizados de forma intercambiável aqui. Um organismo transgênico resultante pode ser desenvolvido partindo da célula de linhagem germinativa. O organismo transgênico resultante pode então ser introduzido em uma população do tipo selvagem e através do cruzamento pelo organismo transgênico com um organismo do tipo selvagem, a sequência de ácido nucleico estranha é transferida para a prole ou a progênie resultante. Como um resultado, os métodos da presente divulgação são direcionados para a produção de uma população de organismos transgênicos que possuem características desejadas partindo de um organismo transgênico inicial e um organismo do tipo selvagem. Quando o organismo transgênico for introduzido em uma população do tipo selvagem e for cruzado com um organismo do tipo selvagem, a progênie resultante pode ser referida como uma população do tipo selvagem alterada. Como um resultado da sequência de ácido nucleico estranha ter entrado estavelmente no genoma da prole transgênica ou da progênie transgênica, a prole transgênica ou a progênie transgênica pode ter uma ou mais características desejadas que resultam da expressão do ácido nucleico estranho. De acordo com certos aspectos, os métodos descritos aqui podem ser utilizados para criar uma população do tipo selvagem alterada de organismos transgênicos em que os organismos transgênicos exibem uma ou mais características desejadas resultantes da expressão do ácido nucleico estranho.

[004] De acordo com certos aspectos, a sequência de ácido nucleico estranha codifica pelo menos uma proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA, tal como uma ou mais de uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA, uma proteína nickase que se liga ao DNA guiada pelo RNA ou uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease guiada pelo RNA e um ou mais de um grande número de RNAs guias (ácidos ribonucleicos). Um RNA guia é complementar ao DNA (ácido desoxirribonucleico), tal como um DNA alvo no genoma de uma célula de linhagem germinativa. A sequência de ácido nucleico estranha também codifica pelo menos um ou mais promotores de forma que a célula de linhagem germinativa possa expressar a proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e os RNAs guias ou qualquer outra sequência de ácido nucleico ou gene que pode estar na sequência de ácido nucleico estranha. Um perito será facilmente capaz de identificar promotores adequados com base na presente divulgação e na célula de linhagem germinativa particular. A sequência de ácido nucleico estranha também pode incluir qualquer outra sequência de ácido nucleico ou sequências conhecidas pelos peritos na arte como sendo necessárias para a expressão da sequência de ácido nucleico estranha por uma célula de linhagem germinativa. A sequência de ácido nucleico estranha também pode incluir qualquer outra sequência gênica ou sequências gênicas que se desejam que sejam expressas pela célula de linhagem germinativa. Tal sequência gênica ou tais sequências gênicas podem ser referidas como “DNA cargo”. Deve ser entendido que um perito será facilmente capaz de identificar uma ou mais sequências gênicas dependendo da característica desejada que um perito deseja que seja exibido pela célula de linhagem germinativa ou pelo organismo desenvolvido partindo da célula de linhagem germinativa quando a célula expressa a sequência de ácido nucleico estranha. A sequência de ácido nucleico estranha codifica também pelo menos duas sequências flanqueadoras que flanqueiam pelo menos a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o um ou mais RNAs guias. Como conhecido pelos peritos na arte, as sequências flanqueadoras são colocadas em extremidades opostas de uma sequência de ácido nucleico particular de forma que a sequência de ácido nucleico particular fique entre as sequências flanqueadoras. De acordo com um aspecto, as sequências flanqueadoras incluem pelo menos uma sequência que é idêntica a uma sequência correspondente em um cromossomo selecionado. De acordo com um aspecto, tais sequências flanqueadoras permitem que uma célula insira a sequência de ácido nucleico estranha em seu DNA genômico em um sítio de corte utilizando mecanismos bem entendidos tais como recombinação homóloga ou ligação de extremidades não homólogas.

[005] De acordo com certos aspectos, quando a sequência de ácido nucleico estranha é expressa pela célula de linhagem germinativa, uma ou mais de uma proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um ou mais de um grande número de RNAs guias são produzidos. A proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia produzem um complexo da proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA, o RNA guia e uma sequência alvo de DNA de filamento duplo. Neste aspecto, diz-se que o RNA guia a proteína de ligação ao DNA à sequência alvo de DNA de filamento duplo para ligação com a mesma. Este aspecto da presente divulgação pode ser referido como colocalização do RNA e a proteína que se liga ao DNA a ou com o DNA de filamento duplo.

[006] As proteínas que se ligam ao DNA dentro do âmbito da presente divulgação podem incluir aquelas que criam uma quebra de filamento duplo (que podem ser referidas como uma proteína nuclease que se liga ao DNA), aquelas que criam uma quebra de filamento simples (referidas como uma nickase proteína que se liga ao DNA) ou aquelas que não possuem atividade de nuclease (referidas como uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease), mas de outra maneira se ligam ao DNA alvo. Desta maneira, um complexo de proteína que se liga ao DNA-RNA guia pode ser utilizado para criar uma quebra de filamento duplo em um sítio de DNA alvo, para criar uma quebra de filamento simples em um sítio de DNA alvo ou para localizar uma proteína ou um domínio regulador da transcrição, que pode ser expresso pela célula, em um sítio de DNA alvo de forma a regular a expressão do DNA alvo. De acordo com certos aspectos, a sequência de ácido nucleico estranha pode codificar uma ou mais de uma proteína nuclease que se liga ao DNA, uma proteína nickase que se liga ao DNA ou uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease. A sequência de ácido nucleico estranha também pode codificar uma ou mais proteínas ou domínios reguladores da transcrição ou uma ou mais sequências de ácido nucleico doadoras que se pretendem inserir no DNA genômico. De acordo com um aspecto, a sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease guiada pelo RNA codifica ainda a proteína ou o domínio regulador da transcrição fundido com a proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease guiada pelo RNA. De acordo com um aspecto, a sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma ou mais RNAs codifica ainda um alvo de um domínio que se liga ao RNA e o ácido nucleico estranho que codifica a proteína ou o domínio regulador da transcrição codifica ainda um domínio que se liga ao RNA fundido com a proteína ou o domínio regulador da transcrição.

[007] Consequentemente, a expressão de uma sequência de ácido nucleico estranha pela célula de linhagem germinativa pode resultar em uma quebra de filamento duplo, uma quebra de filamento simples e/ou na ativação ou na repressão da transcrição do DNA genômico. O DNA doador pode ser inserido no sítio de quebra pelos mecanismos celulares tal como recombinação homóloga ou ligação de extremidades não homólogas. Deve ser entendido que a expressão de uma sequência de ácido nucleico estranha que é descrita aqui pode resultar em um grande número de quebras de filamento duplo ou quebras de filamento simples em várias localizações ao longo do DNA genômico alvo, incluindo um ou mais de um grande número de sequências gênicas, quando desejado.

[008] Os aspectos da presente divulgação são direcionados para a utilização da sequência de ácido nucleico estranha como um drive de gene. O conceito de um drive de gene é conhecido pelos peritos na arte e refere-se a uma sequência de ácido nucleico estranha que quando expressa é capaz de se inserir no genoma da célula dentro da qual foi introduzida. O conceito de um drive de gene é fornecido em Windbichler e outros, Nature, doi:10.1038/nature09937 (2011) e Burt, Proc. R. Soc. Lond. B (2003) 270, 921-928 (2003) dos quais cada um é incorporado aqui como referência em suas totalidades.

[009] De acordo com um aspecto da presente divulgação, as sequências de ácido nucleico estranhas descritas aqui atuam como drives de genes quando introduzidas em uma célula de linhagem germinativa. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico estranha é expressa pela célula de linhagem germinativa para produzir uma proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia. O RNA guia é complementar a um DNA alvo sequência em um cromossomo. A proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o RNA guia se colocalizam com o DNA alvo e o DNA alvo é clivado de uma maneira específica ao sítio. O DNA alvo pode ser um sítio de DNA alvo em um ou ambos os cromossomos de um par de cromossomos. A sequência de ácido nucleico estranha é então inserida no DNA genômico no sítio de corte do DNA alvo, por exemplo, por recombinação homóloga. A sequência de ácido nucleico estranha pode ser inserida no DNA genômico em um ou ambos os cromossomos de um par de cromossomos se cada cromossomo tiver sido clivado de uma maneira específica ao sítio pela proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA. Se inserida em ambos os cromossomos de um par de cromossomos, então a célula de linhagem germinativa é homozigota em relação à sequência de ácido nucleico estranha. Em uma modalidade alternativa, a sequência de ácido nucleico estranha é inserida em um primeiro cromossomo de um par de cromossomos. A sequência de ácido nucleico estranha inserida é então expressa pela célula e a proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o RNA guia se colocalizam em ou com um segundo cromossomo de um par de cromossomos que é então clivado de uma maneira específica ao sítio, assim como foi o primeiro cromossomo. O DNA alvo clivado no segundo cromossomo é então reparado, por exemplo, por recombinação homóloga, utilizando o primeiro cromossomo como um molde. Desta maneira, o segundo cromossomo é reparado para incluir a sequência de ácido nucleico estranha resultando em uma célula de linhagem germinativa que é homozigota em relação à sequência de ácido nucleico estranha, isto é, a sequência de ácido nucleico estranha está presente tanto no primeiro quanto no segundo cromossomos do par de cromossomos. Os mecanismos através dos quais as células reparam o DNA genômico danificado, clivado ou cortado são bem conhecidos. Os aspectos da presente divulgação tiram vantagem destes mecanismos celulares em combinação com proteínas nucleases ou nickases que se ligam ao DNA para criar um drive de gene com material genético estranho desejado que se insere no DNA genômico de células em que a célula se torna homozigota em relação ao material genético estranho. O material genético estranho é então passado adiante para a progênie para criar uma população de organismos transgênicos que possui uma ou mais características desejadas.

[010] Utilizando o conceito de uma sequência de ácido nucleico estranha que é descrita aqui como um drive de gene, são fornecidos métodos para a incorporação de material genético estranho em uma população selvagem de organismos. São fornecidos métodos para a produção de uma célula homozigota em relação ao material genético estranho. São fornecidos métodos para o espalhamento de uma modificação genética ao longo de uma população do tipo selvagem de organismos. São fornecidos métodos para o espalhamento de uma modificação genética planejada humana ao longo de uma população selvagem de organismos. São fornecidos métodos para engenheirar o genoma inteiro através do espalhamento de uma modificação genética planejada humana ao longo de uma população selvagem de organismos. São fornecidos métodos para a edição do genoma de uma espécie do tipo selvagem. São fornecidos métodos para a edição de inúmeros loci de DNA genômico de um organismo. São fornecidos métodos para a edição multiplex de loci genômicos. São fornecidos métodos para a edição de forma reversível de um lócus ou inúmeros loci de DNA genômico de um organismo.

[011] Com base na função desejada do drive de gene descrito aqui, são fornecidos métodos para o controle de fluxo gênico ao longo de uma população selvagem de organismos. São fornecidos métodos para a supressão da expansão de uma população alvo de um organismo. São fornecidos métodos para a diminuição ou para a eliminação de uma população alvo de um organismo. São fornecidos métodos para o aumento de uma população alvo de um organismo. São fornecidos métodos para a redução ou para a eliminação de doenças disseminadas por vetores, tal como malária. São fornecidos métodos para a diminuição do espalhamento de doença por um organismo alvo, tal como uma população de vetor de inseto. São fornecidos métodos para a interrupção de um gene responsável pela transmissão de doenças por um organismo alvo. São fornecidos métodos para a interrupção de um cromossomo Y em uma célula de linhagem germinativa. São fornecidos métodos para a interrupção de um cromossomo X em uma célula de linhagem germinativa. São fornecidos métodos para o controle de pragas invasivas. São fornecidos métodos para a preservação de espécies ameaçadas por alteração ecológica.

[012] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de bloqueio do fluxo gênico de um organismo engenheirado para a população do tipo selvagem que inclui 1) a inserção de uma cópia codificada novamente de um gene cujo fenótipo quando interrompido é letal negativo dominante em uma região distal do mesmo cromossomo no qual a cópia do tipo selvagem é codificada e 2) a inserção de um elemento gênico egoísta, isto é, drive de gene guiado pelo RNA que é descrito aqui e como o termo drive de gene é entendido pelos peritos na arte, que se copia no lugar da versão do tipo selvagem do mesmo gene, de forma que qualquer prole de um organismo engenheirado e um organismo engenheirado contenha duas cópias funcionais do gene codificado novamente, enquanto que a prole de um organismo engenheirado e um organismo do tipo selvagem possuirá apenas uma única cópia do gene codificado novamente após o elemento genético egoísta substituir a cópia do tipo selvagem e não pode copiar o gene codificado novamente sobre o cromossomo do tipo selvagem.

[013] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de bloqueio do fluxo gênico entre uma subpopulação que carrega uma sequência única e o restante da população que inclui 1) a liberação de um primeiro elemento genético egoísta que se espalha exclusivamente utilizando a sequência única e insere parte de um gene cujo fenótipo quando interrompido é negativo dominante em outro local no genoma, 2) a liberação de um segundo elemento genético egoísta que se espalha exclusivamente utilizando as sequências gênicas parciais e insere uma versão codificada novamente do gene e também interrompe a cópia do tipo selvagem do gene de forma que 1) toda a prole resultante de cruzamentos entre um organismo que carrega o primeiro elemento genético egoísta e um organismo que carrega o segundo elemento genético egoísta contém o segundo elemento genético egoísta no qual ambas as cópias do tipo selvagem do gene são interrompidas, mas são substituídas por cópias codificadas novamente em outro local no genoma e 2) qualquer cruzamento entre um organismo que contém o segundo elemento genético egoísta e um organismo do tipo selvagem não gera progênie porque a cópia do tipo selvagem do gene é perdida e não substituída por uma cópia codificada novamente.

[014] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de direcionamento da proporção sexual da prole que inclui a utilização de um ou mais cromossomos que juntos 1) codificam uma nuclease guiada pelo RNA que é expressa exclusivamente durante a pré-meiose e 2) expressam RNAs guias que direcionam a nuclease para clivar sequências exclusivamente encontradas em um dos cromossomos sexuais de forma que gametas viáveis contenham menos casos do cromossomo direcionado do que é típico de um organismo não modificado.

[015] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de direcionamento da proporção sexual de uma população que inclui a utilização de um cromossomo sexual que codifica uma nuclease guiada pelo RNA que é expressa exclusivamente durante a pré-meiose e expressa também RNAs guias que direcionam a nuclease para clivar sequências exclusivamente encontradas no cromossomo sexual oposto de forma que gametas viáveis contenham predominantemente o cromossomo sexual que codifica a nuclease guiada pelo RNA.

[016] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de direcionamento da proporção sexual da prole em direção ao sexo heterogamético (por exemplo, XY) que inclui a utilização de um cromossomo engenheirado com uma cópia de um gene essencial normalmente presente sobre o cromossomo X e um elemento gênico egoísta que se copia no lugar do gene essencial do tipo selvagem sobre o cromossomo X de forma que progênie do sexo feminino não seja viável em relação ao desenvolvimento devido à perda do gene essencial enquanto que a progênie do sexo masculino sobrevive devido à cópia sobre o cromossomo engenheirado.

[017] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de direcionamento da proporção sexual de uma população em direção ao sexo heterogamético (por exemplo, XY) que inclui a utilização de um cromossomo Y engenheirado com uma cópia de um gene essencial normalmente presente sobre o cromossomo X e um elemento gênico egoísta que se copia no lugar do gene essencial do tipo selvagem sobre o cromossomo X de forma que progênie do sexo feminino não seja viável em relação ao desenvolvimento devido à perda do gene essencial enquanto que a progênie do sexo masculino sobrevive devido à cópia sobre o cromossomo Y engenheirado.

[018] De acordo com certos aspectos, um método de direcionamento da proporção sexual da prole em direção ao sexo homogamético (por exemplo, XX em mamíferos) que inclui a utilização de um ou mais cromossomos que juntos 1) codificam uma nuclease guiada pelo RNA e 2) expressam RNAs guias que direcionam a nuclease para clivar sequências exclusivamente encontradas sobre o cromossomo sexual heterogamético (por exemplo, XY em mamíferos) de forma que o cromossomo sexual heterogamético de qualquer prole que normalmente se desenvolveria como o sexo heterogamético (por exemplo, indivíduos do sexo masculino em mamíferos) seja destruído.

[019] De acordo com certos aspectos, um método de direcionamento da proporção sexual de uma população em direção ao sexo homogamético (por exemplo, XX em mamíferos) que inclui a utilização de um cromossomo sexual homogamético que 1) codifica uma nuclease guiada pelo RNA e 2) expressa RNAs guias que direcionam a nuclease para clivar sequências exclusivamente encontradas sobre o cromossomo sexual heterogamético (por exemplo, XY em mamíferos) de forma que o cromossomo sexual heterogamético de qualquer prole que normalmente se desenvolveria como o sexo heterogamético (por exemplo, indivíduos do sexo masculino em mamíferos) seja destruído.

[020] De acordo com certos aspectos, um método de direcionamento da proporção sexual de uma população em direção a indivíduos do sexo masculino inclui a liberação de indivíduos do sexo masculino engenheirados que codificam um elemento gênico egoísta que se copia no lugar de um gene necessário para a fertilidade do sexo feminino. De acordo com um aspecto, o elemento genético egoísta é codificado sobre o cromossomo Y. De acordo com um aspecto, o cromossomo Y codifica também um elemento gênico egoísta que se direciona a um gene essencial presente sobre o cromossomo X.

[021] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de controle da população que inclui a liberação em uma população que deve ser removida de organismos do sexo masculino engenheirados que contêm um cromossomo Y que codifica 1) um elemento gênico egoísta que se copia no lugar de um gene necessário para a fertilidade do sexo feminino e 2) um segundo elemento genético egoísta que se copia no lugar de um gene essencial sobre o cromossomo X de forma que a prole do sexo feminino não seja viável e a liberação em uma população que deve ser protegida de organismos que codifica um terceiro elemento genético egoísta que altera a sequência do gene essencial sobre o cromossomo X de forma que a prole de cruzamentos entre indivíduos do sexo masculino que contêm o primeiro e o segundo elementos genéticos egoístas e indivíduos do sexo feminino que contêm o terceiro elemento genético egoísta produzam indivíduo do sexo masculino fértil, mas prole do sexo feminino estéril.

[022] De acordo com certos aspectos, é fornecido um método de alteração de uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo que inclui a introdução na célula de linhagem germinativa de uma primeira sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um ou mais RNAs guias e que inclui sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais localizações alvos sobre o DNA genômico de um primeiro cromossomo e um segundo cromossomo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e a sequência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora,em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico,em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, em que pelo menos uma cópia da sequência localizada entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora que é cortada e substituída pela sequência de ácido nucleico estranha é necessária para que o organismo sobreviva ou produza prole viável, expressando a primeira sequência de ácido nucleico estranha para produzir a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o um ou mais RNAs em que a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia associado se colocalizam com uma localização alvo associada sobre o primeiro cromossomo do DNA genômico e o segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, inserindo a primeira sequência de ácido nucleico estranha no primeiro cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem e inserindo a primeira sequência de ácido nucleico estranha no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linhagem germinativa homozigota em relação à sequência de ácido nucleico estranha e realizando as etapas de expressão e inserção anteriores no estágio do desenvolvimento no qual a sequência localizada entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora que é cortada e substituída pela sequência de ácido nucleico estranha para produzir uma carga genética não é mais necessária para que tal organismo sobreviva ou produza prole fértil.

[023] De acordo com certos aspectos, um método para supressão ou extinção da população direcionada de acordo com tais métodos descritos aqui inclui a liberação de um drive de carga genética guiado pelo RNA na população direcionada.

[024] Uma carga genética, como o termo é utilizado aqui, pode se referir à diferença entre a capacidade física do genótipo teoricamente ótimo em uma população e a capacidade física do genótipo médio observado em uma população. O termo carga genética também pode se referir a uma redução na capacidade física média para uma população comparada com a capacidade física máxima.

[025] Características e vantagens adicionais de certas modalidades da presente invenção se tornarão mais completamente evidentes na descrição a seguir das modalidades e desenhos das mesmas e partindo das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[026] A patente ou o arquivo do pedido de patente contém pelo menos um desenho realizado em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) em cores serão fornecidas pelo Escritório a pedido e pagamento da taxa necessária. As características e as vantagens anteriores e outras das presentes modalidades serão mais completamente entendidas partindo da descrição detalhada a seguir de modalidades ilustrativas consideradas em conjunto com os desenhos em anexo em que:

[027] A Fig. 1A é uma representação esquemática de um drive do gene Cas9 guiado pelo RNA padronizado que exibe expressão de Cas9 e RNA guia (SEQ ID NO:28), colocalização, corte de um gene alvo para criar uma quebra e a inserção do drive do gene Cas9 guiado pelo RNA no gene alvo no sítio de corte por recombinação homóloga. A Fig. 1B representa uma vista cromossômica da herança do drive de gene. A Fig. 1C representa uma mutação que previne a colocalização de Cas9 e um RNA guia de forma a impedir o corte do DNA alvo e a inserção do drive de gene. A Fig. 1D representa o uso de um grande número de RNAs guias e sítios de corte para evitar que uma mutação previna a inserção do drive de gene. A Fig. 1E representa NHEJ que deleta todos os sítios de reconhecimento para criar um alelo resistente ao drive. A Fig. 1F representa NHEJ que cria um alelo resistente ao drive que interrompe de forma deletéria um gene essencial.

[028] A Fig. 2A representa o uso de um único drive para editar vários sítios distais através da inclusão de RNAs guias apropriados. A Fig. 2B representa o uso de drives subsequentes para atualizar alterações feitas por um primeiro drive. A Fig. 2C representa o uso de um drive de restauração de todas as alterações de volta para o tipo selvagem, deixando apenas o gene Cas9 e os RNAs guias.

[029] A Fig. 3 representa o uso de dois drives de genes que direcionam o mesmo gene essencial utilizando RNAs guias diferentes que se tornam incompatíveis quando cruzados devido à perda de ambas as cópias. A liberação deste tipo de drive em uma população irá dividir artificialmente a mesma em tantas espécies quanto houver drives.

[030] A Fig. 4A representa o uso de drives de genes meióticos para eliminar o cromossomo sexual competidor durante a meiose, produzindo um conjunto direcionado de gametas. A expressão do drive é limitada à pré-meiose para impedir que o drive seja letal. A Fig. 4B mostra que tal silenciamento do cromossomo sexual meiótico pode ser evitado utilizando duas nucleases de Cas9 ortogonais. Cas9 A faz com que o cassete que codifica Cas9 B seja copiado partindo do cromossomo sexual em um autossomo no início do desenvolvimento, onde fica livre para eliminar o cromossomo sexual competidor durante a meiose. A Fig. 4C mostra que drives X zigóticos podem direcionar o cromossomo Y para a destruição no óvulo fertilizado, produzindo exclusivamente progênie do sexo feminino. A Fig. 4D mostra que os drives Y zigóticos podem codificar um gene essencial normalmente encontrado sobre o cromossomo X e utilizar um cassete de drive do gene para eliminar tal gene do X. O drive se copia partindo do X paterna para o materno, deixando zigotos do sexo feminino sem quaisquer cópias do gene essencial.

[031] A Fig. 5A representa a supressão da população utilizando drives de Y com função dual em que o A Y-drive que também contém uma capacidade de filha estéril (Y-Drive-SD) atua como um drive zigótico na população do tipo selvagem, que pode levar à extinção. A Fig. 5B mostra que após encontrar um drive padronizado que codifica novamente o gene essencial, o Y-Drive-SD não controlará mais. O efeito de filha estéril impedirá a invasão de drives mútuos até que a população invasiva entre em colapso.

[032] A Fig. 6A representa um método para o controle de espécies invasivas com baixa e alta mobilidade em que a carpa asiática do sexo masculino com Y-drive liberada ao longo de habitats invadidos tal como o Mississippi pode ser utilizada para erradicar populações de carpa asiática. Um drive de nova codificação protetor pode estar disponível para proteger populações asiáticas no evento de transporte humano deliberado de indivíduos do sexo masculino com Y-drive. A Fig. 6B representa a liberação de machos de ratos com Y-Drive-SD em populações de ratos invasivas que iniciarão a erradicação local enquanto um drive padronizado codifica novamente de forma protetora as populações de ratos nativas da Eurásia. A construção do Y- Drive-SD irá erradicar ratos invasivos da maioria das ilhas e muitas áreas continentais. O fluxo gênico mediado por Stowaway será limitado pelo efeito de filha estéril do Y-Drive-SD em populações codificadas novamente. O processo pode ser repetido com novos drives uma vez que stowaways codificados novamente invadem de forma bem sucedida habitats livres de ratos.

[033] A Fig. 7 representa a regulação mediada por drive de genes endógenos em que reguladores da transcrição guiados por RNA podem modular a atividade de genes distantes sem editar sua sequência. A regulação será evolutivamente estável durante o tempo de vida do drive se a nuclease do drive requerer o regulador para expressão apropriada.

[034] A Fig. 8 representa a indução da especiação partindo de uma população do tipo selvagem modificada. Dois drives de genes sucessivos que se direcionam a uma subpopulação que carrega um único alelo (representado como um único gene) pode induzir a incompatibilidade genética com a população do tipo selvagem remanescente. O primeiro drive se espalha utilizando o único alelo e codifica novamente um gene que exibe um fenótipo letal dominante quando interrompido. O segundo drive se espalha utilizando o gene codificado novamente e elimina o primeiro drive. Qualquer cruzamento com um organismo do tipo selvagem faz com que o segundo drive interrompa a cópia do tipo selvagem, causando letalidade em toda a progênie.

[035] A Fig. 9 representa um método descrito aqui em que o Drive 1 codifica novamente um gene essencial do sexo masculino sobre o cromossomo Y (se presente) e um gene essencial recessivo sobre o cromossomo X enquanto se insere (isto é, é inserido por um mecanismo da tal como recombinação homóloga após a expressão de Cas9 e RNA guia e a localização do Cas9 e do RNA guia com uma sequência de ácido nucleico alvo) adjacente ao único gene. O Drive 2 se espalha ao longo do cromossomo X modificado, elimina o Drive 1 do autossomo e também pula para dentro do cromossomo Y modificado se presente. Após o cruzamento com um organismo do tipo selvagem, o Drive 2 elimina os genes essenciais dos cromossomos X ou Y. A única progênie viável é de fêmeas híbridas que mantêm uma única cópia codificada novamente do gene essencial recessivo sobre o cromossomo X. Estas podem cruzar livremente com indivíduos do sexo masculino que foram modificados com o Drive 2, permitindo que os genes do tipo selvagem se espalhem dentro da população engenheirada. O cruzamento com um macho do tipo selvagem produz apenas mais híbridos do sexo feminino, prevenindo o fluxo gênico de volta para população do tipo selvagem.

[036] A Fig. 10 representa um método para a produção de um Y-drive zigótico que é descrito aqui.

[037] A Fig. 11A representa um método de produção de um cromossomo Y com filha estéril que elimina um gene necessário para a fertilidade do sexo feminino. O cromossomo Y (Y-SD) não é um drive verdadeiro, mas incorpora um mecanismo de drive de gene limitado que substitui um gene essencial para a fertilidade do sexo feminino com o drive. A Fig. 11B mostra que nas filhas de indivíduos do sexo masculino com Y-SD, o drive similar substitui a cópia materna do gene de fertilidade do sexo feminino, causando esterilidade. Se nenhum gene específico para a fertilidade do sexo feminino for conhecido, um gene de fertilidade necessário para ambos os sexos pode ser direcionado e complementado com uma cópia extra em outro local sobre o cromossomo Y.

[038] A Fig. 12A representa um método de produção de um Y-drive que inclui cromossomos Y com capacidade de filha estéril (Y-drive-SD) (Y-drive + filha estéril). Após o cruzamento com uma fêmea do tipo selvagem, o Y-drive-SD substitui ou interrompe tanto um gene essencial quanto um gene de fertilidade do sexo feminino. Os indivíduos do sexo masculino sobrevivem devido à complementação partindo da cópia extra sobre o Y-drive-SD. Como representado na Fig. 12B, na progênie do sexo feminino, os drives substituem similarmente as cópias maternas, deixando as filhas embrionariamente não viáveis. O Y-drive-SD consequentemente exibe controle. Como representado na Fig. 12C, fêmeas modificadas com um drive protetor têm sítios que flanqueiam o gene essencial codificado novamente. O Y- Drive-SD pode substituir apenas o gene de fertilidade. Como representado na Fig. 12D, a progênie do sexo feminino ainda é estável, mas não possui quaisquer cópias do gene de fertilidade e é consequentemente infértil. Devido ao fato de que os indivíduos do sexo masculino não ganham qualquer benefício de capacidade física proveniente da ausência de irmãs, o Y-drive-SD não terá controle em uma população protegida. Entretanto, apenas o custo de capacidade física que é incorrido pelo drive por si só, de forma que será removido da população apenas lentamente. A perda de resultado reprodutivo de fêmeas resultará em potente supressão da população. Devido a isto, os indivíduos protegidos acharão difícil invadir populações em que o Y-drive-SD é comum. Similarmente, o Y-Drive-SD não será capaz de invadir populações protegidas.

[039] A Fig. 13A é uma representação esquemática que mostra que a herança direcionada de ADE2 é facilmente visível em S. cerevisiae. Mutações em ADE2 geram um fenótipo vermelho em meios com limitação de adenina devido à constituição dos pigmentos vermelhos. O cruzamento de um haploide mutante vermelho com um haploide do tipo selvagem produz diploides de cor creme, que produzem progênie 50% vermelha e 50% de cor creme após a esporulação. A herança direcionada de ADE2 é facilmente visível em S. cerevisiae. A Fig. 13B é uma representação esquemática que mostra que quando os haploides com um drive de gene que direciona ADE2 cruzam com haploides do tipo selvagem na presença de Cas9, o corte e a reposição ou interrupção subsequente de ADE2 levará a diploides vermelhos que produzem exclusivamente progênie vermelha. A Fig. 13C é uma imagem de colônias de S. cerevisiae. Os diploides produzidos através do cruzamento de haploides de drive gênico do tipo selvagem e ADE2::sgRNA produzem colônias de cor creme na ausência de Cas9 ou quando o sítio alvo é removido através de nova codificação, mas colônias uniformemente vermelhas também estão presentes, demonstrando a interrupção dependente de Cas9 da cópia de ADE2 do tipo selvagem. A Fig. 13D mostra imagens de esporos provenientes de 15 tétrades dissecadas que produzem colônias uniformemente vermelhas sobre placas com limitação de adenina, confirmando a interrupção do gene ADE2 herdado do parental do tipo selvagem. Na ausência do sítio alvo ou de Cas9, é observada a segregação de 2:2 normal.

[040] A Fig. 14A é uma representação esquemática que mostra que o drive de gene que direciona ADE2 foi modificado para carregar URA3 como um gene de carga. A Fig. 14 B é uma imagem de diploides produzidos através do cruzamento de levedura haploide URA3- do tipo selvagem com haploides que codificam o drive de gene que carrega URA3 que foram esporulados e as tétrades foram dissecadas para isolar colônias provenientes de esporos individuais. Todos estes cresceram quando plaqueados em réplica em placas sem uracil, demonstrando que o drive copiou de forma bem sucedida URA3 em todos os diploides. A Fig. 14C é uma representação esquemática que mostra que o drive de gene que direciona ABD1 corta e codifica novamente a cauda do gene ABD1 essencial. Os drives de genes e os genes de carga permanecem intactos após a cópia e podem se espalhar através do direcionamento tanto de genes não essenciais quanto essenciais.

[041] A Fig. 15A é uma representação esquemática de uma árvore filogenética que indica as relações entre cepas do tipo selvagem selecionadas para o teste do drive de gene. Adaptada com a permissão de Macmillan Publishers Ltd: Nature 458:337-341, copyright 2009. A Fig. 15 B representa resultados de PCR quantitativa da extensão do direcionamento da herança em diversas cepas de levedura representando a abundância relativa dos alelos do tipo selvagem e que contêm drives em diploides provenientes dos cruzamentos entre drives de genes que carregam SK1 haploides e diversas cepas haploides do tipo selvagem. “Sem Cas9” e “Sem Alvo” referem-se às células haploides que contêm o elemento de controle de ADE2 cruzadas com haploides do tipo selvagem na ausência de Cas9 ou com uma cepa do tipo selvagem com uma mutação na sequência alvo que previne o corte. “2nd gen” refere-se à progênie haploide de um cruzamento anterior.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[042] As modalidades da presente divulgação se baseiam no uso de proteínas que se ligam ao DNA guiadas pelo RNA para colocalização com o RNA guia em um sítio de DNA alvo e atuam como drives de genes. Tais proteínas que se ligam ao DNA são facilmente conhecidas pelos peritos na arte como se ligando ao DNA para várias finalidades. Tais proteínas que se ligam ao DNA podem ocorrer naturalmente. As proteínas que se ligam ao DNA incluídas dentro do âmbito da presente divulgação incluem aquelas que podem ser guiadas pelo RNA, referido aqui como RNA guia. De acordo com um aspecto, o RNA guia tem entre aproximadamente 10 até aproximadamente 500 nucleotídeos. De acordo com um aspecto, o RNA tem entre aproximadamente 20 até aproximadamente 100 nucleotídeos. De acordo com este aspecto, o RNA guia e a proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA formam um complexo de colocalização no DNA.

[043] As proteínas que se ligam ao DNA que possuem atividade de nuclease são conhecidas pelos peritos na arte e incluem proteínas que se ligam ao DNA que ocorrem naturalmente que possuem atividade de nuclease, tais como proteínas Cas9 presentes, por exemplo, em sistemas de CRISPR do Tipo II. Tais proteínas Cas9 e sistemas de CRISPR do Tipo II são bem documentados na arte. Ver Makarova e outros, Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, junho de 2011, pp. 467477 incluindo toda a informação suplementar incorporada no mesmo como referência em sua totalidade.

[044] Os sistemas de CRISPR-Cas bacterianos e de archaeal se baseiam em RNAs guias curtos em complexo com proteínas Cas para direcionar a degradação de sequências complementares presentes dentro do ácido nucleico estranho invasor. Ver Deltcheva, E. e outros CRISPR RNA maturation by transencoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy de Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. e outros A programmable dual-RNA- guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. e outros The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); e Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011). Uma reconstituição in vitro recente do sistema de CRISPR do tipo II de S. pyogenes demonstrou que o crRNA (“RNA de CRISPR”) fundido com ao tracrRNA normalmente codificado em trans (“RNA de CRISPR com ativação em trans”) é suficiente para direcionar a proteína Cas9 para clivar de forma específica à sequência as sequências de DNA alvo que se combinam com o crRNA. A expressão de um gRNA homólogo a um sítio alvo resulta no recrutamento de Cas9 e na degradação do DNA alvo. Ver H. Deveau e outros, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008).

[045] Três classes de sistemas de CRISPR são geralmente conhecidas e são referidas como Tipo I, Tipo II ou Tipo III. De acordo com um aspecto, uma enzima útil particular de acordo com a presente divulgação para clivar o dsDNA é a enzima efetora única, Cas9, comum ao Tipo II. Ver K. S. Makarova e outros, Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology 9, 467 (Jun, 2011) incorporado aqui como referência em sua totalidade. Dentro das bactérias, o sistema efetor do Tipo II consiste de um pré-crRNA longo transcrito partindo do lócus CRISPR que contém espaçador, da proteína Cas9 multifuncional e de um tracrRNA importante para o processamento do gRNA. Os tracrRNAs se hibridizam com as regiões de repetição que separam os espaçadores do pré-crRNA, iniciando a clivagem do dsRNA pela RNase III endógena, que é seguida por um segundo evento de clivagem dentro de cada espaçador pela Cas9, produzindo crRNAs maduros que permanecem associados ao tracrRNA e à Cas9.

[046] De acordo com um aspecto, a enzima da presente divulgação, tal como Cas9 desenrola o duplex de DNA e procura por sequências que se combinam com o crRNA para clivagem. O reconhecimento do alvo ocorre após a detecção de complementaridade entre uma sequência “protoespaçadora” no DNA alvo e o restante da sequência espaçadora no crRNA. De maneira importante, Cas9 corta o DNA apenas se um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) correto também estiver presente na extremidade a 3’. De acordo com certos aspectos, um motivo adjacente ao protoespaçador diferente pode ser utilizado. Por exemplo, o sistema de S. pyogenes requer uma sequência NGG, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Os sistemas do Tipo II de S. thermophilus requerem NGGNG (ver P. Horvath, R. Barrangou, CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, 167 (Jan 8, 2010) incorporado aqui como referência em sua totalidade e NNAGAAW (ver H. Deveau e outros, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) incorporado aqui como referência em sua totalidade), respectivamente, enquanto sistemas de S. mutans diferentes toleram NGG ou NAAR (ver J. R. van der Ploeg, Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequent occurrence of acquired immunity against infection by M102-like bacteriophages. Microbiology 155, 1966 (Jun, 2009) incorporado aqui como referência em sua totalidade. Análises de bioinformática geraram bancos de dados extensos de loci de CRISPR em uma variedade de bactérias que podem servir para identificar PAMs úteis adicionais e expandir o conjunto de sequências que podem ser direcionadas por CRISPR (ver M. Rho, Y. W. Wu, H. Tang, T. G. Doak, Y. Ye, Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes. PLoS genetics 8, e1002441 (2012) e D. T. Pride e outros, Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time. Genome research 21, 126 (Jan, 2011) dos quais cada um é incorporado aqui como referência em suas totalidades.

[047] Os exemplos de proteínas que se ligam ao DNA que possuem atividade de nuclease funcionam para fazer pequenos cortes ou cortar DNA de filamento duplo. Tal atividade de nuclease pode resultar da proteína de ligação ao DNA que possui uma ou mais sequências polipeptídicas que exibem atividade de nuclease. Tais exemplos de proteínas que se ligam ao DNA podem ter dois domínios de nuclease separados com cada domínio responsável pelo corte ou pela produção de pequenos cortes de um filamento particular do DNA de filamento duplo. Os exemplos de sequências polipeptídicas que possuem atividade de nuclease conhecidos pelos peritos na arte incluem o domínio relacionado à McrA-HNH nuclease e o domínio de nuclease similar a RuvC. Consequentemente, os exemplos de proteínas que se ligam ao DNA são aqueles que na natureza contêm um ou mais do domínio relacionado à McrA-HNH nuclease e o domínio de nuclease similar a RuvC.

[048] Em S. pyogenes, Cas9 gera uma quebra de filamento duplo com extremidades cegas 3pb a montante do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) através de um processo mediado por dois domínios catalíticos na proteína: um domínio HNH que cliva o filamento complementar do DNA e um domínio similar a RuvC que cliva o filamento não complementar. Ver Jinke e outros, Science 337, 816- 821 (2012) incorporado aqui como referência em sua totalidade. As proteínas Cas9 são conhecidas por existirem em muitos sistemas de CRISPR do Tipo II incluindo os seguintes que são identificados na informação suplementar para Makarova e outros, Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, Junho de 2011, pp. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHA1; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 11B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida DSM 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bd1; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX H1; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RS1; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Pei191; bactéria do grupo 1 de Cupim não cultivada filotipo Rs D17; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC118; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst CH1; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes M1 GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 18311; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum B Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAi1; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 11170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitides 053442; Neisseria meningitides alpha14; Neisseria meningitides Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81116; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U112; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis; Francisella tularensis WY96-3418; e Treponema denticola ATCC 35405. A proteína Cas9 pode ser referida por um perito na arte na literatura como Csn1. Um exemplo de sequência de proteína Cas9 de S. pyogenes é mostrado a seguir. Ver Deltcheva e outros, Nature 471, 602-607 (2011) incorporado aqui como referência em sua totalidade. MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAE ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSD VDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYA GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELH AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWG RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDH IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRK MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGA PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO: 1)

[049] De acordo com um aspecto, a especificidade da clivagem de Cas9 direcionada pelo gRNA é utilizada como um mecanismo para engenheirar o genoma e como um gene de controle. De acordo com um aspecto, a hibridização do gRNA não precisa ser de 100 por cento para que a enzima reconheça o híbrido de gRNA/DNA e afete a clivagem. Alguma atividade fora do alvo poderia ocorrer. Por exemplo, o sistema de S. pyogenes tolera pareamentos errados nas primeiras 6 bases fora da sequência espaçadora madura de 20pb in vitro. De acordo com um aspecto, uma maior estringência pode ser benéfica in vivo quando sítios fora do alvo potenciais que se combinam (últimos 14 pb) com NGG existem dentro do genoma de referência humano para os gRNAs.

[050] De acordo com certos aspectos, a especificidade pode ser aprimorada. Quando a interferência for sensível à temperatura de fusão do híbrido gRNA-DNA, sequências alvos ricas em AT podem ter menos sítios fora do alvo. A escolha cuidadosa de sítios alvos para evitar pseudo-sítios com sequências que se combinam de pelo menos 14pb em outro local no genoma pode aumentar a especificidade. O uso de um variante de Cas9 que requer uma sequência de PAM mais longa pode reduzir a frequência de sítios fora do alvo. A evolução direcionada pode aprimorar a especificidade de Cas9 até um nível suficiente para impedir completamente a atividade fora do alvo, requerendo de forma ideal uma combinação de gRNA de 20pb perfeita com um PAM mínimo. Consequentemente, a modificação na proteína Cas9 é uma modalidade representativa da presente divulgação. Os sistemas de CRISPR úteis na presente divulgação são descritos em R. Barrangou, P. Horvath, CRISPR: new horizons in phage resistance and strain identification. Annual review of food science and technology 3, 143 (2012) e B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna, RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331 (Feb 16, 2012) dos quais cada um é incorporado aqui como referência em suas totalidades.

[051] De acordo com certos aspectos, a proteína de ligação ao DNA é alterada ou de outra maneira modificada para inativar a atividade de nuclease. Tal alteração ou modificação inclui a alteração de um ou mais aminoácidos para inativar a atividade de nuclease ou o domínio de nuclease. Tal modificação inclui a remoção da sequência polipeptídica ou das sequências polipeptídicas que exibem atividade de nuclease, isto é, o domínio de nuclease, de forma que a sequência polipeptídica ou as sequências polipeptídicas que exibem atividade de nuclease, isto é, domínio de nuclease, estejam ausentes da proteína de ligação ao DNA. Outras modificações para inativar a atividade de nuclease serão facilmente evidentes para um perito na arte com base na presente divulgação. Consequentemente, uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease inclui sequências polipeptídicas modificadas para inativar a atividade de nuclease ou para a remoção de uma sequência ou sequências polipeptídicas para inativar a atividade de nuclease. Uma proteína que se liga ao DNA nula em relação à nuclease mantém a capacidade de se ligar ao DNA muito embora a atividade de nuclease tenha sido inativada. Consequentemente, a proteína de ligação ao DNA inclui a sequência ou as sequências polipeptídicas necessárias para a ligação com o DNA, mas pode não ter a uma ou mais ou todas as sequências de nuclease que exibem atividade de nuclease. Consequentemente, a proteína de ligação ao DNA inclui a sequência ou as sequências polipeptídicas necessárias para a ligação com o DNA, mas pode ter uma ou mais ou todas as sequências de nuclease que exibem atividade de nuclease inativada.

[052] De acordo com um aspecto, a proteína que se liga ao DNA que possui dois ou mais domínios de nuclease pode ser modificada ou alterada para inativar todos, menos um dos domínios de nuclease. Tal proteína que se liga ao DNA modificada ou alterada é referida como uma proteína nickase que se liga ao DNA, até a extensão em que a proteína de ligação ao DNA corta ou produz pequenos cortes apenas em um filamento de DNA de filamento duplo. Quando guiada pelo RNA para o DNA, a proteína nickase de ligação ao DNA é referida como uma proteína nickase que se liga ao DNA guiada pelo RNA.

[053] Um exemplo de proteína que se liga ao DNA é uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA de um Sistema de CRISPR do Tipo II, tal como uma proteína Cas9 ou Cas9 modificada ou homólogo de Cs9. Um exemplo de proteína que se liga ao DNA é uma proteína nickase de Cas9. Um exemplo de proteína que se liga ao DNA é uma proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA de um Sistema CRISPR do Tipo II que não possui atividade de nuclease. Um exemplo de proteína que se liga ao DNA é uma proteína Cas9 nula em relação à nickase.

[054] De acordo com certos aspectos de métodos de regulação do genoma guiada pelo RNA descritos aqui, Cas9 é alterada para reduzir, reduzir substancialmente ou eliminar a atividade de nuclease. De acordo com um aspecto, a atividade de nuclease de Cas9 é reduzida, substancialmente reduzida ou eliminada através da alteração do domínio de nuclease RuvC ou do domínio de nuclease HNH. De acordo com um aspecto, o domínio de nuclease RuvC é inativado. De acordo com um aspecto, o domínio de nuclease HNH é inativado. De acordo com um aspecto, o domínio de nuclease RuvC e o domínio de nuclease HNH são inativados. De acordo com um aspecto adicional, são fornecidas proteínas Cas9 nas quais o domínio de nuclease RuvC e o domínio de nuclease HNH são inativados. De acordo com um aspecto adicional, proteínas Cas9 nulas em relação à nuclease são fornecidas à medida que o domínio de nuclease RuvC e o domínio de nuclease HNH são inativados. De acordo com um aspecto adicional, é fornecida uma nickase de Cas9 na qual o domínio de nuclease RuvC ou o domínio de nuclease HNH é inativado, deixando assim o domínio de nuclease remanescente ativo em relação à atividade de nuclease. Desta maneira, apenas um filamento do DNA de filamento duplo é cortado ou sofre pequenos cortes.

[055] De acordo com um aspecto adicional, são fornecidas proteínas Cas9 nulas em relação à nuclease nas quais um ou mais aminoácidos em Cas9 são alterados ou de outra maneira removidos para fornecer proteínas Cas9 nulas em relação à nuclease. De acordo com um aspecto, os aminoácidos incluem D10 e H840. Ver Jinke e outros, Science 337, 816-821 (2012). De acordo com um aspecto adicional, os aminoácidos incluem D839 e N863. De acordo com um aspecto, um ou mais ou todos os D10, H840, D839 e H863 são substituídos por um aminoácido que reduz, elimina substancialmente ou elimina a atividade de nuclease. De acordo com um aspecto, um ou mais ou todos os D10, H840, D839 e H863 são substituídos por alanina. De acordo com um aspecto, uma proteína Cas9 que possui um ou mais ou todos os D10, H840, D839 e H863 substituídos por um aminoácido que reduz, elimina substancialmente ou elimina a atividade de nuclease, tal como alanina, é referida como uma Cas9 nula em relação à nuclease ou Cas9N e exibe atividade de nuclease reduzida ou eliminada ou a atividade de nuclease está ausente ou substancialmente ausente dentro dos níveis de detecção. De acordo com este aspecto, a atividade de nuclease para uma Cas9N pode ser indetectável utilizando ensaios conhecidos, isto é, abaixo do nível de detecção de ensaios conhecidos.

[056] De acordo com um aspecto, a proteína Cas9, a proteína nickase de Cas9 ou a Cas9 nula em relação à nuclease inclui homólogos e ortólogos da mesma que mantêm a capacidade da proteína de se ligar ao DNA e de serem guiados pelo RNA. De acordo com um aspecto, a proteína Cas9 inclui a sequência que é apresentada para Cas9 que ocorre naturalmente de S. pyogenes e sequências de proteína que possuem pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia com a mesma e que são uma proteína que se liga ao DNA, tal como uma proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA.

[057] De acordo com um aspecto, é fornecido um sistema de Cas9-gRNA engenheirado que possibilita a regulação do genoma guiada pelo RNA em células através da ligação dos domínios de ativação da transcrição a uma Cas9 nula em relação à nuclease ou aos RNAs guias. De acordo com um aspecto da presente divulgação, uma ou mais proteínas ou domínios reguladores da transcrição (tais termos são utilizados de forma intercambiável) são ligados ou de outra maneira conectados a uma Cas9 deficiente em relação à nuclease ou um ou mais RNAs guias (gRNA). Os domínios reguladores da transcrição correspondem a loci alvos. Consequentemente, os aspectos da presente divulgação incluem métodos e materiais para a localização de domínios reguladores da transcrição nos loci alvo através da fusão, da conexão ou da ligação de tais domínios a Cas9N ou ao gRNA. De acordo com certos aspectos, são fornecidos métodos para a regulação de genes endógenos utilizando Cas9N, um ou mais gRNAs e uma proteína ou domínio regulador da transcrição. De acordo com um aspecto, um gene endógeno pode ser qualquer gene desejado, referido aqui como um gene alvo.

[058] De acordo com um aspecto, é fornecida uma proteína de fusão de Cas9N capaz de ativação da transcrição. De acordo com um aspecto, um domínio de ativação de VP64 (ver Zhang e outros, Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011) incorporado aqui como referência em sua totalidade) é ligado, fundido, conectado ou de outra maneira anexado ao terminal C de Cas9N. De acordo com um método, o domínio regulador da transcrição é fornecido no sítio de DNA genômico alvo pela proteína Cas9N. De acordo com um método, uma Cas9N fundida com um domínio regulador da transcrição é fornecida dentro de uma célula junto com um ou mais RNAs guias. A Cas9N com o domínio regulador da transcrição fundido à mesma se liga no ou próximo ao DNA genômico alvo. O um ou mais RNAs guias se ligam no ou próximo ao DNA genômico alvo. O domínio regulador da transcrição regula a expressão do gene alvo. De acordo com um aspecto específico, uma fusão de Cas9N-VP64 ativou a transcrição de construções repórteres quando combinada com gRNAs que direcionam sequências próximas ao promotor, exibindo assim ativação da transcrição guiada pelo RNA.

[059] De acordo com um aspecto, é fornecida uma proteína de fusão com gRNA capaz de ativar a transcrição. De acordo com um aspecto, um domínio de ativação VP64 é ligado, fundido, conectado ou de outra maneira anexado ao gRNA. De acordo com um método, o domínio regulador da transcrição é fornecido no sítio do DNA genômico alvo pelo gRNA. De acordo com um método, um gRNA fundido com um domínio regulador da transcrição é fornecido dentro de uma célula junto com uma proteína Cas9N. A Cas9N se liga no ou próximo ao DNA genômico alvo. O um ou mais RNAs guias com a proteína ou o domínio regulador da transcrição fundido aos mesmos se ligam no ou próximo ao DNA genômico alvo. O domínio regulador da transcrição regula a expressão do gene alvo. De acordo com um aspecto específico, uma proteínas Cas9N e um gRNA fundido com um domínio regulador da transcrição ativou a transcrição de construções repórteres, exibindo assim ativação da transcrição guiada pelo RNA.

[060] De acordo com um aspecto, a proteína ou o domínio regulador da transcrição é um ativador da transcrição. De acordo com um aspecto, a proteína ou o domínio regulador da transcrição regula para mais a expressão do ácido nucleico alvo. De acordo com um aspecto, a proteína ou o domínio regulador da transcrição é um repressor da transcrição. De acordo com um aspecto, a proteína ou o domínio regulador da transcrição regula para menos a expressão do ácido nucleico alvo. Os ativadores da transcrição e os repressores da transcrição podem ser facilmente identificados por um perito na arte com base na presente divulgação.

[061] De acordo com um aspecto, a sequência de ácido nucleico estranha codifica dois ou mais RNAs guias com cada RNA sendo complementar a um sítio adjacente no ácido nucleico alvo do DNA e codifica também pelo menos uma proteína nickase que se liga ao DNA guiada pelo RNA e que é guiada pelos dois ou mais RNAs, em que os dois ou mais RNAs e a pelo menos uma proteína nickase que se liga ao DNA guiada pelo RNA são expressos e em que a pelo menos uma proteína nickase que se liga ao DNA guiada pelo RNA se colocaliza com os dois ou mais RNAs no ácido nucleico alvo do DNA e faz pequenos cortes no ácido nucleico alvo do DNA resultando em dois ou mais pequenos cortes adjacentes. De acordo com certos aspectos, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam no mesmo filamento do DNA de filamento duplo. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam no mesmo filamento do DNA de filamento duplo e resultam na recombinação homóloga. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e criam quebras de filamento duplo. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e criam quebras de filamento duplo resultando na ligação de extremidades não homólogas. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e são compensados em relação um ao outro. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e são compensados em relação um ao outro e criam quebras de filamento duplo. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e são compensados em relação um ao outro e criam quebras de filamento duplo resultando na ligação de extremidades não homólogas. De acordo com um aspecto, os dois ou mais pequenos cortes adjacentes ficam em filamentos diferentes do DNA de filamento duplo e criam quebras de filamento duplo resultando na fragmentação do ácido nucleico alvo prevenindo assim a expressão do ácido nucleico alvo.

[062] De acordo com certos aspectos, a especificidade de ligação da proteína que se liga ao DNA guiada pelo RNA pode ser aumentada de acordo com métodos descritos aqui. De acordo com um aspecto, pequenos cortes fora do lugar são utilizados nos métodos de edição do genoma. Uma grande maioria de pequenos cortes raramente resulta em eventos de NHEJ, (ver Certo e outros, Nature Methods 8, 671-676 (2011) incorporado aqui como referência em sua totalidade) minimizando assim os efeitos de pequenos cortes fora do alvo. Em contraste, a indução de pequenos cortes fora do lugar para gerar quebras de filamento duplo (DSBs) é altamente eficiente na indução da interrupção gênica. De acordo com certos aspectos, pontas penduradas a 5’ geram eventos de NHEJ mais significativos ao contrário das pontas penduradas a 3’. Similarmente, as pontas penduradas a 3’ favorecem HR em relação aos eventos de NHEJ, embora o número total de eventos de HR seja significativamente menor que quando uma ponta pendurada a 5’ é gerada. Consequentemente, são fornecidos métodos para a utilização de pequenos cortes para recombinação homóloga e pequenos cortes fora do lugar para gerar quebras de filamento duplo para minimizar os efeitos da atividade de Cas9-gRNA fora do alvo.

[063] As células de linhagem germinativa de acordo com a presente divulgação incluem qualquer célula de linhagem germinativa dentro da qual ácidos nucleicos estranhos podem ser introduzidos e expressos como descrito aqui. Deve ser entendido que os conceitos básicos da presente divulgação descrita aqui não são limitados pelo tipo de célula. As células de linhagem germinativa de acordo com a presente divulgação incluem células de linhagem germinativa eucarióticas, células de linhagem germinativa procarióticas, células de linhagem germinativa de animais, células de linhagem germinativa de mamíferos, células de linhagem germinativa de plantas, células de linhagem germinativa de insetos, células de linhagem germinativa fungos, células de linhagem germinativa de archae, células de linhagem germinativa de eubactérias e similares. Ainda, as células de linhagem germinativa incluem qualquer uma na qual seria benéfico ou desejável introduzir uma sequência de ácido nucleico estranha descrita aqui.

[064] Os ácidos nucleicos alvos incluem qualquer sequência de ácido nucleico para a qual um complexo de colocalização que é descrito aqui pode ser útil para cortar, fazer pequenos cortes ou regular. Os ácidos nucleicos alvos incluem genes. Para as finalidades da presente divulgação, o DNA, tal como o DNA de filamento duplo, pode incluir o ácido nucleico alvo e um complexo de colocalização pode se ligar ou de outra maneira se colocalizar com o DNA no ou adjacente ou próximo ao ácido nucleico alvo e de uma maneira em que o complexo de colocalização pode ter um efeito desejado sobre o ácido nucleico alvo. Tais ácidos nucleicos alvos podem incluir ácidos nucleicos endógenos (ou que ocorrem naturalmente) e ácidos nucleicos exógenos (ou estranhos). Um perito com base na presente divulgação será facilmente capaz de identificar ou planejar RNAs guias e proteínas Cas9 que se colocalizam com um DNA incluindo um ácido nucleico alvo. Um perito será ainda capaz de identificar proteínas ou domínios reguladores da transcrição que similarmente se colocalizam com um DNA incluindo um ácido nucleico alvo. O DNA inclui DNA genômico, DNA mitocondrial, DNA viral ou DNA exógeno.

[065] Os ácidos nucleicos estranhos (isto é, aqueles que não fazem parte da composição de ácido nucleico natural de uma célula) podem ser introduzidos em uma célula utilizando qualquer método conhecido pelo perito na arte para tal introdução. Tais métodos incluem transfecção, transdução, transdução viral, microinjeção, lipofecção, nucleofecção, bombardeio de nanopartículas, transformação, conjugação e similares. Um perito na arte entenderá e adaptará facilmente tais métodos utilizando fontes na literatura que podem ser facilmente identificadas.

[066] As proteínas ou os domínios reguladores da transcrição que are ativadores da transcrição ou repressores da transcrição podem ser facilmente identificados pelos peritos na arte com base na presente divulgação e na célula de linhagem germinativa particular.

[067] Os exemplos a seguir são apresentados como sendo representativos da presente divulgação. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes do âmbito da presente divulgação uma vez que estas e outras modalidades equivalentes serão evidentes em vista da presente divulgação, figuras e reivindicações em anexo.

EXEMPLO I

[068] Drives do Gene Cas9

[069] A Fig. 1A é uma representação esquemática que mostra a colocalização de um RNA guia e uma nuclease de Cas9 com um DNA alvo. Os sítios do DNA alvo incluem uma sequência “protoespaçadora” que se combina com o “espaçador” do RNA guia e um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) curto necessário para a ligação de Cas9. Um exemplo de drive do gene Cas9 mostrado na Fig. 1A é uma sequência de ácido nucleico estranha que é descrita aqui (que pode ser referida como um “cassete” como o termo é entendido pelos peritos na arte) que codifica pelo menos uma nuclease de Cas9 guiada pelo RNA, um ou mais RNAs guias que são complementares a um ou mais sítios de DNA alvos, tal como dentro de um gene essencial adjacente e sequências flanqueadoras. O cassete também pode incluir qualquer material genético de carga, tal como um ou mais genes que serão expressos pela célula de linhagem germinativa dentro da qual o material genético de carga deve ser inserido ou deve ser expresso pelos descendentes de tal célula. O drive do gene Cas9 é expresso para produzir Cas9 e o um ou mais RNAs guias que então se colocalizam em um ou mais sítios de DNA alvos sobre um primeiro cromossomo de um par de cromossomos e onde a Cas9 então cliva o DNA alvo sobre o primeiro cromossomo de uma maneira específica ao sítio produzindo uma quebra de filamento duplo. O reparo direcionado por homologia de quebras de filamento duplo induzidas por Cas9 então insere o drive do gene Cas9 no primeiro cromossomo no sítio de corte. De acordo com certos aspectos, o drive do gene Cas9 inserido é então expresso para produzir Cas9 e o um ou mais RNAs guias que então se colocalizam no um ou mais sítios de DNA alvos sobre o segundo cromossomo do par de cromossomos e então clivam o DNA alvo de uma maneira específica ao sítio produzindo uma quebra de filamento duplo. O reparo direcionado por homologia das quebras de filamento duplo induzidas por Cas9 utiliza o cromossomo que contém o drive de Cas9 intacto como um molde inserindo assim o drive de Cas9 no segundo cromossomo do par de cromossomos para criar um par de cromossomos que é homozigoto em relação ao drive do gene Cas9. Isto é representado na Fig. 1B.

[070] A Fig. 1C mostra que uma mutação no sítio do DNA alvo pode impedir o corte por uma única proteína Cas9. Consequentemente, os aspectos da presente divulgação apresentados na Fig. 1D fornecem inúmeros RNAs guias para vários sítios de DNA alvos. Desta maneira, os drives de genes guiados pelo RNA podem superar os alelos resistentes através do direcionamento a inúmeras sequências adjacentes de forma que nenhuma mutação isolada possa conferir resistência. As chances de que um sítio alvo não será clivado por causa de uma mutação são enormemente reduzidas uma vez que o sítio de DNA alvo será provavelmente clivado em várias localizações fornecendo assim um sítio de corte dentro do qual o drive de gene guiado pelo RNA pode ser inserido. Como mostrado na Fig. 1E, o reparo utilizando a via de ligação de extremidades não homólogas (NHEJ) alternativa pode deletar todos os sítios de reconhecimento, criando um alelo resistente ao drive que compete com o drive. A Fig. 1F mostra que eventos de NHEJ que interrompem um gene essencial são altamente deletérios e serão selecionados contra a favor do drive. A escolha de sítios alvos dentro de um gene essencial garante que eventos de reparo incorretos não podem criar alelos resistentes através da deleção de todas as sequências alvos. A ligação de extremidades não homólogas pode criar pequenas inserções ou deleções na junção do reparo que podem impedir a ligação de um RNA guia e Cas9 no sítio de reparo. Como um resultado, o drive de gene guiado pelo RNA pode não ser capaz de ser inserido neste sítio sobre o cromossomo se houver apenas um único RNA guia para este sítio codificado no drive de gene guiado pelo RNA. Entretanto, o fato de que o drive de gene guiado pelo RNA codifica inúmeros RNAs guias que se direcionam a vários sítios e, portanto, produzem vários sítios de corte aumentará as chances de que o drive de gene guiado pelo RNA será inserido no cromossomo. Ainda, os aspectos da presente divulgação são direcionados para mirar inúmeros sítios para Cas9 dentro de um gene essencial como um método para o aprimoramento da eficiência de inserção do drive de gene guiado pelo RNA em um cromossomo.

EXEMPLO II

[071] Edição e Regulação de Inúmeros Loci Endógenos

[072] De acordo com certos aspectos da presente divulgação, um drive de gene guiado pelo RNA pode editar inúmeros alelos endógenos distais ao próprio drive através da incorporação de RNAs guias que se direcionam para os respectivos alelos do tipo selvagem. Como mostrado na Fig. 2A, inúmeros RNAs guias são fornecidos para um grande número de sequências gênicas, isto é, Gene A WT, Gene B WT e Gene Essencial WT. A expressão dos inúmeros RNAs guias e da proteína Cas9 resulta em cada um dos genes sendo modificados por Cas9. De acordo com um aspecto, o drive de Cas9 também pode incluir uma ou mais proteínas Cas9 nulas em relação à nuclease ortogonais e RNAs guias associados a reguladores da transcrição que podem se colocalizar com um sítio de DNA alvo de forma que o regulador da transcrição possa regular o gene. Ver a Fig. 7. Como mostrado na Fig. 2B, drives de Cas9 subsequentes adicionais podem ser utilizados para atualizar as alterações que foram feitas anteriormente por um drive de Cas9 anterior. Por exemplo, se um drive particular causar efeitos colaterais inesperados, um segundo drive liberado como uma atualização pode substituir uma ou todas as modificações codificadas pelo primeiro drive. De acordo com este aspecto, o segundo drive pode ser planejado para remover o drive inserido existente e então por si só inserido no cromossomo. Em adição, um ou mais genes que foram modificados por um drive de gene guiado pelo RNA anterior podem ser removidos e substituídos por um gene desejado. Similarmente, como representado na Fig. 2C, um terceiro drive de restauração pode restaurar a sequência do tipo selvagem em todas as localizações genômicas exceto pela presença do gene Cas9 e dos RNAs guias necessária para espalhar o drive de restauração. Desta maneira, uma população pode ser modificada para a reversão de volta para seu tipo selvagem. Consequentemente, os aspectos da presente divulgação são direcionados para a modificação ou para a substituição de um drive do gene Cas9 guiado pelo RNA previamente inserido através da introdução de um segundo drive do gene Cas9 guiado pelo RNA em uma célula modificada anteriormente utilizando os métodos descritos aqui. O segundo drive de gene é planejado para fazer modificações adicionais além daquelas feitas pelo primeiro drive de gene ou para eliminar as modificações feitas pelo primeiro drive de gene.

EXEMPLO III

[073] Controle do Espalhamento

[074] De acordo com certos aspectos, o espalhamento de drives de genes guiados pelo RNA pode ser limitado a uma única espécie alvo ou até mesmo uma subpopulação através do direcionamento de um único gene ou um polimorfismo de sequência associado à única espécie ou subpopulação alvo. Devido ao fato de que o drive pode apenas cortar a sequência única, este não se espalha ao longo de populações que não são alvos. Consequentemente, os aspectos da presente divulgação são direcionados para métodos de planejamento e de utilização de drives de genes guiados pelo RNA que são específicos para uma única sequência gênica ou polimorfismo de sequência. Desta maneira um ou mais RNAs guias são planejados para serem complementares à única sequência gênica ou polimorfismo de sequência. Desta maneira, a proteína de ligação ao DNA é restrita à localização na única sequência gênica ou polimorfismo de sequência.

EXEMPLO IV

[075] Indução de Especiação Artificial

[076] De acordo com certos aspectos, são fornecidos métodos de utilização de drives de genes guiados pelo RNA para bloquear o fluxo gênico causando incompatibilidade genética entre duas populações. De acordo com este aspecto e como mostrado na Fig. 3, dois drives de genes que direcionam para sequências diferentes dentro do mesmo gene essencial utilizando RNAs guias diferentes são liberados nas duas populações. As duas populações se tornam incompatíveis por causa da perda de cada cópia do gene essencial dentro de cada população. A liberação deste tipo de drive em uma população irá dividi-la artificialmente em tantas espécies quanto há drives. Como mostrado nos exemplos da Fig. 3, o drive A corta as sequências 1, 2, 3 e 4 dentro do gene essencial X. À medida que o drive A se espalha, este substitui o gene X com uma versão que possui as sequências 1, 2, 3 e 4 codificadas novamente de forma que não possa ser cortada. O drive B corta as sequências 5, 6, 7 e 8 dentro do gene X e sua versão do gene X possui estas sequências codificadas novamente de forma que não possa ser cortada. O cruzamento de um macho com o drive A e uma fêmea com o drive B resulta na progênie que herda um cromossomo com o drive A e o gene X com 1/2/3/4 codificados novamente e um cromossomo com o drive B e o gene X com 5/6/7/8 codificados novamente. O drive A corta a segunda cópia do gene X nos sítios 1/2/3/4, porque a segunda cópia não tem tais sítios codificados novamente - possui apenas 5/6/7/8 codificados novamente. Similarmente, o drive B corta a primeira cópia do gene X nos sítios 5/6/7/8 porque a primeira cópia não tem tais sítios codificados novamente, possui apenas 1/2/3/4 codificados novamente. O organismo acaba com ambas as cópias do gene X cortadas. Uma vez que o gene X é essencial e o organismo não possui uma cópia intacta do gene X para ser reparado, o organismo morre. O drive A e o drive B são consequentemente incompatíveis.

[077] De acordo com este aspecto, cada drive codifica uma versão diferente do gene essencial - uma primeira sequência de ácido nucleico estranha e uma segunda sequência de ácido nucleico estranha - que cada uma preserva a sequência de aminoácidos da proteína essencial codificada por tal gene, mas que tem conjuntos diferentes de localizações alvos codificados novamente - o primeiro drive possui os sítios 1/2/3/4 codificados novamente para serem não complementares aos guias 1/2/3/4, enquanto que o segundo drive possui os sítios 5/6/7/8 codificados novamente para serem não complementares aos guias 5/6/7/8. Quando os drives são cruzados, o primeiro drive cliva a cópia do segundo drive do gene essencial em 1/2/3/4 porque não tem aqueles sítios codificados novamente, enquanto o segundo drive cliva a cópia do primeiro drive do gene essencial em 5/6/7/8 porque não tem aqueles sítios codificados novamente.

[078] Drives de genes mais complexos podem bloquear o fluxo gênico entre uma subpopulação engenheirada e a população do tipo selvagem sem modificar a última (ver a Fig. 8). Esta barreira pode ser ainda de mão única, permitindo que a população engenheirada receba, mas não doe material genético para a população do tipo selvagem (ver a Fig. 9). Estes ou planejamentos relacionados poderiam ser utilizados para impedir que outros drives de genes ou modificações genéticas se espalhem para membros não modificados da mesma espécie ou de espécies relacionadas. De acordo com este aspecto, apenas uma das duas populações são modificadas e dois drives de genes guiados pelo RNA separados são utilizados. O primeiro drive cria um sítio de inserção para o segundo drive. O segundo drive 1) inclui uma cópia de um gene essencial, de forma que copie tal gene à medida que se espalha para dentro de um sítio de inserção criado pelo primeiro drive e 2) neutraliza a cópia do tipo selvagem de tal gene essencial. Quando um organismo com o segundo drive cruza com um organismo com o primeiro drive, o segundo drive é copiado dentro de um sítio de inserção criado pelo primeiro drive, adicionando uma cópia do gene essencial e removendo a cópia do tipo selvagem. A alteração líquida nos genes essenciais é 0, assim a célula é viável. Quando um organismo com o segundo drive é cruzado com um organismo do tipo selvagem, o drive e seu gene essencial não podem ser inseridos no cromossomo do tipo selvagem porque não possui um sítio de inserção. Entretanto, o segundo drive ainda neutraliza a cópia do tipo selvagem. A alteração líquida nos genes essenciais é -1, assim a célula morre. Consequentemente, quaisquer cruzamentos entre os organismos que contêm o segundo drive e organismos do tipo selvagem não produzem progênie. Este aspecto da divulgação fornece um método de produção de organismos transgênicos incompatíveis com a população do tipo selvagem para impedir o espalhamento de transgenes.

EXEMPLO V

[079] Supressão e Extinção da População

[080] De acordo com certos aspectos, as nucleases guiadas pelo RNA podem criar várias formas diferentes de drives de genes de direcionamento sexual que podem ser úteis para o controle da população. Como mostrado na Fig. 4A, a expressão de Cas9 e RNAs guias que se direcionam para o cromossomo X exclusivamente durante a meiose do sexo masculino resultará em um Y-drive “meiótico” clássico análogo àqueles encontrados na natureza. O drive de gene meiótico elimina o cromossomo sexual competidor durante a meiose, produzindo um conjunto direcionado de gametas. A expressão do drive tem que ser estritamente limitada à pré-meiose ou o drive será letal. Este tipo de drive pode direcionar os gametas de organismos empregando sistemas de determinação sexual XY, ZW e até uma extensão menor XO a favor de qualquer sexo. Ainda em relação à Fig. 4A, um drive de gene guiado pelo RNA é introduzido no cromossomo Y de um espermatócito. O drive de gene guiado pelo RNA inclui um grande número de RNAs guias complementares às sequências alvos sobre o cromossomo X. Quando o drive de gene guiado pelo RNA for expresso, os RNAs guias e a nuclease de Cas9 se colocalizam no cromossomo X onde a nuclease de Cas9 cria quebras de filamento duplo tornando o cromossomo X inoperável. Após a meiose, apenas o esperma que possui o cromossomo Y será viável.

[081] De maneira importante, nucleases de Cas9 ortogonais devem ser capazes de evitar o silenciamento do cromossomo meiótico. Os aspectos da presente divulgação são direcionados para o uso de um primeiro drive de gene guiado pelo RNA que é descrito aqui sobre um cromossomo Y para a expressão de Cas9 com o RNA guia adequado antes de produzir esperma em que a Cas9 expressa e o RNA guia adequado cortam um autossomo e um segundo drive de gene guiado pelo RNA que codifica uma segunda Cas9 e o RNA guia adequado é inserido no autossomo. Durante a espermatogênese, o segundo drive de gene guiado pelo RNA no autossomo é expresso e a segunda Cas9 expressa e o RNA guia adequado cortam o cromossomo X tornando-o assim inoperável. Este método permite o corte do cromossomo X mesmo em espécies em que os cromossomos X e Y não são expressos durante a espermatogênese. Como mostrado na Fig. 4B, Cas9 faz com que o cassete que codifica Cas9B seja copiado partindo do cromossomo sexual em um autossomo no início do desenvolvimento, onde fica livre para eliminar o cromossomo sexual competidor durante a meiose. De acordo com um aspecto, drives de genes guiados pelo RNA que direcionam um sexo particular são fornecidos sobre o cromossomo sexual para o qual direcionam a população. Por exemplo, indivíduos do sexo masculino possuem cromossomos Y em mamíferos, de forma que um drive que induz as populações em direção a indivíduos do sexo masculino tenha que estar sobre o cromossomo Y, uma vez que ajuda o cromossomo Y a fazer mais cópias dele mesmo. Uma vez que os cromossomos sexuais de mamíferos não são expressos durante a meiose (a formação de esperma e óvulo), duas cópias de Cas9 podem ser utilizadas para facilitar a inserção apropriada dos drives em um cromossomo que quando expressos produzirão uma Cas9 que cortará o cromossomo sexual. A primeira Cas9 atua no início do desenvolvimento, bem antes da formação de esperma e corta um autossomo (cromossomos que não são sexuais que não são silenciados durante a meiose) permitindo assim a inserção de um drive de gene guiado pelo RNA que codifica uma segunda Cas9 no autossomo. Esta segunda Cas9 é expressa partindo do autossomo durante a formação de esperma e corta o cromossomo X, garantindo assim que o esperma mais viável contenha o cromossomo Y. O método descrito anteriormente, portanto, utiliza dois drives de genes guiados pelo RNA em que um é inserido em um autossomo que pode ser expresso para induzir as populações em direção a indivíduos do sexo masculino na situação em que os cromossomos sexuais não podem expressar os genes durante a meiose.

[082] Como mostrado na Fig. 4C, drives de direcionamento sexual “zigóticos” eliminam irmãos de sexo oposto durante o estágio zigótico ou pós-zigótico (ver Rice e Friberg 2008 incorporado aqui como referência em sua totalidade). De maneira importante, estes não requerem padrões de altamente específicos para funcionarem. Os drives X eliminam zigotos do sexo masculino simplesmente através do direcionamento aos sítios sobre o cromossomo Y (Fig. 4C). Nos drives Y, um cassete de drive do gene se copia no lugar de um gene essencial sobre o cromossomo X, cuja perda é complementada em indivíduos do sexo masculino por uma cópia inserida em outro local sobre o cromossomo Y de direcionamento (Fig. 4D). Pode ser necessário ajustar a expressão do gene essencial transplantado para realizar a compensação de dosagem em algumas espécies.

[083] Em relação à Fig. 4C, um espermatócito do tipo selvagem cria um esperma do tipo selvagem com um cromossomo X e um esperma do tipo selvagem com um cromossomo Y. É fornecido um oócito com um drive de gene guiado pelo RNA com um ou mais RNAs guias complementares ao cromossomo Y, que é referido como um “oócito de drive X”. Quando o esperma do tipo selvagem com o cromossomo Y é combinado com o oócito, o drive de gene guiado pelo RNA é expresso, o RNA guia e a nuclease de Cas9 se colocalizam no cromossomo Y onde a nuclease de Cas9 cria quebras de filamento duplo no cromossomo Y tornando o cromossomo Y inoperável e produzindo assim um zigoto inoperável. Em contraste, quando o esperma do tipo selvagem com o cromossomo X é combinado com o oócito, o drive de gene guiado pelo RNA é expresso, o RNA guia complementar ao cromossomo X e a nuclease de Cas9 se colocalizam com o cromossomo X em que a nuclease de Cas9 cria quebras de filamento duplo no cromossomo X que é reparado por recombinação homóloga inserindo assim o drive de gene guiado pelo RNA no cromossomo X tornando o zigoto homozigoto em relação ao cromossomo X. Esta cópia do cromossomo X permanece viável porque as quebras de filamento duplo são reparadas quando o drive de gene guiado pelo RNA é copiado. A progênie resultante é toda fêmea, porque os indivíduos do sexo masculino não são viáveis devido à perda do cromossomo Y. Estas fêmeas possuem uma vantagem em relação às outras fêmeas que não codificam um drive de gene guiado pelo RNA porque não têm que competir com irmãos do sexo masculino por recursos. Consequentemente, o cromossomo X com um drive de gene guiado pelo RNA possui uma vantagem de capacidade física. Em relação à Fig. 4D, os drives Y zigóticos codificam um gene essencial normalmente encontrado sobre o cromossomo X e utilizam um cassete de drive do gene para eliminar tal gene essencial do cromossomo X. É inserido o drive Y partindo do cromossomo X paterno para o materno, deixando zigotos do sexo feminino sem quaisquer cópias do gene essencial. Em particular, é fornecido um espermatócito com um cromossomo Y que possui um gene essencial proveniente do cromossomo X e um drive de gene guiado pelo RNA que codifica um ou mais RNAs guias complementares ao gene essencial sobre o cromossomo X. O cromossomo X do espermatócito inclui ainda o mesmo drive de gene guiado pelo RNA. O espermatócito produz um esperma com o cromossomo Y e um esperma com o cromossomo X. O esperma com o cromossomo Y é combinado com um oócito do tipo selvagem que possui um cromossomo X com o gene essencial. Quando o drive de gene guiado pelo RNA for expresso, o um ou mais RNAs guias se colocalizam com a nuclease de Cas9 no cromossomo X onde a nuclease de Cas9 corta fora o gene essencial do cromossomo X. Entretanto, uma vez que o gene essencial do cromossomo X está presente sobre o cromossomo Y, o zigoto será viável. Em contraste, quando o esperma com o cromossomo X incluindo o drive de gene guiado pelo RNA se combina com o oócito do tipo selvagem com o cromossomo X, o um ou mais RNAs guias expressos se colocalizam com a nuclease de Cas9 no cromossomo X onde a nuclease de Cas9 corta fora o gene essencial do cromossomo X. Uma vez que o gene essencial não existe mais no oócito, o oócito não é viável.

[084] O benefício de capacidade física de drives zigóticos variará dependendo do grau de competição entre os irmãos, da extensão do investimento parental na prole e da dinâmica de cruzamento nos adultos. Todos os drives Y zigóticos devem produzir pelo menos tanto quanto, senão mais, filhos que cromossomos Y do tipo selvagem competidores e nenhum destes filhos terá que competir com as irmãs. Diferentemente de outros tipos de drives, a faixa de hospedeiro de drives Y zigóticos pode ser restrita garantindo que os cruzamentos com espécies relacionadas em risco específicas ou subpopulações que não são alvos sejam estéreis. Isto pode ser realizado através da incorporação de RNAs guias que clivam sequências únicas sobre os cromossomos X para eliminar indivíduos do sexo masculino híbridos.

[085] A liberação de um drive Y tornará a população local extinta se mutações capazes de bloquear o drive não surgirem rapidamente sobre o cromossomo X ou um dos autossomos. O drive pode ser interrompido e eventualmente eliminado pela liberação de organismos que carregam cromossomos sexuais que são imunes ao corte. O monitoramento e o controle rigorosos podem impedir a extinção total.

[086] As nucleases guiadas pelo RNA também podem criar cromossomos Y “com filhas estéreis” menos agressivos que podem eliminar populações, mas não se espalham como um drive (Fig. 10A). Uma cópia de Cas9 sobre o cromossomo Y que direciona um gene essencial ligado ao X para a fertilidade do sexo feminino ao invés da viabilidade irá ainda eliminar o potencial reprodutivo da progênie do sexo feminino, mas não fornecerá vantagem para os filhos. Devido ao custo menor da atividade de Cas9, um Y de filhas estéreis eventualmente será superado de forma competitiva pelo cromossomo Y do tipo selvagem, mas não antes causando supressão grave da população se introduzido em números suficientemente grandes. Esta abordagem está intimamente relacionada aos métodos de letalidade e de esterilidade específicas para o sexo feminino que são desenvolvidos para o controle de populações de insetos e de peixes, mas é provável que seja tanto mais direta para sua construção quanto mais estável na evolução devido a sua localização sobre o Y.

[087] Abordagens híbridas para controlar a população poderiam combinar as vantagens do drive Y e métodos de filhas estéreis (Fig. 5A-B). Por exemplo, um cromossomo Y que se direciona tanto a um gene essencial quanto a um gene de fertilidade do sexo feminino se conduzirá rapidamente ao longo da população porque é um drive Y. Entretanto, perderia sua vantagem de capacidade física após encontrar um drive de gene padronizado subsequentemente liberado que codifica novamente o gene essencial, mas não o gene de fertilidade do sexo feminino, sobre o cromossomo X. Fêmeas híbridas crescerão para serem inférteis ao invés de morrerem embrionariamente, causando supressão contínua sem extinção.

[088] Uma abordagem relacionada para controlar a população utiliza drives de genes guiados pelo RNA para interromper um ou mais genes que são 1) necessários para a fertilidade ou a viabilidade, mas 2) uma cópia intacta satisfaz grandemente a função. Tal drive cortaria e reporia o gene alvo nas células de linhagem germinativa de organismos que herdam uma cópia do drive e uma cópia do gene do tipo selvagem em qualquer momento após a função do gene ser requerida. Por exemplo, um gene necessário para o desenvolvimento gônadas e para a fertilidade subsequente poderia ser cortado e substituído por um drive de gene guiado pelo RNA logo antes da meiose. Uma vez que um organismo que herdou apenas uma cópia já teria sofrido do desenvolvimento de gônada correto porque a cópia do tipo selvagem satisfaz essa finalidade, este teria fertilidade normal. Entretanto, a maioria ou toda a prole herdaria o drive devido à cópia do drive logo antes da produção de esperma e/ou óvulo. Este planejamento permite que o drive seja espalhado ao longo da população quando é raro porque a maioria dos eventos de cruzamento produzirá mais indivíduos que herdam uma cópia do drive e uma cópia do tipo selvagem. Mais tarde, os cruzamentos entre dois indivíduos que carregam o drive produzirão prole estéril, levando ao colapso de uma população. Este cenário foi modelado extensivamente como descrito em: Burt, A. Site-specific selfish genes as tools for the control and genetic engineering of natural populations. Proc. Biol. Sci. 270, 921-928 (2003). Deredec, A., Burt, A. & Godfray, H. C. J. The population genetics of using homing endonuclease genes in vector and pest management. Genetics 179, 2013-2026 (2008). North, A., Burt, A. & Godfray, H. C. J. Modelling the spatial spread of a homing endonuclease gene in a mosquito population. J. Appl. Ecol. 50, 1216-1225 (2013), dos quais cada um é incorporado aqui como referência em suas totalidades. Os métodos de restrição da expressão gênica às células de linhagem germinativa e/ou ao período de tempo antes da meiose são conhecidos pelos peritos na arte.

EXEMPLO VI

[089] Aplicações

[090] Os drives de genes descritos aqui possuem utilidade prática particular na erradicação de doenças infecciosas e no controle de espécies invasivas. Tais drives de genes Cas9 guiados pelo RNA podem ser utilizados para espalhar rapidamente alelos protetores através das espécies ameaçadas ou próximas de serem ameaçadas tais como anfíbios. Tais drives de genes Cas9 guiados pelo RNA também podem ser utilizados para imunizar populações selvagens que servem comumente como reservatórios para vírus humanos através do direcionamento dos vírus de dsDNA com Cas9 e vírus de RNA com o maquinário de RNAi partindo de uma espécie estranha carregada pelo drive. Os vetores causadores de doenças podem ser engenheirados para serem incapazes de alcançar o agente patogênico ou podem ser eliminados utilizando um drive Y descrito aqui, isto é, um drive do gene Cas9 guiado pelo RNA que inibe a propagação de um cromossomo X. Similarmente, pragas invasivas e ecologicamente destrutivas poderiam ser localmente controladas ou erradicadas utilizando drives Y. Pode-se prevenir que animais domesticados contribuam com genes para espécies selvagens relacionadas e populações ferais são controladas para minimizar os danos ecológicos e para reduzir a necessidade de abrigos e agências de resgate. Similarmente, plantas de cultivo e animais transgênicos poderiam ser geneticamente separados de seus primos não modificados, assim como poderiam as espécies ameaçadas em risco de extinção pela diluição genética partindo de parentes mais abundantes ou invasivos. Finalmente, os drives de genes poderiam ser utilizados para testar diretamente hipóteses em relação à importância evolutiva e ecológica de genes, proporções sexuais e especiação em ambientes naturais.

[091] Os drives de genes descritos aqui possuem utilidade prática particular com doenças disseminadas por vetores. O número de vítimas humanas de doença infecciosa transmitida por vetor é surpreendente. A malária sozinha mata mais de 650.000 pessoas a cada ano, a maioria delas crianças, enquanto afeta mais 200 milhões com febres debilitantes que devastam economicamente suas sociedades. Dengue, febre amarela, tripanossomíase, leishmaniose, doença de Chagas e doença de Lyme são causadas por outros agentes patogênicos que se espalham utilizando vetores. Todas estas podem ser potencialmente reduzidas ou até mesmo eliminadas através da condução de alterações no vetor que previnem a transmissão. Cientistas identificaram várias interrupções gênicas candidatas ou genes inseridos que interferem na transmissão da malária (Ito e outros Nature 2002, PMID:12024215: Dong e outros PloS Pathogens 2012, PMID: 22216006; Isaacs e outros, PNAS 2012, PMID: 22689959) e outras doenças bem estudadas (Franz e outros PNAS 2006, PMID: 16537508), mas não para muitos outros agentes patogênicos. Consequentemente, os aspectos da presente divulgação são direcionados para a eliminação direta das espécies de vetores com um drive Y. No caso da malária, esta estratégia é particularmente promissora contra vetores de mosquitos emergentes que preferem picar e descansar em ambientes externos, uma vez que estes comportamentos são altamente resistentes às estratégias de controle atuais concentradas em torno aspersão de inseticidas em ambientes internos e redes de mosquito nas camas. Embora todas as espécies de vetores tenham que ser direcionadas em certa área para que seja interrompida a transmissão, a doença será permanentemente erradicada se os nichos ecológicos recém-desocupados forem preenchidos com espécies que não são vetores competidoras. Significativamente, esta estratégia requer pouco ou nenhum entendimento da biologia molecular do vetor, mas inevitavelmente acarreta na extinção local ou possivelmente global das espécies de vetores.

[092] Os drives de genes descritos aqui possuem utilidade prática particular no controle de espécies invasivas. Uma das consequências de danos ambientais mais importantes da atividade econômica global é o transporte de espécies invasivas, que frequentemente causa perturbação ecológica e a extinção de espécies nativas. Ecossistemas isolados tais como aqueles em ilhas pequenas são especialmente vulneráveis. Os drives Y de Cas9 possuem enorme potencial de promover biodiversidade através do controle ou até mesmo da erradicação destas espécies de ilhas individuais ou possivelmente continentes inteiros. O planejamento de sequências de drive únicas para as espécies invasivas, que incorporam RNAs guias que degradarão os cromossomos X de parentes em risco e utilizando drives de especiação para tornar as espécies alvos geneticamente incompatíveis com seus parentes direcionam o drive para as espécies selecionadas e reduzem o risco de transferência entre espécies sem modificar diretamente todas as espécies relacionadas. As espécies relacionadas podem ser protegidas através da liberação de drives de genes padronizados específicos para a espécie que codificam novamente os sítios necessários para a função do drive Y. O risco de que o drive Y poderia ser espalhado da espécie invasiva de volta para o habitat nativo é insignificante para espécies que invadem apenas através da ação humana intencional, tal como peixes de água doce e sapos-cururu, mas o espalhamento do drive Y é quase certo para ratos e outros clandestinos invasivos. Populações nativas podem sempre ser protegidas da extinção através da liberação de um drive de recodificação X ou até mesmo um cromossomo X resistente. Como um exemplo, populações invasivas de espécies de baixa mobilidade tal como a carpa asiática são excelentes candidatos para a eliminação direta através do drive Y. (Fig. 6A) Devido ao fato de que o fluxo gênico requereria introdução humana deliberada, é provável que a erradicação local seja permanente e que possa ser conseguida sem se forçar a recodificação da população nativa. Em contraste, ratos e outras espécies invasivas altamente móveis não podem ser permanentemente eliminados salvo a extinção total das espécies. Entretanto, estes poderiam ser controlados através da liberação periódica de um drive de recodificação padronizado nas populações nativas e de um drive Y com efeito de filhas estéreis (Y-Drive-SD) através das populações invasivas (Fig. 6B).

EXEMPLO VII

[093] Segurança Agrícola e Sustentabilidade

[094] Os aspectos da presente divulgação são direcionados para o uso dos métodos de Cas9 descritos aqui para controlar, reduzir ou eliminar ervas daninhas e pragas associadas à agricultura. Uma praga refere-se geralmente a uma planta ou um animal prejudicial para seres humanos ou preocupações humanas tal como com a agricultura ou a produção de animais de fazenda. O termo praga pode incluir qualquer organismo vivo que é invasivo ou prolífico, prejudicial, importuno, nocivo, destrutivo, uma moléstia para plantas ou animais, humanos ou preocupações humanas, gado, estruturas humanas, ecossistemas selvagens etc. O termo praga também pode incluir animais daninhos, erva daninha, parasitas e agentes patogênicos de plantas e animais. Uma erva daninha de acordo com a presente divulgação pode se referir a uma planta considerada indesejável em uma situação particular. Em um sentido amplo, uma erva daninha pode ser considerada uma praga que é uma planta. Os exemplos comuns são plantas indesejadas em ambientes controlados por humanos, tais como campos da fazenda, jardins, gramados e parques. O termo “erva daninha” também pode incluir qualquer planta que cresce ou se reproduz agressivamente ou que é invasiva fora de seu habitat nativo.

[095] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, os métodos de Cas9 são utilizados para inserir no genoma de uma célula de linhagem germinativa de uma erva-daninha ou uma praga um ou mais “drives de sensibilização” guiados pelo. Um drive de sensibilização é um drive de gene que é descrito aqui e também pode ser referido como um “drive de gene de sensibilização”. Consequentemente, um “drive de sensibilização” é um drive de gene que é inserido no DNA genômico e que é transferido para a progênie e torna a progênie sensível a um estímulo externo. De acordo com um aspecto, o “drive de sensibilização” guiado pelo RNA confere à erva-daninha ou à praga como um resultado de ser incorporado no DNA genômico uma sensibilidade prejudicial a um composto ou reagente químico, tal como toxicidade. Desta maneira, o crescimento e a proliferação da erva- daninha ou da praga podem ser controlados através do contato da erva-daninha ou da praga com um composto ou um reagente químico ou uma condição que ordinariamente não seria tóxica para a erva-daninha ou a praga. Desta maneira, o fenótipo da erva-daninha ou da praga foi alterado pelo drive de gene de sensibilização como um resultado da inserção do drive de gene em uma célula de linhagem germinativa e da transferência para a progênie. Desta maneira, a referência a uma erva-daninha ou uma praga pode ser feita à população que resulta da inserção inicial do drive de gene de sensibilização em uma célula de linhagem germinativa e do cruzamento com uma população do tipo selvagem. A população resultante pode ser referida como uma população alterada ou uma população sensibilizada ou uma população alterada geneticamente.

[096] De acordo com a presente divulgação, o termo “sensibilidade” como se refere a uma erva-daninha ou uma praga significa uma reação prejudicial, tal como toxicidade, a um composto ou um reagente químico ou uma condição à qual a erva- daninha ou a praga é exposta. O drive de sensibilização é um drive de gene que é descrito aqui que altera o DNA genômico para resultar em uma reação prejudicial, tal como toxicidade, em resposta a um composto, um reagente químico ou uma condição à qual a erva-daninha ou a praga é exposta. Os “drives de sensibilização” também podem ser referidos aqui como “drives de toxicidade” ou “drive de gene de toxicidade” até a extensão em que um reagente químico, um composto ou uma condição é tóxica para a erva-daninha ou a praga como um resultado de ter o drive de sensibilização ou o drive de toxicidade presente em seu genoma. De acordo com um aspecto, o drive de sensibilização ou o drive de toxicidade é adicionado de forma exógena ao organismo da linhagem germinativa. Desta maneira, o drive de gene de sensibilização ou o drive de gene de toxicidade é um ácido nucleico estranho, muito embora, de acordo com certa aplicação, este pode incluir uma sequência nativa da espécie da erva-daninha ou da praga, mas não presente em uma célula de linhagem germinativa dentro da qual deve ser introduzida. De acordo com um aspecto, o drive de sensibilização ou o drive de toxicidade é um ácido nucleico estranho que é adicionado de forma exógena no organismo da linhagem germinativa utilizando uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e RNA guia associado como descrito aqui.

[097] De acordo com um aspecto, a erva-daninha ou a praga pode ser resistente a um herbicida ou um pesticida particular ou a erva-daninha ou a praga pode ter desenvolvido ao longo do tempo uma resistência ao herbicida ou ao pesticida particular. A evolução das ervas daninhas ou das pragas aos herbicidas ou aos pesticidas é um problema importante para a agricultura. Os métodos descritos aqui utilizam “drives de sensibilização” guiados pelo RNA para conferir sensibilidade do organismo a um regente químico, um composto ou uma condição que era previamente não tóxica ou tinha baixa toxicidade para o organismo, de forma que a progênie do organismo seja sensível ao reagente químico, ao composto ou à condição e o organismo morra como um resultado da toxicidade ou a proliferação é reduzida ou o organismo é tornado estéril de forma que não possa se reproduzir. Desta maneira, a sequência de ácido nucleico dentro do drive de gene de sensibilização é expressa pelo organismo, tal como uma erva-daninha ou uma praga e a expressão do ácido nucleico altera o fenótipo do organismo tornando-o vulnerável ao reagente químico, ao composto ou à condição.

[098] De acordo com um aspecto adicional, um drive ou drives de sensibilização são utilizados para substituir alelos resistentes (tais como aqueles com mutações de resistência) por seus equivalentes ancestrais (ou que não foram submetidos à mutação) para restaurar a sensibilidade. Consequentemente, um organismo que desenvolveu resistência a um herbicida ou um pesticida através da mutação de um alelo pode ser tornado sensível ao herbicida ou ao pesticida através da remoção da forma mutante do alelo que possui resistência e da substituição do mesmo pela forma não mutante que possui sensibilidade. Desta maneira, a forma não mutante do alelo é estranha para o organismo ou a população de organismos uma vez que esta inclui a forma mutante do alelo. Consequentemente, um drive de gene de sensibilização poderia reverter mutações conhecidas que conferem resistência a pesticidas ou herbicidas existentes. Os drives de genes guiados pelo RNA são utilizados para reverter alterações no genoma que se espalharam ao longo das populações de um organismo. De acordo com este aspecto, a liberação de um segundo drive poderia substituir uma ou todas as alterações causadas por um primeiro drive, como é descrito aqui. Desta maneira, a população de organismos é caracterizada pela presença de um primeiro drive de gene e uma primeira sequência de ácido nucleico que confere um fenótipo tal como toxicidade que foi primeiramente introduzido em uma célula de linhagem germinativa para produzir tal fenótipo na progênie e que foi então transferido para a progênie. Entretanto, através de mutações ou de outra maneira, o fenótipo é perdido. Neste contexto, um segundo drive de gene com uma segunda sequência de ácido nucleico que confere o mesmo fenótipo é introduzido em uma célula de linhagem germinativa com ou sem o primeiro ácido nucleico ser removido e a segunda sequência de ácido nucleico é transportada para dentro da progênie. Desta maneira, o primeiro ácido nucleico do drive de gene é substituído pelo segundo ácido nucleico do drive de gene, por exemplo, para resultar na toxicidade, através da reversão da mutação que cria resistência.

[099] De acordo com um aspecto adicional, um drive de sensibilização pode carregar uma enzima que converte a pró-droga que tornaria uma molécula de pró- droga tóxica para os organismos que expressam a enzima. Desta maneira, é produzida uma enzima e o organismo deve ser colocado em contato com a pró- droga, a enzima irá converter a pró-droga em um composto ou um reagente químico que é tóxico para o organismo, tal como uma erva-daninha ou uma praga. Várias combinações de pró-droga/enzima serão evidentes para um perito na arte com base na presente divulgação.

[0100] Ainda de acordo com um aspecto adicional, um drive de sensibilização pode substituir um gene essencial por uma versão que é fortemente inibida por uma molécula pequena particular. Consequentemente, a expressão do gene seria inibida ou o produto de expressão do gene seria inibido. Tal inibição pode resultar na morte do organismo ou em uma proliferação menor. Devido ao fato de que, em algumas modalidades, os drives de sensibilização não teriam efeito sobre a ausência de sua molécula associada - e em alguns casos vice versa - estes confeririam controle muito fino sobre a geografia e a extensão da supressão da população com risco ecológico mínimo.

[0101] De acordo com um exemplo de aspecto, um drive de sensibilização é utilizado para reverter mutações permitindo que o verme da raiz de milho ocidental resista a toxinas Bt (ver Gassman e outros PNAS, vol. 111 no. 14, páginas 51415146, doi: 10.1073/pnas.1317179111 (2014) incorporado aqui como referência em sua totalidade) ou que a avoadinha-do-Canadá e o Amaranthus palmeri resistam ao herbicida glifosato (Ver Gaines, T. A. e outros Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 1029-1034 (2010) e Ge, X., d’ Avignon, D. A., Ackerman, J. J. & Sammons, R. D. Pest Manag. Sci. 66, 345-348 (2010) dos quais cada um é incorporado aqui como referência em suas totalidades), um herbicida atualmente essencial para a agricultura não cultivada ambientalmente sustentável. De acordo com este aspecto, organismos que possuem o drive de sensibilização são liberados na população selvagem, cujos organismos individuais podem ou não ter resistência e o drive de sensibilização é transferido para a progênie, cujo resultado é a redução da resistência da população da progênie (em que a resistência está presente na população selvagem) e o aumento da sensibilidade da população da progênie a um herbicida ou um pesticida particular (em que a resistência está presente na população selvagem). Deve ser entendido que apenas alguns membros da população do tipo selvagem podem ter resistência, mas que o drive de sensibilização se espalhará tanto para os membros sensíveis quanto resistentes da população do tipo selvagem resultando em uma população da progênie que possui o drive de sensibilização. De acordo com um aspecto, os organismos que incluem o drive ou os drives de sensibilização seriam liberados em áreas não tratadas com herbicida ou pesticida criando assim reservatórios de drives de sensibilização que poderiam se espalhar em áreas adjacentes que são tratadas com um herbicida ou um pesticida.

[0102] De acordo com um aspecto, são fornecidos métodos em que um drive ou drives de sensibilização são utilizados para agir contra mutações que levam à resistência. De acordo com este aspecto, a introdução de tais drives de sensibilização no genoma de uma população do tipo selvagem, inicialmente e ao longo de períodos de tempo subsequentes, que desenvolveu resistência a um pesticida ou um herbicida como um resultado de uma mutação ou mutações reverte o efeito da mutação ou mutações de fornecer resistência e torna o pesticida ou herbicida tóxico para a população. Tal método permite o uso de qualquer herbicida ou pesticida fornecido indefinidamente porque as mutações que conferem resistência são impedidas ou substituídas dessa maneira “recuando” sempre que a resistência possa ocorrer.

[0103] De acordo com um aspecto adicional, uma planta ou um animal pode ser tornado vulnerável a um reagente químico ou um composto ou uma condição através da inclusão em seu genoma (e, portanto, em sua progênie) de um drive ou drives de sensibilização que tornam o reagente químico, o composto ou a condição tóxica para a planta ou o animal, tal como uma erva-daninha ou uma praga. Consequentemente, os compostos que podem ser considerados seguidos para os seres humanos podem ser tóxicos para plantas ou animais como um resultado da inclusão de um drive ou drives de sensibilização dentro do genoma da planta ou do animal tornando assim o reagente químico ou o composto tóxico para a planta ou o animal. De acordo com este aspecto, os compostos existentes considerados seguros e/ou eficientes poderiam ser aplicados contra organismos que não são atualmente vulneráveis aos mesmos se um drive de sensibilização tiver que fornecer um gene sensível proveniente de uma espécie afetada ou de um isolado de laboratório ou substituir um gene importante para a capacidade física por um gene sensível.

[0104] De acordo com um aspecto adicional, são fornecidos métodos em que os drives de sensibilização são utilizados para tornar populações de pragas vulneráveis a moléculas, compostos ou reagentes químicos que são inofensivos a outras formas de vida. Embora pesticidas e herbicidas atuais - mesmo aqueles denominados como “orgânico” - sejam escolhidos em relação a sua toxicidade em direção a pragas de insetos e ervas daninhas, estes frequentemente prejudicam espécies que não são pragas ou até mesmos seres humanos porque as vias afetadas são conservadas ao longo das espécies. De acordo com a presente divulgação, são fornecidos métodos em que é fornecido um gene ou genes que conferem sensibilidade a um organismo a uma molécula normalmente não prejudicial. A introdução do drive de gene de sensibilidade converte eficientemente tal molécula em um pesticida ou um herbicida altamente específico para as espécies de praga ou de erva daninha particulares modificadas pelo drive. A combinação do drive e a molécula é letal para o organismo. Um exemplo de modalidade é o uso de uma combinação de enzima/pró-droga em que a enzima é introduzida no genoma do organismo e é expressa. Quando o organismo é exposto à pró-droga, a enzima converte a pró-droga em um herbicida ou um pesticida ativo. Os candidatos análogos que demonstram o princípio para este aspecto da presente divulgação são terapias antivirais ou anticâncer em que uma enzima específica para o vírus ou para o tumor produzida localmente ativa um pró-fármaco. Os exemplos incluem o par de citosina desaminase/5-fluorocitosina e o par nitrorredutase/CB1954. No caso de drives de sensibilização, a enzima seria fornecida para as espécies alvo pelo drive de gene, fazendo com que a pró-droga se torne um pesticida específico. Outro exemplo de pares inclui enzimas metabólicas primárias alteradas para se tornarem fortemente inibidas por reagentes químicos particulares. Por exemplo, uma invertase engenheirada pode se tornar não funcional na presença de um reagente químico xenobiótico predominantemente biologicamente inerte tal como sucralose ou polissacarídeos halogenados relacionados. Um drive de sensibilização substituiria o gene da invertase natural do organismo pela versão engenheirada, tornando-o sensível ao composto de outra maneira predominantemente inerte. Um perito seria facilmente capaz de indentificar pares de enzima/reagente químico úteis adequados para esta finalidade com base nos métodos de drive de sensibilização descritos aqui.

[0105] Um perito será facilmente capaz de identificar ervas daninhas dentro do âmbito da presente divulgação como incluindo aquelas plantas de ervas daninhas prejudiciais para plantas de cultivo agrícola. Tais ervas daninhas podem ou não se denominadas “erva daninha nociva” sob lei federal ou estadual. Por exemplo, a avoadinha-do-Canadá e o Amaranthus palmeri são considerados ervas daninhas que são prejudiciais para plantas de cultivo agrícola, mas não podem ser denominados ervas daninhas nocivas. Os exemplos de ervas daninhas denominadas ervas daninhas nocivas pelo USDA incluem as seguintes.

[0106] Aquáticas

[0107] Ervas daninhas adicionais dentro do âmbito da presente divulgação incluem Atríplex, Propagação; Carrapicho, Pendente; Capim-Cevadinha, Felpudo; Cenoura, selvagem; Camomila, inodora; Morrião-dos-Passarinhos, comum; Pepino, carrapicho; Dente-de-Leão; Pulicária, Canadá; Flixweed; Gramínea, Fedorenta; Gramínea, Tufted love; Camapu, Liso; Urtiga de cerca viva, Pântano; Solano da Carolina; Cavalinha, Campo; Alface, Espinhoso; Mercurial, com três sementes; Muhly, Wire-stemmed; Labresto; Capim-Pansco; Sandbur, com espinho longo; Persicária, Brejo; Serralha, Anual; Serralha, Perene; Verônica, Milho; Ervilhaca, em tufos; Violeta, Campo; Waterhemp, Comum; Espécies de Azedinha; Capim-de-Burro; Trepadeira; Tachagem de folha ampla; Bardana; Comum lambsquarters; Charlie Rastejante; Dente-de-Leão; Vara-de-Ouro; Sanguinária Japonesa; Kudzu; Eufórbio frondoso; Cardo-leiteiro; Sumagre venenoso; Erva-de-Santiago; Azeda; Striga; Erva- de-São-João; Sumagre; Alianto; Cenoura selvagem; Azedinha e Yellow nutsedge.

[0108] Ervas daninhas adicionais identificadas pelo nome científico incluem Acalypha rhomboidea Raf.; Agrostis gigantea Roth; Amaranthus rudis L.; Atriplex patula L.; Bidens cernua L.; Bromus tectorum L.; Cenchrus longispinus Hack.; Conyza Canadensis; Daucus carota L.; Descurainia sophia L.; Equisetium arvense L.; Eragrostis spp.; Lactuca scariola L.; Lapsana communis L.; Matricaria perforata Merat.; Muhlenbergia frondosa Poir.; Oxallis dillenii Jacq; Physalis virginiana Mill.; Polygonum coccineum Muhl.; Sicyos angulatus L.; Solanum carolinense L; Sonchus arvensis L.; Sonchus oleraceus L.; Stachys palustris L.; Stellaria media; Taraxacum officinale Weber.; Veronica avensis L.; Vicia cracca L.; e Viola avensis L.

[0109] Deve ser entendido que ervas daninhas adicionais dentro do âmbito da presente divulgação podem ser identificadas por fontes facilmente disponíveis para os peritos na arte.

[0110] Herbicidas comuns aos quais uma erva daninha pode ser resistente ou desenvolver resistência incluem os seguintes. Um perito na arte será facilmente capaz de identificar herbicidas tóxicos para espécies de ervas daninhas particulares com base na presente divulgação.

[0111] Deve ser entendido que herbicidas adicionais dentro do âmbito da presente divulgação podem ser identificados por fontes facilmente disponíveis para os peritos na arte.

[0112] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com o milho incluem as seguintes.

[0113] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com o algodão incluem as seguintes.

[0114] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com o carvalho incluem as seguintes.

[0115] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com o pinheiro incluem as seguintes.

[0116] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com pequenos grãos incluem as seguintes.

[0117] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com a soja incluem as seguintes.

[0118] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com a uva incluem as seguintes.

[0119] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com a palmeira incluem as seguintes.

[0120] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com as plantas solanáceas incluem as seguintes.

[0121] As pragas dentro do âmbito da presente divulgação associadas com drupa incluem as seguintes.

[0122] Pragas agrícolas adicionais incluem os nematoides de cisto a seguir.

[0123] Pragas agrícolas adicionais incluem exotic wood borer ou bark beetles a seguir.

[0124] Pragas agrícolas adicionais incluem os moluscos a seguir.

[0125] Pragas agrícolas adicionais incluem as traças a seguir.

[0126] Deve ser entendido que as pragas adicionais dentro do âmbito da presente divulgação podem ser identificadas por fontes facilmente disponíveis para os peritos na arte.

[0127] Pesticidas comuns em geral dentro do âmbito da presente divulgação aos quais uma praga pode ser resistente ou desenvolver resistência incluem os seguintes: algicidas, antifouling agents, agentes antimicrobianos, agentes de atração, biopesticidas, biocidas, agentes desinfetantes, fungicidas, agentes para fumigação, inseticidas, miticidas, pesticidas microbiano, moluscicidas, nematicidas, feromônios, repelentes e rodenticidas.

[0128] As espécies de pesticida a seguir são úteis dentro do âmbito da presente divulgação: Glifosato, Atrazina, Metam Sódio, Metolaclor-S, Acetoclor, Dicloropropeno, 2,4-D, Brometo de Metila, Cloropicrina, Pendimentalina, Etefon, Clorotalonil, Metam Potássio, Clorpirifos, Hidróxido de Cobre, Sulfato de Cobre, Simazina, Trifluralin, Propanil, Mancozeb, Aldicarb, Acefato, Diuron, MCPA, Paraquat, Dimetenamida, Carbaril, MCPP, MSMA, Piretroides, Malation, Dicamba, Pelarganoc Ácido, Fluoreto de Sulfurila, Triclopir, Paradiclorobenzeno, Naftaleno, Clorpirifos, Naled, Dicrotofos, Fosmet, Forato, Diazinon, Dimetoato, Azinfos-Metil e N,N-dietil-meta-toluamida (repelente de insetos). Um perito na arte será facilmente capaz de identificar espécies de pesticidas adicionais utilizando informação disponível publicamente de bancos de dados, por exemplo, a lista EPA de pesticidas registrados no world wide website iaspub.epa.gov/apex/pesticides/f?p=chemicalsearch:1 e com referência aos ingredientes ativos como pesticidas convencionais mais comumente utilizados nos U.S. Agricultural, Home and Garden, Industry, Commercial, and Government Market Sectors como compilado pela EPA e disponíveis publicamente no world wide website www.epa.gov/opp00001/pestsales/.

[0129] Um perito na arte será facilmente capaz de identificar pesticidas tóxicos para espécies de pragas particulares com base na presente divulgação.

[0130] Consequentemente, os aspectos da presente divulgação são direcionados para um método de alteração de uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo incluindo a introdução na célula de linhagem germinativa de uma primeira sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um ou mais RNAs guias e incluindo sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora e incluindo um ácido nucleico de sensibilização cuja expressão é prejudicial para o organismo quando o organismo for exposto a um regente químico, um composto ou uma condição, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais localizações alvos sobre o DNA genômico de um primeiro cromossomo e um segundo cromossomo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e a sequência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, a expressão da primeira sequência de ácido nucleico estranha para produzir a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o um ou mais RNAs em que a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia associado se colocalizam com uma localização alvo associada sobre o primeiro cromossomo do DNA genômico e o segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, a inserção da primeira sequência de ácido nucleico estranha no primeiro cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem e a inserção da primeira sequência de ácido nucleico estranha no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linhagem germinativa homozigota em relação à sequência de ácido nucleico estranha e a expressão do ácido nucleico de sensibilização tornando o organismo resultante sensível ao reagente químico, ao composto ou à condição de forma que o organismo resultante sucumba ou seja tornado estéril quanto exposto ao reagente químico, ao composto ou à condição.

[0131] De acordo com um aspecto, a expressão do ácido nucleico de sensibilização aumenta a toxicidade do reagente químico, do composto ou da condição ao organismo. De acordo com um aspecto, a célula de linhagem germinativa é crescida em um organismo e o ácido nucleico de sensibilização é transferido para a progênie para criar uma população de organismos que inclui o ácido nucleico de sensibilização e em que o ácido nucleico de sensibilização aumenta toxicidade do reagente químico, do composto ou da condição ao organismo. De acordo com um aspecto, o organismo é uma erva-daninha ou uma praga. De acordo com um aspecto, o ácido nucleico de sensibilização é um gene de sensibilização que substitui um gene existente. De acordo com um aspecto, o gene de sensibilização é a versão ancestral exata ou com códons alterados de um gene mutante existente em populações do tipo selvagem, de forma que a versão mutada atual seja substituída pela forma ancestral. De acordo com um aspecto, o gene existente adquiriu uma mutação que contribui para a resistência a um pesticida, um herbicida ou um fungicida. De acordo com um aspecto, o reagente químico ou o composto é um pesticida, um herbicida ou um fungicida. De acordo com um aspecto, o pesticida, o herbicida ou o fungicida é um de: uma toxina Bt produzida por Cry1A.105, CryIAb, CryIF, Cry2Ab, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, mCry3A ou VIP, 2,4-D ou glifosato. De acordo com um aspecto, o gene de sensibilização substitui um gene existente cuja função é necessária para que o organismo sobreviva ou se reproduza. De acordo com um aspecto, o reagente químico é uma pró-droga e o gene de sensibilização codifica uma enzima que converte a pró-droga correspondente. De acordo com um aspecto, o par enzima/reagente químico é citosina desaminase/5-fluorocitosina ou nitrorredutase/CB1954.

[0132] De acordo com certo aspecto da presente divulgação, é fornecido um método de controle de uma população de erva-daninha ou de praga que inclui um drive de gene de sensibilidade no genoma da população de erva-daninha ou de praga em que o drive de gene de sensibilidade torna a população de erva-daninha ou de praga vulnerável à toxicidade quando na presença de um reagente químico, um composto ou uma condição que inclui o contato da população de erva-daninha ou de praga com o reagente químico, o composto ou a condição em uma quantidade eficiente para matar a erva-daninha ou a praga, reduzir a proliferação da erva- daninha ou da praga ou tornar a erva-daninha ou a praga estéril para inibir a proliferação. De acordo com um aspecto, o reagente químico ou o composto é um herbicida ou um pesticida ou um fungicida.

[0133] De acordo com certo aspecto da presente divulgação, é fornecido um método de alteração de uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo incluindo um primeiro drive de gene de sensibilização que inclui a introdução na célula de linhagem germinativa de uma segunda sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um ou mais RNAs guias e que inclui sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora e incluindo uma segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização cuja expressão é prejudicial para o organismo quando o organismo for exposto a um regente químico, um composto ou uma condição, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais localizações alvos sobre o DNA genômico de um primeiro cromossomo incluindo o primeiro drive de gene de sensibilização e um segundo cromossomo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa incluindo o primeiro drive de gene de sensibilização, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e a sequência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias da segunda sequência de ácido nucleico estranha ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, expressando a segunda sequência de ácido nucleico estranha para produzir a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o um ou mais RNAs em que a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia associado se colocalizam com uma localização alvo associada sobre o primeiro cromossomo do DNA genômico e o segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, em que a primeira sequência de ácido nucleico estranha é removida, inserindo a segunda sequência de ácido nucleico estranha no primeiro cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem e inserindo a segunda sequência de ácido nucleico estranha no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linhagem germinativa homozigota em relação à segunda sequência de ácido nucleico estranha e a expressão da segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização tornando o organismo resultante sensível ao reagente químico, ao composto ou à condição de forma que o organismo resultante sucumba ou seja tornado estéril quanto exposto ao reagente químico, ao composto ou à condição. De acordo com um aspecto, o organismo resultante é introduzido em uma população do tipo selvagem de forma que tal progênie do organismo resultante e um organismo do tipo selvagem inclua a segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização. De acordo com um aspecto, o organismo é uma erva-daninha ou uma praga.

[0134] De acordo com certo aspecto da presente divulgação, é fornecido um método de alteração de uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo incluindo um primeiro drive de gene de sensibilização que inclui a introdução na célula de linhagem germinativa de uma segunda sequência de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um ou mais RNAs guias e incluindo sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora e que inclui uma segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização cuja expressão é prejudicial para o organismo quando o organismo for exposto a um regente químico, um composto ou uma condição, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais localizações alvos sobre o DNA genômico de um primeiro cromossomo incluindo o primeiro drive de gene de sensibilização e um segundo cromossomo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa incluindo o primeiro drive de gene de sensibilização, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e a sequência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias da segunda sequência de ácido nucleico estranha ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, expressando a segunda sequência de ácido nucleico estranha para produzir a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e o um ou mais RNAs em que a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA e um RNA guia associado se colocalizam com uma localização alvo associada sobre o primeiro cromossomo do DNA genômico e o segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína nuclease que se liga ao DNA guiada pelo RNA cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, inserindo a segunda sequência de ácido nucleico estranha no primeiro cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem e inserindo a segunda sequência de ácido nucleico estranha no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linhagem germinativa homozigota em relação à segunda sequência de ácido nucleico estranha e expressando a segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização tornando o organismo resultante sensível ao reagente químico, ao composto ou à condição de forma que o organismo resultante sucumba ou seja tornado estéril quanto exposto ao reagente químico, ao composto ou à condição. De acordo com certos aspectos, o organismo resultante é introduzido em uma população do tipo selvagem de forma que tal progênie do organismo resultante e um organismo do tipo selvagem inclua a segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização. De acordo com certos aspectos, o organismo é uma erva-daninha ou uma praga.

EXEMPLO I

[0135] Plasmídeos e Cassetes Genômicos

[0136] Os cassetes de drives de genes foram sintetizados partindo de gBlocks (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) e inseridos em células SK1 através da modificação do genoma mediada por Cas9 como a seguir. Os RNAs guias para cada drive foram clonados nos plasmídeos que contêm p416-Cas9 com controle de expressão pelo promotor SNR52. Ver DiCarlo, J. E. e outros Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 41,4336-4343 (2013). Braços de homologia de 60 pares de bases com o lócus alvo foram adicionados sobre ambas as extremidades do cassete de drive do gene via PCR e 5 ug de produto da PCR foram cotransformados com os plasmídeos p416-Cas9-gRNA. Os drives de genes integrados de forma correta foram verificados através do sequenciamento e os plasmídeos p416-Cas9-gRNA foram curados utilizando a seleção com Ácido 5-Fluoroorótico (FOA).

[0137] Para criar o drive do gene ADE2 contendo URA3, o drive do gene ADE2 foi clonado próximo ao gene URA3 de Candida albicans no plasmídeo pAG60. O cassete de URA3 inteiro e o drive de gene foram amplificados por PCR e inseridos utilizando modificação do genoma mediada por Cas9 no lócus ADE2 de células SK1 haploides.

[0138] O terminal C recodificado do gene ABD1 e o drive de gene correspondente foram sintetizados como um gBlock para remover homologia e gerar mutações na sequência da semente através de alterações sinônimas. O terminado TEF1 foi inserido na extremidade a 3’ do gene ABD1 codificado novamente entre o gene e o gRNA uma vez que ABD1 compartilha um terminador com o gene VHC1. O cassete inteiro foi integrado no genoma de SK1 haploide utilizando modificação do genoma mediada por Cas9.

[0139] O plasmídeo p416-Cas9-gRNA (que confere prototrofia ao uracil) é um variante do plasmídeo p414-Cas9-gRNA descrito anteriormente (que confere prototrofia ao triptofano) (ver DiCarlo, J. E. e outros Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013)) (Addgene #43802). Um ou o outro foi utilizado em cada experiment de cruzamento. O vetor pRS413 foi transformado em tipos de células selecionados para conferir prototrofia à histidina como um marcador para selecionar em relação a células diploides. Os genótipos das cepas são fornecidos na Tabela 1 a seguir.

EXEMPLO II

[0140] Experimentos de Cruzamento de Leveduras

[0141] As cepas de levedura SK1 que contêm o drive haploides e do tipo selvagem haploides do tipo sexual oposto foram misturadas em quantidades equivalentes em meio líquido YPAD e incubadas durante toda a noite. Os diploides resultantes foram lavados em água esterilizada e plaqueadas sobre meio seletivo em relação a ambos os genótipos parentais. A Tabela 2 a seguir detalha os cruzamentos específicos.Tabela 2

EXEMPLO III

[0142] Esporulação e Dissecção de Tétrades

[0143] Após o cruzamento em YPAD líquido e a seleção em relação aos diploides sobre as placas de seleção, as placas de seleção foram raspadas para dentro de 10 mL de meio de seleção e foram crescidas durante toda a noite a 30°C. Uma cultura de YPAD de 5 mL fresca foi então inoculada até e DO=0,1 e crescida 45 horas a 30°C. A cultura inteira foi então lavada duas vezes em 10 mL de água, inoculada em 2 mL de meio de esporulação (acetato de potássio a 1%) e incubada à temperatura ambiente durante 3 dias ou até que os esporos ficassem visíveis. As células esporuladas foram suspensas em 50 μL de uma solução estoque de zimoliase (50 μg/mL em sorbitol a 1 M) e incubadas a 30°C durante 5 minutos, transferidas para o gelo, diluídas com 150 μL de H2O gelada, microdissecadas utilizando um microscópio de disseção de tétrades Zeiss e os esporos crescidos sobre placas de YPAD foram isolados.

EXEMPLO IV

[0144] Seleção em Relação à Função de URA3

[0145] Os esporos dissecados foram crescidos em meio completo sintético (SC) e então colocados sobre meio SC bem como meio SC sem uracil. Para aumentar a coloração vermelha, todos os meios sólidos SC utilizados para obtenção de imagens das placas continham hemissulfato de adenina 0,5 X (concentração final de 0,08 mM).

EXEMPLO V

[0146] PCR Quantitativa

[0147] Pares de iniciadores candidatos foram planejados para amplificar regiões curtas específicas para cada drive ou a sequência do tipo selvagem substituída pelo drive, bem como o gene ACT1 como um controle. Todas as sequências são incluídas na informação complementar. O DNA genômico foi extraído utilizando o Método A que é descrito em Looke e outros.31.

[0148] O KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) foi utilizado para realizar a reação de qPCR junto com 25 ng de DNA genômico. A eficiência de amplificação e a especificidade relativa de cada par de iniciadores foram medidas através da amplificação de diluições do DNA genômico de haploides do tipo selvagem e do drive, respectivamente e os pares com melhor desempenho e melhor combinados foram selecionados para uso (ver a seguir para todos os iniciadores utilizados). As reações de PCR quantitativo foram realizadas sobre o DNA genômico isolado de cada haploide parental bem como de diploides produzidos partindo de três eventos de cruzamento independentes. Três reações (réplicas técnicas) foram realizadas por amostra sem uma máquina LightCycler 96 da Roche.

EXEMPLO VI

[0149] Cálculos

[0150] Foi calculada a média dos resultados provenientes de três réplicas técnicas para cálculos. Com a finalidade de calcular diretamente a proporção de alelos antes da amplificação por PCR, foram primeiramente determinadas as eficiências dos pares de iniciadores diferentes. As eficiências foram calculadas partindo de corridas de qPCR de diluições em série (6 ordens de grandeza) na forma de: Eficiência=10-1/inclinação

[0151] Os valores de R2 eram maiores que 0,99 em todos os casos exceto para um par (ade2::URA3+sgRNA).

[0152] As proporções alélicas foram calculadas na forma de: xa . EaCt,a = xb . EbCt,b xa/ xb = EbCt,b / EaCt,a

[0153] com xa e xb sendo a concentração inicial de drive e DNA wt,

[0154] Ea e Eb a eficiência dos respectivos pares de iniciadores e

[0155] Ct,a e Ct,b os valores de Ct para cada amostra.

EXEMPLO VII

[0156] Eficiência de Drives de Genes CRISPR/Cas9 em Levedura

[0157] Para medir diretamente a eficiência de drives de genes CRISPR/Cas9 em levedura, foi desenvolvido um sistema que utiliza a coloração vermelha que se forma na levedura que não possui cópias funcionais do gene ADE2. Ver Chamberlain, N., Cutts, N. S. & Rainbow, C. The formation of pigment and arylamine by yeasts. J. Gen. Microbiol. 7, 54-60 (1952). Como representado na Fig. 13A, se haploides ADE2_ vermelhos forem cruzados com haploides do tipo selvagem de coloração creme, os diploides heterozigotos resultantes herdam uma cópia funcional e são, portanto, de coloração creme. Quando estes diploides sofrem meiose e se reproduzem através de esporulação, metade dos haploides resultantes herda a cópia rompida e é consequentemente vermelha; a outra metade herda a cópia intacta e tem coloração creme (Fig. 13A).

[0158] Como representado na Fig. 13B, se os haploides vermelhos codificarem um drive de gene funcional que corta e substitui o lócus ADE2 intacto herdado do parental do tipo selvagem, sua progênie diploide será vermelha. Devido ao fato de que estes diploides vermelhos terão duas cópias rompidas de ADE2, toda a sua prole haploide esporulada herdará uma cópia rompida e consequentemente será também vermelha. Assim, a eficiência de corte de um drive de gene que se direciona para e substitui ADE2 pode ser avaliada simplesmente plaquenado diploides e contando a fração que é vermelha.

[0159] Uma construção de drive de gene que se direciona para ADE2 foi feita. Para evitar fuga acidental do drive de gene para a natureza, Cas9 e RNAs guias foram separados para evitar a criação de um cassete com tendência de herança autossuficiente. Consequentemente, as construções codificavam um RNA guia que se direcionava para ADE2, enquanto Cas9 era fornecido partindo de plasmídeo epissomal. Os haploides vermelhos foram cruzados com a levedura do tipo selvagem do tipo sexual oposto na presença ou ausência do plasmídeo e plaqueados sobre meio que seleciona diploides. Como mostrado na Fig. 13C, quase todas as colônias eram vermelhas na presença do plasmídeo, indicando corte altamente eficiente da cópia de ADE2 herdada do parental do tipo selvagem. Na ausência de Cas9, nenhuma colônia de diploide vermelho era observada, demonstrando que o drive pode se espalhar apenas nas populações de levedura de laboratório que o fornecem.

[0160] Para verificar se os alelos ADE2 dos parentais do tipo selvagem tinham sido perdidos, os diploides cruzados foram esporulados e sua progênie haploide resultante foi examinada. Como mostrado na Fig, 13D, após a dissecção de diploides 18 cas9+, uma proporção perfeita de 4:0 de haploides vermelhos:cremes foi observada, confirmando que todas as cópias do lócus ADE2 estavam interrompidas. Em contraste, 18 diploides cas9— de coloração creme forneceram uma proporção de 2:2 de vermelhos: cremes, indicando a herança normal do drive inativado e dos alelos do tipo selvagem.

[0161] Para determinar se as interrupções de ADE2 nos diploides vermelhos eram o resultado da cópia bem sucedida do elemento do drive por recombinação homóloga, 72 haploides derivados dos diploides cas9+ dissecados foram sequenciados. Todas as colônias sequenciadas continham drives intactos sem mutações adicionais, indicando que a mobilização do drive era eficiente e ocorria em alta fidelidade.

[0162] Um drive de gene ADE2 foi modificado como mostrado no esquema na Fig. 14A para conter um alelo URA3 in cis, que permite que cepas de levedura modificadas no laboratório cresçam na ausência de suplementação de uracil. Este elemento do drive foi testado em relação à capacidade de drives de genes de “carregarem” um elemento de carga associado quando copiados dentro de um lócus alvo. Os haploides de drive que contêm URA3 foram cruzados com haploides do tipo selvagem na presença de um plasmídeo Cas9 epissomal, os diploides foram selecionados (dos quais todos eram vermelhos) e esporulados e 18 tétrades foram dissecadas. Como era o caso para o drive de gene ADE2 original, todas as células haploides esporuladas formavam colônias vermelhas. Como mostrado na Fig. 14B, todos cresciam normalmente quando a réplica era plaqueada sobre meio deficiente em relação a uracil, indicando que o elemento de carga de URA3 era copiado eficientemente com o drive.

[0163] Os drives de genes que se direcionam e recodificam um gene essencial poderiam evitar a resistência ao drive mesmo em populações grandes uma vez que os eventos de reparo propenso a erros que modificam o sítio alvo causarão letalidade. Genes não essenciais, mas, todavia, importantes, poderiam ser similarmente editados devido ao fato de que os mutantes criados por eventos de NHEJ ainda seriam menos adequados que o próprio drive. Para testar a recodificação de genes essenciais durante a inserção do drive, um terceiro drive de gene que se direcionada a ABD1 mostrado no esquema na Fig. 14C foi construído. Ver Mao, X., Schwer, B. & Shuman, S. Mutational analysis of the Saccharomyces cerevisiae ABD1 gene: cap metiltransferase activity is essential for cell growth, Mol. Cell. Biol. 16, 475-480 (1996).

[0164] Uma cepa haploide que contém um alelo ABD1 codificado novamente a montante de um RNA guia que se direciona à sequência codificadora de ABD1 natural foi cruzada com células do tipo selvagem na presença de Cas9. Foram selecionadas células diploides das quais 18 esporularam 18 das mesmas. 72 segregantes foram sequenciados. Todos continham o lócus ABD1 codificado novamente e os RNAs guias, demonstrando assim drives de genes baseados na recodificação do gene essencial.

[0165] Os drives de genes foram copiados partindo de uma cepa de laboratório em um grupo diverso de cepas de S. cerevisiae nativas. Os haploides contendo o drive ADE2 foram cruzados com 6 cepas do tipo selvagem filogeneticamente e fenotipicamente diversas de S. cerevisiae haploide. Ver Liti, G. e outros Population genomics of domestic and wild yeasts, Nature 458, 337-341 (2009). Ver também a Fig. 15A. Para medir de forma quantitativo a eficiência da cópia do drive de gene para cada cruzamento, a PCR quantitativa foi realizada nas populações de todos os diploides utilizando um conjunto de iniciadores específicos para o drive e outro conjunto planejado para amplificar alelos do tipo selvagem ou interrompidos por NHEJ. Como mostrado na Fig. 15B que foi gerada utilizando BoxPlot (ver Spitzer, M., Wildenhain, J., Rappsilber, J. & Tyers, M. BoxPlotR: a web tool for generation of box plots. Nat. Methods 11, 121-122 (2014)), a fração de cromossomos diploides que contém o drive de gene ADE2 era maior que 99% independentemente do parental do tipo selvagem, demonstrando o uso do drive em bases genéticas diversas. A adição do gene de carga URA3 não alterava consideravelmente esta eficiência. O drive ABD1 foi copiado em uma taxa equivalente.

[0166] A estabilidade do drive ao longo de eventos de cópia sucessivos foi investigada. Como mostrado na Fig. 15B, várias proles haploides dos diploides de drives de genes ADE2 da primeira rodada foram cruzadas com haploides do tipo selvagem contendo o plasmídeo de expressão de Cas9. Todas as construções de drives de genes de segunda geração direcionavam a herança na mesma eficiência, demonstrando uma capacidade continuada de se espalhar através da reprodução sexual de populações ao longo de gerações.

[0167] São fornecidas as sequências de iniciadores e de gBlock de modificação do genoma a seguir

Claims

1. Método para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: introduzir na célula de linhagem germinativa uma primeira sequência de áci-do nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e um ou mais RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanquea- dora e uma segunda sequência flanqueadora, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais loca-lizações alvo no DNA genômico de um primeiro cromossomo e um segundo cromos-somo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Cas9 e a se-quência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias ficam entre a pri-meira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo no primeiro cromossomo ou no segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo no primeiro cromossomo ou no segundo cromossomo do DNA genômico, expressar a primeira sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e o um ou mais RNAs, em que a proteína Cas9 e um RNA guia asso-ciado se co-localizam à uma localização alvo associada no primeiro cromossomo do DNA genômico e no segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cli-va o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, inserir a primeira sequência de ácido nucleico exógena no primeiro cromos- somo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem e inserir a primeira sequência de ácido nucleico exógena no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linha-gem germinativa homozigota em relação à sequência de ácido nucleico exógena, e ainda compreende introduzir na célula de linhagem germinativa uma se-gunda sequência de ácido nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e um ou mais RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma pri-meira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais loca-lizações alvo que foram alteradas pela primeira sequência de ácido nucleico exóge-na, expressar a segunda sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e o um ou mais RNAs, em que a proteína Cas9 e um RNA guia asso-ciado se co-localizam à uma localização alvo associada no cromossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cliva o cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem para remover a primeira se-quência de ácido nucleico exógena, e inserir a segunda sequência de ácido nucleico exógena no cromossomo do DNA genômico no sítio de clivagem.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína Cas9 cria uma quebra de filamento duplo ou uma quebra de filamento simples.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína Cas9 é Cas9 nickase.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) pelo menos uma localização alvo fica dentro de um gene essencial e a primeira sequência de ácido nucleico exógena é inserida adjacente a e substituindo parte do gene essencial; (ii) a primeira sequência de ácido nucleico exógena é inserida por recombi- nação homóloga; (iii) a célula de linhagem germinativa é uma célula de fungo, uma célula ve-getal, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero; ou (iv) o um ou mais RNAs guias incluem entre 10 a 250 nucleotídeos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína Cas9 se co-localiza com um RNA guia associado em uma pluralidade de localizações alvos associadas para clivar o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo em uma pluralidade de sítios de clivagem.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a clivagem na pluralidade de sítios de clivagem remove uma sequência de DNA que é substituída com a primeira sequência de ácido nucleico exógena por recombi- nação homóloga.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) a segunda sequência de ácido nucleico exógena inclui modificações ge-néticas diferentes da primeira sequência de ácido nucleico exógena; ou (ii) a segunda sequência de ácido nucleico exógena inclui a sequência do tipo selvagem do cromossomo que foi modificada pela primeira sequência de ácido nucleico exógena.

8. Método para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano em uma pluralidade de genes CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: introduzir na célula de linhagem germinativa uma primeira sequência de ácido nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e uma pluralidade de RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora, junto com uma ou mais se-quências de ácido nucleico exógenas adicionais que correspondem à pluralidade de genes, em que a pluralidade de RNAs guias incluem um ou mais RNAs guias espe-cíficos ao gene que são complementares a uma ou mais localizações alvos em uma pluralidade de genes no DNA genômico de um cromossomo da célula de linhagem germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Cas9 e a se-quência de ácido nucleico que codifica a pluralidade de RNAs guias ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção de uma das localizações alvos no cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da mesma localização alvo no cromossomo do DNA genômico, em que cada da uma ou mais sequências de ácido nucleico contêm uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora que cor-responde a uma primeira porção e uma segunda porção das localizações alvos re-manescentes, expressar a primeira sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e a pluralidade de RNAs, em que a proteína Cas9 e RNAs guias as-sociados se co-localizam à uma pluralidade de localizações alvo associadas no cro-mossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico em uma pluralidade de genes de uma maneira específica ao sítio de cliva-gem, inserir a primeira sequência de ácido nucleico exógena no cromossomo do DNA genômico no sítio de clivagem, e compreende ainda introduzir na célula de linhagem germinativa uma segun-da sequência de ácido nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e uma pluralidade de RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanqueadora e uma segunda sequência flanqueadora, em que a pluralidade de RNAs guias são complementares à pluralidade de localizações alvo que foram alteradas pela primeira sequência de ácido nucleico exógena, expressar a segunda sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e a pluralidade de RNAs guias, em que a proteína Cas9 e RNAs guias associados se co-localizam com localizações alvo associadas no cromossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cliva o cromossomo do DNA genômico nas locali-zações alvo associadas de uma maneira específica ao sítio de clivagem para remo-ver a primeira sequência de ácido nucleico exógena, e inserir a segunda sequência de ácido nucleico exógena no cromossomo do DNA genômico no sítio de clivagem.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sequência de ácido nucleico exógena inclui modificações genéticas diferentes da primeira sequência de ácido nucleico exógena.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sequência de ácido nucleico exógena inclui a sequência do tipo selvagem do cromossomo que foi modificada pela primeira sequência de ácido nu- cleico exógena.

11. Método para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano, não vegetal CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: introduzir na célula de linhagem germinativa uma primeira sequência de áci-do nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e um ou mais RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanquea- dora e uma segunda sequência flanqueadora, e incluir um ácido nucleico de sensibilização cuja expressão é prejudicial para o organismo quando o organismo for exposto a um produto químico, composto ou condição, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais loca-lizações alvo no DNA genômico de um primeiro cromossomo e um segundo cromos-somo de um par de cromossomos da célula de linhagem germinativa, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Cas9 e a se-quência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias ficam entre a pri-meira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo no primeiro cromossomo ou no segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo no primeiro cromossomo ou no segundo cromossomo do DNA genômico, expressar a primeira sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e o um ou mais RNAs, em que a proteína Cas9 e um RNA guia asso-ciado se co-localizam à uma localização alvo associada no primeiro cromossomo do DNA genômico e no segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cli-va o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, inserir a primeira sequência de ácido nucleico exógena no primeiro cromos-somo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem, e inserir a primeira sequência de ácido nucleico exógena no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linha-gem germinativa homozigota em relação à sequência de ácido nucleico exógena, e expressar o ácido nucleico de sensibilização que torna o organismo resultante sensível ao produto químico, composto ou condição de forma que o organismo resultante sucumba ou seja tornado estéril quando exposto ao produto químico, composto ou condição.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) a expressão do ácido nucleico de sensibilização aumenta a toxicidade do produto químico, composto ou condição para o organismo; (ii) a célula de linhagem germinativa é crescida em um organismo e o ácido nucleico de sensibilização é transferido para a progênie para criar uma população de organismos que inclui o ácido nucleico de sensibilização e em que o ácido nucleico de sensibilização aumenta a toxicidade do produto químico, composto ou condição para o organismo; (iii) o organismo é uma praga; (iv) o ácido nucleico de sensibilização é um gene de sensibilização que substitui um gene existente, em que opcionalmente: (a) o gene de sensibilização é a versão ancestral exata ou com códons alterados de um gene mutante existente em populações do tipo selvagem, de forma que a versão mutada atual seja substituída pela forma ancestral; (b) o gene existente adquiriu uma mutação que contribui para a resis-tência a um pesticida ou fungicida; ou (c) o gene de sensibilização substitui um gene existente cuja função é necessária para que o organismo sobreviva ou se reproduza; (v) o produto químico ou composto é um pesticida ou fungicida; ou (vi) o produto químico é um pró-fármaco e o gene de sensibilização codifica uma enzima que converte o pró-fármaco correspondente, em que opcionalmente o par enzima/produto químico é citosina desaminase/5-fluorocitosina ou nitrorredu- tase/CB1954.

13. Método para alterar uma célula de linhagem germinativa eucariótica de um organismo não humano, não vegetal CARACTERIZADO pelo fato de que inclui um primeiro drive de gene (gene drive) de sensibilização que compreende: introduzir na célula de linhagem germinativa uma segunda sequência de ácido nucleico exógena que codifica uma proteína Cas9 e um ou mais RNAs guias, e incluir sequências promotoras correspondentes e uma primeira sequência flanquea- dora e uma segunda sequência flanqueadora, e incluir uma segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização cuja expressão é prejudicial para o organismo quando o organismo for exposto a um produto químico, composto ou condição, em que o um ou mais RNAs guias são complementares a uma ou mais loca-lizações alvos no DNA genômico de um primeiro cromossomo que inclui o primeiro drive de gene de sensibilização e um segundo cromossomo de um par de cromos-somos da célula de linhagem germinativa que inclui o primeiro drive de gene de sensibilização, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Cas9 e a se-quência de ácido nucleico que codifica o um ou mais RNAs guias da segunda se-quência de ácido nucleico exógena ficam entre a primeira sequência flanqueadora e a segunda sequência flanqueadora, em que a primeira sequência flanqueadora inclui uma primeira sequência idêntica a uma primeira porção da localização alvo no primeiro cromossomo ou no segundo cromossomo do DNA genômico, em que a segunda sequência flanqueadora inclui uma segunda sequência idêntica a uma segunda porção da localização alvo sobre o primeiro cromossomo ou o segundo cromossomo do DNA genômico, expressar a segunda sequência de ácido nucleico exógena para produzir a proteína Cas9 e o um ou mais RNAs, em que a proteína Cas9 e um RNA guia asso-ciado se co-localizam à uma localização alvo associada no primeiro cromossomo do DNA genômico e o segundo cromossomo do DNA genômico e a proteína Cas9 cliva o primeiro cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira es-pecífica ao sítio de clivagem e cliva o segundo cromossomo do DNA genômico na localização alvo de uma maneira específica ao sítio de clivagem, inserir a segunda sequência de ácido nucleico exógena no primeiro cromos-somo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem, e inserir a segunda sequência de ácido nucleico exógena no segundo cromossomo do par de cromossomos do DNA genômico no sítio de clivagem para tornar a célula de linha-gem germinativa homozigota em relação à segunda sequência de ácido nucleico exógena, e expressar a segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização que tor-na o organismo resultante sensível ao produto químico, composto ou condição de forma que o organismo resultante sucumba ou seja tornado estéril quando exposto ao produto químico, composto ou condição.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) o organismo resultante é introduzido em uma população do tipo selvagem de forma que a progênie do organismo resultante e um organismo do tipo selvagem inclua a segunda sequência de ácido nucleico de sensibilização; ou (ii) o organismo é uma praga.