JP6744391B2 - Ｔｏｓｏ活性を調節するための方法および組成物 - Google Patents

Ｔｏｓｏ活性を調節するための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１２年３月１６日に出願の米国仮出願番号第６１／６１２，１８３号、２０１２年５月１１日に出願の米国仮出願番号第６１／６４６，１４３号、および２０１２年１１月２９日に出願の米国仮出願番号第６１／７３１，４２８号に基づく優先権の利益を主張し、全ての目的について、これらの内容の全体が参照により本明細書に援用される。
発明の背景
ＴｏｓｏまたはＦａｉｍ３（Ｆａｓアポトーシス誘導分子３）は、元来はＦａｓ誘導されたアポトーシスの細胞死メディエーターとして、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞白血病株）におけるレトロウイルスの過剰発現スクリーンを介して特徴づけられる一回膜貫通細胞表面受容体である（Ｈｉｔｏｓｈｉ， Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｓｏ，ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｆａｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９８．８（４）：ｐ．４６１−７１）。その後の研究により、ＴｏｓｏはＩｇＭの未解明の受容体であることが示唆された。また、Ｔｏｓｏの発現は、特に進行性の形態の慢性リンパ性白血病、すなわちＣＬＬと相関するように思える。
治療標的としてのＴｏｓｏの用途を明らかにするために、インビボでのその役割の特徴付に対する、またＴｏｓｏに結合すること、および／またはその活性を調節することができる物質を含む組成物に対する需要がある。
したがって、本発明は、Ｔｏｓｏ活性を調節する、およびＴｏｓｏが関与している疾患および障害を治療するための方法および組成物を提供する。
一つの態様において、本発明は、被験体における自己免疫疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む組成物で被験体を治療する工程を含む、方法を提供する。例示的な実施形態において、自己免疫疾患は、限定されないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、狼蒼またはＩ型糖尿病である。
さらなる態様において、本発明は、被験体におけるＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、治療上有効な量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む組成物で被験体を治療する工程を含む、方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、被験体における喘息を治療する方法であって、治療上有効な量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む組成物で被験体を治療する工程を含む、方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドまたはその断片もしくは欠失変異体を投与することによって、被験体における糖尿病、喘息、多発性硬化症または慢性関節リウマチを治療する方法を提供する。さらなる実施形態において、被験体におけるＴｏｓｏ活性は、被験体において減少される。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜２５のうちの任意の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドを投与することによって、被験体における糖尿病、喘息、多発性硬化症または慢性関節リウマチを治療する方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、被験体における癌、アレルギー、ＣＯＰＤ、ハイパーＩｇＭ症状群、狼蒼または好中球増加関連障害を治療する方法であって、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の治療上有効な量を含む組成物で被験体を治療する工程を含む、方法を提供する。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ＮＰ＿００５４４０．１、すなわちヒトＴｏｓｏアイソフォームにおけるアミノ酸Ｐ２１〜Ｇ２５１のアミノ酸残基を含む（Ｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）を参照され、全ての目的について、および特にＴｏｓｏの細胞外ドメインに関連した全ての教示について、その全体が本明細書に援用される）。
なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ヒトＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメインを含む。さらなる実施形態において、本発明において有用な可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７のアミノ酸残基１８〜２５３を含む。
なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の方法で使用される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５または６に記載のアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５または６に対して少なくとも９０％の配列同一性をもったアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５または６の欠失変異体を含む。なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の方法で使用される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１〜２５の任意の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、多量体である。なおさらなる実施形態において、多量体は６個の単量体で構成される。なおさらなる実施形態において、多量体Ｔｏｓｏタンパク質の各単量体は、配列番号６に記載の配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、Ｔｏｓｏポリペプチド活性を阻害する方法であって、膜結合したＴｏｓｏ受容体を含む細胞に対して可溶性Ｔｏｓｏポリペプチドを適用することを含む、方法を提供する。
なおさらなる態様において、本発明は、配列番号５または配列番号６のポリペプチドを含む組成物を提供する。一つの実施形態において、組成物は、Ｔｏｓｏ活性を阻害する。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、多量体である。なおさらなる実施形態において、多量体は、６個の単量体を含み、各単量体は、配列番号６に記載の配列を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載したタンパク質のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載したタンパク質のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質をコードする単離された核酸を発現する宿主細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ヒトＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメイン、Ｆｃ領域および多量体化タグを含む融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、細胞外ドメインは、ヒトＴｏｓｏタンパク質のアミノ酸２１〜２５１を含む。なおさらなる実施形態において、多量体化タグは、配列番号４を含む。さらに他の実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号３を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、上記した融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、上記した融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、配列番号８〜２４に対して、または配列番号７のアミノ酸残基１８〜２５１を含むポリペプチド領域に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された可溶性ポリペプチドを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかをコードするポリペプチドを製造する方法であって、その方法は、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供することを含み、その細胞は、前記ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養される、方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。
図１は、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおける炎症に関連したデータを示す。図１Ａは、デジタルカリパーを使用して足関節厚の変化により測定される関節の炎症の測定値を示す。図１Ｂは、可視腫脹および可動性に基づく各関節についての疾患重症度スコアを示す。図１Ｃは、流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）におけるリンパ球集団のフローサイトメトリー解析を示す。 図２は、Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび野生型マウスで、ＯＶＡで誘導される喘息モデルからのデータを示す。図２Ａは、喘息モデル誘導の模式図である。図２Ｂは、ＤｉｆＱｕｉｋ染色によって評価された、気管支初期肺胞スペースへの好酸球遊走に関するデータを示す。図２Ｃは、スライド当たり少なくとも２００の白血球を計数することにより定量された好酸球に関するデータを示す。 図３Ａ〜３Ｃは、ＥＬＩＳＡにより評価された、ＢＡＬＦにおいてＯＶＡで誘導されるＴＨ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３に関するデータを示す。図３Ｄは、ＢＡＬＦにおけるエオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、すなわち好酸球を誘引するＣ−Ｃケモカインに関するデータを示す。図３Ｅは、平滑筋細胞におけるＴＮＦα治療に反応して産生されるエオタキシンのレベルを示す。 図４は、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおけるＩｇＥに関するデータを示す。図４Ａおよび図４Ｂは、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおける総ＩｇＥおよび特異的ＩｇＥのレベルを示し、また図４Ｃは、野生型マウスとＴｏｓｏ−／−マウスの間でのＩｇＧ１レベルを示す。 図５は、野生型マウス対照と比較したＴｏｓｏ−／−マウスのＰｅｎｈ値を示す。 図６は、野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスにおいてＭＯＧ誘導されたモデルでのＥＡＥスコアを示す。 図７Ａは、Ｔｏｓｏ−／−および野生型樹状細胞を用いて以前に気管内に設置されたエアロゾル化ＯＶＡに反応した、野生型動物の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中におけるサイトカイン産生に関するデータを示す。図７Ｂは、ＭＯＧ３５−５５を負荷したＴｏｓｏ−／−樹状細胞と共に培養された２ｄ２マウス由来のＴ細胞の増殖を示す。図７Ｃは、ＧＰを負荷したＴｏｓｏ−／−および野生型の樹状細胞を静脈注射したＲＩＰ−ＧＰ動物における血中グルコースレベルおよびＧＰペプチドを負荷した野生型およびＴｏｓｏ−／−樹状細胞を注射されたＲＩＰ−ＧＰマウスのカプラン−メイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）のプロットを示す。ＲＩＰ−ＧＰマウスは、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）の制御下で、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）由来の主要な糖タンパク質（ＧＰ）を発現するマウスである。このようなマウスは、増加した血清グルコースのレベルで評価される糖尿病を発症する。 図８Ａは、Ｔｏｓｏ可溶性受容体の模式図である。 図８Ｂは、可溶性受容体に関するＥＬＩＳＡデータを示す。図８Ｃは、ウエスタンブロット（図８Ｃｉ）およびクーマシーブルー染色（図８Ｃｉｉ）による、Ｔｏｓｏ可溶性受容体分泌のデータ確認を示す。 図８Ｄは、Ｔｏｓｏ可溶性受容体の脾細胞への結合データを示す。 図８Ｅは、Ｔｏｓｏ−Ｆｃが、脾臓においてＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣｈｉ成熟樹状細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＢ２２０＋ Ｂ細胞に最も有意に結合することを示すさらなるデータを示す。 図８Ｆは、プレート結合したヒトＩｇＭに対するＴｏｓｏ−Ｆｃ結合のＥＬＩＳＡの結果を示す。 図８Ｇは、５０μｇのＴｏｓｏ−Ｆｃで毎日治療されたマウスにおける正常な体重増加を示す。 図９Ａは、ＯＶＡで誘導されるマウス喘息モデルのための治療プロトコルの模式図である。図９Ｂは、ＢＡＬＦにおけるＴｈ２サイトカインに関するデータを示し、また図９Ｃは、ＢＡＬＦにおける細胞実質データを示しており、これらは両者共に疾患の重症度の尺度である。 図９Ｂは、ＢＡＬＦにおけるＴｈ２サイトカインに関するデータを示し、また図９Ｃは、ＢＡＬＦにおける細胞実質データを示しており、これらは両者共に疾患の重症度の尺度である。 図１０は、本発明の実施形態の配列を提供しており、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（図１０Ａ）、ＩＬ−２シグナル配列（図１０Ｂ）、Ｆｃドメイン（図１０Ｃ）および６量体タグ（図１０Ｄ）の配列が含まれている。 図１１Ａは、可溶性受容体の多量体形の発現を可能にする６量体タグを含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の実施形態の配列を提供する。図１１Ｂは、ヒトＴｏｓｏタンパク質（ＮＰ＿００５４４０．１）の配列を提供する（配列番号７）。 図１２は、顆粒球上でのＴＯＳＯ発現を示す。ａ：ＲＮＡは、野生型（ＷＴ）マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスの脾臓および肝臓から単離した。Ｔｏｓｏ ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析し、１８Ｓ ＲＮＡ当たりの発現として表した（ｎ＝４）。ｂ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の脾細胞をＣＤ１９（Ｂ細胞）およびＣＤ３（Ｔ細胞）について染色し、またラット抗マウスＴｏｓｏ抗体またはアイソタイプ対照で同時染色した。グレー領域はアイソタイプ対照を示し、太線は抗Ｔｏｓｏ抗体での染色を示す。ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）およびＣＤ３陽性細胞（Ｔ細胞）の１つの代表的なヒストグラムが示されている。ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の脾細胞および血液白血球を、ラット抗マウスＴｏｓｏ抗体またはアイソタイプ対照を用いて、Ｇｒ１について一緒に染色した。グレーの領域はアイソタイプ対照を示し、太線はＴｏｓｏでの染色を示す。Ｇｒ１陽性細胞の１つの代表的なヒストグラムが示されている。ｄ：野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液白血球を、顆粒球およびリンパ球について、前方散乱および側方散乱により解析した。μＬ当たりの白血球が示されている（ｎ＝４）。ｅ：リンパ球は、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８−細胞）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋細胞）およびＢ細胞（Ｂ２２０＋細胞、ｎ＝４）について解析した。ｆ：野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の脾臓重量を解析した（ｎ＝４）。ｇ：脾臓リンパ球を、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８−細胞）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋細胞）およびＢ細胞（Ｂ２２０＋細胞、ｎ＝４）について解析した。 図１３は、ＴＯＳＯ欠損マウスの顆粒球においては、活性化のための閾値が低下することを示す。１３ａ：野生型マウスまたはＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液を異なる濃度のｆＭＬＰと共に３７℃で３０分インキュベートした。顆粒球の活性化は、方法に記載されているようにして、ＲＯＳ産生（ジヒドロローダミン染色）および脱顆粒（側方散乱）によって測定した。顆粒球上でゲートされた細胞の１つの代表的なドットプロットが示されている。ゲートは、活性化された顆粒球上にセットされる。活性化された顆粒球のパーセンテージが与えられている（ｎ＝６）。１３ｂ：ＷＴマウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスからの血液を、異なる濃度のＴＮＦ-αと共にインキュベートした。活性化された顆粒球のパーセンテージが与えられる（ｎ＝６）。１３ｃ：ＷＴおよびＴｏｓｏ−／−マウスからの血液を、異なる濃度のリポ多糖と共にインキュベートした。活性化された顆粒球のパーセンテージが与えられる（ｎ＝６）。１３ｄ：ＷＴマウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液を、異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦ（上清形Ｘ６３Ｏ細胞のパーセンとして与えられる）と共にインキュベートした。活性化された顆粒球の割合が与えられる（ｎ＝６）。１３ｅ：野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液を、１０％ＧＭ−ＣＳＦの上清または５００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでプライミングした。３０分後に、細胞を２μＭのｆＭＬＰで１５分間刺激した。活性化された顆粒球のパーセンテージが与えられる（ｎ＝６）。１３ｆ：ＷＴマウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液を、異なる温度で３０分間インキュベートした。脱顆粒は、側方散乱を使用して測定した。脱顆粒された細胞のパーセンテージが与えられる（ｎ＝６）。 図１４は、顆粒球における活性化閾値が内因的に調節されることを示す。方法において記載するように、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにＸ線照射し、ＣＤ４５遺伝子に点突然変異を有する野生型マウス由来の骨髄（ＣＤ４５．１、群１）、Ｔｏｓｏ−／−マウス由来の骨髄（ＣＤ４５．２、群２）または野生型骨髄（ＣＤ４５．１）とＴｏｓｏ−／−骨髄細胞の１：１混合物（ＣＤ４５．２、群３）を用いて再構成した。骨髄移植の３０日後に末梢血液をｆＭＬＰで刺激し、活性化された顆粒球について解析した。１４ａ：Ｇｒ１についてゲート制御され、かつＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２およびジヒドロローダミン（ＲＯＳ）について染色された細胞の代表的なＦＡＣＳプロットが示されている。１４ｂ：顆粒球のパーセンテージが、骨髄キメラの３つの異なる群について定量化される（ｎ＝８）。１４ｃ：側方散乱によって測定された活性化された顆粒球のパーセンテージおよび図３ａのゲートに従うＲＯＳ産生を解析した（ｎ＝８）。１４ｄ：側方散乱およびジヒドロローダミン（ＲＯＳ）の平均蛍光強度は、総顆粒球および活性化された顆粒球について解析した（ｎ＝８）。 図１５は、Ｔｏｓｏ欠損マウスにおける損なわれたリステリアの制御を示す。１５ａ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応する野生型マウスを、１×１０４ ＣＦＵのリステリアで感染させた。生存をモニターした（ｎ＝８〜１５）。１５ｂ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応する野生型マウスを、１×１０４ ＣＦＵのリステリアで感染させた。感染の後、顆粒球活性化（ＲＯＳ形成）を血液顆粒球ｄ０およびｄ２において測定した（ｎ＝４〜５）。１５ｃ：ＷＴマウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスを、１×１０６ ＣＦＵのリステリアで感染させた。ミエロペルオキシダーゼは、未処置のＷＴマウスの血漿および感染６時間後のリステリアに感染させたＷＴおよびＴｏｓｏ−／−マウスの血漿において解析した（ｎ＝４）。１５ｄ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応するＷＴマウスを、１×１０６ ＣＦＵのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）で感染させた。２０時間後に肝臓組織学を解析した。１つの代表的スライドを示す（ｎ＝４）。縮尺バー＝５０μｍ。１５ｅ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応するＷＴマウスを、１×１０４ ＣＦＵのリステリアで感染させた。１日後に、ＲＯＳ産生を脾臓および肝臓の顆粒球において測定した（ｎ＝３）。ｆ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応するＷＴマウスを、１×１０４ ＣＦＵのリステリアで感染させた。感染の３および４日後に、脾臓、肝臓および脳においてリステリア力価を解析した（ｎ＝６）。 図１６は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８の発現がＴｏｓｏによって影響されることを示す。１６ａ：Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応するＷＴマウス由来の血液顆粒球をホルマリン固定し、次いでＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８について染色した。平均蛍光発現を示す（ｎ＝６）。ｐ値は、対応スチューデントｔ検定から誘導される。１６ｂ：野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウス由来の血液を、異なる濃度のＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳで刺激した。顆粒球の上のＣＤ１１ｂについての平均蛍光発現を示す（ｎ＝６）。１６ｃ：Ｃｄ１１ｂ−／−マウスおよび対応する野生型マウス由来の血液顆粒球を２μＭ ｆＭＬＰで、または２μＭ ｆＭＬＰに加えて４０％のＧＭ−ＣＳＦ上清で刺激した。平均蛍光強度が、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８について与えられる（ｎ＝４）。１６ｄ：Ｃｄ１１ｂ−／−マウスおよび対応する野生型マウス由来の顆粒球を、２μＭ ｆＭＬＰで、または２μＭ ｆＭＬＰに加えて４０％のＧＭ−ＣＳＦ上清で刺激した。活性顆粒球のパーセンテージが与えられる（ｎ＝４）。ＲＯＳ染色の平均蛍光強度が、活性化された顆粒球と同様に総顆粒球についても与えられる（ｎ＝４）。 図１７は、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球におけるアポトーシスを示す。Ｔｏｓｏ−／−由来の血液を、３７℃において、ＧＭ−ＣＳＦ（１０％）と共に、およびＧＭ−ＣＳＦ なしでインキュベートした。アポトーシスは、１時間後および７時間後にアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）および７ＡＡＤで測定した（ｎ＝４）。 図１８は、Ｔｏｓｏ−／−マウスの感染の後のリステリア菌血症を示す。Ｔｏｓｏ−／−マウスおよび対応する野生型マウスを、１×１０６ ＣＦＵのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）で感染させた。血液リステリア力価を感染の１時間後および２０時間後に評価した（ｎ＝４）。 図１９は、高脂肪食の開始後の、野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスからのデータを示す。図１９Ａは、野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスの雄の体重を示し、これは５週齢で始まる高脂肪食の開始からモニターした。図１９Ｂは、高脂肪食後１４週の時点での両方の組のマウスにおける食物摂取の測定値を示す。 図２０Ａは、高脂肪食開始後の、野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスから得たグルコース負荷試験のデータを示す。図２０Ｂは、同じ組のマウスから得たインスリン耐性試験のデータを示す。 図２１は、正規の固形飼料（高脂肪でない）食事で維持された野生型マウスおよびＴｏｓｏ−／−マウスが、同様のレベルのグルコース耐性（図２１Ａ）およびインスリン寛容性（図２１Ｂ）を示すことを図示したデータを示す。 図２２は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質で治療前の（図２２Ａ）、および治療後の（図２２Ｂ）野生型マウスのグルコース耐性に関するデータを示す。 図２３は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質で治療されたマウス（Ｔｏｓｏ−Ｆｃ；黒四角）と比較して、ＰＢＳで治療されたマウスにおけるＥＡＥ臨床スコア（黒丸）を示す。 図２４Ａは、対照単体（黒丸）で治療されたマウスおよび可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（Ｔｏｓｏ−Ｆｃ；白四角）で治療されたマウスを比較して、関節炎マウスモデルにおけるデータを示す。図２４Ｂは、関節炎マウスモデルからのデータを示し、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで治療されたマウス（Ｔｏｓｏ−Ｆｃ；白四角）における関節炎の発生パーセントを対照（単体；黒丸）と比較している。 図２５は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで治療された脾細胞において、コラーゲンに対する減少した増殖反応を示す。 図２６は、対照（単体；黒丸）と比較したときの、関節炎マウスモデルにおける可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（Ｔｏｓｏ−Ｆｃ；白四角）の治療効果を示す。 図２７Ａは、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の異なる実施形態の配列を提供する。 図２７Ｂは、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の異なる実施形態の配列を提供する。 図２７Ｃは、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の異なる実施形態の配列を提供する。
本発明の実施は、特に明記しない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術および記載を用いてよく、それは当該分野の技術の範囲内である。このような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、ファージディスプレイおよび標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技術の特定の例示は、本願の実施例を参照することによって得ることができる。しかし、当然ながら、その他の同等な従来方法もまた使用することができる。このような従来の技術および記述は、標準的な実験室マニュアル（たとえば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に見出すことができ、これらは全部、全ての目的でその全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形の不定冠詞および定冠詞は、その内容が明確に他のことを指示しない限り、複数の対象物を含む。したがって、たとえば「ポリメラーゼ」に対する言及は、このような物質類の１つの物質または混合物をいう。また、「方法」に対する言及は、当業者に公知の同等な工程および方法等を含む。
別途定義されない限り、ここで用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における通常の熟練者が共通に理解するのと同じ意味を有する。ここで述べる全ての刊行物は、その刊行物に記載される装置、組成物、製材および方法を記載および開示する目的で、本明細書の一部として援用され、これらはここに記載する発明に関連して使用されるであろう。
ある値の範囲が与えられる場合、内容的に明確に他のことが指示されない限り、それは各介在値、下限の単位の１０分の１、その範囲の上限および下限の間および任意の他の述べられた、または述べられた範囲内の介在値が、本発明の中に包含されるものと理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、明示された範囲内の任意の特定の排除された限界に従うことを条件として、独立してこのより小さな範囲に含まれてよく、これもまた本発明に包含される。明示された範囲がこの限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界の両方のいずれかを除く範囲もまた、本発明に含まれる。
以下の記述において、多数の特定の詳細は、本発明のより完全な理解を提供するために記載される。しかし、本発明がこれらの特定の詳細の１つまたは複数なしで実施されてよいことは、当業者には明らかであろう。その他の例において、当業者に周知の特徴および手順は、発明を不明瞭にすることを回避するために記述していない。
本明細書で使用される「を含む」の用語は、組成物および方法が詳述された要素を含むことを意味する旨を意図しているが、その他を除外していない。組成物および方法を定義するために用いるときに、「本質的になる」は、組成物または方法に必須の何らかの重要なもの以外の要素を除外することを意味する。「からなる」は、請求項に記載された組成物のその他の成分のうちの微量要素より多いもの、および実質的方法工程を除くことを意味するものとする。これら移行用語の各々により定義された実施形態は、本発明の範囲内である。したがって、方法および組成物は、さらなる工程および成分を含むことができる（含むこと）、あるいは重要性でない工程および組成を含むこと（本質的になること）が意図されており、あるいは明示された方法工程または組成だけ（からなること）が意図される。
全ての数値指定、たとえばｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、範囲を含み、０．１の増分だけ変化する（＋）または（−）近似値である。また、常に明示的に述べられるものではないが、全ての数値指定には、「約」が先行するものと理解されるべきである。「約」の用語は、正確な値「Ｘ」に加えて小さな増分を加えたもの、たとえば「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」を含む。必ずしも明示されないが、本明細書において記述した薬剤は単なる例示に過ぎず、その均等物が当該技術分野において公知であることも理解されるべきである。
「組成物」は、薬剤または化合物を含む任意の物質を含んでよく、また薬剤または化合物およびその他の物質の任意の組み合わせを包含することが意図され、これらはアジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどの、担体、たとえば化合物または組成物、不活性なもの（たとえば、検出可能な薬剤または標識）または活性なものを含む。また、担体は、薬学的賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭化水素（たとえば、糖、単糖類、二等類、三糖類、四糖類およびオリゴ糖類を含む糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖などの糖誘導体；および多糖または糖ポリマー）を含み、それらは単一または組み合わせにおいて存在することができ、単独または組み合わせで１〜９９．９９重量％または容量％を含む。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等などの血清アルブミンを含む。緩衝能力においても機能することができる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等を含む。炭化水素賦形剤もまた本発明の範囲内であり、その例はフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等などの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等などの二糖類；ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等などの多糖類；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールなどのアルジトール類を含むが、限定されない。
薬理学的に許容される担体（または媒体）の用語は、生物学的に適合可能な担体または媒体の用語と互換的に用いられてよく、治療的に投与されるべき細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、信頼できる医学的判断の範囲内にある薬剤、細胞、化合物、材料、組成物および／または投与量形態をいうが、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の厄介な問題を伴わずに、合理的な利益／リスク比と釣り合った状態で人間および動物の組織に接触して使用するのに適する。本発明における使用に適した薬学的に許容可能な担体は、液体、半固体（たとえば、ゲル）および固体物質（たとえば、細胞足場およびマトリックス、管、シートおよび当該技術において公知かつ本明細書でさらに詳細に記載する他のこのような材料）を含む。これらの半固体材料および固体材料は、身体内での分解に抵抗するように設計されてよく（非バイオ分解性）、またはこれらは、身体内で分解するように（バイオ分解性、バイオ侵食性）設計されてもよい。バイオ分解性の材料は、さらに生体再吸収性または生体吸収型でもよい。すなわち、これは体液中に溶解および吸収されてよく（水溶性インプラントが一例である）、または天然経路を介した他の物質への変換または破壊および除去によって分解され、最終的には身体から除去され得る。
本明細書で使用される「患者」または「被験体」の用語は、動物、哺乳動物、さらにヒト患者を意図する。例示のみの目的で言えば、哺乳動物はヒト、サル、マウス、ウシ、ウマ、ブタまたはヒツジを含むが、限定されない。
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」の用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせで構成される短いポリマーをいう。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用され得る。
「アミノ酸」の用語は、天然に存在するアミノ酸または合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体および疑似アミノ酸をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子暗号によってコードされたもの、並びに後で修飾されたこれらのアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合するα炭素を有する化合物、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このような類似体は、修飾されたＲ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。疑似アミノ酸とは、アミノ酸の一般的な化学的構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した機能を有する化学的化合物をいう。
本明細書で使用される「単離された」の用語は、たとえば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％を上回る他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料または細胞材料をいう。一つの態様において、「単離された」の用語は、天然源に存在し、かつその天然のまたは天然の状態に存在する場合には達成できない結果を達成するようにその材料の操作、たとえば組換え複製または突然変異による操作を可能にする、それぞれその他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞オルガネラまたは組織もしくは器官から分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸またはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞オルガネラまたは組織もしくは器官をいう。また、「単離された」の用語は、組換えＤＮＡ技術により製造されるときは細胞材料、ウイルス材料または培地を、または化学的に合成されるときは化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在しない、および天然状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。また、「単離された」の用語は、他の細胞タンパク質から単離されるポリペプチドをいうために本明細書において使用され、また、たとえば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を上回る純度を持った精製および組換えポリペプチドを包含することを意味する。また、「単離された」の用語は、他の細胞または組織から単離される細胞または組織をいうために本明細書において使用され、また培養および操作された細胞または組織を包含することを意味する。
「組換え」核酸は、通常は一緒に存在しないであろう２つ以上の配列を結合することによって作製される人工の核酸をいう。一つの実施形態において、これは、抗生物質耐性などの特定の目的のために異なる形質をコードし、または変化させるために、バクテリアのプラスミドなどの既存の生物ＤＮＡに関連ＤＮＡを導入することを介して創製される。「組換え」ポリペプチドは、組換え核酸に由来するポリペプチドである。
本明細書で使用される「プロモーター」の用語は、遺伝子の直接の転写に十分な核酸配列をいう。また、本発明には、プロモーター依存的な遺伝子発現を、外部のシグナルまたは薬剤によって細胞タイプ特異性、組織特異性または誘導性について制御可能にするために十分なこれらのプロモーターエレメントが含まれる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは分離したプロモーターである。誘導性プロモーターは、化学的条件または温度もしくは光などの物理的な条件によってオンにすることができる。化学的プロモーターの例は、アルコールで調節されるプロモーター、テトラサイクリンで調節されるプロモーター、ステロイドで調節されるプロモーター、金属で調節されるプロモーターおよび病原性関連のプロモーターを含むが、限定されない。分離したプロモーターの例は、たとえば、Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １６（３）：４３５−４９に見出すことができる。
本明細書で使用される「調節エレメント」の用語は、遺伝子の転写を調節できる核酸配列をいう。調節エレメントの非限定的な例は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサ、ポリアデニル化シグナル、転写終始配列を含む。調節エレメントは、天然の遺伝子の５’または３’領域に、またはイントロンの中に存在してよい。
種々のタンパク質もまた、そのヒトタンパク質およびコード配列について、これらのＧｅｎＢａｎｋ目録番号と共に本明細書に開示される。しかし、タンパク質は、開示されたＧｅｎＢａｎｋ目録番号により表されるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質に限定されず、その他の動物から、特に、温血動物（たとえば、ラット、モルモット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、その他）由来アミノ酸配列を有してもよい。
本明細書で使用される「Ｔｏｓｏ」、「ＦＡＩＭ３」または「Ｆａｓアポトーシス阻害分子３」の用語は、代表的なＴｏｓｏ配列のいずれかと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をいい、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＰ＿００１１３５９４５（ヒトアイソフォームｂ）、ＮＰ＿００１１８０２６７（ヒトアイソフォームｃ）、ＮＰ＿００５４４０（ヒトアイソフォームａ）、ＮＰ＿０８１２５２（マウス）またはＮＰ＿００１０１４８４３（ラット）の全てのバージョンを含む。Ｔｏｓｏをコードする適切なｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＭ＿００１１４２４７３、ＮＭ＿００１１９３３３８、ＮＭ＿００５４４９、ＮＭ＿０２６９７６およびＮＭ＿００１０１４８４３に提供されている。
本明細書で使用される「Ｔｏｓｏの生物学的活性」または「Ｔｏｓｏ活性」の用語は、全長天然Ｔｏｓｏタンパク質に関連した任意の生物学的活性をいう。いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏの生物学的活性は、ＩｇＭ抗体に結合することをいう。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物学的活性は、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８活性を阻害することをいう。さらに他の実施形態において、Ｔｏｓｏの生物学的活性は、顆粒球の活性化閾値を増加させることをいう。活性化閾値は、骨髄からの活性顆粒球の数によって測定することができる。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物学的活性は、樹状細胞およびＴ細胞に抗原を提示するその能力の活性化を含む。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物学的活性は、アポトーシスの阻害またはＴＮＦシグナリングの増強を含む。いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏ生物学的活性は、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＰ＿００１１３５９４５、ＮＰ＿００１１８０２６７、ＮＰ＿００５４４０、ＮＰ＿０８１２５２またはＮＰ＿００１０１４８４３（これら目録番号の全てのバージョンを含む）によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性に等しい。
本明細書で使用される「ＣＤ１１ｂ、「ＩＴＧＡＭ」または「ＩＴＧＡＭインテグリン、アルファＭ（補体コンポーネント３受容体３サブユニット）」は、実質的にＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＰ＿０００６２３の代表的なＣＤ１１ｂ配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。ＣＤ１１ｂをコードする適切なｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＭ＿０００６３２で与えられる。
本明細書で使用される「ＣＤ１１ｂの生物学的活性」の用語は、全長天然ＣＤ１１ｂタンパク質に関連した任意の生物学的活性をいう。一つの実施形態において、ＣＤ１１ｂの生物学的活性は、白血球特異的なインテグリンを形成するためにβ２鎖（ＩＴＧＢ２）と結合することをいう。適切な実施形態において、ＣＤ１１ｂ生物学的活性は、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＰ＿０００６２３によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性に等しい。転写活性の測定は、免疫組織化学、リポーターアッセイまたはＲＴ−ＰＣＲなどの任意の公知の方法を使用して行うことができる。
本明細書で使用される「ＣＤ１８」、「ＩＴＧＢ２」または「ＩＴＧＢ２インテグリン、β２（補体コンポーネント３受容体３および４サブユニット）」の用語は、実質的にＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＰ＿０００２０２の代表的なＣＤ１８配列と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。ＣＤ１８をコードする適切なｃＤＮＡコードは、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号ＮＭ＿０００２１１で与えられる。
本明細書で使用される「治療すること」の用語は、疾患または障害の少なくとも一つの有害作用または症状を減少させ、緩和させ、反転させ、または予防することによって患者の状態を改善する目的のために、医薬組成物を投与することをいう。
本明細書で使用される「予防すること」の用語は、疾患に対する増加した感受性を有するが、疾患の症状をまだ示していない被験体（すなわち、患者）を同定し、およびこの開示の原則にしたがった療法を施すことをいう。予防療法は、感受性の被験体が後で症状性になる可能性を低減するように、または予防療法が存在しない場合よりも疾患が発症もしくは進行を遅延されるように設計される。被験体は、たとえば疾患もしくは他の退行性脳障害の家族歴を同定すること、または疾患もしくは疾患に対する感受性を示す１つまたは複数の診断マーカーを有することによるものを含む、任意の適切な方法により、疾患を発症する増大した可能性を有するとして同定される可能性がある。
本明細書で使用される「試料」または「試験試料」の用語は、核酸を含む任意の液体または固体物質をいう。適切な実施形態において、試験試料は、培養物または動物（最も好ましくはヒト）由来の組織試料中の細胞などの、生物学的供与源（すなわち、「生体試料」）から得られる。
本明細書で使用される「実質的に同一である」の用語は、タンパク質またはポリペプチドをいうときには、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するものを意味する。比較の長さは、好ましくはポリペプチドまたはタンパク質の全長であるが、一般に少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０または１００またはそれ以上の連続アミノ酸である。「実質的に同一の」核酸とは、引用核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。比較の長さは、好ましくは核酸の全長であるが、一般に、少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチドまたはそれ以上である。
本明細書で使用される「アミノ酸置換」または「置換」は、他のアミノ酸を持つ開始ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の置換をいう。たとえば置換Ｍ２３Ｙは、位置２３においてメチオニンがチロシンで置換された変異体ポリペプチドをいう。
タンパク質または核酸の「生物学的同等物」とは、アミノ酸配列または核酸配列によって当該タンパク質または核酸と実質的に同一であるか、または当該タンパク質もしくは核酸と同等な生物学的活性を有するタンパク質または核酸をいう。
本明細書で使用される「有効量」の用語は、患者に医学的な利益を提供するために十分な頻度で送達される化合物（たとえば、Ｔｏｓｏタンパク質または生物活性これらの断片）の量をいう。一つの実施形態において、タンパク質の有効量は、疾患の症状を治療し、または寛解させるために十分な量である。
細胞の集団とは、表現型および／または遺伝子型において同一の（クローン性の）、または同一でない複数の細胞のコレクションを意図する。
「実質的に均一な」とは、細胞の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、または約９５％超が同一もしくは類似の発現型である細胞の集団を記述する。表現型は、予め選択された細胞表面マーカーまたはその他のマーカーによって決定することができる。
自家転植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）および自家移植片等の用語は、細胞ドナーが細胞移植治療のレシピエントでもある場合の治療をいう。同種転植、同種移植、および同種移植片等の用語は、細胞ドナーが細胞置換療法レシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない場合の治療をいう。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合性においてマッチングしている場合の細胞移植は、しばしば、同系移植と称される。異種転植、異種移植、異種移植片等の用語は、細胞ドナーが細胞補充療法のレシピエントとは異なる種である場合の治療をいう。
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体の全体およびその任意の抗原結合性断片もしくは単鎖を含む。したがって、「抗体」の用語には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチドを含む。このような例には、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分の領域、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域（フレームワーク（ＦＲ）領域またはその任意の部分）または結合性タンパク質の少なくとも一部を含むが、限定されない。一般に、「抗体」の用語は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬを含むが、限定されない少なくとも１つの定常ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。本発明における使用を見出す抗体は、伝統的な抗体、並びに抗体の誘導体、断片および疑似物を含む本明細書において記述した多数の形式を取ることができる。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、任意の適切な生物学的供与源、たとえばマウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
モノクローナル抗体は、細胞またはハイブリドーマの単一のクローンによって産生される抗体であり、したがって、単一の純粋で均質なタイプの抗体である。
ハイブリドーマは、抗体産生リンパ球および非抗体産生癌細胞、通常は骨髄腫またはリンパ腫の融合により研究室において産生される細胞である。ハイブリドーマは、増殖し、特異的モノクローナル抗体の連続的供給源を生じる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」の用語は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでよい（たとえば、インビトロでのランダムなもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」の用語は、マウスなどのもう一つの哺乳動物種の生殖系細胞に由来するＣＤＲ配列がフレームワーク上に移植されている抗体を含むことは意図されない。したがって、本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」の用語は、タンパク質の実質的にあらゆる部分（たとえば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ（ＶＬ、ＶＨ））が、軽微な配列の変化または変異を伴うだけで、実質的にヒトにおいて非免疫原性である抗体をいう。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジー等）、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等）および他の哺乳類を指定した抗体は、このような種、亜属、属、サブファミリー、ファミリー特異的抗体を指定する。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含む。このような変化または変異は、任意にかつ好ましくは、非改変抗体と比較して、ヒトまたは他の種における免疫原性を保持し、または減少させる。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（たとえば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現できる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞により産生できることが示される。さらに、ヒト抗体が単鎖抗体であるとき、これは天然のヒト抗体には見られないリンカーペプチドを含むことができる。たとえば、Ｆｖは、２〜約８個のグリシンまたはその他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含むことができ、これは重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を結合する。このようなリンカーペプチドは、ヒト起源であると考えられる。
本明細書で使用される、ヒト抗体は、抗体がヒト免疫グロブリン配列を使用する系から、たとえばヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫化することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる場合、特定の生殖系細胞配列に「由来する」。ヒト生殖系細胞免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系細胞免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することによって同定することができる。選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列において、典型的にはヒト生殖系細胞免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、また他の種（たとえば、マウス生殖系配列）の生殖免疫グロブリンアミノ酸配列と比較したときに、ヒト抗体をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。一定の場合に、ヒト抗体は、アミノ酸配列において、生殖系細胞免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。典型的には、特定のヒト生殖系細胞配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系細胞免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは１０アミノ酸を上回らない相違しか示さないであろう。一定の場合には、ヒト抗体は、生殖系細胞免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは、５アミノ酸を上回らない、またはさらに４、３、２、もしくは１アミノ酸を上回らない相違しか示さないであろう。
本明細書で使用される、「組換えヒト抗体」の用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてのトランスジェニックもしくは染色体導入である動物（たとえば、マウス）またはこれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、たとえばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された抗体などの、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系細胞に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、一定の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用されるときは、体細胞突然変異誘発）を受けることができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系細胞ＶＨおよびＶＬ配列に由来するものであっても、インビボのヒト抗体生殖系細胞レパートリー内に天然には存在しなくてもよい配列である。これらの抗体を作製する方法は、本明細書において記載してある。
本明細書で使用される「アイソタイプ」は、これらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療的抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドを含むことができることを理解すべきである。
本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」の用語は、異なるＢ細胞株に由来する抗体の製剤をいう。これらは、特異的抗原に対して分泌され、各々が異なるエピトープを認識する免疫グロブリン分子の混合物である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」の用語は、単一の分子組成物の抗体分子の製剤をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについての単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で使用される「標識」の用語は、「標識された」組成物を生成するように、検出すべき組成物に直接または間接的に結合される直接または間接的に検出可能な化合物、たとえばＮ末端基ヒスチジンタグ（Ｎ−Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位体元素、たとえば１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、１３Ｃおよび１５Ｎなどの非放射性アイソトープ、ポリヌクレオチドまたは抗体などのタンパク質を意図する。また、この用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等などの、挿入配列の発現に際してシグナルを与えるであろうポリヌクレオチドに結合された配列をも含む。標識は、それ自体によって検出可能でもよく（たとえば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。標識は、小スケールでの検出のために適切であること、または高スループットスクリーニングのためにより適切であることができる。したがって、適切な標識は、磁気的に活性な同位体元素、非放射性の同位体元素、放射性同位体元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素および酵素を含むタンパク質を含むが、限定されない。標識は、単に検出されてもよく、またはこれは、定量化されてもよい。単に検出される反応は、一般にその存在が単に確認される反応を含むのに対して、定量化される反応は、一般に、強度、変更および／または他の性質などの定量化可能な（たとえば、数値的に報告可能な）値を有する反応を含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な反応は、結合に実際に関与するアッセイ成分に付随した発光団または蛍光団を使用して直接発生されてもよく、または別の（たとえば、リポーターまたは指標）成分に会合した発光団または蛍光団を使用して間接的に発生されてもよい。
シグナルを産生する発光標識の例は、生物発光および化学発光を含むが、限定されない。検出可能な発光反応は、一般に、発光シグナルにおける変化または発光シグナルの発生を含む。アッセイ成分を発光で標識するための適切な方法および発光団は、当該技術分野において公知であり、たとえばＨａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ ｅｄ．）に記述される。発光プローブの例は、エクオリンおよびルシフェラーゼを含むが、限定されない。
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイト（Ｍａｌａｃｉｔｅ）緑、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、カスケードブルー（商標：Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標））およびテキサスレッドを含むが、限定されない。その他の適切な光学的色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ ｅｄ．）に記載されている。
もう一つの態様において、蛍光標識は、細胞表面マーカーなどの細胞または組織の表面にまたはその上に存在する細胞成分への共有結合を容易にするために官能化される。適切な官能基は、限定されないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびスルホニルハライドを含み、これらの全てを第２の分子に蛍光標識を付着するために使用されてよい。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカーまたは第２の標識化薬剤のいずれかへの結合部位に依存するであろう。
本発明は、主に特定の実施形態を参照して説明してあるが、本開示を読むことにより、他の実施形態が当業者に明らかになるであろうことが想定され、このような実施形態もまた本発明方法の範囲内に含まれることが意図される。
Ｉ．発明の概要
本発明は、Ｔｏｓｏタンパク質（本明細書において、互換的に「Ｔｏｓｏ」、「Ｔｏｓｏ受容体」、「Ｆａｉｍ３」または「ＦＣＭＲ」とも称する）の活性を調節するための方法および組成物に向けられる。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、Ｔｏｓｏタンパク質の活性を増加させる。その他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、Ｔｏｓｏタンパク質の活性を阻害する。いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏタンパク質の活性を調節するための組成物は、Ｔｏｓｏタンパク質またはＴｏｓｏタンパク質のリガンドに結合する薬剤を含む。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む。本明細書においてさらに詳述するように、本発明の可溶性タンパク質は、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインの全部または一部を含む。本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、シグナルペプチドおよび／またはＦｃドメインをさらに含んでもよい。本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、欠失変異体（全長細胞外ドメインの１つまたは複数のアミノ酸が欠失された変異体）および１つまたは複数のアミノ酸置換を含む変異体を含む、Ｔｏｓｏタンパク質変異体の細胞外ドメインをさらに含んでもよい。
本発明は、さらに、被験体に可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（またはその変異体）を投与することによって、障害および疾患を治療する方法に向けられる。本明細書においてさらに詳述するように、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、自己免疫疾患（限定されないが、１型または２型糖尿、多発性硬化症または慢性関節リウマチを含む）、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）、ハイパーＩｇＭ症状群、ＣＬＬ、狼蒼または好中球増加関連する障害（限定されないが、好中球減少、重篤な先天性好中球減少、周期的な好中球減少、抗体で媒介される好中球減少、細網異形成症、白血球接着欠損、家族性骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、家族性冷却じんま疹および白血球増加症および慢性肉芽腫症を含む）に罹患する被験体を治療するために使用することができる。
ＩＩ． 可溶性Ｔｏｓｏタンパク質
本発明の組成物は、Ｔｏｓｏ活性を調節する薬剤を含む。このような組成物は、以下でさらに詳細に考察するように、限定されることなく、可溶性形態のＴｏｓｏタンパク質を含む。
本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（本明細書において、互換的に「可溶性Ｔｏｓｏ受容体」、「Ｔｏｓｏ−Ｆｃ」および「可溶性Ｔｏｓｏポリペプチド」とも称する）は、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインの全部または一部を含む。さらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、シグナルドメインおよび／またはＦｃドメインを含む。本明細書でさらに詳細に述べるように、Ｔｏｓｏタンパク質のこれら成分は、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を提供するために、追加の成分および／または修飾の有無にかかわらず任意の方法で結合されてよい。
一つの態様において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏの細胞外ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、本可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ヒトＴｏｓｏアイソフォームａの細胞外ドメインを含む。ヒトＴｏｓｏの細胞外ドメインは、ＮＰ＿００５４４０．１、ヒトＴｏｓｏアイソフォームａのアミノ酸Ｐ２１〜のＧ２５１にわたることが予測される（Ｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）を参照されたい；これは、全ての目的について、およびＴｏｓｏの細胞外ドメインに関連した全ての教示について、その全体が本明細書に援用される）。明確化のために、本明細書における考察の大部分は、ヒトＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に向けられる。しかし、任意の種由来のＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメインを、本明細書の記述にしたがって可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を産生するために使用できることが予測されるであろうし、また本明細書で考察されるヒトＴｏｓｏタンパク質の領域に対応する別の種のＴｏｓｏタンパク質の領域を同定することは当業者の能力の範囲内であろう。
一つの実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１に記載の細胞外ドメイン配列を含み、これは図１０に示してある。さらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を有する。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１における１−７５、２−７０、３−６５、４−６０、５−５５、６−５０、７−４５、８−４０、９−３５、１０−３０、１１−２５、１２−２０、１３−１５、５−２０、６−１８、８−１６、１０−１４のアミノ酸置換を伴ったポリペプチドを含む。さらに他の実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のアミノ酸置換を伴ったポリペプチドを含む。
一つの実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８に記載の細胞外ドメイン配列を含んでおり、これは図２７に示してある。さらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を有する。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８において１−７５、２−７０、３−６５、４−６０、５−５５、６−５０、７−４５、８−４０、９−３５、１０−３０、１１−２５、１２−２０、１３−１５、５−２０、６−１８、８−１６、１０−１４のアミノ酸置換を備えたポリペプチドを含む。さらに他の実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のアミノ酸置換を伴ったポリペプチドを含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７のアミノ酸１８〜２５３を含む。なおさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７のアミノ酸２１〜２５３を含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７のアミノ酸２１〜２５１を含む。さらに他の実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７由来のアミノ酸の以下範囲のいずれかを含む：１−２５５、５−２４５、１０−２３５、１５−２２５、２０−２１５、２５−２０５、３０−１９５、３５−１８５、４０−１７５、４５−１６５、５０−１５５、４５−１４５、４０−１３５、３５−１２５、３０−１１５、３５−１０５、４０−９５、４５−８５、５０−７５、５５−６５。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号７のアミノ酸１８〜２５３または２１〜２５３に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。
なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図２７に描かれた配列番号８の全体または一部を含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８のアミノ酸１−２３１、６−２２１、１１−２１１、１６−２０１、２１−１９１、２６−１８１、３１−１７１、３６−１６１、４１−１５１、４６−１４１、５１−１３１、５６−１２１、６１−１１１、６６−１０１、７１−９１、７６−８１を含む。さらに他の実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８のアミノ酸領域１−２３１、６−２２１、１１−２１１、１６−２０１、２１−１９１、２６−１８１、３１−１７１、３６−１６１、４１−１５１、４６−１４１、５１−１３１、５６−１２１、６１−１１１、６６−１０１、７１−９１、７６−８１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を備えたポリペプチドを含む。
さらに他の実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３のうちの任意の１つのを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。これらの配列は、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインの欠失変異体を含む。
なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏタンパク質の完全な細胞外ドメインの欠失変異体を含む。例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の構成成分である欠失変異体は、以下のアミノ酸の１つまたは複数が配列番号８から欠失されたポリペプチドを含む：１−２１、１−３５、１−８７、１−２１および２１１−２３１の両方の領域、２１１−２３１、１５４−２３１、１０５−２３１および９３−２３１。さらなる例示的実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の構成成分である欠失変異体は、以下のアミノ酸配列：１−２１、１−３５、１−８７、１−２１および２１１−２３１の両方の領域、２１１−２３１、１５４−２３１、１０５−２３１および９３−２３１の１つまたは複数を欠失した配列番号８に記載のポリペプチドに対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性をもつポリペプチドを含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏ受容体のリガンドに結合する領域を含む細胞外ドメイン成分を含む。例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ＩｇＭに結合する細胞外ドメイン成分を含む。なおさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８のアミノ酸３５〜８７を含む。さらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８のアミノ酸２５−１００、２９−９５、３３−９０、３７−８５、４１−８０、４５−７５、４９−７０、５３−６５または５７−６０を含む。
さらなる態様において、また上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、上記した細胞外ドメイン成分を含み、さらにシグナル配列を含む。例示的な実施形態において、シグナル配列は、宿主細胞からの分泌を増強する。さらに他の実施形態において、シグナル配列は、限定されないが、ＩＬ−２シグナル配列、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−交配因子プレ配列、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のα−アミラーゼシグナル配列、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）由来のグルコアミラーゼ（Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）シグナル配列、ヒト由来の血清アルブミンシグナル配列、クルイベロマイセス・マキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｙｅｓ ｍａｘｉａｎｕｓ）由来のイヌリナーゼシグナル配列、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のインベルターゼシグナル配列、サッカロマイセスセレビジエ由来のキラータンパク質シグナル配列、ニワトリ由来のリソザイムシグナル配列から選択されるメンバーを含む。なおさらなる実施形態において、シグナル配列は、図１０に示した配列番号２に記載の配列を含む。なおさらなる実施形態において、シグナル配列は、配列番号２に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。特定の実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１、８、９、１１、１３、１５、１７、２１および２３の任意の１つ、または配列番号２または配列番号２に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列との融合タンパク質としてのこれら配列の変異体を含む。
さらなる態様において、また上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインおよびＦｃドメインを含む。例示的な実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ヒトＴｏｓｏタンパク質のアイソフォームＡの細胞外ドメインおよびＦｃドメインを含む融合タンパク質である。さらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインをもたないタンパク質と比較して、タンパク質の半減期を増強する任意のドメインを含む。なおさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインをもたないタンパク質と比較して、タンパク質の薬物動態学的プロファイルを改善する任意のドメインを含む。なおさらなる実施形態において、このＦｃドメインは、Ｃ末端においてヒトＩｇＧ１に由来し、これはさらに他の実施形態において、抗体依存性および補体依存性の細胞障害性を減弱または除去する突然変異を含む。なおさらなる実施形態において、このような突然変異は、以下の突然変異：Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓの１つまたは複数を単独で、または任意の組み合わせで含む。さらに他の実施形態において、Ｆｃドメインは、図１０に示した配列番号３に記載の配列を含む。なおさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号３に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。
さらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外ドメイン成分およびＦｃドメイン成分の両者を含む融合タンパク質を含む。なおさらなる例示的な実施形態において、本発明のＴｏｓｏタンパク質は、配列番号１、８、９、１１、１３、１５、１７、２１および２３または配列番号３との融合タンパク質として、または配列番号３に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列との融合タンパク質としてのこれら配列の変異体を含む。
一つの態様において、および上記のいずれかにしたがってに、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメイン、シグナル配列およびＦｃドメインを含み−これらの成分のそれぞれは、これらの成分の上記バージョンのいずれかを任意の組み合わせで含んでもよい。なおさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５に記載の配列を含む。なおさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の任意の１つに記載の配列を含み、これは細胞外ドメイン成分、シグナル配列およびＦｃドメインを含む。さらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の任意の１つのに対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。
さらなる態様において、また上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏ細胞外ドメイン成分とＦｃドメイン間、Ｔｏｓｏ細胞外ドメイン成分とシグナル配列間またはＴｏｓｏ細胞外ドメイン成分とＦｃドメインの間および細胞外ドメイン成分とシグナル配列の間の両方に、リンカーをさらに含んでよい。例示的な実施形態において、このようなリンカーは、２つのアミノ酸配列を連結するために有効であるように、当該技術分野において公知のアミノ酸リンカー、ポリマーリンカーまたは任意のその他のリンカーであってもよい。さらなる例示的な実施形態において、リンカーは、アミノ酸リンカーである。なおさらなる実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＩＳＡＭＶＲＳ（配列番号２５）である。さらに他の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５または６アミノ酸置換を含んだ配列番号２５の変異体である。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の変異体は、配列番号５、６または８−２４を含む本明細書で述べた可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかのアミノ酸配列の改変を介して作製することができる。このような改変は、当該技術において公知の任意の技術、たとえば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲに基づく突然変異誘発を使用して達成することができる。このような技術は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されており、これら文献のそれぞれは、全ての目的について、および特にタンパク質変異体を形成することに関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
なおさらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、単量体形態または多量体形態であってよく、多量体における各モノマーは、１つの細胞外ドメイン配列を含む。さらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の単量体の多量体である。特定の実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、６単量体の多量体である。さらなる実施形態において、６量体Ｔｏｓｏ多量体は、６量体化タグを含む単量体で形成される。さらなる実施形態において、６量体化タグは、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００６）に記載されているようなヒトＩｇＡアルファ重鎖定常領域由来の２１アミノ酸尾部小片を含み、この文献は、全ての目的について、および特に６量体化またはその他の多量体化タグに関連した全ての教示ついて、本明細書の一部として援用される。なおさらなる実施形態において、本発明の６量体化タグは、図１０に示した配列番号４に記載の配列を含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、タンパク質の１つまたは複数の機能特性を変化させるために修飾される。例示的な実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、化学的に修飾される。たとえば、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、そのインビボでの安定性および／またはその薬物動態学的プロファイルを改善するために、１つまたは複数のポリマーで修飾されてよい。このようなポリマーは、限定されないが、１つまたは複数の種々の非タンパク質ポリマー、たとえば米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されたような、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンを含み、これらは全て、全ての目的について、および特にポリマーにタンパク質を連結することに関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の範囲内に含まれるＴｏｓｏ可溶性タンパク質の修飾は、上で述べた配列および可溶性Ｔｏｓｏタンパク質にしたがったＴｏｓｏポリペプチドのターゲットされたアミノ酸残基を、Ｔｏｓｏポリペプチドの選択した側鎖またはＮ−もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。一般に使用される架橋剤は、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオンナート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二機能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドおよびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの薬剤を含む。
他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタルニルおよびアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖のアミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれる可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のもう一つのタイプの修飾には、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変化させることを含む。「天然のグリコシル化パターンを変化させる」は、本明細書における目的については、天然の配列のＴｏｓｏポリペプチドに見られる１つまたは複数の炭化水素を欠失させること、および／または天然の配列のＴｏｓｏポリペプチドには存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意図する。
Ｔｏｓｏ可溶タンパク質に対するグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変化させることによって達成してもよい。この変化は、たとえば天然配列の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に対して（Ｏ−結合されたグリコシル化部位について）、１つまたは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加またはこれによる置換によって達成されてよい。可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のアミノ酸配列は、必要に応じてＤＮＡレベルでの変化を介して、特に予め選択された塩基において所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるようにＴｏｓｏ可溶タンパク質をコードするＤＮＡを変異させることによって変化させてもよい。
Ｔｏｓｏ可溶タンパク質上の炭化水素部分の数を増加させるもう一つの手段は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的または酵素的結合による。このような方法は、たとえば１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において記述されており、これらは、全ての目的について、および特にタンパク質上の炭化水素部分を変化させることに関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
可溶性Ｔｏｓｏタンパク質上に存在する炭化水素部分の除去は、化学的に、もしくは酵素的に、またはグリコシル化のためのターゲットとして働くアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によって達成されてもよい。化学的な脱グルコシル化技術は、当該技術において公知であり、たとえばＨａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。ポリペプチド上の炭化水素部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができ、これらは、全ての目的について、および特にタンパク質上の炭化水素部分を変化させることに関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
また、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、もう一つの異種のポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたタンパク質を含むキメラ分子を形成する方法で改変されてもよい。一つの実施形態において、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供するタグポリペプチドと可溶性Ｔｏｓｏポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは、一般に、Ｔｏｓｏポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。このようなエピトープがタグ付けされた形態のＴｏｓｏポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、エピトープタグに結合する抗タグ抗体またはもう一つのタイプの親和性マトリックスを使用してＴｏｓｏポリペプチドを親和性精製により容易に精製することを可能にする。代わりの実施形態において、キメラ分子は、Ｔｏｓｏポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域の融合を含んでもよい。キメラ分子の二価形態については、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域またはＧＳＴ融合に対するのものである得るであろう。
種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野において周知である。例には、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２−１９４（１９９２）］；チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
さらなる実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞貫通ペプチドと融合される。
さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質をコードする核酸、並びにこのような核酸を含む宿主細胞を包含する。一定の実施形態において、本発明にしたがって使用される宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９８Ｔ、Ｃｏｓ７、ＨｅＬａおよびＣＨＯ−ＤＨＦＲ欠損細胞を含むが、限定されない。なおさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、無血清懸濁液中で増殖するように改変された株化細胞において安定して発現される。
さらなる態様において、本発明の組成物は、添加物および薬学的に許容される担体と共に、本明細書で述べた可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかを含んでよい。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、組み合わさられたときに、その接合体が抱合体の活性を保持し、また被験体の免疫系とは非反応性である任意の材料を含む。その例には、標準的な医薬品担体、たとえばリン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のいずれかを含むが、限定されない。他の担体には、滅菌溶液、およびコーティング錠を含む錠剤、並びにカプセルを含む。典型的には、このような担体は、デンプン、乳、糖、一定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコールまたはその他公知の賦形剤などの賦形剤を含む。このような担体はまた、香料および着色添加剤またはその他の成分を含んでもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。
ＩＩＩ． Ｔｏｓｏに対する抗体
一つの態様において、本発明は、Ｔｏｓｏタンパク質に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｔｏｓｏ活性を増加させる。その他の実施形態において、本発明の抗体は、Ｔｏｓｏ活性を減少させる。
抗体を調製する方法は、一般に当該技術分野において公知である。たとえば、米国特許第６，７２７，３５０号は、Ｔｏｓｏに対する抗体を開示しており、これは、全ての目的について、および特にＴｏｓｏタンパク質に対する抗体に関連した全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の抗体は、以下で定義したように、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはこれらの誘導体もしくは断片であってよい。一つの態様において、断片は、抗体のＣＤＲを含む、または代わりにそれから本質的になる、またはさらにそれからなる。一つの態様において、本発明の抗体は、検出可能に標識されており、またはさらにそれに抱合された検出可能な標識を含む。また、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株化細胞が提供される。上記実施形態の１つまたは複数を含む組成物がさらに提供される。
また、抗体および担体を含む組成物も提供される。さらに、抗体の生物学的に活性な断片または抗体断片を含む組成物が提供される。適切な担体は、上で定義されている。
抗体および抗体に特異的に抗体に結合されるポリペプチドを含む、または代わりにそれから本質的になる、またはさらに代わりにそれからなる抗体−ペプチド複合体がさらに提供される。一つの態様において、ポリペプチドは、それに対して抗体が産生されるキメラポリペプチドである。
また、本発明は、本発明の治療方法において有用である、Ｔｏｓｏと特異的に複合体を形成できる抗体を提供する。本発明の抗体は、マウス抗体、ラット抗体およびウサギ抗体またはヒト抗体を含むが、限定されない。抗体は、細胞培養において、ファージにおいて、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿などを含むが、限定されない種々の動物において製造することができる。また、抗体は、治療的ポリペプチドを同定し、および精製するために有用である。
また、本発明は、上記抗体および抗体に特異的に結合されるポリペプチドを含む、または代わりにそれから本質的になる、またはさらに代わりにそれからなる抗体−ペプチド複合体を提供する。一つの態様において、ポリペプチドは、それに対して抗体が産生されるポリペプチドである。一つの態様において、抗体−ペプチド複合体は、単離された複合体である。さらなる態様において、複合体の抗体は、本明細書において記述したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または抗体誘導体であるが、限定されない。抗体−ペプチド複合体の抗体またはペプチドのいずれかまたは両方は、検出可能な標識することができ、またはそれに抱合された検出可能な標識をさらに含む。つの態様において、本発明の抗体−ペプチド複合体は、診断アッセイまたはスクリーニングアッセイにおける対照または参照サンプルとして使用することができる。
本発明のポリクローナル抗体は、当該技術分野において公知の、かつ文献に十分に記載された従来の技術を使用して産生することができる。いくつかの方法論が、ポリクローナル抗体の産生のために存在する。たとえば、ポリクローナル抗体は、典型的にはニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ラマ（ｌｈａｍａ)、マウス、ラットおよびウサギなどの適切な哺乳動物の免疫化によって産生されるが、限定されない。抗原が哺乳動物に注射され、これが抗原に特異的なＩｇＧ免疫グロブリンを産生するようにＢリンパ球を誘導する。このＩｇＧは、哺乳動物の血清から精製される。この方法論の変形例には、最適な産生および動物ヒト治療のための、アジュバント、投与の経路および部位、部位当たりの注射容積および動物当たりの部位の数を含む。たとえば、アジュバントは、典型的には、抗原に対する免疫応答を改善し、または増強するために使用される。大部分のアジュバントは、注射部位抗原デポーを提供し、これは流入領域リンパ節への抗原の遅放を可能にする。その他のアジュバントは、広い表面領域にわたるタンパク質抗原分子および免疫刺激分子の濃縮を促進する表面活性物質を含む。ポリクローナル抗体産生のためのアジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバントシステムおよびタイターマックス（Ｔｉｔｅｒｍａｘ）を含む。ポリクローナル抗体は、米国特許第７，２７９，５５９号；第７，１１９，１７９号；第７，０６０，８００号；第６，７０９，６５９号；第６，６５６，７４６号；第６，３２２，７８８号；第５，６８６，０７３号；および第５，６７０，１５３号に記載の方法を使用して産生することができ、これらは、全ての目的のために、および特に抗体に関連した全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の、かつ文献に十分に記載された従来のハイブリドーマ技術を使用して産生することができる。たとえば、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（たとえば、限定されないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ３９７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏなどのミエローマ細胞株）等、またはヘテロミエローマ、その融合産物またはこれらから誘導された細胞もしくは融合細胞、または当該技術において公知の任意の他の適切な細胞株（たとえば、２００７年１１月２６日に最後にアクセスされたｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．）を、内因性または異種の核酸として、組換えまたは内因性のウイルス、バクテリア、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、齧歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本、二本もしくは三本鎖、ハイブリダイズされたもの、またはこれらの任意の組み合わせとしていずれかで、限定されないが、単離された、もしくはクローン化された脾臓、末梢血液、リンパ、扁桃またはその他の免疫細胞もしくはＢ細胞を含む細胞または重鎖もしくは軽鎖定常もしくは可変もしくはフレームワークもしくはＣＤＲ配列を発現する任意のその他の細胞などの抗体産生細胞と融合させることによって産生される。また、抗体産生細胞は、関心対象の抗原で免疫化したヒトまたはその他の適切な動物の末梢血液、または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。また、任意の他の適切な宿主細胞を、本発明の抗体、その特定された断片または変異体をコードする異種もしくは内因性の核酸を発現するために使用することができる。融合された細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件またはその他の適切な公知の方法で単離すること、また限界希釈もしくは細胞ソーティングまたはその他の公知の方法によってクローン化することができる。
一つの実施形態において、本明細書に記載した抗体は、多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＭＡＰ）系を使用して産生することができる。ＭＡＰシステムは、３つまたは７つの放射状に分枝したリジン残基のペプチジルコアを利用することができ、その上に標準の固相化学を使用して関心対象の抗原ペプチドを構築することができる。リジンコアは、内核に依存して、ペプチドエピトープの約４〜８のコピーを有するＭＡＰを生じるが、これは一般に総分子量の１０％未満に相当する。そのＭＡＰシステムは、結合のために担体タンパク質を必要としない。ＭＡＰにおいて、抗原性エピトープの複数のコピーの高モル比および高密度パッキングは、強力な免疫原性の反応を生じることが示された。この方法は、米国特許第５，２２９，４９０号に記載されており、この特許は全ての目的について、および特にＭＡＰシステムに関連した全ての教示について、その全体が本明細書の一部として援用される。
当該技術で公知の方法を使用して、ペプチドまたはタンパク質ライブラリーから組換え抗体を選択する方法（たとえば、限定されないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ等、ディスプレイライブラリー；たとえばＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ（ＵＫ））、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの種々の商業的供給業者から入手可能）を含む、必要な特異性の抗体を産生する、または単離する他の適切な方法を使用することができる。米国特許第４，７０４，６９２号；第５，７２３，３２３号；第５，７６３，１９２号；第５，８１４，４７６号；第５，８１７，４８３号；第５，８２４，５１４号；第５，９７６，８６２号を参照され、これらは、全ての目的について、および特に抗体に関連した方法に関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。代わりの方法は、当該技術において公知なように、および／または本明細書に記載したように、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物の免疫化に依存する（たとえば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７；Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５−１１８；Ｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４−１６１）。このような技術は、限定されないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７−４９４２；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４１３０−１４１３５）；単細胞抗体産生技術（たとえば、選択されたリンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２、Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−７８４８）；ゲルマイクロドロップレットおよびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７）；ワンセルシステム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３；およびＫｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５−１３４）を含み、これらは、全ての目的について、および特に抗体を生成するための方法に関連した全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
また、本発明の抗体誘導体は、ミルクの中にこのような抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマおよびヒツジ等などのトランスジェニック動物または哺乳類を提供するように、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に送達することによって調製することができる。これらの方法は、当該技術分野において公知であり、またたとえば米国特許第５，８２７，６９０号；第５，８４９，９９２号；第４，８７３，３１６号；第５，８４９，９９２号；第５，９９４，６１６号；第５，５６５，３６２号；および第５，３０４，４８９号に記載されており、これらは全ての目的について、および特に抗体を生成することに関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
「抗体誘導体」の用語は、抗体または断片の直鎖状のポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を含む。たとえば、全ての目的について、および特に抗体の修飾に関連した全ての教示について、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，６０２，６８４ Ｂ１号は、増大されたＦｃ媒介性細胞毒性有する抗体分子全体、抗体断片または免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質を含む修飾されたグリコール形の抗体を産生するための方法およびこのようにして産生された糖タンパク質を記載している。
また、抗体誘導体は、本発明のポリヌクレオチドを送達して、このような抗体、特定の部分および変異体を産生するトランスジェニック植物および培養された植物細胞（限定されないが、たとえばタバコ、トウモロコシおよびウキクサ）を提供し、植物部分において、またはこれから培養された細胞において、このような抗体、特定の部分または変異体を産生することによって製造することができる。たとえば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８およびその中に引用された参照文献は、たとえば誘導性プロモーターを使用して、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコの葉の製造を記載している。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において産生され、または天然供与源から精製されたものと同等の生物学的活性で、市販の産生レベルで哺乳動物タンパク質を発現させるために使用されてきた。たとえば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７およびその中に引用された参照文献を参照されたい。また、単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）などの抗体断片を含む抗体誘導体も、タバコの種およびジャガイモ塊茎を含むトランスジェニック植物種子から大量に産生されてきた。たとえば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９およびその中で引用された参照文献を参照されたい。したがって、本発明の抗体はまた、公知の方法にしたがってトランスジェニック植物を使用して産生することができる。
また、抗体誘導体は、たとえば外因性配列を付加して免疫原性を修飾し、結合性、親和性、オンレート、オフレート、アビディティー、特異性、半減期または他の適切な特性を低下、増強または改変することによって製造することができる。一般に、非ヒトまたはヒトのＣＤＲ配列の一部または全部は、維持され、一方で、可変領域および定常領域の非ヒト配列は、ヒトまたは他のアミノ酸で置換される。
一般に、ＣＤＲ残基（抗体断片の例）は、抗原結合への影響に直接および最大限に関与する。本発明の抗体のヒト化または操作は、以下に記載されているものなどの任意の公知の方法を使用して行うことができる：米国特許第５，７２３，３２３号；第５，９７６，８６２号；第５，８２４，５１４号；第５，８１７，４８３号；第５，８１４，４７６号；第５，７６３，１９２号；第５，７２３，３２３号；第５，７６６，８８６号；第５，７１４，３５２号；第６，２０４，０２３号；第６，１８０，３７０号；第５，６９３，７６２号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，２２５，５３９号；および第４，８１６，５６７号、これらは、全ての目的について、および特にヒト化または抗体を操作することに関連した全教示について、その全体が参照により本明細書に援用される。
部分的ないし完全にヒト抗体を作製するための技術は、当該技術分野において公知であり、任意のこのような技術を使用することができる。一つの実施形態にしたがって、完全なヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。異なるクラスの抗体を産生することができる、複数系統のこのようなトランスジェニックマウスが作製されてきた。所望の抗体の連続的な産生のためのハイブリドーマ細胞株を作製するために、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウスからのＢ細胞を融合することができる。（たとえば、Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（４）：１８２０−１８２６；Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４−５４０；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９Ａ）Ｊ．ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６：４０１−４１０；Ｙａｎｇ（１９９９Ｂ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９（６）：１２３６−１２４３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：３３−４２；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（３）：４８３−４９５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４；Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：４１３−４２１；Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｇｏｌｄ（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １７（１４）；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｏｌ．ＩＶ，１９４．１−１９４．７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５６１−５６６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：２９４−３０７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４（８）：７６１−７６３；Ａｒｂｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １（４）：２４７−２６０；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４１７）：２５５−２５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（６）：２５５１−２５５５；および米国特許第６，０７５，１８１号を参照されたい）。
また、本発明の抗体は、キメラ抗体を作製するために改変することができる。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の種々のドメインが複数の種由来のＤＮＡによってコードされるものである。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
あるいは、本発明の抗体は、また、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を作製するために改変することができる。ベニアリング抗体は、第１の種の抗体が第２の種において免疫原性ではなくなり、それによって抗体の免疫原性を減少させるように、第１の種の抗体の外部アミノ酸残基を第２の種のもので慎重に置換したものである。タンパク質の抗原性は、主にその表面の性質に依存するので、抗体の免疫原生は、もう一つの別の哺乳動物種の個体に通常見られるものとは異なる露出した残基を置換することによって減少させることができるであろう。外側の残基のこの慎重な置換は、内部ドメインに対して、もしくはドメイン間接触に対してほとんどまたは全く効果を有さないであろう。したがって、リガンド結合特性は、可変領域フレームワーク残基に限定される変化の結果として、影響を受けないはずである。このプロセスは、抗体の外部表面または皮膚だけを変化させ、支持残基は乱されないまま残るので、「ベニアリング」と称される。
「ベニアリング」のための手順は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈに準拠したヒト抗体可変ドメインについて入手可能な配列データ、このデータベースに対する更新および他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質）を使用する。ベニアリング抗体を生成するために使用される方法の非限定的な例は、ＥＰ ５１９５９６；米国特許番号６，７９７，４９２；およびＰａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４−５）：４８９−４９８に記載されたものを含む。
また、「抗体誘導体」の用語は、２つの抗原結合部位をもつ抗体断片である「二重特異性抗体」を含み、断片は、同じポリペプチド鎖における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。（たとえば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８を参照されたい）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするにはあまりに短いリンカーを使用することにより、ドメインは、もう一つの鎖の相補的なドメインと強制的に対形成して、２つの抗原結合部位を形成する。（また、親抗体の超可変領域に挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有し、かつ抗原に対する親抗体の結合親和性より少なくとも約２倍強い標的抗原に対する親和性を有する抗体変異体を開示する、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，６３２，９２６号を参照されたい）。
「抗体誘導体」の用語は、さらに「直鎖状の抗体」を含む。直鎖状の抗体を作製するための手順は、当該技術分野において公知であり、およびＺａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載されている。簡単に言えば、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対の直列型Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状の抗体は、二重特異性または単一特異性であることができる。
本発明の抗体は、タンパク質Ａ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むが、限定されない公知の方法によって組換え細胞培養物から回収すること、および精製することができる。また、高速液体クロマトグラフィーを精製のために使用することができる。
本発明の抗体は、天然に精製した産物、化学的合成法の産物、並びにたとえば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から、または代わりに上記した原核生物細胞から組換え技術によって産生された産物を含む。
試験されるモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験される抗体と本発明のハイブリドーマにより提供される抗体は、同等である。また、抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、本発明のモノクローナル抗体が、そのモノクローナル抗体が通常反応するタンパク質またはポリペプチドに結合するのを、試験される抗体が妨げるかどうかを決定することによって、過度の実験なしに決定することが可能である。試験される抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、２つの抗体は、同じエピトープまたは密接に関連したエピトープに結合する可能性が高い。あるいは、本発明のモノクローナル抗体を、それが通常反応性であるタンパク質と共にプレインキュベートすること、および試験されるモノクローナル抗体が、抗原を結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することができる。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、全ての可能性において、それは本発明のモノクローナル抗体と同じか、または密接に関連したエピトープ特異性を有する。
また、「抗体」の用語は、全てのアイソタイプの抗体を含むことが意図される。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合物から選択することによって直接的に調製すること、あるいは、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６５３またはＳｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７４：３０７に記載された方法を使用してクラススイッチ変異体を単離するためのｓｉｂ選択技術を使用することによって異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体の特異性をもつモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離は、抗イディオタイプ抗体を産生することによって当業者が達成することができる。Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００。抗イディオタイプ抗体は、関心対象であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体上に存在する固有の決定因子を認識する抗体である。
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間におけるイディオタイプ同一性は、２つのモノクローナル抗体が同じエピトープ決定因子の認識に関して同じであることを示す。したがって、モノクローナル抗体上のエピトープ決定因子に対する抗体を使用することにより、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現するその他のハイブリドーマを同定することができる。
また、抗イディオタイプ技術を使用して、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を製造することもができる。たとえば、第１のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体によって結合されるエピトープの鏡像である超可変領域の結合ドメインを有するであろう。したがって、この場合、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、これらの抗体を産生するための免疫化のために使用することができる。
本発明のいくつかの態様において、これは、抗体を検出可能に、または治療的に標識するために有用であろう。抗体をこれらの薬剤に結合するための方法は、当該技術分野において公知である。例示のみの目的で言えば、抗体は、放射性原子、発色団、蛍光団等の検出可能部分で標識されることができる。このような標識された抗体は、診断技術のために、インビボで、または単離された試験試料においていずれかで使用することができる。
低分子量ハプテンに対して抗体を結合すると、アッセイにおける抗体の感受性を増加させることができる。次いで、ハプテンを第２の反応によって特異的に検出することができる。たとえば、アビジンに反応するビオチン、または抗ハプテン抗体と特異的で反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセインなどのハプテンを使用することが普通である。上記Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）を参照されたい。
また、本発明の抗体は、多くの異なる担体に結合することができる。したがって、本発明はまた、抗体および活性または不活性なもう一つの物質を含む組成物を提供する。公知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれかであることができる。当業者は、モノクローナル抗体を結合するための他の適切な担体を知っているか、またはルーチンの試験を使用してこのようなものを確認できるであろう。
一定の実施形態において、本発明の抗体は、このような突然変異のない抗体と比較して抗体の薬物動態学的特性を改善する定常領域に突然変異を含む。このような抗体は、一定の実施形態において、Ｃ末端においてヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインを含み、これはさらなる実施形態において、抗体依存性または補体依存性の細胞毒性を減少する、または除去する突然変異を含む。なおさらなる実施形態において、このような突然変異は、単独でまたは任意の組み合わせにおいて、次の突然変異の１つまたは複数を含む：Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓ。なおさらなる他の実施形態において、Ｆｃドメインは、図１０に示した配列番号３に記載の配列を含む。なおさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号３に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性をもつ配列を含む。
さらなる実施形態において、抗体の１つまたは複数のＣＤＲにおいて１つまたは複数のアミノ酸改変が作製される。一般には、１または２つまたは３つのアミノ酸だけが、任意の単一のＣＤＲにおいて置換され、また一般には、一組のＣＤＲ内で４、５、６、７、８、９または１０を上回らない変化が作製される。しかし、任意のＣＤＲにおけるゼロ置換、１、２、または３の置換の任意の組み合わせが、独立して、かつ必要に応じて、他の任意の置換と組み合わされ得ることが認識されるべきである。
いくつかの場合に、ＣＤＲにおけるアミノ酸改変は、「親和性成熟」といわれる。「親和性成熟した」抗体は、１つまたは複数のＣＤＲにおいて１つまたは複数の変化を有し、これは、これらの変化（群）を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性における改善を生じる。いくつかの場合には、稀にではあるが、抗原に対する抗体の親和性を減少させることが望ましいかもしれないが、一般には好ましくない。
親和性成熟は、抗原に対する抗体の結合親和性を「親」抗体と比較して少なくとも約１０％から５０−１００−１５０％またはそれ以上、または１〜５倍まで増大させるように行うことができる。好ましく親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモル程度の親和性を有するであろう。親和性成熟した抗体は、公知の手順によって産生される。たとえば、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟を記述したＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３を参照されたい。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発は、たとえばＢａｒｂａｓ，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３；Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；およびＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
あるいは、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲにおいて、たとえば抗原に対する抗体の親和性を有意に変化させない「サイレント」であるアミノ酸改変を作製することができる。これらは、発現を最適化することを含む多くの理由で作製することができる（本発明の抗体をコードする核酸について行うことができるので）。
したがって、変異体ＣＤＲおよび抗体は、本発明のＣＤＲおよび抗体の定義の範囲内で含まれる；すなわち、本発明の抗体は、Ａｂ７９およびＡｂ１９のＣＤＲの１つまたは複数にアミノ酸改変を含むことができる。加えて、以下で概説するように、アミノ酸改変はまた、フレームワークおよび定常領域を含むＣＤＲの外側の任意の領域においても、独立して、かつ任意に作製することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体を薬物と抱合して、抗体−薬物縫合体（ＡＤＣ）を形成する。一般に、ＡＤＣは、腫瘍学的用途において使用され、この場合、細胞障害能または細胞増殖抑制性薬剤の局所的送達のための抗体−薬物抱合体の使用により、腫瘍に対する薬物のターゲッティングされた送達を可能にし、これにより、より高い有効性、より低い毒性等を可能にすることができる。この技術の概要は、Ｄｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２１）：５−１３（２０１０）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．１４（３）：１５４（２００８）およびＳｅｎｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２３５−２４４（２００９）において与えられており、これらの全ては、全ての目的について、および特に薬物が結合する抗体に関連した全ての教示ついて、その全体が参照により本明細書に援用される。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、薬物に抱合されたＴｏｓｏ抗体を提供する。一般に、抱合は、抗体への共有結合付着によって行われ、一般にはリンカー、多くの場合はペプチド結合に依存する（これは、当技術分野で公知の通り、標的部位でのプロテアーゼによる切断に対して感受性であるように、またはそうでないように設計されてもよい）。加えて、上記の通り、リンカー薬物ユニット（ＬＵ−Ｄ）の結合は、抗体内のシステインへの結合によって行うことができる。当業者が理解するように、抗体当たりの薬物部分の数は、反応の条件に応じて変化することができ、１：１から１０：１の薬物：抗体の比で変化することができる。当業者が理解するように、実際の数は平均値である。
ＡＤＣの薬物は、化学療法剤などの細胞毒性薬剤、増殖阻害薬剤、毒素（たとえば、バクテリア、菌類、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）または放射性同位元素（すなわち、放射性接合体）を含むが、限定されない任意の数の薬剤であることもできる。他の実施形態において、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。
本発明の抗体−薬物抱合体における使用のための薬物は、細胞毒性薬物、特に癌療法のために使用されるものを含む。このような薬物には、一般に、ＤＮＡ損傷薬、抗代謝物剤、天然物およびこれらの類似体を含む。細胞毒性薬剤の例示的な分類は、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸シンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ開裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎｓ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、分化誘導因子およびタキソールを含む。
これら分類のメンバーには、たとえばメトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシダイン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｅｉｎｅ）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン（ｔａｌｌｙｓｏｍｙｃｉｎ）、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体（たとえば、エトポシドまたはリン酸エトポシド）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを含むタキサン類、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトセシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、エン−ジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリケアマイシン、カンプトセシン、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ：ＤＭ１を含む）、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびメイタンシノイド（ＤＭ４）、並びにこれらの類似体を含む。
毒素は、抗体−毒素抱合体として使用してもよく、またジフテリア毒素などのバクテリア毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）などの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を含んでよい。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、これらの細胞障害作用および細胞静止作用を働かせ得る。
Ｔｏｓｏ抗体とメイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシンおよびＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの１つまたは複数の小分子毒素との接合体が想定される。
上記のいずれかにしたがって、本発明の抗体に対して行うことができるもう一つのタイプの修飾は、グリコシル化における変化である。もう一つの実施形態において、本明細書に開示された抗体は、１つまたは複数の操作された糖形態を含めるように修飾することができる。本明細書で使用される「操作された糖型」は、抗体に共有結合される炭化水素組成物を意味し、前記炭化水素組成物は、親抗体のものとは化学的に異なる。操作された糖型は、エフェクター機能を増強すること、または減少させることを含むが、限定されない種々の目的のために有用であり得る。操作された糖型の例示的形態は、アフコシル化であり、これは多分ＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより堅い結合を介して、ＡＤＣＣ機能における増大に相関することが示されている。この点において、「アフコシル化」は、宿主細胞において産生される抗体の大多数、たとえば生成された抗体の９０−９５−９８％は、抗体の炭化水素部分の成分としての相当のフコース（一般にＦｃ領域におけるＮ２９７に結合される）を実質的に欠いていることを意味する。機能的に定義すれば、アフコシル化された抗体は、一般に、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して少なくとも５０％以上の親和性を示す。
操作された糖型は、当該技術分野において公知の種々の方法よって形成されてもよい（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号；米国出願番号１０／２７７，３７０；米国出願番号１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、これらの全ては、全ての目的について、および特に操作された糖型に関連した全ての教示において、その全体が参照により本明細書に援用される）。これら技術の多くは、フコシル化されたもののレベルを制御すること、および／またはＦｃ領域に共有結合されたオリゴ糖を二分することに基づいており、これは、たとえば操作さたまたはそうではない種々の生物または株化細胞（たとえばＬｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させること、またはグリコシル化経路（たとえばＦＵＴ８［α１，６−フコシル基転移酵素］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）に含まれる酵素を調節することによる、またはＩｇＧが発現された後で炭化水素を修飾することによる。たとえば、シアトル・ジェネティックスの「糖を操作された抗体」または「ＳＥＡ技術」は、産生の際にフコシル化を阻害する修飾された糖を加えることによって機能する；たとえば、２００９０３１７８６９を参照され、その全体が参照により本明細書に援用される。操作された糖型とは、典型的には異なる炭化水素またはオリゴ糖をいい；したがって、抗体は操作された糖型を含むことができる。
あるいは、操作された糖型は、水化物またはオリゴ糖を含む変異体をいい得る。当該技術で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（たとえば、以下で述べた特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）またはタンパク質が産生された宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系が当該技術分野で公知であり、また本明細書において考察される。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結である。Ｎ−連結されたとは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭化水素部分の結合をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ−結合グリコシル化は、糖の一つであるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
抗体（または任意の他のポリペプチド、たとえば上で述べた可溶性Ｔｏｓｏタンパク質）へのグリコシル化部位の付加は、それが１つまたは複数の上記トリペプチド配列（Ｎ−連結されたグリコシル化部位について）を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって、都合よく達成される。また、この変化は、出発配列（Ｏ−連結されたグリコシル化部位について）に対して１つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基を付加または置換することによって作製してもよい。容易さのために、抗体アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基で変異させることによって、好ましくは変化させられる。
抗体またはもう一つのタンパク質上の炭化水素部分の数を増加させるもう一つの手段は、タンパク質に対して、グリコシドを化学的または酵素的に結合させることによるものである。これらの方法は、Ｎ−およびＯ−連結されたグリコシル化のグリコシル化能を有する宿主細胞中でのタンパク質産生を必要としない点で有利である。使用する結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジンに、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのものなどのヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０に、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記述されており、両方とも、全ての目的について、および特にタンパク質に炭化水素部分を接続することに関する全ての教示について、その全てが参照により本明細書に援用される。
出発抗体上に存在する炭化水素部分の除去（たとえば、翻訳後に）は、化学的にまたは酵素的に達成してもよい。化学的脱グリコシルは、化合物トリフルオロメタンスルホン酸またはその同等化合物にタンパク質を曝露することを必要とする。この処理は、連結する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全部の糖の切断を生じる一方で、ポリペプチドは無処置のまま残す。化学的脱グリコシルは、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７（Ａｒｃｈ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されており、両方とも、全体が参照により援用される。ポリペプチド上の炭化水素部分の酵素的切断は、全体が参照により援用されるＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７（Ｍｅｔｈ．）Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記述されたように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを使用することによって達成できる。潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化は、全体が参照により援用されるＤｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５）によって記述されるように、化合物ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。
抗体のもう一つのタイプの共有結合結合性の修飾は、たとえばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｎｅｋｔａｒ ｗｅｂｓｉｔｅで入手可能）からの２００５−２００６ ＰＥＧ Ｃａｔａｌｏｇ、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号（全てが、全ての目的について、および特にポリマーに対する抗体の連結に関する全ての教示について、全体が参照により援用される）に記載されている方法で、限定されないがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの種々のポリオールを含む、抗体を種々の非タンパクポリマーに連結することを含む。加えて、当該技術において公知のように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために、抗体内の種々の位置においてアミノ酸置換を作製してもよい。たとえば、全体が参照により援用される米国公開番号２００５／０１１４０３７Ａ１を参照されたい。
本発明は、本発明のＴｏｓｏ抗体をコードする核酸をさらに含む。重鎖および軽鎖の定常ドメインが抗体に含まれる場合、一般に、これらは、各々をコードする核酸を使用して作製され、これらは標準的な宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞等）の中で結合されて、抗体の四量体構造を産生する。１つの不変領域のみが作製される場合、単一の核酸だけが使用されるであろう。
本発明にしたがって使用される抗体の製剤は、望ましい純度を有する抗体を任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって、貯蔵のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、また緩衝液、たとえばホスフェート、シトラートおよびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（たとえば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；石炭酸、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩成形性対イオン；金属複合体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性物質を含む。
また、本発明の製剤は、治療される特定の適応症のために必要な複数の活性化合物、好ましくは、相互に悪影響を与えない相補的な活性をもつものを含んでよい。たとえば、他の特異性をもつ抗体を提供することがが望ましいであろう。あるいは、または加えて、組成物は、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤および／または小分子アンタゴニストを含んでもよい。このような分子は、意図した目的のために有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、この活性成分は、たとえばコアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、またコロイド性薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に包括されてよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でまたはほとんど無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
持放性製剤が調製されてよい。持放性製剤の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、整形品（たとえばフィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持放性マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル［たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標；乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なマイクロスフェア）等の分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３、−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日以上にわた見出って分子の放出を可能にするが、一定のヒドロゲルはより短時間だけタンパク質を放出する。
カプセル化された抗体が長時間にわたって身体に残るとき、これらは、３７℃の湿気への曝露の結果として変性または凝集して、生物学的活性の喪失および免疫原性における可能な変化を生じる。安定化のための合理的なストラテジーを、関与する機構に応じて工夫することができる。たとえば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互変化を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが示された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成し得る。
ＩＶ． Ｔｏｓｏ活性を調節する方法
一つの態様において、本発明は、Ｔｏｓｏ活性を調節する方法に向けられる。一つの実施形態において、Ｔｏｓｏ活性を調節する方法は、Ｔｏｓｏ活性を阻害することを含む。他の実施形態において、Ｔｏｓｏ活性を調節する方法は、Ｔｏｓｏ活性を増加させることを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｔｏｓｏ活性を直接調節することを含む。例示的な実施形態において、このような方法は、抗体などのＴｏｓｏに結合する薬剤を適用することを含む。
他の実施形態において、たとえばＴｏｓｏの同族リガンドを結合することによって、Ｔｏｓｏ活性は間接的に調節される。例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏ活性は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を投与することによって調節される。
さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏ活性は、機構の組み合わせによって、たとえばＴｏｓｏの同族のリガンドに結合する薬剤を含む組成物と組み合わせて、Ｔｏｓｏに結合する薬剤を含む組成物を投与することによって調節される。例示的な実施形態において、このような組み合わせは、限定されないが、Ｔｏｓｏ抗体および可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含んでよい。
理解されるように、Ｔｏｓｏ活性を調節する方法は、本明細書に記載した配列番号１−２５の任意の１つまたは複数、並びにその任意の変異体または修飾体の１つまたは複数を含む、本明細書に記載した組成物のいずれかを任意の組み合わせで使用することを含むことができる。
Ｖ． 障害を治療する方法
一つの態様において、および上記のいずれかにしたがって、本発明は、限定されないが、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質またはＴｏｓｏに対する抗体を含有するＴｏｓｏ活性を調節する組成物を用いて、それを必要としている被験体を治療することによって障害を治療する方法を提供する。
特定の実施形態において、および上記のいずれかにしたがって、本発明は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む組成物を用いて、それを必要としている被験体を治療することによって障害を治療する方法を提供する。理論に制約されるものではないが、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質がこれら障害のための有効な治療である１つの潜在的な機構は、Ｔｏｓｏ活性を調節することによるものである。一定の実施形態において、本発明にしたがって障害を治療する方法は、配列番号１−２５の任意の１つまたは複数またはそのいずれかの変異体を含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む、本明細書に記載した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質またはそのいずれかの変異体の治療上有効な量を投与することを含む。さらなる実施形態において、糖尿病、多発性硬化症、喘息および癌を含む障害を治療するために使用される可溶性タンパク質は、配列番号１−２５のいずれか一つに対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性をもつポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、本明細書に記載したいずれかの障害を治療するために化学修飾を含む、本明細書に記載した方法にしたがってさらに修飾されてよい。
さらなる態様において、本発明は、被験体に可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（またはその変異体）を投与することによって、障害および疾患を治療する方法に向けられる。本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、限定されないが、自己免疫疾患（限定されないが、１型糖尿病、多発性硬化症または慢性関節リウマチを含む）、２型糖尿病、喘息、アレルギー慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）、ハイパーＩｇＭ症状群、狼蒼、癌または好中球増加関連障害（限定されないが、好中球減少、重篤な先天性好中球減少、周期的な好中球減少、抗体媒介性の好中球減少、細網異形成症、白血球接着欠損、家族性骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、家族性冷却じんま疹および白血球増加、および慢性肉芽腫症を含む）に罹患した被験体を治療するために使用することができる。理解されるように、本明細書に記載された可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかは、単独または任意の組み合わせにおいて、これら障害または疾患のいずれかを治療するために使用することができる。
さらなる実施形態において、薬学的に許容される量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、それを必要としている被験体に対して、本明細書で述べた障害のいずれかを治療するために投与される。いくつかの実施形態において、被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメインおよび／またはＦｃドメインおよび／またはシグナル配列および／または可撓性リンカーを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２５の任意の１つに記載の配列を含む。また、配列番号１−２５の任意の１つの組み合わせは、本明細書述べた障害のいずれかを治療するために、別々のポリペプチドとして、または融合タンパク質として一緒に使用してもよい。このようなポリペプチドは、このような障害を治療するために、本明細書での記載にしたがって、化学修飾を含めてさらに修飾されてもよい。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載した障害のいずれかを治療するために使用される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５を含む配列を有する。さらに他の実施形態において、本明細書で述べた障害のいずれかの治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性をもった配列を有する。さらなる実施形態において、本明細書で述べた障害のいずれかの治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して約７５−９９％、８０−９８％、８５−９７％、９０−９６％、９１−９９％、９２−９８％、９３−９７％、９４−９６％の同一性をもった配列を有する。なおさらなる実施形態において、本明細書で述べた障害のいずれかの治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸置換を伴う配列番号５を含む。さらに他の実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１−３０、２−２５、３−２０、４−１５、５−１０、６−９、７−８のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。さらなる例示的な実施形態において、約１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。理解されるように、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の量は、実験動物からヒトへの投薬量変換のために広く認められた、体表面積（ＢＳＡ）正規化方法を使用して、動物試験に基づいて確認することができる。（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ，Ｓ．，Ｎｉｈａｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄｍａｄ，Ｎ．Ｄｏｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．２００７．Ｔｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい）。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１型または２型糖尿病のリスクがあり、またはその疾患を有する被験体を治療するために使用される。さらなる実施形態において、薬学的に許容される量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、それを必要とする被験体に投与される。いくつかの実施形態において、糖尿病を治療するために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメインおよび／またはＦｃドメインおよび／またはシグナル配列および／またはリンカーを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、本明細書で述べた配列番号１−２５の任意の１つに記載の配列または配列番号１−２５の変異体のいずれかを含む。さらに他の実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２５の任意の１つに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性をもつ配列を含む。また、配列番号１−２５の任意の１つの組み合わせを、糖尿病を治療するために、別々のポリペプチドとして、または融合タンパク質として一緒に、いずれかで使用してもよい。このようなポリペプチドは、糖尿病を治療するために、本明細書における記載にしたがって、化学修飾を含めてさらに修飾されてもよい。なおさらなる実施形態において、糖尿病の被験体を治療するために使用される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５を含む配列を有する。さらに他の実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性をもつ配列を有する。さらなる実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、約７５−９９％、８０−９８％、８５−９７％、９０−９６％、９１−９９％、９２−９８％、９３−９７％、９４−９６％の同一性をもつ配列を有する。なおさらなる実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。さらに他の実施形態において、糖尿病の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１−３０、２−２５、３−２０、４−１５、５−１０、６−９、７−８のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載した組成物のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質での治療は、被験体における糖耐性を改善し、それによって糖尿病を治療するのに役に立つ。例示的な実施形態において、約１０−２０、１１−１９、１２−１８、１３−１７、１４−１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。さらなる例示的な実施形態において、約１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。理解されるように、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の量は、実験動物からヒトへの投薬量の変換のために広く認められた体表面積（ＢＳＡ）正規化方法を使用して、動物試験に基づいて確認することができる。（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ，Ｓ．，Ｎｉｈａｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄｍａｄ，Ｎ．Ｄｏｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．２００７．Ｔｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい）。本明細書においてさらに詳細に記載した実験については、５０μｇの用量が疾患モデルにおいて使用され、それはおよそ２０ｇのマウスにおいて２．５ｍｇ／ｋｇであろう。ＢＳＡ変換を使用すると、これは０．２０２７ｍｇ／ｋｇまたは７．５ ｍｇ／ｍ２、または６０ｋｇの成人について１２．２ｍｇであろう。
他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、多発性硬化症のリスクにあるか、またはその疾患を有する被験体を治療するために使用される。さらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の薬学的に許容される量が、多発性硬化症の治療または寛解のために、それを必要とする被験体に投与される。いくつかの実施形態において、被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｆｃドメインおよび／または可撓性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメインおよび／またはＦｃドメインおよび／またはシグナル配列および／またはリンカーを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２４の任意の１つに記載の配列を含む。 配列番号１−２５の任意の１つの組み合わせもまた、別々のポリペプチドとして、または融合タンパク質として一緒に、いずれかで多発性硬化症を治療するために使用されてもよい。また、このようなポリペプチドは、多発性硬化症を治療するために、本明細書の記載にしたがって、化学修飾も含めてさらに修飾されてよい。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５を含む配列を有する。さらに他の実施形態において、多発性硬化症の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性をもった配列を有する。さらなる実施形態において、多発性硬化症の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、約７５−９９％、８０−９８％、８５−９７％、９０−９６％、９１−９９％、９２−９８％、９３−９７％、９４−９６％の同一性をもつ配列を有する。なおさらなる実施形態において、多発性硬化症の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。さらに他の実施形態において、多発性硬化症の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１−３０、２−２５、３−２０、４−１５、５−１０、６−９、７−８のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載した組成物のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質での治療は、多発性硬化症の進行を遅延させるのに役に立つ。例示的な実施形態において、約１０−２０、１１−１９、１２−１８、１３−１７、１４−１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。さらなる例示的な実施形態において、約１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。理解されるように、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の量は、実験動物からヒトへの投薬量の変換のために広く認められた体表面積（ＢＳＡ）正規化方法を使用して、動物試験に基づいて確認することができる。（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ，Ｓ．，Ｎｉｈａｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄｍａｄ，Ｎ．Ｄｏｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．２００７．Ｔｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい）。本明細書においてさらに詳細に記載した実験については、５０μｇの用量が疾患モデルにおいて使用され、それはおよそ２０ｇのマウスにおいて２．５ｍｇ／ｋｇであろう。ＢＳＡ変換を使用すると、これは０．２０２７ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｍ２、または６０ｋｇの成人について１２．２ｍｇであろう。
他の実施形態においては、関節炎のリスクがあるか、またはその疾患を有する被験体を治療するために、本発明の方法および組成物が使用される。さらなる実施形態において、薬学的に許容される量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、関節炎の治療または予防のために、それを必要としている被験体に投与される。いくつかの実施形態において、被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｆｃドメインおよび／またはリンカーを含む。いくつかの実施形態において、被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメインおよび／またはＦｃドメインおよび／またはシグナル配列および／またはリンカーを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２５の任意の１つに記載の配列を含む。配列番号１−２５の任意の１つ組み合わせは、別々のポリペプチドとして、または融合タンパク質として一緒に、いずれかで関節炎を治療するために使用されてよい。このようなポリペプチドは、関節炎を治療するために、本明細書の記載にしたがって、化学修飾も含めてさらに修飾されてよい。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５を含む配列を有する。さらに他の実施形態において、関節炎の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性をもつ配列を有する。さらなる実施形態において、関節炎の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、約７５−９９％、８０−９８％、８５−９７％、９０−９６％、９１−９９％、９２−９８％、９３−９７％、９４−９６％の同一性をもつ配列を有する。なおさらなる実施形態において、関節炎の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸置換をもつ配列番号ＮＯ．５を含む。さらに他の実施形態において、関節炎の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１−３０、２−２５、３−２０、４−１５、５−１０、６−９、７−８のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載した組成物のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質での治療は、関節炎の進行を遅延させるのに役に立つ。
特定の実施形態においては、喘息のリスクにあるか、またはその疾患を有する被験体を治療するために、本発明の方法および組成物が使用される。さらなる実施形態において、薬学的に許容される量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、それを必要としている被験体に投与される。いくつかの実施形態において、喘息を治療するために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメインおよび／またはＦｃドメインおよび／またはシグナル配列および／またはリンカーを含む。なおさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２５の任意の１つ、または本明細書で述べた配列番号１−２５の変異体のいずれかに記載の配列を含む。さらに他の実施形態において、喘息の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１−２５の任意の１つに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含む。また、配列番号１−２５の任意の１つの組み合わせを、別々のポリペプチドとして、または融合タンパク質として一緒に、いずれかで喘息を治療するために使用されてよい。このようなポリペプチドは、喘息を治療するために、本明細書の記載にしたがって、化学修飾を含めてさらに修飾されてよい。なおさらなる実施形態において、喘息について被験体を治療するために使用される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図８に示した配列番号５を含む配列を有する。さらに他の実施形態において、喘息の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性をもつ配列を有する。さらなる実施形態において、喘息の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に対して、約７５−９９％、８０−９８％、８５−９７％、９０−９６％、９１−９９％、９２−９８％、９３−９７％、９４−９６％の同一性をもった配列を有する。なおさらなる実施形態において、喘息の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。さらに他の実施形態において、喘息の治療のために被験体に投与される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、１−３０、２−２５、３−２０、４−１５、５−１０、６−９、７−８のアミノ酸置換をもつ配列番号５を含む。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載した組成物のいずれかに記載の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質での治療は、被験体における糖耐性を改善し、それによって喘息を治療するのに役に立つ。例示的な実施形態においては、約１０−２０、１１−１９、１２−１８、１３−１７、１４−１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。さらなる例示的な実施形態において、約１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６ｍｇの可溶性Ｔｏｓｏタンパク質が、治療効果のために被験体に投与される。理解されるように、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の量は、実験動物からヒトへの投薬量の変換のために広く認められた体表面積（ＢＳＡ）正規化方法を使用して、動物試験に基づいて確認することができる。（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ，Ｓ．，Ｎｉｈａｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄｍａｄ，Ｎ．Ｄｏｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．２００７．Ｔｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい）。本明細書においてさらに詳細に記載した実験については、５０μｇの用量が疾患モデルにおいて使用され、それはおよそ２０ｇのマウスにおいて２．５ｍｇ／ｋｇであろう。ＢＳＡ変換を使用すると、これは０．２０２７ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｍ２、または６０ｋｇの成人について１２．２ｍｇであろう。
さらなる実施形態において、配列番号１−２５のポリペプチドの任意の１つまたは複数を含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含めて、本明細書に記載した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、医薬としての使用のための形態にある。さらなる実施形態において、本発明は、医薬としての使用のために、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１、２２、２３、２４、または２５のポリペプチドの任意の１つまたは複数（または任意の１つまたは複数の一部）を含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、配列番号１−２５のポリペプチドの任意の１つのを含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の、以下の障害の任意の１つのを治療するための使用のための方法を提供する：自己免疫疾患（限定されないが、１型または２型糖尿病、多発性硬化症または慢性関節リウマチを含む）、喘息、アレルギー性慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）、ハイパーＩｇＭ症状群、狼蒼、癌または好中球増加関連障害（限定されないが、好中球減少、重篤な先天性好中球減少、周期的な好中球減少、抗体媒介性の好中球減少、細網異形成症、白血球接着欠損、家族性骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、家族性の冷却じんま疹および白血球増加並びに慢性肉芽腫症を含む）。
上記で述べたように、いくつかの実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、癌を治療するために使用される。さらなる実施形態において、本発明にしたがって癌を治療する方法には、Ｔｏｓｏ活性を調節することによって腫瘍浸潤および／または転移を阻害する方法を含む。例示的な実施形態において、本発明の組成物は、それを必要とする被験体において腺癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、肉腫またはテラトカルシノーマの群の任意の１つのを治療するために使用される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、頚部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺または子宮の１つまたは複数における癌に罹患した被験体を治療するために使用される。
実施例１：Ｔｏｓｏは関節炎の病原性において役割を担う
Ｔｏｓｏ−／−および野生型マウスには、皮下に完全フロイントアジュバント中のＩＩ型ニワトリコラーゲンを注射し、期間にわたって疾患進行をモニターした。ＩＩ型コラーゲンに曝露された動物は、ヒト慢性関節リウマチ（ＲＡ）と類似の免疫学的、病理学的および組織学的特徴を有する疾患を発症する。関節の炎症は、デジタルノギスを使用して足関節厚の変化によって測定したときに、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおいて有意に減少した（図１Ａ）。加えて、疾患重症度を、視覚での腫脹および移動度に基づいてそれぞれの関節について０〜４でスコア化した。Ｔｏｓｏ−／−マウスは、野生型対照と比較して、臨床的スコアを大幅に減少させた（図１Ｂ）。流入領域リンパ節におけるリンパ球集団のフローサイトメトリー解析は、Ｂ２２０＋ Ｂ細胞の有意な減少を示した（図１Ｃ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏが関節炎の病原性において有意な役割を有することを示唆する。
実施例２：Ｔｏｓｏ−Ｆｃでの処理は関節炎を防ぐ
本実施例は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ（配列番号：５）での処理が関節炎を防ぐことを示す。関節炎感受性マウス、ＤＢＡ１に、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ Ｉ．Ｐ．５０μｇをプレ投与し、疾患を誘導するために完全フロイントアジュバント中のＩＩ型コラーゲンで免疫し、および次いで、実験の過程にわたって、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで週に３回処理した。Ｔｏｓｏ−Ｆｃ処理されたマウスは、疾患の重症度および発病率の両方を防ぎ、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ投与が関節炎の管理において有用であり得ることを示唆した。たとえば、図２４Ａは、加算的関節炎スコアが、対照マウス（媒体のみで処理した）と比較して、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで処理されたマウスにおいてごくわずかであったことを示す。同様に、また、図２４Ｂは、関節炎のパーセント発病率が、対照と比較してＴｏｓｏ−Ｆｃ処理されたマウスにおいてごくわずかであったことを示す。関節炎の臨床的症候を以下の通りに評価した；０＝正常、１＝軽微な腫脹および／または紅斑、２＝明白な腫脹、３＝関節強直。それぞれのマウスについての個々の肢スコアを加算して、１２の最大疾患スコアを与えた。疾患の発病率は、マウスが肢において１の疾患スコアを有することを観察したときに記録した。
図２５は、コラーゲンで刺激したＴｏｓｏ−Ｆｃおよび媒体処理したマウスからの脾細胞のリコール反応（増殖）を示すさらなるデータを提供した。図に示したように、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで処理されたマウスからの脾細胞は、媒体処理した対照からの脾細胞より減少した増殖反応を示す。
実施例３：一旦疾患を確立すれば、Ｔｏｓｏ−Ｆｃは関節炎に対して有効である
上に示したように、Ｔｏｓｏ−Ｆｃの予防的投与は、慢性関節リウマチのマウスモデルにおける疾患症候を寛解させた。また、本実施例は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃの投与が、治療的状況において有効であることを示す（すなわち、疾患をすでに確立されているとき）。
雌のＤＢＡ．１マウス（生後６〜８週間）を、疾患が観察されたときに、一方は媒体処理を受け、および他方はＴｏｓｏ−Ｆｃを受けた２つの群に無作為割付けした。全てのマウスには、疾患を誘導するために、コラーゲンを接種した。疾患症候の開始は、免疫化後４３日目で観察された。動物を、プロット上の矢印によって示したように（図２６）、５２日目に媒体対照またはＴｏｓｏ−Ｆｃで処理した。５７日目の後に、Ｔｏｓｏ−Ｆｃの治療的投与は、総疾患スコアおよび関節炎発病率を激減させた（図２６を参照されたい）。これらのデータは、疾患をすでに確立したときに、Ｔｏｓｏ−Ｆｃが関節炎症候を効率的に管理することができ、およびしたがって、治療的、並びに予防的状況において有効であり得ることを示す。
実施例４：Ｔｏｓｏは、喘息の発症に関与する
喘息は、異常なＴＨ２活性化、ＩｇＥ産生、気管支反応亢進および気管支粘膜への白血球管外遊出によって特徴づけられるアレルギーの障害である。好酸球増加症は、アレルギー性喘息の特徴であり、および炎症における重要なプレーヤーであると考えられる。喘息の病理学徴候は、肺に収縮を生じさせ、および喘鳴、息切れ、胸部緊張およびせきをまねく。
ＯＶＡで誘導される喘息モデルをＴｏｓｏ−／−および野生型マウスにおいて行った（図２Ａ）。ＯＶＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を０、７および１４日目において腹膜内に送達した。次いで、マウスは、２１、２２および２３日目において３０分間、エアロゾル化したＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を受け、および２日後屠殺した。Ｔｏｓｏ−／−マウスは、ＤｉｆＱｕｉｋ染色によって評価したときに（図２Ｂ）、気管支肺胞腔への好酸球遊走の急激な減少を有した。形態に基づいて、好酸球をスライド当たり少なくとも２００の白血球を計数することによって定量化した（図２Ｃ）。
喘息およびその他のアレルギー疾患は、ＴＨ２細胞へのナイーヴＴ細胞の優先的な分化で典型的に表される。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるＴＨ２関連サイトカインおよびケモカインの存在を評価した。Ｔｏｓｏ−／−マウスは、ＥＬＩＳＡによって評価したときに、ＢＡＬＦにおけるＯＶＡで誘導されるＴＨ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３において有意な減少を有した（図３Ａ〜Ｃ）。肺への抑制された好酸球遊走と一致して、Ｔｏｓｏ−／−マウスは、ＢＡＬＦにおいてエオタキシン、Ｃ−Ｃケモカインを誘引する好酸球を有意に減少させた（図３Ｄ）。気管支平滑筋細胞が、ＴＮＦαに応答してエオタキシンを産生することは公知である。Ｔｏｓｏが肺において発現すること、およびＴｏｓｏがマウスにＴＮＦへの抵抗性を与えることが公知であるので、本発明者は、エオタキシンレベルにおけるＴｏｓｏの効果が肺固有であったかどうかに取り組もうと努力した。培養したＴｏｓｏ−／−気管支平滑筋細胞は、ＴＮＦα治療に応答して産生されるエオタキシンのレベルを有意に減少させた（図３Ｅ）。総合すれば、これらのデータは、Ｔｏｓｏ欠損は、ＯＶＡで誘導されるＴＨ２サイトカインおよび肺におけるエオタキシンレベルに影響を及ぼすことを示唆する。
アレルギー性喘息の特徴は、ＩｇＥの生産過剰である。抗体産生Ｂ細胞は、ＩＬ−４などのＴＨ２サイトカインによってＩｇＥを産生するように誘導される（Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｈ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｇｅｈａ，ＩｇＥ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．１０７（３）：ｐ．４２９−４０）。ＯＶＡで誘導される血清におけるＩｇＥ総量およびＯＶＡ特異的なＩｇＥレベルは、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおいて有意に抑制したが（図４ＡおよびＢ）、一方、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１は、野生型とノックアウトとの間で類似した（図４Ｃ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏの遺伝的除去またはおそらく治療的遮断が、ＩｇＥの産生を減少させることができることを示唆する。
アレルギー性喘息の典型となる炎症性の現象は、結果的に肺に拘束性の気流を生じさせる気道再構築になる。したがって、Ｔｏｓｏ欠損は、ＯＶＡで誘導される気道過敏症に影響を及ぼしたかどうかを、全身プレチスモグラフィーを使用してメタコリンの用量を増加させることに応答するエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）を測定することによって評価した。Ｔｏｓｏ−／−マウスは、野生型対照と比較して、Ｐｅｎｈ値における有意な減少によって示したときに、ＯＶＡで誘導される気道過敏症から有意に保護した（図５）。これらのデータは、Ｔｏｓｏ遮断がアレルギー性喘息における気道反応性を緩和するための効率的なストラテジーであることを示唆する。
実施例５：Ｔｏｓｏ除去は樹状細胞活性に影響を及ぼす
Ｔｏｓｏ除去は、アレルギー性および炎症性疾患の発症に広範な効果を有する。１つの可能性のある限定されない機構は、おそらく樹状細胞（ＤＣｓ）がナイーヴＴ細胞に対して抗原を提示する機能を介して、Ｔｏｓｏが全体的なレベルにてこれらの疾患プロセスを調節する。
Ｔ細胞の活性化において、または疾患の発症において、Ｔｏｓｏ−／−樹状細胞の機能的関連を試験するため、本発明者らは、抗原を負荷したＴｏｓｏ−／− ＤＣｓの導入が、野生型対応物に類似の疾患プロセスを誘発したをかどうかを決定した。
野生型およびＴｏｓｏ−／−骨髄由来ＤＣｓを、ＧＭ−ＣＳＦとの培養を介して作製した（Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９．２２３（１）：ｐ．７７−９２を参照され、これは全ての目的のために、および特に樹状細胞の培養に関する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。Ｌａｍｂｒｅｃｈｔらのプロトコルと同様に、本実験におけるＤＣｓには、ＯＶＡを負荷した。抗原負荷したＤＣｓをＣ５７ＢＬ６動物の気管に注入した（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ Ｔｈ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｈａｌｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０００．１０６（４）：ｐ．５５１−９を参照され、これは全ての目的のために、および樹状細胞に関連した全ての教示のために、参照により本明細書に援用される）。１週間後、動物を３日間連続の喘息研究に従ってエアロゾル化したＯＶＡで処理した。著しく、ＯＶＡ負荷したＴｏｓｏ−／−樹状細胞は、野生型対照と比較して、これらがＢＡＬＦ内でＴＨ２サイトカイン産生を誘導する能力を有意に減少した（図７Ａ）。２ｄ２ ＴＣＲトランスジェニック株は、ＥＡＥを誘発するために使用されたＭＯＧ３５−５５ペプチドに特異的であるＴ細胞を含む（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｉｔｉｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００３．１９７（９）：ｐ．１０７３−８１）。２ｄ２マウスに由来したＴ細胞は、ＭＯＧ３５−５５負荷されたＴｏｓｏ−／−ＤＣｓと共培養したときに、増殖できなかった（図７Ｂ）。ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）の制御下でリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から主要糖タンパク質（ＧＰ）を発現するマウスは、血清グルコースの増加したレベルによって評価したときに、糖尿病を発症する。同様に、また、ＧＰペプチドを受けたＲＩＰ−ＧＰを負荷したＤＣｓは、疾患を発症する。Ｔｏｓｏ−／−ＤＣｓは、野生型対照と比較して、これらが疾患を誘発する能力に機能障害を示し、およびペプチドを負荷したＴｏｓｏ−／− ＤＣｓを受けたＲＩＰ−ＧＰマウスは、ペプチドを負荷した野生型ＤＣｓを受けたこれらのマウスより有意に生存する（図７Ｃ）。総合すれば、これらの結果は、ＴｏｓｏがＴ細胞を活性化し、および樹状細胞が疾患を誘導する能力に必要であることを示唆する。
実施例６：可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の投与は、喘息疾患測定基準を抑止する
可溶性受容体を生成するために、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーからＴｏｓｏの細胞外ドメインを増幅し、および次いで、ＩＬ２シグナル配列の下流のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１ｅ３−Ｆｃ２内に、Ｃ末端にヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインで、インフレームにクローン化し、培養上清への最適の分泌を可能にした（図８Ａ−シグナル配列を囲い枠によって示し、Ｆｃドメインを下線で示した）。加えて、Ｆｃ領域は、抗体依存的な、および補体依存的な細胞毒性を除去することが示されている、いくつかの突然変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６／Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含んだ。これらの突然変異は、インビボで投与されたときに、タンパク質の半減期を増強すること、および好ましい薬物動態学的プロフィールを与えることができる。このＴｏｓｏ−Ｆｃ構築物、並びに空のベクター対照を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅの発現システムを使用して、無血清培地細胞４００ｍｌ中の３×１０８個の２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。２日後、上清を収集し、および細胞をさらなる培地４００ｍｌ中に再懸濁した。培養のさらに２日後、第２の上清を収集し、および第１の上清と混合した。Ｔｏｓｏ−Ｆｃ可溶性受容体の分泌を、ＥＬＩＳＡを使用して確認し（図８Ｂ）、プロテインＧクロマトグラフィーによって精製し、および１００ｍＭグリシンｐＨ２．３で溶出した。溶離液画分１ｍｌを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５）６０μｌ中に収集し、およびＦｃ領域に対する抗体でのウエスタンブロット（図８Ｃｉ）およびクーマシーブルー染色（図８Ｃｉｉ）によって確認した。
可溶性受容体の結合をマウス脾細胞において試験した。およそ１０６個の細胞を、氷上で２時間、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３）１００μｌ中で示した量のＴｏｓｏ−Ｆｃとインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、および氷上で３０分間、ＦＩＴＣ抱合された抗ヒトＦＣ ｇ Ｆ（ａｂ’）２断片とインキュベートし、およびＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーターで得た。脾細胞のおよそ１０％は、１０μｇにて可溶性受容体に結合した（図８Ｄ）。精製したＦｃタンパク質単独では、脾細胞に対する有意な結合を示さず、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ結合が特異的であったことを示唆した。さらなる詳細分析は、Ｔｏｓｏ−ＦｃがＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣｈｉ成熟樹状細胞または脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋形質細胞様ＤＣｓに最も有意に結合することを示した（図８Ｅ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ可溶性受容体が機能的であり、およびＴｏｓｏのリガンドが成熟樹状細胞において発現し得ることを例証する。
Ｔｏｓｏ−Ｆｃ投与の治療的有用性を、ＯＶＡで誘導される喘息のマウスモデルにおいて評価した。疾患を、わずかに改変して上記のように誘発した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、エアロゾル化したＯＶＡ曝露前に３日間連続で、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ ５０μｇを腹膜内に投与したことを除いては、記述されたように処理した（図９Ａ）。疾患の重症度を、ＢＡＬＦにおけるＴｈ２サイトカイン（図９Ｂ）、ＢＡＬＦにおける細胞充実性（図９Ｃ）を調べることによって評価した。Ｔｏｓｏ−Ｆｃでの前処置は、疾患測定基準を有意に抑止し、Ｔｏｓｏ−Ｆｃの投与が喘息の管理において有用な治療規範であり得ることを示唆した。
実施例７：Ｔｏｓｏは多発性硬化症の治療のための潜在的標的である
実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）は、ヒトＭＳのための有用なマウスモデルである。この系は、ＣＤ４＋ ＴＨ１／ＴＨ１７細胞の抗原依存的な活性化および脱髄および後肢不随をまねく単核球性細胞の血管周囲蓄積を含む。Ｃ５７ＢＬ／６の背景において、ＥＡＥは、完全フロイントアジュバント中の百日咳毒素で疾患が時間と共に増加し、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド、ＭＯＧ３５−５５の注射を介して誘発されるときに、慢性進行性とみなされる。疾患重症度を、およそ１ヵ月間、毎日０から５でスコア化した（この場合、０＝疾患の徴候なし、１＝弱々しい尾部および後肢の弱さ、しかし両方でない、２＝弱々しい尾部または後肢の弱さ、３＝部分的な後肢不随、４＝完全な後肢不随、５＝ＥＡＥによる瀕死の状態または死）。
上述したＭＯＧで誘導されるモデルにおいて、Ｔｏｓｏ−／−マウスは、野生型対照と比較して、ＥＡＥの発症から著しく保護された（図６）。これらのデータはＴｏｓｏ機能をブロックすることがＭＳのための新規の治療ストラテジーとなり得ることを示唆する。
実施例８：Ｔｏｓｏ−Ｆｃでの処理はＥＡＥの発症を遅延させる
本実施例は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ（配列番号：５）での処理がＥＡＥの発症を遅延させることを証明する。上で議論したように、ＥＡＥマウスモデルは、ヒトＭＳのための有用なモデルである。図２３Ａにおいて描かれた実験については、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、疾患を誘導するＭＯＧペプチドでの免疫化前に、Ｔｏｓｏ−Ｆｃで前処理した。Ｔｏｓｏ−Ｆｃで処理した。免疫化後、マウスを３０日間、週に３回腹膜内にＴｏｓｏ−Ｆｃ ５０μｇ（または対照マウスのためのＰＢＳ）で処理した。図２３Ｂに示したように、Ｔｏｓｏ−Ｆｃは、ＥＡＥの進行を遅延させ、多発性硬化症におけるＴｏｓｏ−Ｆｃの修飾効果を示す。
実施例９：Ｔｏｓｏは生得的な抗菌免疫応答を減少させる
本実施例は、顆粒球が細菌感染後のＴｏｓｏ欠損マウスにおいて早く活性化され、および病原体の制御に必須であることを証明する。Ｔｏｓｏ欠損顆粒球は、増強されたＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８の発現を証明し、低下した活性化閾値を示した。これらの結果と一致して、Ｔｏｓｏ欠損顆粒球は、末梢組織における炎症部位にて減少したエフェクター機能を示した。変化させられた顆粒球機能の結果、Ｔｏｓｏ欠損マウスは、全身性リステリア感染を一掃することができず、Ｔｏｓｏ欠損マウスの迅速な死をまねく。したがって、Ｔｏｓｏは、顆粒球の活性化閾値およびエフェクター機能に影響を及ぼし、およびしたがって、決定的に生得的な抗菌免疫応答を減少させる。
材料および方法
マウス：短配列は、マウスＴｏｓｏ ｃＤＮＡ配列に由来する一連のオリゴマーを使用して、ライブラリー単離したゲノムＤＮＡ断片をシークエンスすることによって得た。６．５ｋｂｐ断片を、ＢｇｌＩＩ制限消化酵素を使用して５’末端から単離し、ノックアウト構築物のための長腕として使用した。６５０ｂｐ短腕は、遺伝子の３’末端の配列に由来したオリゴマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって産生した（５’ＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＧＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＣＣ３’配列番号：１および５’ＣＡＡＧＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＴＧＡＡ３’配列番号：２）。長および短腕は、Ｔｏｓｏ翻訳センスと同じ向きにネオマイシン耐性カセットのいずれかの末端に連結した。胚性幹（ＥＳ）細胞ゲノムＤＮＡへのこのノックアウト構築物の部位特異的な挿入を、Ｎｅｏの３’末端において、および短腕の３’末端の下流のゲノムＤＮＡ隣接領域においてデザインしたプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって最初にスクリーニングした。マウスを、３つのプライマーを使用してスクリーニングした。共通のプライマー（５’ＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧ３’配列番号：３）は、短腕領域に位置し、および２つのその他のプライマーは、Ｎｅｏの３’領域（５’ＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ３’配列番号：４）またはノックアウト構築物によって切除されたＤＮＡの３’領域（５’ＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣ３’配列番号：５）のいずれか由来であった。そうする際に、再編成された対立遺伝子から得られたバンドは、４００ｂｐであり、および天然の遺伝子のものは、４５０ｂｐであった。Ｄ３ ＥＳ細胞には、ノックアウト構築物を電気穿孔し、３００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下において増殖させた。次いで、陽性ＥＳクローンをＥ３．５ Ｃ５７／ＢＬ６由来の胚盤胞に注射し、キメラ子孫を再編成された対立遺伝子の存在についてスクリーニングし、およびＣ５７ＢＬ／６背景と戻し交配した。ＣＤ１１ｂ−／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６背景においてＪａｃｋｓｏｎに由来した。
骨髄キメラマウス：マウスを、１０５０ｒａｄで致死的に照射を受し、および１０７個のＣＤ４５．１ ＷＴ骨髄細胞または１０７個のＣＤ４５．２ Ｔｏｓｏ−／−骨骨髄細胞または５×１０６個のＣＤ４５．１ ＷＴ骨髄細胞プラス５×１０６個のＣＤ４５．２ Ｔｏｓｏ−／−骨髄細胞いずれかで再構成した。この研究において使用した全てのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景において維持した。全ての実験は、単一の換気されたケージにおいて行った。
リステリア感染：リステリアを、ハートインフュージョン寒天培地において増殖させた。別に示されない場合、マウスは、２×１０４ＣＦＵで静脈内に感染させた。
サイトカイン刺激後の顆粒球活性化およびＦＡＣＳ解析：ＦＡＣＳ染色および解析は、記述されたように行った（Ｌａｎｇ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｇｇｒａｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂｙ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４，７５６−７６１（２００８）、これは全ての目的のために、および特にＦＡＣＳ染色および解析に関連した全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。組換えマウスＴＮＦ−αは、Ｒ＋Ｄシステムからであり、ＬＰＳは、Ｓｉｇｍａからであり、およびＧＭ−ＣＳＦは、Ｘ６３Ｏ細胞上清から得た。ＳｉｇｍａからのｆＭＬＰを示した濃度にて使用した。活性化研究については、血液１０μｌを抗Ｇｒ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ジヒドロローダミン（Ａｌｅｘｉｓ）およびＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、示された場合）に加えて、異なるサイトカインを含む培地１００μｌ中でインキュベートした。３０分または４５分のインキュベーション（別に示されない場合、３７℃にて）後、顆粒球を固定し、および赤血球を、赤血球溶解緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して溶解した。ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８のナイーヴ発現については、血液を１０分間２％ホルマリンで固定し、および次いで、４℃にて抗Ｇｒ１および一致する抗体で染色した。Ｔｏｓｏ抗体をＮｇｕｙｅｎら（Ｂｌｏｏｄ，２０１１，Ｊｕｌ ２１，１１８（３）：５９８−６０８）に従って産生した。
プライミング研究については、顆粒球を異なるサイトカインと３０分間インキュベートし、続いて１５分間のｆＭＬＰインキュベーションを行った。
組織学：組織学的解析は、Ｌａｎｇ、Ｋ．Ｓ．らに記載されたようにスナップ凍結された、またはホルマリン固定された組織において行った。肝臓の免疫特権状態は、Ｔｏｌｌ様受容体３シグナリングによって制御される。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６，２４５６−２４６３（２００６）、これは、全ての目的のために、および特に組織学的解析に関連した全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
ＭＰＯ ＥＬＩＳＡ：ＭＰＯ ＥＬＩＳＡは、Ｈｙｃｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈに由来し、製造業者の説明書に従って行った。
定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ遺伝子−プロファイリング：ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、Ｔｒｉｚｏｌを使用して行った。遺伝子発現解析は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴｏｓｏ（Ｆａｉｍ３）キットＭｍ０１３０２３８８＿ｍ１を使用して行った。解析については、全ての標的遺伝子の発現レベルを１８ｓＲＮＡ（ΔＣｔ）に対して規準化した。遺伝子発現値は、ΔＣｔとして表してある。
統計分析：データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表してある。２つの異なる群間の統計的に有意な相違をスチューデントのｔ検定を使用して解析した。別に言及されない場合、独立二元配置。いくつかの群を含む解析を、さらなるボンフェローニまたはダネット試験で、一元ＡＮＯＶＡを使用して行った。複数の時点にわたる実験群間の統計的に有意な相違を、二元ＡＮＯＶＡ（繰り返し測定）を使用して算出した。ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。
ＴＯＳＯは、顆粒球において発現されるが、白血球分化のために重要でない
Ｔｏｓｏのインビボでの機能関連を解析するため、本発明者は、材料および方法に記載されたようにＴｏｓｏ欠損マウスを作製した。Ｔｏｓｏ欠損マウスをＣ５７ＢＬ／６背景に戻し交配し、次いでＴｏｓｏ ＲＮＡの発現を解析した。Ｔｏｓｏ−／−マウスからのＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｔｏｓｏの欠如を示し、実際は、ＴｏｓｏをＴｏｓｏ−／−マウスにおいて発現しなかったことを示唆した（図１２ａ）。次に、Ｔｏｓｏタンパク質を、Ｔｏｓｏ特異抗体を使用してリンパ球において解析した。Ｔ細胞でなくナイーヴＴ細胞が、公開された文献と一致してＴｏｓｏ（図１２ｂ）を発現したことを見出した。次に、本発明者は、顆粒球におけるＴｏｓｏの発現を解析した。本発明者は、血液および脾臓両方における顆粒球が細胞表面上にＴｏｓｏを発現したことを見出した（図１２ｃ）。Ｔｏｓｏがリンパ球または顆粒球発症に影響を及ぼしたかどうかを解析するために、本発明者は、Ｔｏｓｏ−／−マウスの末梢血液におけるこれらの細胞集団を解析した。Ｔｏｓｏ−／−マウスは、血液顆粒球において何らの著しい相違も示さなかった（図１２ｄ）。減少したＢ細胞数に起因してＴｏｓｏ欠損マウスにおける血液リンパ球数のわずかに有意な減少があった（図１２ｄおよびｅ）。Ｔｏｓｏ−／−マウスの脾臓サイズは、正常であり、および脾臓リンパ球は、正常な分布を示し、免疫細胞の発達に対してＴｏｓｏの主要な役割がないことを示唆する（図１２ｆおよびｇ）。
３． 活性化のための閾値は、ＴＯＳＯ欠損マウス顆粒球において減少する
Ｔｏｓｏ−／−および野生型マウスからの顆粒球を顆粒球活性化因子Ｎ−ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ）で活性化した。ｆＭＬＰは、顆粒球上のｆＭＬＰ受容体を活性化し、病原体接触を模倣する。プレ活性化した顆粒球において、ｆＭＬＰとの接触は、活性酸素種（ＲＯＳ）および脱顆粒の強力な産生をまねく。対照的に、サイトカインによってプレ活性化されていない顆粒球は、制限されたｆＭＬＰへの反応を示す。わずか１０％の野生型顆粒球が、ＲＯＳおよび脱顆粒の産生によって解析したときに、ｆＭＬＰでの処理により活性化された（図１３ａ）。対照的に、ｆＭＬＰでの処理は、５０％のＴｏｓｏ−／−顆粒球を活性化した（図１３ａ）。
次に、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球のＲＯＳ産生および脱顆粒をＴＮＦ−αでの処理後に解析し、これは通常顆粒球を刺激するだけであるが、ＲＯＳ産生をまねかない。ＴＮＦ−αでの処理は、ＷＴ顆粒球における実質的にＲＯＳ産生の欠如をまねく（図１３ｂ）。対照的に、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球は、ＴＮＦ−α治療後に有意なＲＯＳを産生する／脱顆粒された顆粒球を示し、Ｔｏｓｏが顆粒球活性化の閾値に影響することを示唆する（図１３ｂ）。また、顆粒球を刺激することが公知であるＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦでの処理は、野生型もＴｏｓｏ−／−顆粒球においてもＲＯＳを活性化しない（図１３ｃおよびｄ）。これらの結果は、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球が、ｆＭＬＰおよびＴＮＦ−α両方のための活性化閾値の低下を有したことを示す。ＧＭ−ＣＳＦまたはｆＭＬＰと共にＬＰＳでの共処理では、ＷＴ顆粒球における１０倍までＲＯＳ産生野生型顆粒球の割合を上昇させた（図１３ｅ）。また、ＲＯＳ産生顆粒球の割合は、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球を共処理したＬＰＳまたはＧＭ−ＣＳＦ刺激したｆＭＬＰのいずれにおいても増加した（図１３ｅ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球が、またＧＭ−ＣＳＦまたはＬＰＳで刺激する顆粒球の状況において活性化閾値の低下を示したことを示す。Ｔｏｓｏ−／−顆粒球が、一般的に減少した活性化閾値を有したことを示唆する。
細胞のストレスは、顆粒球を活性化することができ、（自己）炎症性疾患に有意に寄与し得る。Ｔｏｓｏ−／−顆粒球が、よりこのような活性化の傾向があるかどうか解析するために、野生型（ＷＴ）およびＴｏｓｏ−／−顆粒球を異なる温度にてインキュベートした。野生型顆粒球が何らの応答も示さなかった条件である、温度低下は、３０％のＴｏｓｏ−／−顆粒球における脱顆粒を誘導した（図１３ｆ）。活性化閾値の相違は、ＷＴとＴｏｓｏ−／−顆粒球との間の寿命における相違によって説明することができる。顆粒球は、通常インビトロ培養後２４時間以内に自発性のアポトーシスによって強調される非常に限られた寿命を有する。顆粒球活性化は、通常、長期にわたる寿命および減少したアポトーシスと連関する。しかし、自発性アポトーシスにおける相違は、Ｔｏｓｏ−／−とＷＴ顆粒球との間にはなかった（図１７）。ＧＭ−ＣＳＦでの処理は、Ｔｏｓｏに依存しなかったプロセスである顆粒球におけるアポトーシスを減少させた（図１７）。データは、Ｔｏｓｏタンパク質の発現が、炎症性またはストレスシグナルに遭遇するときに、静止非活性化状態における顆粒球を保持したことを証明する。
顆粒球における活性化閾値を本質的に調節する
Ｔｏｓｏ−／−マウスに由来する顆粒球は、野生型顆粒球と比較したときに、エフェクター表現型への分化のために閾値の低下を有する。これらの固有の制御の他に、顆粒球活性化は、いくつかの外部体液因子（たとえば：サイトカイン、抗体、補体因子）、並びにＢ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞または血小板などの周囲の細胞の活性化状態によって影響される。Ｔｏｓｏ−／−マウスに由来する顆粒球の活性化閾値の低下の機構に対するより多くの洞察を得るために、混合骨髄キメラを解析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを照射し、および次いで、ＷＴ、Ｔｏｓｏ−／−または混合ＷＴ／Ｔｏｓｏ−／−（比１：１）骨髄のいずれかで再構成した。ＷＴ骨髄は、ＣＤ４５．１アイソフォームの発現によってキメラマウスにおいて別々に追跡することができた（図１４ａ）。この混合骨髄キメラにより、同じマウスに由来するＷＴおよびＴｏｓｏ−／−顆粒球の活性化閾値の解析を可能になった。観察された活性化閾値における相違（特に混合キメラマウスにおけるもの）は、Ｔｏｓｏが本質的に顆粒球の活性化を調節することを示唆するだろう。骨髄移植後３０日の骨髄キメラの解析は、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球がＷＴ顆粒球と同じ数で再構成されたことを示し、顆粒球の発生においてＴｏｓｏの主要な役割がなかったことを再び示唆する（図１４ｂ）。混合キメラにおいて、総顆粒球（ＷＴおよびＴｏｓｏ−／−）は、単一のマウス株から骨髄を受けていたマウスと同等であった（図１４ｂ）。混合骨髄キメラの競合的状況では、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球に対してＷＴの著しい利点はなかった（図１４ｂ）。
次に、キメラマウスにおけるＷＴ対Ｔｏｓｏ−／−顆粒球の活性化閾値を解析した。ｆＭＬＰでの処理は、骨髄移植を受けたマウスにおいて、より多くの顆粒球を活性化し（図１４ａ対図１３ａ）、この潜在性機構に限られずに、骨髄移植受けるマウスにおける異なるサイトカインレベルのためであり得る。Ｔｏｓｏ−／−マウスに由来したデータと同等で、Ｔｏｓｏ−／−骨髄で再構成されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、低下された活性化閾値を示した（図１４ｃ）。また、これは、混合骨髄キメラにおいても見られた（図１４ｃ）。これは、Ｔｏｓｏが、本質的に顆粒球の活性化閾値に影響したことを示唆する。
加えて、Ｔｏｓｏが、エフェクター機能の強度に影響したかどうか決定するために、活性ＷＴおよび活性Ｔｏｓｏ−／−顆粒球のＲＯＳ産生の量を決定した。活性ＷＴ顆粒球は、活性Ｔｏｓｏ−／−顆粒球より有意に多くのＲＯＳ産生を示した（図１４ｄ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏが顆粒球の活性化閾値を増強したことを示す。一旦、顆粒球が活性化されると、これらはＴｏｓｏの存在における増強されたエフェクター機能を示した。
Ｔｏｓｏ欠損マウスにおける損なわれたリステリアの制御
インビボでの細菌制御に対する顆粒球中のＴｏｓｏの欠如の効果を評価した。グラム陽性リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）での感染は、顆粒球の迅速案活性化において、特に強く依存的である。リステリアの致死量以下の用量での感染は、Ｔｏｓｏ−／−マウスにおける増加した死をまねき（図１５ａ）、Ｔｏｓｏが細菌の制御に必須であったことを示唆する。Ｔｏｓｏ−／−マウスにおける血液顆粒球は、リステリア接種の２日後に増強された脱顆粒およびＲＯＳ産生を示した（図１５ｂ）。これは、Ｔｏｓｏ−／−マウス（図１５ｃ）の血清中でのミエロペルオキシダーゼの増強された放出と相関した。
一つの可能性は、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球は、血液において迅速に活性化されるが、感染した器官におけるこれらの完全な打撃（ｂｌｏｗｎ）エフェクター機能を及ぼすことができないであろうということであった。この仮説を解析するために、感染された野生型またはＴｏｓｏ−／−マウスを、リステリア２×１０６ＣＦＵで感染させ、および組織学を２０時間後に解析した。肉芽腫をＷＴおよびＴｏｓｏ−／−マウス両方において見出し（図１５ｄ）、Ｔｏｓｏが肉芽腫形成に含まれなかったことを示唆する。リステリアの染色は、肉芽腫における増強された細菌を示し（図１５ｄ）、肉芽腫におけるエフェクター機能が、Ｔｏｓｏによって影響されたことを示唆する。
器官における感染１日後の顆粒球の解析は、減少したエフェクター機能を示し（図１５ｅ）、リステリア成長は、Ｔｏｓｏ−／−マウスの肝臓および脾臓において有意に増強した（図１５ｆ）。これは、血液（図１８）および最後に脳へのリステリアの伝播と関連し、おそらくリステリア感染したＴｏｓｏ−／−マウスの死因であった（図１５ｆ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏ−／−マウスがリステリア感染に対する増強した感染性を示したことを示す。これは、血液における増強された顆粒球活性化、肝臓および脾臓における減少したエフェクター機能および脳へのリステリアの伝播と相関した。
Ｔｏｓｏは、顆粒球における表面ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８発現を調節する
Ｔｏｓｏ欠損顆粒球は、血液において増強した活性化を、しかし組織において顆粒球の減少したエフェクター機能を示す。この表現型は、インテグリンの異なる発現および／または異なるシグナリングにうまく適合するだろう。ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８は、顆粒球活性化のための重要なインテグリンである。したがって、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８の発現をＷＴおよびＴｏｓｏ−／−顆粒球において比較した。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８の有意に増強された発現が、ナイーヴＴｏｓｏ欠損顆粒球においてあった（図１６ａ）。ＣＤ１１ａの発現は、ＷＴとＴｏｓｏ−／−顆粒球との間で著しく異ならなかった（図１６ａ）。ＧＭ−ＣＳＦまたはＬＰＳで活性化することにより、ＣＤ１１ｂ発現は、ＷＴおよびＴｏｓｏ−／−顆粒球の両方においてアップレギュレートされたが、しかし、発現の相違は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ濃度の増加と共に減少した（図１６ｂ）。ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦは、ｆＭＬＰにより顆粒球の活性化閾値を減少させた。したがって、ＷＴとＴｏｓｏ−／−顆粒球との間のＣＤ１１ｂ発現における相違は、おそらく異なる活性化閾値を説明することができる。実際にＣＤ１１ｂ発現が活性化閾値の制御に関与するかどうかを見るために、本発明者は、系におけるＣＤ１１ｂの役割を解析した。予想通りに、ＣＤ１１ｂの欠如は、ＣＤ１８の減少した発現をまねいた（図１６ｃ）。Ｃｄ１１ｂ−／−顆粒球は、ＧＭ−ＣＳＦと共にｆＭＬＰで処理することにより、減少した活性化およびＲＯＳ産生を示した（図１６ｄ）。これらのデータは、Ｔｏｓｏ−／−顆粒球がＣＤ１１ｂ、顆粒球の活性化閾値に影響を及ぼすインテグリンの増強された基礎発現を示したことを示す。これらの所見は、Ｔｏｓｏの非存在下において減少した活性化閾値でＴｏｓｏ−／−顆粒球における増強されたＣＤ１１ｂ発現と関連した。
実施例１０：Ｔｏｓｏは、糖耐性およびインスリン感受性において役割を担う
本実施例は、Ｔｏｓｏが糖耐性およびインスリン感受性において役割を担うことを証明する。図１９は、Ｔｏｓｏ−／−マウスが高脂肪食の開始後に正常な食物摂取および体重を有することを示す。図１９Ａにおける実験について、ＷＴおよびＴｏｓｏ−／−雄マウスの体重は、高脂肪食の開始から（生後５週間にて開始する）モニターした。図１９Ｂについては、食物摂取は、高脂肪食後１４週間にて測定した。食物摂取は、２日間の期間の始めと終わりにて、食物重量の相違の決定と共に、動物を単独で収容することによって測定した。
図２０に示したように、Ｔｏｓｏ−／−マウスは、１０〜１３週間高脂肪食であった後に、野生型マウスと比較して、糖耐性およびインスリン感受性を増強した。グルコース負荷試験を、生後５週間から１０〜１３週間高脂肪食を与えた野生型およびＴｏｓｏ−／−マウスで行った（類似の結果が、雌マウス群で得られた点に留意されたい）。インスリン負荷試験を、生後５週間から１０〜１３週間高脂肪食を与えた野生型およびＴｏｓｏ−／−マウスで行った。
グルコース負荷試験は、午前９：３０から１１：３０の間に一晩絶食させた動物において行い、腹膜内に注射した（ｉ．ｐ．）１ｇ／体重のｋｇのグルコース用量を利用して、および注射の後の０、１５、３０、６０および１２０分にてグルコースレベルを測定した。
インシュリン負荷試験は、午前９：３０と１１：３０の間に一晩絶食させた動物または午後１：００〜３：００の間に４．５時間絶食させた動物において行い、０．５Ｕ／体重のｋｇの用量でヒト通常インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ）を利用して、および血糖値を注射後０、１５、３０、４５および６０分にて測定した。
高脂肪食を与えたマウスと対照的に、図２１は、マウスの両方のセットが１０〜１３週間規則的な固形飼料であったときに、Ｔｏｓｏ−／−が野生型マウスと類似の糖耐性およびインスリン感受性を有したことを示す。グルコース負荷試験を、規則的な固形飼料を与えた野生型およびＴｏｓｏ−／−雄マウス（１５〜１８週間目）で行った。インスリン負荷試験を、規則的な固形飼料を与えた野生型およびＴｏｓｏ−／−雄マウス（１５〜１８週間目）で行った。図２１は、理論によって拘束されないが、Ｔｏｓｏ欠損の保護効果が高脂肪食を必要とすることを示唆する。グルコース負荷試験を、午前９：３０と１１：３０の間に一晩絶食させた動物において行い、腹膜内に注射した（ｉ．ｐ．）１ｇ／体重のｋｇのグルコース用量を利用して、注射後の０、１５、３０、６０および１２０分にてグルコースレベルを測定した。インシュリン負荷試験を、午前９：３０と１１：３０の間一晩絶食させた動物または午後１：００〜３：００の間４．５時間絶食させた動物において行い、０．５Ｕ／体重のｋｇの用量でヒト通常インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ）を利用して、および血糖値を注射後０、１５、３０、４５および６０分にて測定した。
実施例１１：可溶性Ｔｏｓｏでの治療は、高脂肪食を与えられた野生型マウスにおける糖耐性を改善する
本実施例は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（配列番号：５）での処理が１４週間高脂肪食を与えた野生型マウスにおける糖耐性を改善したことを証明する。図２２Ａは、可溶性Ｔｏｓｏ処理前の野生型雄マウスからのデータを示す。グルコース負荷試験を、生後５週間目から１４週間高脂肪食（６０％の脂肪カロリー）を与えられた絶食されせた野生型マウスで行った。図２２Ｂは、可溶性Ｔｏｓｏ処理後の野生型マウスからのデータを示す。マウス（１４週間の高脂肪食）を０、２、５、７、９、および１２日目において腹膜内に５０μｇの用量にて可溶性Ｔｏｓｏ−ｈＩｇＧで処理した。グルコース負荷試験を、一晩の絶食後に１４日目に行った。可溶性Ｔｏｓｏタンパク質処理の間に、マウスは、高脂肪食を続けた。グルコース負荷試験を、午前９：３０と１１：３０の間、一晩絶食させた動物において行い、腹膜内に注射した（ｉ．ｐ．）１ｇ／体重のｋｇのグルコース用量を利用して、注射後の０、１５、３０、６０および１２０分にてグルコースレベルの測定をした。
実施例１２：ヒトおよびマウスＴｏｓｏ−Ｆｃを分泌する安定な株化細胞の生成
ｃＤＮＡをコードするＴｏｓｏ−Ｆｃを、リポフェクタミン２０００を使用して接着性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。単一のクローンを、１０％ウシ胎児血清および０．２ｍｇ／ｍｌゼオシンを補ったＤＭＥＭ培地において選択した。高発現クローンを１５ｃｍのディッシュに広げて、コンフルエンスにて１：２に分割した。それぞれの分割にて、安定なトランスフェクタントを、連続的により無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地の培地および連続的により少ないＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地において培養して細胞を無血清成長に馴化した。（たとえば、分割１にて９０％ＤＭＥＭ／ＦＢＳ １０％Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ→分割１０にて１００％Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）。無血清培地において増殖するよう馴化した安定なトランスフェクタントは、生存度を損ねることなく軌道シェーカーインキュベーターにおける懸濁液において増殖した（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）。
本明細書は、ここに記述した技術の実施例の態様でその方法論、系および／または構造および用途の完全な記述を提供する。この技術の種々の態様を一定の詳細さの程度で、または１つまたは複数の個々の態様に関して記述したが、当業者は、この技術の精神または範囲を逸脱しない範囲で開示された態様に多数の変化を行うことができる。ここに記述した技術の精神または範囲を逸脱せずに多くの態様を行うことができるので、適切な範囲は、本明細書の後の特許請求の範囲にある。したがって、その他の態様が想定される。さらにまた、別途明確に請求され、または具体的順序が請求項の言い回しによって本質的に必要とされない限り、任意の操作が任意の順序で行われてもよいことを理解すべきである。上記の記述に含まれ、および添付の図面において示された全ての事項が、特定の態様の例証のみであると解釈されるものとし、および示した実施形態に限定されるというわけではないことが意図される。状況から明らか、または明白に明示されていない限り、本明細書に提供された任意の濃度値は、混合物の特定の成分の添加により、またはその後に生じる任意の変換に関係なく、混合物値または割合に関して一般に与えられる。すでに明白に本明細書に援用されていない範囲で、この開示において言及した全ての公開された参照文献および特許文献は、全ての目的のためにこれらの全体が参照により本明細書に援用される。詳細または構造における変化を、以下の特許請求の範囲に記載された本技術の基本要素を逸脱しない範囲で行ってもよい。

Claims (6)

  1. 配列番号５または配列番号６のポリペプチドを含む組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物であって、前記組成物は、Ｔｏｓｏ活性を阻害する組成物。
  3. 請求項１又は２に記載の組成物であって、前記ポリペプチドは、多量体である組成物。
  4. 請求項３に記載の組成物であって、前記多量体は、６つの単量体を含み、各単量体は、配列番号６に記載の配列を含む組成物。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞。
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