JP6737770B2

JP6737770B2 - 骨形成タンパク質の治療上の使用

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Publication number: JP6737770B2
Application number: JP2017500932A
Authority: JP
Inventors: ダブリュモレルニコラス; リウェイ; ディーアップトンポール
Original assignee: ケンブリッジエンタープライズリミテド
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2020-08-12
Anticipated expiration: 2035-07-09
Also published as: HUE048924T2; EP3166628B2; LT3669886T; EP3669886A1; US20240043485A1; DK3166628T3; AU2015287397B2; US20170209540A1; DK3669886T3; SI3669886T1; ES2876124T3; SI3166628T1; LT3166628T; ES2770073T5; RU2733318C2; RU2017102381A3; RS61961B1; US11572396B2; CA2954221C; HRP20200418T1

Description

（発明の分野）
本発明は、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10 （BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択されるポリペプチドに関する。また、本発明はBMP9の新規バリアント及び前記ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。

（発明の背景）
血管疾患は大型及び中型筋性動脈の病理的状態であり、内皮細胞の機能不全により引き起こされる。病原体、酸化LDL粒子及び他の炎症性刺激のような因子を原因として、内皮細胞は活性化状態になる。このことは、内皮細胞の特性の変化をもたらす：内皮細胞は、サイトカイン及びケモカインを分泌し、その表面に接着分子を発現し始める。このことは、今度は白血球（単球及びリンパ球）の動員をもたらし、該白血球は血管壁に浸潤し得る。内皮細胞及び動員された白血球によって生産されたサイトカインによって平滑筋細胞層が刺激されると、平滑筋細胞は増殖し、血管内腔へと遊走する。このプロセスにより、管壁が肥厚し、増殖する平滑筋細胞、マクロファージ、及び様々な種類のリンパ球からなる斑が形成される。この斑は血流を遮ることとなり、標的器官に到達する酸素及び栄養素の量の減少をもたらす。また末期において、該斑は破裂して、血餅の形成、その結果として卒中を引き起こし得る。

呼吸器疾患は、高等生物におけるガス交換を可能とする器官及び組織を冒す病理的状態を包含し、上部気道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜、及び胸膜腔、並びに呼吸を司る神経及び筋肉の状態を含む医学用語である。呼吸器疾患は、軽度かつ一定の経過をたどるもの、例えば風邪から、細菌性肺炎、肺塞栓症、及び肺癌のような生命を脅かす実体までの範囲にわたる。

肺動脈性肺高血圧症（PAH）は、現在治療法が存在しないまれな血管疾患である。遺伝性かつ特発性の肺動脈性肺高血圧症（PAH）は、平滑筋細胞、線維芽細胞、及び内皮細胞の増殖及びアポトーシス抵抗性に続発する、前毛細血管肺動脈の狭小化及び閉塞を特徴とする（Morrellらの文献、(2009) J Am Coll Cardiol 54, S20-31）。結果としての肺血管抵抗の増加により、肺動脈血圧が激しく上昇し、これにより右室肥大及び最終的には右心機能不全による死がもたらされる（Gaine及びRubinの文献、(1998) Lancet 352, 719-725）。

2000年に発表された、骨形成タンパク質II型受容体（BMPR-II）をコードする遺伝子における、ヘテロ接合の生殖系列変異の特定（Laneらの文献、Nat Genet 26, 81-84 (2000); Dengらの文献、(2000) Am J Hum Genet 67, 737-744）により、遺伝性PAHの病理生物学についての主要な見識が提供された。また、その後の研究により、特発性PAHの症例の15〜40％におけるBMPR-IIの変異（Thomsonらの文献、(2000) J Med Genet 37, 741-745）、並びにヒト（Atkinsonらの文献、(2002) Circulation 105, 1672-1678）及び動物モデル（Longらの文献、(2009) Circulation 119, 566-576）におけるPAHの非遺伝性形態の特徴としてのBMPR-IIの発現の低下が確認された。

また、遺伝的証拠により内皮細胞が、PAHにおける重要な開始段階の細胞種として強く関係づけられている。過去の研究から、内皮におけるBMPR-IIの条件付き欠失が、ある割合のマウスにおけるPAHの誘導に十分であること（Hongらの文献、(2008) Circulation 118, 722-730）、及びげっ歯類モデルにおいて、内皮でのBMPR-IIシグナル伝達のレスキューにより実験的肺高血圧症が妨害され、又は逆行すること（Reynoldsらの文献、(2012) Eur Respir J 39, 329-343; Reynoldsらの文献、(2007) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292, L1182-1192; Spiekerkoetterらの文献、(2013) J Clin Invest 123, 3600-3613）が示されている。より最近、BMP9により内皮BMPR-IIを選択的に増強させると、肺動脈性肺高血圧症が逆行することが示された（Longらの文献、(2015) Nature Medicine 21, 777-785）。さらに現在、PAHを有する患者において、I型受容体ALK-1（Trembathらの文献、(2001) N Engl J Med 345, 325-334）及びIII型受容体補助タンパク質、エンドグリン（Harrisonらの文献、(2003) J Med Genet 40, 865-871）における変異が報告されている。これらの両方は内皮上でほとんど排他的に発現している。この証拠にもかかわらず、PAHの病理生物学における内皮機能不全の厳密な性質、及びこのプロセスにおけるBMPシグナル伝達の関与は、依然として論点とされ続けている。確立されているPAHは閉塞性細胞病変の構成要素としての肺内皮細胞の過剰なクローン増殖（Yeagerらの文献、(2001) Circ Res 88, E2-E11）により特徴づけられているが、疾患のヒト（Teichert-Kuliszewskaらの文献、(2006) Circ Res 98, 209-217）及び動物モデル（Wilsonらの文献、(1992) Crit Rev Toxicol 22, 307-325; Taraseviciene-Stewartらの文献、(2001) Faseb J 15, 427-438）の両方において、疾患病理の開始が内皮細胞のアポトーシスの逆説的な増加に結び付けられている。さらなる研究により、血管透過性の激化及び血管壁を通過する白血球の変化した転位における内皮BMPR-IIの喪失の役割が特定された（Burtonらの文献、(2011) Blood 117, 333-341; Burtonらの文献、(2011) Blood 118, 4750-4758; Kimらの文献、(2013) Arterioscler Thromb Vasc Biol 33, 1350-1359）。

肺動脈平滑筋細胞（PASMC）を用いたインビトロでの研究から、BMPリガンドの濃度を増加させることにより、BMPシグナル伝達経路における変異に関連する機能喪失を克服することができること（Yangらの文献、(2008) Circ Res 102, 1212-1221）が示されている一方、今日まで治療上インビボでBMPリガンドを送達し、PAHの治療におけるそのようなアプローチの概念証明を提供した研究は存在しない。4つのII型受容体、5つのI型受容体、及び20を上回るBMPリガンドから構成される、BMPシグナル伝達ファミリーの複雑性（Miyazonoらの文献、(2005) Cytokine Growth Factor Rev 16, 251-263）により、そのような研究の非存在の理由を説明できる。肺性内皮を選択的に標的とする適当なリガンドを同定することは、著しい困難を提示する。近年、BMPR-IIがALK-1とのシグナル伝達複合体を形成し、微小血管内皮細胞におけるBMP9及び10に反応して特異的にシグナルを伝達することが見出された（Davidらの文献、(2007) Blood 109, 1953-1961）。

WO 2005/113590には、心疾患の治療のためのBMP10アンタゴニストの使用が記載されている。WO 2013/152213には、脊椎動物における赤血球及び/又はヘモグロビンレベルを増加させるための、BMP9及び/又はBMP10ポリペプチドの使用が記載されている。WO 2006/130022には、雌性哺乳動物における濾胞形成及び***速度の調節に有用なBMPRIIのアゴニスト又はアンタゴニストが記載されている。WO 2010/114833には、心疾患治療のための、骨形成タンパク質を含む医薬組成物が記載されている。WO 94/26893には、BMP-10タンパク質、BMP-10タンパク質を生産する方法、並びに骨及び軟骨の欠陥の治療、並びに創傷治癒及び関連する組織修復におけるBMP-10タンパク質の使用が記載されている。WO 95/24474及びWO 96/39431には、新規の骨形成を誘導するのに有用であると主張されている、ヒトBMP-10ポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）が記載されている。WO 93/00432及びWO 95/33830には、BMP-9タンパク質、BMP-9タンパク質を生産する方法、並びに骨及び軟骨の欠陥の治療、創傷治癒及び関連する組織修復、並びに肝臓の成長及び機能におけるBMP-9タンパク質の使用が記載されている。WO 2010/115874には、アペリン/APJの標的薬を投与することにより、肺動脈性肺高血圧症を治療するための方法が記載されている。WO 2009/114180及びWO 2014/160203には、細胞成長、分化、増殖、及びアポトーシスの調節に有用であると主張され、従って炎症、心血管疾患、血液疾患、癌、骨障害を含むBMPシグナル伝達に関連する疾患又は状態を治療するために、並びに細胞の分化及び/又は増殖を調節するために有用であり得るBMPシグナル伝達の低分子阻害剤が記載されている。また、該低分子阻害剤は、ApoB-100又はLDLの循環におけるレベルの低下、及び後天性又は先天性の高コレステロール血症又は高リポタンパク質血症；脂質の吸収又は代謝における欠陥と関連する疾患、障害、又は症候群；あるいは高脂血症により引き起こされる疾患、障害、又は症候群の治療又は予防において有用であると主張されている。

従って、血管疾患及び呼吸器疾患、特に肺動脈性肺高血圧症（PAH）のための有効な治療を提供することが求められている。

（発明の概要）
本発明の第一の態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10（BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択されるポリペプチドが提供される。

本発明のさらなる態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の骨形成タンパク質10（BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択されるポリペプチドを投与することを含む、前記方法が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又は骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントを含む医薬組成物が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、配列番号：5のアミノ酸配列を有するBMP9のバリアントが提供される。

本発明のさらなる態様に従って、配列番号：6のアミノ酸配列を有するBMP9のバリアントが提供される。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書で定義される通りのBMP9のバリアントを含む医薬組成物が提供される。

（図面の簡単な説明）
プロBMP9及びプロBMP10の発現ベクター及び発現系。非骨形成性のBMP9のバリアントの生成。A. BMP9合成及び翻訳後プロセシングの概略図。B〜D. 2つのBMP9のバリアント（D366A及びD408A）は、内皮細胞でのID1及びID2の発現誘導において、野生型と同程度のシグナル伝達活性を有する（B＆C）が、C2C12細胞における骨形成シグナル伝達活性を欠いている（D）。 BMP9及びBMP10の間の、内皮細胞シグナル伝達活性及びC2C12細胞の骨形成活性の比較。A〜C：BMP9及びBMP10はHMEC-1における、同程度のシグナル伝達活性を有する。血清飢餓の後、HMEC-1細胞を示された濃度のBMP9又はBMP10で処理した。処理から8時間後、mRNAを抽出し、ID1、ID2、又はBMPR-IIの発現レベルを定量PCRにより測定した。β2-ミクログロブリンを対照として使用し、未処理試料との相対的な倍数変化をプロットした。平均±SEMが示され、N＝2である；D. BMP9と同様に、BMP10もTNFα-CHXにより誘導されるアポトーシスからhPAECを保護することができる。方法は図3Aと同様であり、N＝1である；E. BMP9及びBMP10は内皮細胞の増殖を同程度阻害する。HPAECをEBM2/2％ FBS中のBMP9又はBMP10（両方ともR&D Systems社）で24時間処理した。最後の6時間は細胞を0.5 μCi/ウェルの³H-チミジンとインキュベートした。続いて細胞を溶解し、液体シンチレーション計数により³H-チミジンの取り込みを測定した。実験はN＝1であり、4ウェルの平均±SEMである。F. BMP9と異なり、BMP10はC2C12細胞におけるALP活性として測定される、検出可能な骨形成活性を有さない。C2C12細胞を64時間にわたり、示された濃度のBMP9又はBMP10で処理した。細胞を1％ Triton X-100/PBS中で溶解し、細胞溶解物中のALP活性を発色性ホスファターゼ基質4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（Sigma社, S0942）を用いて測定し、かつ可溶性生産物をプレートリーダー上405 nmで測定した。全てのアッセイにおいて、BMP9及びBMP10の両方を、R&D Systems社から購入した。プロBMP9を自社生産し、その濃度（成熟リガンド）をR&D system 社から入手したBMP9を標準として用いてELISAにより決定した。自社で生成させたプロBMP10は、完全な活性を示す。A. BMP10の合成及び翻訳後プロセシングの概略図。B. BMP10を発現する抗BMP10抗体（R&D Systems社）でブロットした調整培地。C. S200ゲル濾過カラムからのプロBMP10の精製を示す、非還元SDS-PAGE。BMP10及びプロドメインの同一性を、ウェスタンブロット及び質量分析ペプチドマッピングにより確認した。D＆E. Smad1/5/8のリン酸化及びID1/2/3の遺伝子発現をモニタリングすることによる、HMEC-1におけるプロBMP10のシグナル伝達能力の、BMP9及びBMP10（R&D Systems社から入手）との比較。方法は図3A〜Cと同様である。D. におけるBMP濃度は、0.05、0.1、1、5 ng/mlであり、処理時間は1時間である。平均±SEMが示されており、N＝2である。 BMP9のアラニンスキャニング突然変異誘発の概要。24個のBMP9のバリアントを生成し、ID1遺伝子誘導についてはHMEC-1細胞、アルカリホスファターゼ活性についてはC2C12細胞の、両方の細胞で、試験した。全ての結果を野生型（WT）BMP9に対し正規化した。3つの実験の平均が示されている。「-」は未処理の細胞を意味する。 BMPのバリアントは、hPAECにおいてBMPR2遺伝子の発現を誘導することができる。 BMP D408AバリアントはhPAECにおいてTNFa/CHXで誘導される早期アポトーシスをレスキューすることができる。 BMP9及びBMP10は血液派生内皮細胞（blood outgrowth endothelial cell）（BOEC）のコラーゲン：フィブロネクチンマトリックス中での管形成を阻害する。（A）DAPI及びFITC-ULEXで染色されたコラーゲンゲル中でのBOEC管の代表的な画像。培地単独（2％ BBM2＝2％ FBSを含むEBM2）における場合はネットワークが形成される。漸増濃度のBMP9の追加は、BOECネットワークの形成を阻害する。（B）3つの別個の実験で決定されたBOECネットワークのパラメータの定量化により、BMP9が管の長さ及び数、分枝及びループの形成を濃度依存的に阻害することが示されている。（C）リガンドBMP9及びBMP10は両方ともBOEC管形成を阻害する。

（発明の詳細な説明）
本発明の第一の態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10（BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択されるポリペプチドが提供される。

本発明は、内皮細胞シグナル伝達活性（例えば、ID1、ID2、及び/又はBMPR-II遺伝子の発現誘導により証拠づけられ得るものとしての活性）を維持するが、骨形成活性（例えば、マウス筋芽細胞株C2C12におけるアルカリホスファターゼ（ALP）活性により測定され得るものとしての活性）を欠いている骨形成タンパク質の治療上の使用を対象とする。例えば、本明細書で開示されるBMP10及びBMP9のバリアントは、内皮細胞シグナル伝達活性を維持するだけでなく、相乗的に骨形成活性を欠いている。従って、本明細書で開示される天然のBMP10及びBMP9のバリアントは、骨形成を促進させる能力を欠いているために、天然のBMP9よりも、血管疾患又は呼吸器疾患、特にPAHを治療するためにより望ましいアゴニストを表す。

本明細書における「BMP10」及び「骨形成タンパク質10」への言及は、BMP10遺伝子（配列番号：1に示される配列を有する）にコードされ、配列番号：2に示される424アミノ酸配列を有するTGF-βスーパーファミリーのタンパク質に属するヒトポリペプチドであって、アミノ酸残基1〜21がシグナルペプチドを含み、アミノ酸残基22〜316がプロペプチドを含み、かつアミノ酸残基317〜424が成熟BMP10を含む、前記ポリペプチドを指す。

本明細書における「BMP9のバリアント」及び「骨形成タンパク質9のバリアント」への言及は、BMP9遺伝子（配列番号：3に示される配列を有する）にコードされ、配列番号：4に示される429アミノ酸配列のバリアントを有するTGF-βスーパーファミリーのタンパク質に属するヒトポリペプチドであって、アミノ酸残基1〜22がシグナルペプチドを含み、アミノ酸残基23〜319がプロペプチドを含み、かつアミノ酸残基320〜429が成熟BMP9を含む、前記ポリペプチドを指す。不確かさを回避するため、そのようなBMP9のバリアントは内皮細胞シグナル伝達活性を維持するが、骨形成活性を欠いていなければならないことを強調すべきである。

「バリアント」への言及には、BMP9の天然の、変異体でない、すなわち野生型配列における遺伝的変化が含まれる。そのような遺伝的変化の例には：置換、欠失、挿入などから選択される変異がある。

本明細書で使用される「骨形成活性を欠いている」又は「骨形成活性を欠く」への言及は、骨形成活性（例えば、マウス筋芽細胞株C2C12におけるアルカリホスファターゼ（ALP）活性により測定され得る活性）の排除、最小化、及び/又は抑制をもたらす配列番号：4の配列の1以上の変異を含むBMP9のバリアントを指す。有利なBMP9のバリアントは、内皮特異的シグナル伝達を維持し（すなわち、HMEC-1細胞のID1遺伝子発現により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、ID1の誘導を少なくとも0.75倍有するバリアント）、かつ骨形成活性のより低い値を有する（すなわち、マウス筋芽細胞株C2C12におけるALP活性により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、0.5倍未満）バリアントであるものとする。

より望ましいBMP9のバリアントは、内皮特異的シグナル伝達を維持し（すなわち、HMEC-1細胞のID1遺伝子発現により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、ID1の誘導を少なくとも0.75倍有するバリアント）、かつごくわずかな骨形成活性を有する（すなわち、マウス筋芽細胞株C2C12におけるALP活性により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、0.1倍未満）バリアントであるものとする。

最も望ましいBMP9のバリアントは、増加した内皮特異的シグナル伝達を有し（すなわち、HMEC-1細胞のID1遺伝子発現により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、ID1の誘導をより高いレベルで有するバリアント）、かつごくわずかな骨形成活性を有する（すなわち、マウス筋芽細胞株C2C12におけるALP活性により測定される場合に、野生型BMP9と比較して、0.1倍未満）バリアントであるものとする。

一実施態様において、血管疾患は：肺高血圧症; 肺動脈性肺高血圧症; 遺伝性出血性毛細血管拡張症; アテローム性動脈硬化症; 及び肝肺症候群から選択される。

さらなる実施態様において、血管疾患は：肺高血圧症; 肺動脈性肺高血圧症; 遺伝性出血性毛細血管拡張症; 及び肝肺症候群から選択される。さらなる実施態様において、血管疾患は肺動脈性肺高血圧症から選択される。

一実施態様において、呼吸器疾患は：閉塞性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（COPD）、慢性気管支炎及び肺気腫; 肺血管疾患、例えば肺水腫及び肺出血; 呼吸不全及び呼吸促迫症候群、例えば急性肺傷害及び急性呼吸促迫症候群; 並びに間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症（idopathic pulmonary fibrosis）から選択される。

一実施態様において、ポリペプチドはBMP10である。従って、本発明のさらなる態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10が提供される。BMP10がID1、ID2、及びBMPR-II遺伝子の発現誘導において、BMP9と同程度の効力があることを示すデータが本明細書で提供される（図3A〜3Cを参照されたい）。さらに、BMP10はTNFα-CHXにより誘導されるアポトーシスに対するhPAECの保護において、BMP9と同じ抗アポトーシス活性を示すことが本明細書で示されている（図3Dを参照されたい）。しかしながら決定的に、BMP10はBMP9とは異なり、試験した最も高い濃度においてもALP活性を全く誘導しなかった（図3Fを参照されたい）。

さらなる実施態様において、ポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を含むBMP10である。

さらなる実施態様において、ポリペプチドは、配列番号：1のヌクレオチド配列によりコードされるBMP10である。

さらなる実施態様において、ポリペプチドはプロドメインと結合した形態のBMP10（プロBMP10）である。プロBMP10複合体は非常に安定であり（図4B及び4Cを参照されたい）、血管疾患及び呼吸器疾患、例えばPAHの治療のために好ましい形態である可能性があることを示すデータが本明細書で提供される。

さらなる実施態様において、プロBMP10は、配列番号：2の残基317-424のアミノ酸配列を有する成熟BMP10配列と非共有結合的に結合した、配列番号：2の残基22-316のアミノ酸配列を有するプロペプチド配列を含む。

さらなる実施態様において、プロBMP10は、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP10配列を含む、四量体を含む。

一実施態様において、ポリペプチドは骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントである。従って、本発明のさらなる態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントが提供される。

さらなる実施態様において、ポリペプチドは、プロドメインと結合した形態のBMP9（プロBMP9）のバリアントである。

さらなる実施態様において、プロBMP9のバリアントは：配列番号：4の残基320-429のアミノ酸配列を有する成熟BMP9配列と非共有結合的に結合した、配列番号：4の残基23-319のアミノ酸配列を有するプロペプチド配列のバリアントを含む。

さらなる実施態様において、プロBMP9のバリアントは、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP9配列を含む四量体を含む。

一実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4のアミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入変異体を含む。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体を含む。

さらなる実施態様において、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体は、以下の置換：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418Aの1以上（すなわち、単一、二重、三重変異体など）を含む。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4の以下のBMP9のバリアント：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418Aの1つから選択される。

さらなる実施態様において、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体は、以下の置換：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418Aの1以上（すなわち、単一、二重、三重変異体など）を含む。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4の以下のBMP9のバリアント：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418Aの1つから選択される。これらの変異体配列が内皮特異的シグナル伝達の有益な作用を維持し、大きく低下した骨形成シグナル伝達を有する（図5における野生型BMP9と比較した場合に、少なくとも0.75倍のID1の誘導及び0.5倍未満のALP活性により証拠づけられる）ことを示すデータが、本明細書で提供される。

さらなる実施態様において、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体は、以下の置換：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418Aの1以上（すなわち、単一、二重、三重変異体など）を含む。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4の以下のBMP9のバリアント：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418Aの1つから選択される。これらの変異体配列が内皮特異的シグナル伝達の有益な作用を維持するが、骨形成シグナル伝達を欠いている（図5における野生型BMP9と比較して、少なくとも0.75倍のID1の誘導及びごくわずかな（すなわち0.1倍未満）ALP活性により証拠づけられる）ことを示すデータが、本明細書で提供される。

さらなる実施態様において、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体は、以下の置換：D366A又はD408Aの一方又は両方（すなわち、単一又は二重変異体）を含む。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4の以下のBMP9のバリアント：D366A又はD408Aの1つから選択される。これらの変異体配列が、BMP9の有益な作用を維持するが、骨形成シグナル伝達を開始することができず、そのためにインビボでのBMP9の投与により骨が形成される潜在的なリスクが除かれることを示すデータが、本明細書で提供される（図2に示されている結果を参照されたい）。また、これらの変異体配列が、増加した内皮特異的シグナル伝達を有するが、骨形成シグナル伝達を欠いている（図5における野生型BMP9と比較して、1倍超のID1の誘導及びごくわずかな（すなわち、0.1倍未満）ALP活性により証拠づけられる）ことを示すデータが本明細書で提供される。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：4のD408A BMP9バリアントから選択される。この変異体配列が、腫瘍壊死因子α（TNFα）及びシクロヘキシミド（CHX）によって誘導される、PAECの早期アポトーシスをレスキューすることができることが示されたことを表すデータが本明細書で提供される（図7において示される結果を参照されたい）。

さらなる実施態様において、骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントは、配列番号：5のアミノ酸配列を含むD366A BMP9バリアント、又は配列番号：6のアミノ酸配列を含むD408A BMP9バリアントから選択される。

本明細書で開示されるBMP9のバリアントは、これまで知られておらず、そのために本発明の新規態様を形成するポリプチドを構成することを認識されたい。このように、本発明のさらなる態様に従って、配列番号：5のアミノ酸配列を含むBMP9のバリアントが提供される。本発明のさらなる態様に従って、配列番号：6のアミノ酸配列を含むBMP9のバリアントが提供される。

活性ポリペプチドを単独で投与することは可能であるが、該活性ポリペプチドを医薬組成物（例えば、製剤）として提供することが好ましい。一実施態様において、これは滅菌医薬組成物である。

本発明はさらに、少なくとも1つの本発明のポリペプチドを、1以上の医薬として許容し得る賦形剤、及び任意に他の治療薬剤又は予防薬剤と一緒に含む（例えば、混合する）、先に記載の通りの医薬組成物、及び医薬組成物を生産する方法を提供する。

このように、本発明のさらなる態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のためのBMP10、又は骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントを含む医薬組成物が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書で定義されるBMP9のバリアント、例えば配列番号：5のアミノ酸配列を含むD366A BMP9バリアント、又は配列番号：6のアミノ酸配列を含むD408A BMP9バリアントを含む医薬組成物を提供する。

医薬として許容し得る賦形剤（複数可）は、例えば、担体（例えば、固体、液体、又は半固体担体）、アジュバント、希釈剤、増量剤若しくは充填剤、造粒剤、コーティング剤、放出制御剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤、酸化防止剤、緩衝剤、懸濁剤、増粘剤、香味剤、甘味料、味マスキング剤、安定剤、又は医薬組成物において従来使用される任意の他の賦形剤から選択することができる。様々な種類の医薬組成物に対する賦形剤の例は、以下により詳細に説明する。

本明細書で使用される用語「医薬として許容し得る」は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、過敏症、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴うことなく、対象（例えば、ヒト）の組織と接触させての使用のために適当な、合理的なベネフィット/リスク比に相応の化合物、物質、組成物、及び/又は剤形に関連する。また、各担体、賦形剤などは、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容し得る」ものでなければならない。

本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、公知の技術により製剤化することができる。例えば、「レミントン薬科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAを参照されたい。

医薬組成物は、経口、非経口、局所、鼻腔内、気管支内、舌下、眼、耳、直腸、膣内、又は経皮投与に適当な任意の形態とすることができる。組成物について非経口投与が意図されている場合、該組成物は静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与、又は標的器官若しくは組織への注入、点滴、若しくは他の送達手段による直接の送達のために製剤化することができる。送達はボーラス注入、短期点滴、又は長期点滴によるものとすることができ、かつ受動的送達、又は適当な点滴ポンプ若しくはシリンジドライバの利用を介するものとすることができる。

非経口投与に適応する医薬製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、共溶媒、界面活性剤、有機溶媒混合物、シクロデキストリン錯体形成剤、乳化剤（乳剤製剤を形成し、安定化するため）、リポソーム形成のためのリポソーム成分、重合ゲルを形成するためのゲル化ポリマー(gellable polymer)、凍結乾燥保護剤、及び特に、可溶性形態に活性成分を安定化し、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にするための薬剤の組合わせを含み得る水性及び非水性滅菌注入溶液がある。また、非経口投与のための医薬製剤は、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液の形態をとることができる（R. G. Stricklyの文献、「経口及び注入可能製剤における可溶化賦形剤（Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations）」, Pharmaceutical Research, Vol 21(2) 2004, p 201-230）。

本発明のBMP10又はBMP9のバリアントを含む遺伝子療法が、本発明の範囲内にあることは、理解されよう。例えば、BMP10又はBMP9のバリアントのヌクレオチド配列をコードするベクターは、宿主ヒト対象に投与されて、循環系に放出させるためのBMP10又はBMP9のバリアントポリペプチドの内在の発現（例えば、肝臓における内在の発現）をもたらす。従って、本発明のさらなる態様により、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又はBMP9のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。さらなる実施態様において、ベクターは配列番号：1のヌクレオチド配列を含む。

一実施態様において、ベクターはウイルスベクターである。さらなる実施態様において、ウイルスベクターは：レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペス、ワクシニア、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。さらなる実施態様において、ウイルスベクターであるベクターは、アデノ随伴ウイルスである。

代替の実施態様において、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの使用には、ウイルスベクターの使用と比べ、大規模生産が容易であることや、宿主における免疫原性が低いことのようないくつかの利点がある。非ウイルス遺伝子療法の例には：ネイキッドDNAの注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、並びにオリゴヌクレオチド、リポプレックス、デンドリマー、及び無機ナノ粒子の使用がある。

製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封アンプル、バイアル、及び予め充填されたシリンジ中で提供し、かつ使用の直前に滅菌液体担体、例えば注入用水を加えることのみを要求する凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilised））状態で保存することができる。

医薬製剤は、本発明のポリペプチドを凍結乾燥することにより製造することができる。凍結乾燥（lyophilisation）は、組成物を凍結乾燥する（freeze-drying）手順を指す。従って凍結乾燥（freeze-drying）及び凍結乾燥（lyophilisation）は、同義であるものとして本明細書中で使用する。

用時調製される注入溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から製造できる。

また、非経口注入のための本発明の医薬組成物は、医薬として許容し得る滅菌水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液、又は乳剤、並びに使用直前の滅菌注入溶液又は分散液への再構成のための滅菌粉末を含むことができる。

適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース、及びこれらの適当な混合物、植物油（例えば、ヒマワリ油、ベニバナ油、トウモロコシ油、又はオリーブ油）、並びに注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。適当な流動性は、例えば増粘物質又はコーティング物質、例えばレシチンを使用することにより、分散液の場合には要求される粒度を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、維持することができる。

また、本発明の組成物は、アジュバント、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含むことができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることにより確保できる。また、浸透圧を調節する薬剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合がある。注入可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。

本発明の特定の一実施態様において、医薬組成物は静脈内投与、例えば注入又は点滴に適当な形態とする。静脈内投与については、溶液をそのまま投薬することもでき、投与前に溶液を点滴バッグ（医薬として許容し得る賦形剤、例えば0.9％生理食塩水又は5％ブドウ糖を含む）に注入することもできる。

別の特定の実施態様において、医薬組成物は皮下（s.c.）投与に適当な形態である。

経口投与に適当な医薬剤形には、錠剤（コーティングされた、又はコーティングされていない）、カプセル剤（ハードシェル又はソフトシェル）、カプレット剤、丸薬、ロゼンジ、シロップ、溶液剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤及び懸濁剤、舌下錠、オブラート、又はパッチ剤、例えば頬側パッチ剤がある。

従って、錠剤組成物は活性ポリペプチドの単位用量を不活性希釈剤又は担体、例えば糖又は糖アルコール、例えば；ラクトース、スクロース、ソルビトール、又はマンニトール；及び/又は非糖由来希釈剤、例えば炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、又はセルロース若しくはその誘導体、例えば微結晶性セルロース（MCC）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びトウモロコシデンプンのようなデンプンと一緒に含むことができる。また、錠剤は結合剤及び造粒剤、例えばポリビニルピロリドン、崩壊剤（例えば、架橋性カルボキシメチルセルロースのような膨潤性架橋性ポリマー）、滑沢剤（例えば、ステアレート）、防腐剤（例えば、パラベン）、酸化防止剤（例えば、BHT）、緩衝剤（例えば、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、並びに発泡剤、例えばクエン酸塩/炭酸水素塩混合物のような標準的な成分を含むことができる。そのような賦形剤は周知であり、本明細書で詳細に論じる必要がない。

錠剤は薬物を胃液との接触時に放出する（即時放出錠剤）ようにも、延長された期間にわたって、又は胃腸管の特定の領域にて制御された様式で放出する（制御放出錠剤）ようにも設計することができる。カプセル製剤は、ハードゼラチン種又はソフトゼラチン種とすることができ、活性成分を固体、半固体、又は液体形態で含むことができる。ゼラチンカプセルは、動物ゼラチン又はその合成若しくは植物由来等価物から形成することができる。

固体剤形（例えば、錠剤、カプセル剤など）は、コーティングすることも、コーティングしないこともできる。コーティングは、保護塗膜（例えば、ポリマー、ワックス、又はワニス）としても、制御性薬物放出の手段としても、又は美しさ若しくは識別を目的としても役割を果たすことができる。コーティング（例えば、Eudragit（商標）型ポリマー）は、胃腸管内の所望の位置で、活性成分を放出するように設計することができる。従ってコーティングは、胃腸管内の特定のpH条件下で分解し、それによりポリペプチドを胃で、回腸で、十二指腸で、空腸(jejenum)で、又は結腸で、選択的に放出するように選択することができる。

コーティングの代わりに、又はコーティングに加えて、薬物を放出制御剤、例えば胃腸管内で制御された様式でポリペプチドを放出するように適応され得る徐放化剤を含む、固体マトリックス中に提供することができる。あるいは、薬物をポリマーコーティング、例えば胃腸管における様々な酸性度又は塩基性度条件下で、ポリペプチドを選択的に放出するように適応され得るポリメタクリレートポリマーコーティング中に提供することができる。あるいは、マトリックス物質又は放出遅延コーティングは、剤形が胃腸管を通過するときに実質的かつ継続的に浸食される浸食性ポリマー（例えば、マレイン酸無水物ポリマー）の形態をとることができる。別の代替物として、コーティングは腸内微生物の作用下で崩壊するように設計することができる。さらなる代替物として、活性ポリペプチドを、ポリペプチド放出の浸透圧による制御を提供する送達系中に製剤化することができる。浸透圧による放出製剤及び他の徐放又は持続的放出製剤（例えば、イオン交換樹脂に基づく製剤）は、当業者に周知の方法に従って製造することができる。

本発明のポリペプチドは担体と共に製剤化し、ナノ粒子の形態で投与することができ、ナノ粒子の増加した表面積はその吸収を支援する。さらに、ナノ粒子は細胞内への直接の浸透の可能性を提供する。ナノ粒子薬物の送達系は、2006年3月13日公表のRam B Gupta及びUday B. Kompella編の「薬物送達のためのナノ粒子技術（Nanoparticle Technology for Drug Delivery）」, Informa Healthcare, ISBN 9781574448573に記載されている。また、薬物送達のためのナノ粒子は、J. Control. Release, 2003, 91 (1-2), 167-172, 及びSinhaらの文献、Mol. Cancer Ther. August 1, (2006) 5, 1909に記載されている。

医薬組成物は典型的に、約1％（w/w）〜約95％（w/w）の活性成分、及び99％（w/w）〜5％（w/w）の医薬として許容し得る賦形剤又は賦形剤の組合わせを含む。特に、組成物は約20％（w/w）〜約90％（w/w）の活性成分、及び80％（w/w）〜10％の医薬として許容し得る賦形剤又は賦形剤の組合わせを含む。医薬組成物は、約1％〜約95％、特に約20％〜約90％の活性成分を含む。本発明による医薬組成物は、例えばアンプル、バイアル、坐剤、予め充填されたシリンジ、糖衣錠、錠剤、又はカプセル剤の形態におけるような単位剤形とすることができる。

医薬として許容し得る賦形剤（複数可）は、製剤の所望の物理形態に従って選択することができ、かつ例えば、希釈剤（例えば増量剤又は充填剤のような固体希釈剤；溶媒及び共溶媒のような液体希釈剤）、崩壊剤、緩衝剤、滑沢剤、流動促進剤、放出制御剤（例えば、放出遅延化又は徐放化ポリマー若しくはワックス）、結合剤、造粒剤、顔料、可塑剤、酸化防止剤、防腐剤、香味剤、味マスキング剤、浸透圧調節剤、及びコーティング剤から選択することができる。

当業者は製剤中に使用するための成分の適当な量を選択するための、専門知識を有しているだろう。例えば、錠剤及びカプセル剤は典型的に（薬物投与量に応じて）0〜20％の崩壊剤、0〜5％の滑沢剤、0〜5％の流動促進剤及び/又は0〜99％（w/w）の増量剤又は充填剤を含む。また、錠剤及びカプセル剤は0〜10％（w/w）のポリマー結合剤、0〜5％（w/w）の酸化防止剤、0〜5％（w/w）の顔料を含むことができる。緩効性錠剤は、さらに（投与量に応じて）0〜99％（w/w）の放出制御性（例えば、徐放化）ポリマーを含むであろう。錠剤又はカプセル剤のフィルムコーティングは典型的に、0〜10％（w/w）のポリマー、0〜3％（w/w）の顔料、及び/又は0〜2％（w/w）の可塑剤を含む。

非経口製剤は典型的に、0〜20％（w/w）の緩衝液、0〜50％（w/w）の共溶媒、及び/又は0〜99％（w/w）の注入用水（WFI）（用量及び凍結乾燥されているかどうかに応じて）を含む。また、筋肉内デポーのための製剤は、0〜99％（w/w）の油を含むことができる。

経口投与のための医薬組成物は、活性成分と固体担体を組み合わせ、所望の場合得られる混合物を造粒し、かつ所望の場合又は必要な場合、適当な賦形剤を追加した後混合物を加工して、錠剤、糖衣錠核、又はカプセル剤にすることにより、得ることができる。また、医薬組成物は、活性成分を正確に調整された量だけ拡散し、又は放出させることを可能とするポリマー又はワックス状のマトリックス中に組み込むことも可能である。

また、本発明のポリペプチドは、固体分散物として製剤化することができる。固体分散物は、2以上の固体の均質な極微細の分散相である。固体分散物の1種である、固溶体（分子的分散系）は、医薬技術において使用されることが周知であり（Chiou及びRiegelmanの文献、J. Pharm. Sci., 60, 1281-1300 (1971)を参照されたい）、水溶性の乏しい薬物の溶解速度を増加させ、その生物学的利用能を増加させるのに有用である。

また、本発明は先に記載の固溶体を含む固体剤形を提供する。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、咀嚼錠、及び分散性錠剤又は発泡性錠剤がある。公知の賦形剤も、固溶体と混合して所望の剤形を提供することができる。例えば、カプセル剤は、(a) 崩壊剤及び滑沢剤、又は(b) 崩壊剤、滑沢剤、及び界面活性剤と混合した固溶体を含むことができる。さらに、カプセル剤は充填剤、例えばラクトース又は微結晶性セルロースを含むことができる。錠剤は少なくとも1つの崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、充填剤、及び流動促進剤と混合された固溶体を含むことができる。咀嚼錠は、充填剤、滑沢剤、及び所望の場合は追加の甘味料（例えば、人工甘味料）、及び適当な香料と混合された固溶体を含むことができる。また、固溶体は、糖ビーズ（「ノンパレイユ」）のような不活性担体の表面上に、薬物及び適当なポリマーの溶液を噴霧することにより形成することができる。これらのビーズは続いてカプセル中に充填され、又は錠剤へと圧縮することができる。

医薬製剤は単一の包装、通常はブリスター包装内に治療の全過程を含む、「患者パック（patient packs）」において患者に対し提供され得る。患者パックは、まとめて供給された医薬の患者の分の供給が薬剤師により分割される従来の処方薬と比較し、患者パック中に含まれる、通常患者への処方箋にはついていない添付文書を、患者がいつでも利用できる点において利点がある。添付文書が含まれていると、患者による医師の指示の遵守が向上することが示されている。

局所の使用及び鼻からの送達のための組成物には、軟膏、クリーム、噴霧剤、パッチ剤、ゲル、液滴、及び挿入物（例えば、眼内挿入物）がある。そのような組成物は、公知の方法によって製剤化することができる。

直腸又は膣内投与のための製剤の例には、例えば活性ポリペプチドを含む成形された成形可能な物質又はワックス状物質から形成され得る膣坐剤及び坐剤がある。また、活性ポリペプチドの溶液は直腸投与に使用できる。

吸入による投与のための組成物は、吸入粉末組成物又は液体若しくは粉末噴霧剤の形態をとることができ、粉末吸入装置又はエアロゾル投薬装置を用いる標準的な形態で投与することができる。そのような装置は周知である。吸入による投与について、粉末化製剤は、典型的に活性ポリペプチドとともにラクトースのような不活性固体粉末化希釈剤を含む。

本発明のポリペプチドは一般に単位剤形において提供するものとし、そのため典型的に所望のレベルの生物学的活性を提供するのに十分なポリペプチドを含むものとする。例えば、製剤は1ナノグラム〜2グラムの活性成分、例えば1ナノグラム〜2ミリグラムの活性成分を含むことができる。これらの範囲内で、ポリペプチドの特定の部分範囲は、0.1ミリグラム〜2グラムの活性成分（より一般には10ミリグラム〜1グラム、例えば50ミリグラム〜500ミリグラム)、又は1マイクログラム〜20ミリグラム（例えば1マイクログラム〜10ミリグラム、例えば0.1ミリグラム〜2ミリグラムの活性成分）である。

経口組成物について、単位剤形は、1ミリグラム〜2グラム、より典型的には10ミリグラム〜1グラム、例えば50ミリグラム〜1グラム、例えば100ミリグラム〜1グラムの活性ポリペプチドを含むことができる。

活性ポリペプチドは、所望の治療効果を達成するのに十分な量でそれを必要とする患者（例えば、ヒト又は動物患者）に投与するものとする。

本発明のさらなる態様によって、それを必要とする対象に、骨形成タンパク質10（BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択される治療有効量のポリペプチドを投与することを含む、血管疾患又は呼吸器疾患の治療方法が提供される。

以下の研究が本発明を説明する：
（略語）
ActR-IIA(B): アクチビン受容体-II型A(B);
ALK1、2、3、6: アクチビン受容体様キナーゼ1、2、3、6;
ALP: アルカリホスファターゼ;
BMP: 骨形成タンパク質;
BMPR-II: 骨形成タンパク質受容体II型;
ECD: 細胞外ドメイン;
FBS: ウシ胎仔血清;
HMEC-1: ヒト微小血管内皮細胞;
hPAEC: ヒト肺動脈内皮細胞;
MSC: 間葉性幹細胞;
PAH: 肺動脈性肺高血圧症;
プロBMP9: プロドメインと結合したBMP9;
プロBMP10: プロドメインと結合したBMP10; 及び
qPCR: 定量PCR。

（材料及び方法）
（組換えヒトプロBMP9及びプロBMP10の生成）
ヒトプレプロBMP9のオープンリーディングフレームを含む全長cDNAを、発現ベクターpCEP4のHindIII部位及びXhoI部位の間にクローニングした（図1を参照されたい）。同様に、ヒトプレプロBMP10の全長cDNAを、発現ベクターpCEP4のXhoI部位及びBamHI部位の間にクローニングした（図1を参照されたい）。インサートは、DNA配列決定法により確認した。プロBMP9のバリアントは、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社）を用いて生成し、全ての変異をDNA配列決定法により確認した。

プレプロBMP9（又はプレプロBMP10）を含むプラスミドを、5％ウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM培地中でポリエチレンイミンを用いてHEK-EBNA細胞に形質移入した。ヒトフューリンを発現するプラスミドを共形質移入して、プロBMP9及びプロBMP10のプロセシングを促進させた。細胞を翌日血清を含まないCDCHO培地中に交換し、調整培地を3〜4日後に採取した。調整培地中のプロBMP9及びプロBMP10の同一性を、それぞれ抗BMP9抗体（MAB3209, R&D Systems社）、抗BMP9プロドメイン抗体（AF3879, R&D Systems社）、又は抗BMP10抗体（MAB2926, R&D Systems社）を用いたウェスタンブロットにより確認した。

プロBMP10を精製するため、1〜5リットルの調整培地を、50 mM Tris.HCl、pH7.4、50 mM NaCl中で事前に平衡化させたQ-セファロースカラムに載せた。結合したタンパク質をNaCl勾配（50〜2000 mM）で溶出した。画分を非還元SDS-PAGEにより分析し、プロBMP10を含む画分をプールし、S200ゲルろ過カラムに載せる前に濃縮した。S200カラムからのプロBMP10は90％を上回る純度であり、BMP10プロドメイン及び成熟BMP10の同一性は、ゲル内消化及び質量分析同定によりさらに確認した。

（内皮細胞における定量PCR（qPCR）及びSmad1/5/8リン酸化によるシグナル伝達のアッセイ）
シグナル伝達のアッセイについて、プロBMP9の濃度をR＆D社BMP9を標準として用いるELISAにより決定した；プロBMP10の濃度をR＆D社BMP10を標準として用いるウェスタンブロット及びImageJにより定量化した。

血清飢餓の後、HMEC-1細胞を示された濃度のBMPリガンドで処理した。処理から8時間後、mRNAを抽出し、ID1、ID2、又はBMPR-IIの発現レベルを定量PCRにより測定した。β2ミクログロブリンを対照として使用し、未処理試料に対する倍数変化をプロットした。平均±SEMを示す。N＝2。Smad1/5/8リン酸化アッセイについて、血清飢餓状態にしたHMEC-1細胞を示された濃度のBMPリガンドで1時間処理し、シグナル伝達をドライアイス上にシャーレを置くことにより停止させた。溶解緩衝液（125 mM Tris.HCl、pH6.8、2％ SDS、及び10％グリセロール）を追加し、全細胞溶解物におけるタンパク質濃度をDC（商標）タンパク質アッセイ（Bio-Rad社）を用いて決定した。全細胞タンパク質の25〜35 μgをイムノブロットに使用し、Smad1/5/8のリン酸化を抗pSmad1/5/8抗体（Cell Signaling社, カタログ番号9516）によりモニタリングした。α-チューブリンをローディング対照として使用した。

（マウス筋芽細胞株C2C12におけるアルカリホスファターゼ（ALP）活性）
C2C12細胞を24ウェルプレートの10％FBSを含むDMEM中に、20,000細胞/ウェルで播種した。48時間後、細胞を0.25％ FBSを含むDMEMで16時間にわたって休止させ、示された濃度のBMPリガンドで64時間にわたり処理した。細胞を1％ Triton X-100/PBS中で溶解し、細胞溶解物中の全タンパク質濃度をDC（商標）タンパク質アッセイ（Bio-Rad社）を用いて決定した。細胞溶解物中のALP活性を、発色性ホスファターゼ基質4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（Sigma社, S0942）を用いて測定し、可溶性産物をプレートリーダー上405 nmで測定した。全てのアッセイにおいて、対照BMP9及びBMP10はR＆D Systems社から購入した。

（結果）
（BMP9シグナル伝達及びそのPAHにおける治療的可能性を支持するデータ）
BMP9及びBMP10はオーファン受容体ALK1のリガンドとして同定された（Davidらの文献、(2007) Blood 109(5):1953-1961）。内皮細胞において、BMP9及びBMP10はID1、ID2、及びBMPRIIを含む類似した一群の遺伝子を誘導する。BMP9は肝臓で合成され（Millerらの文献、(2000) J. Biol. Chem. 275(24):17937-17945; Bidartらの文献、(2012) Cell. Mol. Life Sci. 69(2):313-324）、2〜10 ng/mlで循環し、活性濃度で循環することが確認される唯一のBMPである（Herrera及びInmanの文献、(2009) BMC Cell Biol. 10:20; Davidらの文献、(2008) Circ. Res. 102(8):914-922）。BMP9は血管の休止要因であり、インビトロでの内皮細胞の遊走、増殖、及び血管新生を阻害し、従って血管の安定化を促す（Davidらの文献(2008)、前掲）。

（内皮保護特性を保持するが骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントの操作）
内皮の受容体を選択的に活性化することにより、心血管疾患を治療する可能性をもつにもかかわらず、BMP9は間葉性幹細胞（MSC）及びC2C12筋芽細胞におけるシグナルも伝達することができる。試験した14個のBMPのうち、BMP9は最も高いインビトロでの骨形成シグナル伝達及びインビボでの骨形成活性を有することが見出された（Kangらの文献、(2004) Gene Ther. 11(17):1312-1320; Lutherらの文献、(2011) Curr. Gene Ther. 11(3):229-240）。ALK1及びALK2の両方がBMP9の骨形成活性に要求される（Luoらの文献、(2010) J. Biol. Chem. 285(38):29588-29598）が、骨形成活性の状況におけるALK1及びALK2とBMP9との相互作用の性質は知られていない。また、ALK2も血管内皮細胞により発現される（Uptonらの文献、(2008) Mol. Pharmacol. 73(2):539-552）ものの、ALK1がこれらの細胞においてBMP9反応を仲介する主要なI型受容体である（Uptonらの文献、(2009) J. Biol. Chem. 284(23):15794-15804; Scharpfeneckerらの文献、(2007) J. Cell Sci. 120(Pt 6):964-972）。BMP9の骨形成活性に対するII型受容体の要求性は、MSCにおいて研究されている。3つのII型BMP受容体BMPR-II、ActR-IIA、及びActR-IIBの全てのドミナントネガティブ変異体の発現により、BMP9に誘導される骨形成活性を阻害することができ、ドミナントネガティブのActR-IIAが最も効力が高いことが示されている（Wuらの文献、(2010) Acta biochimica et biophysica Sinica 42(10):699-708）。

本発明者らは、BMP9上のI型及びII型受容体との結合部位を変異させることにより、ALK1との結合性を保持するが、ALK2との結合性を失ったBMP9のバリアントを生成することができるという仮説を立てた。そのようなBMP9のバリアントは内皮保護機能を保持するが、骨形成活性を欠いていることが見込まれる。本発明者らは、内皮細胞シグナル伝達活性を維持するが（ID1及びID2遺伝子の発現誘導により証拠づけた）、骨形成シグナル伝達活性を欠いている（C2C12細胞におけるアルカリホスファターゼアッセイにより評価した）ようなBMP9のバリアントを既に2つ同定している（図2）。これらのBMP9のバリアント（D366A及びD408A）は内皮細胞においては正常なシグナル伝達活性を有するが、骨形成シグナル伝達を開始することができず、従ってインビボでのBMP9の投与による骨形成の潜在的リスクが除かれるために、これらのバリアントはインビボでの有益な効果を維持することが見込まれる。

（BMP9のアラニンスキャニング突然変異誘発）
24個のBMP9アラニンバリアント（H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418A）を生成し、ID1遺伝子誘導についてはHMEC-1細胞、アルカリホスファターゼ活性についてはC2C12細胞の、両方の細胞で試験した。本研究の結果は図5に要約されており、この図から、13個のBMP9のバリアント（H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A）が、内皮特異的シグナル伝達の有益な効果を維持し、大きく低下した骨形成シグナル伝達を有する（野生型BMP9と比較した場合、少なくとも0.75倍のID1誘導及び0.5倍未満のALP活性により証拠づけられた）ものとして特定されたことを読み取ることができる。さらに、図5に示される結果は8個のBMP9のバリアント（F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A）が、内皮特異的シグナル伝達を維持するが、骨形成シグナル伝達を欠いている（野生型BMP9と比較した場合、少なくとも0.75倍のID1誘導及びごくわずかな（すなわち、0.1倍未満）ALP活性により証拠づけられた）ものとして特定されたことを示している。さらに、図5に示されている結果は2つのBMP9のバリアント（D366A又はD408A）が、内皮特異的シグナル伝達を増加させたが、骨形成シグナル伝達を欠いている（野生型BMP9と比較した場合、1倍より高いID1誘導及びごくわずかな（すなわち、0.1倍未満）ALP活性により証拠づけられた）ことを示している。

（初代内皮細胞におけるBMP9のバリアントの検証）
先に内皮特異的シグナル伝達を維持するが、骨形成シグナル伝達を欠いているものとして特定された8個のBMP9のバリアント（F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A）を、初代内皮細胞でさらに検証した。これらの変異体は全て、ヒト肺動脈内皮細胞（hPAEC）におけるBMPR2遺伝子の発現を誘導することが見出された（図6）。少なくとも1つのバリアント、D408Aは、PAECの腫瘍壊死因子α（TNFα）及びシクロヘキシミド（CHX）によって誘導される早期アポトーシスをレスキューすることができることが示された（図7）。

（内皮におけるBMP10のシグナル伝達）
BMP10は心臓の発達に不可欠である（Neuhausらの文献、(1999) Mech. Dev. 80(2):181-184）。BMP10を欠失したマウスは重度に損なわれた心臓の発達のために胚性致死となる（Chen Hらの文献、(2004) Development 131(9):2219-2231）。BMP10は転写調節因子Tbx20を通じて心臓の心室壁の発達を調節し（Zhangらの文献、(2011) J. Biol. Chem. 286(42):36820-36829）、心筋におけるBMP10の過剰発現は心臓の生後の肥大性成長を中断させる（Chenらの文献、(2006) J. Biol. Chem. 281(37):27481-27491）。成体では、BMP10は右心房のみに発現する（Chenらの文献、(2004)、前掲）。循環するBMP10はフロー依存的な動脈静止を仲介することが示されている（Lauxらの文献、(2013) Development 140(16):3403-3412）。

BMP10の循環レベルは議論の余地がある。BMP10タンパク質はプロテオミクスのアプローチを用いてヒト血清中に検出されており（Souzaらの文献、(2008) Mol. Endocrinol. 22(12):2689-2702）、ELISAにより測定可能である（Ricardらの文献、(2012) Blood 119(25):6162-6171）が、活性アッセイを用いた他の研究では循環するBMP10は検出できなかった（Bidartらの文献、(2012)並びにHerrera及びInmanの文献、(2009), 前掲）。しかしながら、最近の報告では、循環中のBMP10活性が示されている（Chenらの文献、(2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110(29):11887-11892）。そのような議論は循環するBMP10が活性/不活性状態にあること、不完全にプロセシングされること、血清因子により阻害されること、又は公開された報告で用いられた活性アッセイが異なることに起因する可能性がある。BMP10のプロドメインは、そこで役割を果たし得る。例えば、BMP10のプロドメインは、他のBMPとは異なり、C2C12細胞におけるBMP10に誘導される遺伝子発現を阻害することができることが報告されている（Sengleらの文献、(2011) J. Biol. Chem. 286(7):5087-5099）。さらに、Biacore測定により、BMP10がBMP9よりもALK1/BMPR-IIとの高い親和性を有し（Townsonらの文献、(2012) J. Biol. Chem. 287(33):27313-27325）、PAHの発症の間、BMPR-IIタンパク質の喪失により、BMP10シグナル伝達が明らかに影響を受けることが示されている。重要なことに、インビトロ及びインビボ研究では、BMP10は骨形成活性を欠いている。従って、天然のBMP10は天然のBMP9よりもPAHの治療により望ましいアゴニストを表す。

（BMP9及びBMP10の活性の比較）
ヒト微小血管内皮細胞（HMEC-1）における濃度-反応シグナル伝達アッセイより、BMP10がID1、ID2、及びBMPR-II遺伝子の発現誘導においてBMP9と同程度の効力をもつことが示された（図3A〜3C）。重要なことに、BMP10はTNFα-CHXにより誘導されるアポトーシスに対するhPAECの保護において、BMP9と同じ抗アポトーシス活性を示す（図3D）。BMP9は内皮細胞の増殖を抑制することにより、脈管構造の安定性を維持すると報告されている（Davidらの文献、(2008) 前掲）。BMP9及びBMP10は両方とも、hPAECにおいて³H-チミジンの取り込みとして測定されるDNA合成を同程度抑制する（図3E）。アルカリホスファターゼ（ALP）は骨形成経路の重要な酵素であり、BMP9により誘導されたALP活性は、C2C12細胞において5 ng/mlのBMP9で検出することができる。しかしながら、同一の条件下、BMP10は試験した最高濃度（20ng/ml）においても、ALP活性を一切誘導せず（図3F）、C2C12細胞においてアデノウイルスで発現させたBMPを用いた過去の研究（Kangらの文献、(2004)前掲）と矛盾しなかった。

（PAH及び他の心血管疾患の治療のためのBMP10及びプロドメインと結合したBMP10の投与の可能性）
BMPをプレプロタンパク質として合成すると、プロドメインは分泌の際に切断される（図4A）。過去の報告では、BMP10のプロドメインがBMP10の活性を阻害することができ、BMP10が不活性形態で循環すると見込まれることが示された。本発明者らは大量の、プロドメインと結合したBMP10（プロBMP10）を生成させた。過去の報告と対照的に、プロドメインはBMP10が哺乳動物細胞から生産される場合、依然としてBMP10と結合していること、プロBMP複合体が非常に安定であることが見出された（図4B及び4C）。このことは、プロBMP10が循環時の形態であると見込まれることを示唆している。さらに本発明者らは、HMEC-1細胞（図4D及び4E）及びhPAECにおいて、プロBMP10が商業的供給源（R&D Systems社）から購入したBMP9及びBMP10と同等の活性を有することを示した。プロドメインはBMP10の疎水性表面を保護し、従ってBMP10の循環時の形態を安定化する。そのため、プロBMP10はPAH及び他の心血管疾患を治療するためのインビボ投与に好ましい形態であることが見込まれる。

（BMP9及びBMP10は血液派生内皮細胞（BOEC）のコラーゲンゲル中での管形成を阻害する）
血液派生内皮細胞はほとんどの個体の末梢血液から単離することができ、ヒト内皮細胞を大いに代表する高度に増殖性の細胞種を表す。内皮細胞同様、BOECは3次元コラーゲン：フィブロネクチンマトリックス中で液胞化された毛管様構造を形成することが示されている。この分析の結果は図8に示されており、BMP9及びBMP10の血管形成に対抗する役割を示すだけでなく、BMP9並びに内皮細胞に対し抗増殖性であることが、内皮細胞をアポトーシスから保護し、増加した透過性から内皮細胞を保護することも示している。BMP9による阻害は低濃度でさえも明らかである。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10（BMP10）、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントから選択されるポリペプチド。
（構成２）
前記血管疾患が：肺高血圧症; 肺動脈性肺高血圧症; 遺伝性出血性毛細血管拡張症; アテローム性動脈硬化症; 及び肝肺症候群から選択される、構成1記載の使用のためのポリペプチド。
（構成３）
肺動脈性肺高血圧症から選択される血管疾患の治療を含む、構成1又は2記載の使用のためのポリペプチド。
（構成４）
前記呼吸器疾患が、閉塞性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（COPD）、慢性気管支炎及び肺気腫; 肺血管疾患、例えば肺水腫及び肺出血; 呼吸不全及び呼吸促迫症候群、例えば急性肺傷害及び急性呼吸促迫症候群; 並びに間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症から選択される、構成1記載の使用のためのポリペプチド。
（構成５）
BMP10である、構成1〜4のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
（構成６）
配列番号：2のアミノ酸配列を含むBMP10である、構成5記載の使用のためのポリペプチド。
（構成７）
配列番号：1のヌクレオチド配列によりコードされるBMP10である、構成5又は6記載の使用のためのポリペプチド。
（構成８）
プロドメインと結合した形態のBMP10（プロBMP10）である、構成5〜7のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
（構成９）
前記プロBMP10が、配列番号：2の残基317-424のアミノ酸配列を含む成熟BMP10配列と非共有結合的に結合した、配列番号：2の残基22-316のアミノ酸配列を含むプロペプチド配列を含む、構成8記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１０）
前記プロBMP10が、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP10配列を含む四量体を含む、構成9記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１１）
骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントである、構成1〜4のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１２）
プロドメインと結合した形態のBMP9（プロBMP9）のバリアントである、構成11記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１３）
前記プロBMP9のバリアントが、配列番号：4の残基320-429のアミノ酸配列を有する成熟BMP9配列と非共有結合的に結合した、配列番号：4の残基23-319のアミノ酸配列を有するプロペプチド配列のバリアントを含む、構成12記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１４）
前記プロBMP9のバリアントが、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP9配列を含む四量体を含む、構成13記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１５）
前記骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントが、配列番号：4のアミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入変異体を含む、構成11〜14のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１６）
前記骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントが、配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体を含む、構成15記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１７）
前記配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体が、以下の置換：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418A、例えばH326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A、特にF362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A、とりわけD366A、及びD408Aの1以上、例えば1つを含む、構成16記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１８）
前記配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体が：D366A又はD408A、例えばD408Aから選択される、構成17記載の使用のためのポリペプチド。
（構成１９）
前記配列番号：4のアミノ酸配列の置換変異体が、配列番号：5のアミノ酸配列を含むD366A BMP9のバリアント、又は配列番号：6のアミノ酸配列を含むD408A BMP9のバリアントから選択される、構成16〜18のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
（構成２０）
血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又は骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントを含む医薬組成物。
（構成２１）
配列番号：5のアミノ酸配列を含む、BMP9のバリアント。
（構成２２）
配列番号：6のアミノ酸配列を含む、BMP9のバリアント。
（構成２３）
構成21又は22記載のBMP9のバリアントを含む、医薬組成物。
（構成２４）
血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又はBMP9のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
（構成２５）
配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、構成24記載の使用のためのベクター。
（構成２６）
ウイルスベクター、例えば：レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペス、ワクシニア、及びアデノ随伴ウイルス、特にアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスのベクターである、構成24又は25記載の使用のためのベクター。

Claims

内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドであって、該BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列の相違が、F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A 及びY418Aからなる群から選ばれた置換からなるものである、前記ポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、F362Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、D366Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、I375Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、L379Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、S402Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、D408Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、Y416Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
前記BMP9のバリアントのアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との相違が、Y418Aの置換からなる、請求項１記載のポリペプチド。
内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドを含み、該ポリペプチドが請求項１〜９のいずれか一項に記載されたものである、医薬組成物。
血管疾患又は呼吸器疾患の治療のための、請求項１０記載の医薬組成物。
前記血管疾患が：肺高血圧症; 肺動脈性肺高血圧症; 遺伝性出血性毛細血管拡張症; アテローム性動脈硬化症; 及び肝肺症候群から選択される、請求項１１記載の医薬組成物。
前記血管疾患が肺動脈性肺高血圧症である、請求項１１又は１２記載の医薬組成物。
前記呼吸器疾患が、閉塞性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（COPD）、慢性気管支炎及び肺気腫; 肺血管疾患、例えば肺水腫及び肺出血; 呼吸不全及び呼吸促迫症候群、例えば急性肺傷害及び急性呼吸促迫症候群; 並びに間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症から選択される、請求項１１記載の医薬組成物。
血管疾患又は呼吸器疾患の治療のための医薬の製造における、内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが請求項１〜９のいずれか一項に記載されたものである、前記使用。
内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、該ポリペプチドが請求項１〜９のいずれか一項に記載されたものである、前記ベクター。
前記ベクターが、ウイルスベクター、例えば：レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペス、ワクシニア、及びアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスベクターである、請求項１６記載のベクター。
内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む、医薬組成物であって、該ベクターが請求項１６又は１７に記載されたものである、前記医薬組成物。
血管疾患又は呼吸器疾患の治療のための医薬の製造における、内皮細胞シグナル伝達活性を有し、かつ骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9（BMP9）のバリアントであるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターの使用であって、該ベクターが請求項１６又は１７に記載されたものである、前記使用。