CN106661094A - 骨形态发生蛋白的治疗用途 - Google Patents

骨形态发生蛋白的治疗用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106661094A
CN106661094A CN201580036984.1A CN201580036984A CN106661094A CN 106661094 A CN106661094 A CN 106661094A CN 201580036984 A CN201580036984 A CN 201580036984A CN 106661094 A CN106661094 A CN 106661094A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bmp9
polypeptide
bmp10
seq
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580036984.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106661094B (zh
Inventor
尼古拉斯·W·莫雷尔
伟·李
保罗·D·厄普顿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cambridge Enterprise Ltd
Original Assignee
Cambridge Enterprise Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51453948&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN106661094(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cambridge Enterprise Ltd filed Critical Cambridge Enterprise Ltd
Publication of CN106661094A publication Critical patent/CN106661094A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106661094B publication Critical patent/CN106661094B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体的多肽，用于血管疾病或呼吸道疾病的治疗。本发明还涉及新的BMP9变体和包含所述多肽的药物组合物。

Description

骨形态发生蛋白的治疗用途
技术领域
本发明涉及选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体的多肽，用于治疗血管疾病或呼吸道疾病。本发明还涉及新的BMP9变体和包含所述多肽的药物组合物。
背景技术
血管疾病是大中型肌性动脉的病理状态，并且由内皮细胞功能障碍引发。由于诸如病原体、氧化的LDL颗粒和其他炎症刺激因子，内皮细胞变得活化。这导致内皮细胞特性的改变：内皮细胞开始分泌细胞因子和趋化因子，并在其表面上表达粘附分子。这又导致白血细胞(单核细胞和淋巴细胞)的募集，白血细胞可以渗透血管壁。用由内皮细胞产生的细胞因子以及募集的白血细胞刺激平滑肌细胞层导致平滑肌细胞增殖并向血管腔迁移。该过程导致血管壁增厚，形成由增殖的平滑肌细胞、巨噬细胞和各种类型淋巴细胞组成的斑块。该斑块引起血流阻塞，导致到达靶器官的氧和营养物的量的减少。在最后阶段，所述斑块也可破裂，导致凝块形成，并因此导致中风。
呼吸道疾病是包括影响在高等生物体中使得能够进行气体交换的器官和组织的病理状况的医学术语，并且包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔、以及呼吸神经和肌肉的状况。呼吸道疾病的范围从轻度和自限性(如普通感冒)到危及生命的实体(如细菌性肺炎、肺栓塞和肺癌)。
肺动脉高压(PAH)是一种罕见的血管疾病，目前还无药可医。遗传性和特发性肺动脉高压(PAH)的特征在于前毛细血管肺动脉的狭窄和闭塞，继发于平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增殖和凋亡抵抗(Morrell等人，(2009)J Am Coll Cardiol 54，S20-31)。所导致的肺血管阻力的增加导致肺动脉压力的严重升高，导致右心室肥大以及最终由右心力衰竭引起的死亡(Gaine和Rubin(1998)Lancet 352,719-725)。
在2000年，在编码骨形态发生蛋白II型受体(BMPR-II)的基因中对杂合种系突变的鉴定(Lane等人，Nat Genet 26，81-84(2000)；Deng等(2000)Am J Hum Genet 67，737-744)为可遗传PAH的病理生物学提供了重要的见解。随后的研究还在15-40％的特发性PAH病例中鉴定了BMPR-II突变(Thomson等人(2000)J Med Genet 37，741-745)，以及BMPR-II的表达降低作为在人(Atkinson等人(2002)Circulation 105，1672-1678)和动物模型(Long等(人2009)Circulation 119，566-576)中非遗传性PAH的特征。
遗传证据也强烈影响内皮细胞作为PAH中的关键起始细胞类型。先前的研究已经显示，内皮中的BMPR-II的条件缺失足以在一定比例的小鼠中诱导PAH(Hong等人(2008)Circulation 118,722-730)，并且在啮齿动物模型中内皮BMPR-II信号传导的拯救能预防或逆转实验性肺高压(Reynolds等人(2012)Eur Respir J 39，329-343；Reynolds等人(2007)Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292，L1182-1192；Spiekerkoetter等(2013)J Clin Invest 123，3600-3613)。最近，已经显示用BMP9对内皮BMPR-II的选择性增强逆转了肺动脉高压(Long等人(2015)Nature Medicine 21，777-785)。此外，现已报导了在PAH患者中，I型受体ALK-1(Trembath等人(2001)N Engl J Med 345，325-334)和III型受体辅助蛋白，内皮糖蛋白(Harrison等人，2003)J Med Genet 40，865-871)，这两者几乎仅在内皮上表达。虽有这个证据，PAH的病理生物学中内皮功能障碍的确切性质和在这一过程中BMP信号的参与仍然是争论点。尽管已建立的PAH的特征在于作为阻塞性细胞损伤组分的肺内皮细胞的过度克隆增殖(Yeager等人(2001)Circ Res 88，E2-E11)，但是在人类(Teichert-Kuliszewska等(2006)Circ Res 98，209-217)和动物疾病模型(Wilson等人(1992)Crit Rev Toxicol 22，307-325；Taraseviciene-Stewart等(2001)Faseb J 15，427-438)两者中疾病病理学的启动与内皮细胞凋亡的矛盾性增加相关。另外的研究已经确定了在血管通透性恶化中的内皮BMPR-II损失和穿过血管壁的白细胞的转运改变中的作用(Burton等人(2011)Blood 117，333-341；Burton等(2011)Blood 118，4750-4758；Kim等人(2013)Arterioscler Thromb Vasc Biol 33，1350-1359)。
虽然使用肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的体外研究已经证明浓度增加的BMP配体可以克服与BMP信号传导通路中的突变相关的功能丧失(Yang等人(2008)Circ Res 102，1212-1221)，到目前为止，没有研究在体内治疗性地递送BMP配体，从而为PAH治疗的这种方法提供概念证明。由四种II型受体、五种I型受体和超过二十种BMP配体构成的BMP信号转导家族的复杂性(Miyazono等人(2005)Cytokine Growth Factor Rev 16，251-263)可以解释此类研究的缺乏。鉴定选择性靶向肺内皮的适当配体提出了重大挑战。最近，发现BMPR-II形成与ALK-1的信号复合物，并且特异性地响应于微小血管内皮细胞中的BMP9和10(David等人(2007)Blood 109，1953-1961)。
WO 2005/113590描述了BMP10拮抗剂用于治疗心脏病症的用途。WO 2013/152213描述了BMP9和/或BMP10多肽用于提高脊椎动物中的红细胞和/或血红蛋白水平的用途。WO2006/130022描述了BMPRII的激动剂或拮抗剂，其可用于调节雌性哺乳动物的卵泡生成和***率。WO 2010/114833描述了用于治疗心脏疾病的药物组合物，其包括骨形态发生蛋白。WO 94/26893描述了BMP-10蛋白、其制备方法及其在治疗骨和软骨缺损以及伤口愈合和相关组织修复中的用途。WO 95/24474和WO 96/39431描述了人BMP-10多肽和编码这样的多肽的DNA(RNA)，所述多肽被声称可用于诱导骨的重新形成。WO 93/00432和WO 95/33830描述了BMP-9蛋白，其制备方法及其在治疗骨和软骨缺损、伤口愈合和相关组织修复以及肝生长和功能中的用途。WO 2010/115874描述了通过给与爱佩琳(apelin)/APJ靶向药物来治疗肺动脉高压的方法。WO 2009/114180和WO 2014/160203描述了被声称在调节细胞生长、分化、增殖和凋亡中有用的BMP信号传导的小分子抑制剂，因此可用于治疗与BMP信号传导相关的疾病或病症，包括炎症、心血管疾病、血液疾病、癌症和骨病，以及用于调节细胞分化和/或增殖。小分子抑制剂也被声称在降低ApoB-100或LDL的循环水平中是有用的，以及在治疗或预防如下疾病中是有用的：获得性或先天性高胆固醇血症或高脂蛋白血症；与脂质吸收或代谢缺陷相关的疾病、病症或综合征；或由高脂血症引起的疾病、病症或综合征。
因此，需要为血管和呼吸道疾病，特别是肺动脉高压(PAH)提供有效的治疗。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体的多肽，用于血管疾病或呼吸道疾病的治疗。
根据本发明的又一方面，提供了治疗血管疾病或呼吸道疾病的方法，其包括将治疗有效量的选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体的多肽给药至需要其的受试者。
根据本发明的又一方面，提供了包含BMP10或缺乏成骨活性的BMP9变体的药物组合物，用于血管疾病或呼吸道疾病的治疗。
根据本发明的又一方面，提供了具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的BMP9变体。
根据本发明的另一方面，提供了具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的BMP9变体。
根据本发明的另一方面，提供了包含本文定义的BMP9变体的药物组合物。
附图说明
图1.pro.BMP9和pro.BMP10的表达载体和***。
图2.非成骨BMP9变体的产生。A.BMP9合成和翻译后加工的示意图。B-D.在诱导ID1和ID2表达(B和C)中，两种BMP9变体(D366A和D408A)具有与在内皮细胞中的野生型相当的信号传导活性，但在C2C12细胞中缺乏成骨信号传导活性(D)。
图3.比较BMP9和BMP10的内皮细胞信号传导活性和C2C12细胞成骨活性。A-C：BMP9和BMP10具有相似的信号传导活性HMEC-1。血清饥饿后，用指定浓度的BMP9或BMP10处理HMEC-1细胞。处理8小时后，提取mRNA，并通过定量PCR测量ID1、ID2或BMPR-II的表达水平。使用β2-微球蛋白作为对照，并绘制相对于未处理样品的倍数变化。示出了平均值±SEM，N＝2；D.与BMP9类似，BMP10还可以保护hPAEC抵抗TNFɑ-CHX诱导的细胞凋亡。方法如图3A所示，N＝1；E.BMP9和BMP10以类似的程度抑制内皮细胞增殖。用在EBM2/2％FBS中的BMP9或BMP10(均来自R&D Systems公司)处理HPAEC 24小时。将细胞与0.5μCi/孔3H-胸腺嘧啶孵育最后6小时。然后裂解细胞，并通过液体闪烁计数测量3H-胸腺嘧啶摄取。N＝1个实验，4个孔的平均值±SEM。F.与BMP9不同，BMP10没有作为C2C12细胞中ALP活性测量的可检测到的成骨活性。将C2C12细胞用指定浓度的BMP9或BMP10处理64小时。将细胞在1％Triton X-100/PBS中裂解，并使用显色磷酸酶底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(Sigma，S0942)测量细胞裂解物中的ALP活性，并在酶标仪(plate reader)中在405nm处测量可溶性产物。在所有测定中，BMP9和BMP10均购自R&D Systems公司。Pro.BMP9在内部生产，并且使用购自R&D***的BMP9作为标准通过ELISA来测定其浓度(成熟配体)。
图4.内部生成的pro.BMP10是具有完全活性的。A.BMP10合成和翻译后加工的示意图。B.表达BMP10的条件培养基，用抗BMP10抗体(R&D Systems公司)印迹。C.非还原SDS-PAGE显示来自S200凝胶过滤柱的pro.BMP10的纯化。前结构域和BMP10的一致性已经通过蛋白质印迹和质谱肽图谱验证。D和E.通过监测Smad1/5/8磷酸化和ID1/2/3基因表达，比较pro.BMP10与HMEC-1中的BMP9和BMP10(来自R&D Systems公司)的信号能力。方法如图3A至C所示。D中的BMP浓度为0.05、0.1、1、5ng/ml，并且处理时间为1小时。示出了平均值±SEM，N＝2。
图5.BMP9丙氨酸扫描突变形成的总结。产生24个BMP9变体，并在HMEC-1细胞中测试ID1基因诱导，以及在C2C12细胞中测试碱性磷酸酶活性。所有结果均相对于野生型(WT)BMP9标准化，示出了三个实验的平均值。“-”表示未处理的细胞。
图6.BMP变体可以诱导hPAEC中的BMPR2基因表达。
图7.BMP D408A变体可以挽救hPAEC中由TNFa/CHX诱导的早期凋亡。
图8.BMP9和BMP10抑制胶原:纤连蛋白基质中血液过度生长内皮细胞(BOEC)管形成。(A)用DAPI和FITC-ULEX染色的胶原凝胶中的BOEC管的代表性图像。当仅在培养基中时形成网络(2％BBM2＝含有2％FBS的EBM2)。添加递增浓度的BMP9抑制BOEC网络形成。(B)对3个独立实验确定的BOEC网络参数进行定量，证明BMP9以浓度依赖性方式抑制管的长度和数量、分支和环的形成。(C)BMP9和BMP10，两种配体都抑制BOEC管的形成。
具体实施方式
根据本发明的第一个方面，提供了选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体的多肽，用于血管疾病或呼吸道疾病的治疗。
本发明涉及骨形态发生蛋白的治疗用途，其保持内皮细胞信号传导活性(例如，其可通过诱导ID1、ID2和/或BMPR-II基因表达来证明)，但缺乏成骨活性(例如，其可以通过小鼠成肌细胞细胞系C2C12中的碱性磷酸酶(ALP)的活性测量)。例如，本文公开的BMP10和BMP9变体不仅维持内皮细胞信号传导活性，而且协同地缺乏成骨活性。因此，由于缺乏促进骨形成的能力，本文公开的天然BMP10和BMP9变体代表比天然BMP9更理想的激动剂，用于治疗血管疾病或呼吸道疾病，特别是PAH。
本文中提及的“BMP10”和“骨形态发生蛋白10”是指属于由BMP10基因(具有SEQIDNO：1所示的序列)编码的TGF-β超家族蛋白质的人多肽，并且其具有SEQ ID NO：2中所示的424个氨基酸的序列，其中氨基酸残基1至21包含信号肽，氨基酸残基22至316包含前肽，并且氨基酸残基317至424包含成熟BMP10。
本文中提及的“BMP9变体”和“骨形态发生蛋白9变体”是指属于由BMP9基因(具有SEQ ID NO：3所示的序列)编码的TGF-β超家族蛋白质的人多肽，并且其具有SEQ ID NO：4所示的429个氨基酸的序列的变体，其中氨基酸残基1至22包含信号肽，氨基酸残基23至319包含前肽，并且氨基酸残基320至429包含成熟BMP9。为了避免疑问，应该强调的是，这样的BMP9变体必须保持内皮细胞信号传导活性，但缺乏成骨活性。
提及的“变体”包括BMP9的天然、非突变或野生型序列的遗传变异。这种遗传变异的实例包括选自以下的突变：置换、缺失、***等。
本文所用的“缺乏成骨活性”或“缺成成骨活性”是指包含SEQ ID NO：4的序列的一个或多个突变的BMP9变体，其导致成骨活性的消除、最小化和/或抑制(例如，其可以通过小鼠成肌细胞细胞系C2C12中的碱性磷酸酶(ALP)活性测量)。有利的BMP9变体是保持内皮特异性信号传导的那些(即，通过在HMEC-1细胞中的ID1基因表达来测量，与野生型BMP9相比具有至少0.75倍ID1诱导的那些)，并且其具有较低的成骨活性值(即，通过小鼠成肌细胞细胞系C2C12中的ALP活性来测量，与野生型BMP9相比小于0.5倍)。
更期望的BMP9变体是保持内皮特异性信号传导的那些(即，通过在HMEC-1细胞中的ID1基因表达来测量，与野生型BMP9相比具有至少0.75倍ID1诱导的那些)，以及可忽略的成骨活性(即，通过小鼠成肌细胞细胞系C2C12中的ALP活性来测量，与野生型BMP9相比小于0.1倍)。
最理想的BMP9变体是具有增加的内皮特异性信号传导的那些(即，通过在HMEC-1细胞中的ID1基因表达来测量，与野生型BMP9相比具有更高的ID1诱导水平的那些)，以及可忽略的成骨活性(即，通过小鼠成肌细胞细胞系C2C12中的ALP活性来测量，与野生型BMP9相比小于0.1倍)。
在一个实施方案中，所述血管疾病选自：肺高压；肺动脉高压；遗传性毛细血管扩张症；动脉粥样硬化；和肝肺综合征。
在另一个实施方案中，所述血管疾病选自：肺高压；肺动脉高压；遗传性毛细血管扩张症；和肝肺综合征。
在另一个实施方案中，所述血管疾病选自肺动脉高压。
在一个实施方案中，所述呼吸道疾病选自：阻塞性肺病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎和肺气肿；肺血管疾病，如肺水肿和肺出血；呼吸衰竭和呼吸窘迫综合征，如急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征；和间质性肺病，如特发性肺纤维化。
在一个实施方案中，所述多肽是BMP10。因此，根据本发明的另一方面，提供了BMP10用于在血管疾病或呼吸道疾病的治疗中使用。本文提供了这样的数据，其示出了在诱导ID1、ID2和BMPR-II基因表达中BMP10与BMP9一样有效(参见图3A至3C)。此外，本文已示出在保护hPAEC抵抗TNFɑ-CHX诱导的细胞凋亡中BMP10表现出与BMP9相同的抗凋亡活性(参见图3D)。然而，至关重要的是，与BMP9不同，BMP10在测试的最高浓度下不诱导任何ALP活性(参见图3F)。
在另一个实施方案中，所述多肽为包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的BMP10。
在另一个实施方案中，所述多肽为由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的BMP10。
在另一个实施方案中，所述多肽是BMP10的前结构域结合形式(pro.BMP10)。本文提供了这样的数据，其证明pro.BMP10复合物是非常稳定的(参见图4B和4C)，并且可能是用于治疗血管和呼吸道疾病(例如PAH)的优选形式。
在另一个实施方案中，pro.BMP10包含前肽序列与非共价结合的成熟BMP10序列，所述前肽序列包含SEQ ID NO:2的残基22-316的氨基酸序列，所述成熟BMP10序列包含SEQID NO:2的残基317-424的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述pro.BMP10包括含有两个所述前肽序列和两个所述成熟BMP10序列的四聚体。
在一个实施方案中，所述多肽是缺乏成骨活性的BMP9变体。因此，根据本发明的另一方面，提供了缺乏成骨活性的BMP9变体，其用于血管疾病或呼吸道疾病的治疗。
在另一个实施方案中，所述多肽是BMP9的前结构域结合形式的变体(pro.BMP9)。
在另一个实施方案中，pro.BMP9的变体包括以下的变体：前肽序列与非共价结合的成熟BMP9序列，所述前肽序列包含SEQ ID NO:4的残基23-319的氨基酸序列，所述成熟BMP9序列包含SEQ ID NO:4的残基320-429的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述pro.BMP9包括含有两个所述前肽序列和两个所述成熟BMP9序列的四聚体。
在一个实施方案中，所述缺乏成骨活性的BMP9变体包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换、缺失或***突变体。
在另一个实施方案中，所述缺乏成骨活性的BMP9变体包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体包含以下一个或多个置换(例如一个、两个三个突变等)：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自以下具有SEQ ID NO:4的BMP9变体之一：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A。
在另一个实施方案中，所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体包含以下一个或多个置换(例如一个、两个三个突变等)：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自以下具有SEQ ID NO:4的BMP9变体之一：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。本文提供了这样的数据，其证明这些突变序列维持内皮特异性信号传导的有益效果并且大大降低了成骨信号传导(通过当与图5中的野生型BMP9相比时，至少0.75倍ID1诱导和小于0.5倍的ALP活性证明)。
在另一个实施方案中，所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体包含以下一个或多个置换(例如一个、两个三个突变等)：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自以下具有SEQ ID NO:4的BMP9变体之一：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。本文提供了这样的数据，其证明这些突变序列维持内皮特异性信号传导的有益效果，但是缺乏成骨信号传导(通过当与图5中的野生型BMP9相比时，至少0.75倍ID1诱导和可忽略的ALP活性(即小于0.1倍)证明)。
在另一个实施方案中，所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体包含以下一个或两个置换(即一个或两个突变)：D366A或D408A。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自以下具有SEQ ID NO:4的BMP9变体之一：D366A或D408A。本文提供了这样的数据，其证明这些突变序列维持BMP9的有益效果，但是不能启动成骨信号传导，并且因此通过在体内给予BMP9而去除骨形成的潜在风险(参见图2所示的结果)。本文还提供了这样的数据，其证明这些突变序列具有增加的内皮特异性信号传导，但缺乏成骨信号传导(通过当与图5中的野生型BMP9相比时，大于1倍的ID1诱导和可忽略的ALP活性(即小于0.1倍)证明)。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自SEQ ID NO：4的D408A BMP9变体。本文提供了这样的数据，其证明该突变序列已经示出能够拯救由肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)和环己酰亚胺(CHX)诱导的PAEC早期凋亡(见图7所示的结果)。
在另一个实施方案中，缺乏成骨活性的BMP9变体选自包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的D366A BMP9变体或包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的D408A BMP9变体。
应当理解，本文公开的BMP9变体构成之前未知的多肽，因此形成本发明的新方面。因此，根据本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的BMP9变体。根据本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的BMP9变体。
尽管可以单独给予活性多肽，但其优选作为药物组合物(例如制剂)存在。在一个实施方案中，这是无菌药物组合物。
本发明进一步提供如上定义的药物组合物，以及制备这样的药物组合物的方法，所述药物组合物包含(例如混合)本发明的至少一种多肽、和一种或多种药学上可接受的赋形剂、以及任选的其它治疗剂或预防剂。
因此，根据本发明的另一方面，提供了包含BMP10或缺乏成骨活性的BMP9变体的药物组合物，其用于治疗血管疾病或呼吸道疾病。
根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含本文定义的BMP9变体，如包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的D366A BMP9变体或包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的D408ABMP9变体。
药学上可接受的赋形剂可以选自例如载体(例如固体、液体或半固体载体)、助剂、稀释剂、填料或填充剂、成粒剂、包衣剂、控释剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂、调味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或药物组合物中常规使用的任何其它赋形剂。用于各种类型的药物组合物的赋形剂的实例将在下面更详细地阐述。
本文所用的术语“药学上可接受”涉及在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如人)的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，具有合理的利益/风险比。每种载体、赋形剂等在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
可以根据已知技术配制含有本发明多肽的药物组合物，参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA。
药物组合物可以是适合于口服、肠胃外、局部、鼻内、支气管内、舌下、眼部、耳部、直肠、***内或经皮给药的任何形式。当组合物用于肠胃外给药时，它们可以配制用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下给药，或通过注射、输注或其它递送方式直接递送到靶器官或组织中。递送可以通过弹丸注射、短期输注或长期输注，并且可以通过被动递送或通过利用合适的输注泵或注射器泵。
适于肠胃外给药的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精络合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳液制剂)、用于形成脂质体的脂质体组分、用于形成聚合凝胶的可凝胶化聚合物、冻干保护剂和尤其用于使活性成分以可溶形式稳定并使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂的组合。用于肠胃外给药的药物制剂还可以采取水性和非水性无菌混悬剂的形式，其可以包括悬浮剂和增稠剂(R.G.Strickly，Solubilizing Excipients in oral andinjectable formulations，Pharmaceutical Research，Vol 21(2)2004，p201-230)。
应当理解，包含本发明的BMP10或BMP9变体的基因治疗在本发明的范围内。例如，将编码BMP10或BMP9变体核苷酸序列的载体给药至宿主人类受试者，导致BMP10或BMP9变体多肽的内源性表达(例如在肝脏中的内源性表达)从而释放到循环中。因此，根据本发明的另一方面，提供了包含编码BMP10或BMP9变体的核苷酸序列的载体，其用于治疗血管疾病或呼吸道疾病。在另一个实施方案中，载体包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述载体是病毒载体。在另一个实施方案中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹、牛痘和腺相关病毒。在另一个实施方案中，所述载体是病毒载体，是腺相关病毒。
在一个替代性实施方案中，所述载体是非病毒载体。非病毒载体的使用具有优于使用病毒载体的许多优点，如容易大规模生产和在宿主中的低免疫原性。非病毒基因治疗方法的实例包括：裸DNA的注射、电穿孔、基因枪、声穿孔、磁性转染，以及寡核苷酸、脂质复合物、树状聚合物和无机纳米颗粒的使用。
所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿、小瓶和载药注射器，并且可以储存在仅需要加入无菌液体载体的冷冻干燥(冻干)条件下，所述无菌液体载体例如是注射用水，在临用前直接使用。
通过冻干本发明的多肽可以制备所述药物制剂。冻干是指冷冻干燥组合物的过程。因此，本文中冷冻干燥和冻干作为同义词使用。
即用注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
用于胃肠外注射的本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及在即将使用前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。
合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如葵花籽油、红花油、玉米油或橄榄油)、和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如通过使用增稠剂或包衣材料如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。
本发明的组合物还可以含有助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可能需要包括调节张力的试剂，如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶来实现。
在本发明的一个具体实施方案中，药物组合物是适于静脉内给药的形式，例如通过注射或输注。对于静脉内给药，所述溶液可以直接给药，或者可以在给药前注射到输液袋(含有药学上可接受的赋形剂，如0.9％盐水或5％葡萄糖)中。
在另一个具体的实施方案中，药物组合物是适于皮下(s.c.)给药的形式。
适合于口服给药的药物剂型包括片剂(包衣或未包衣的)、胶囊(硬或软壳)、囊片、丸剂、锭剂、糖浆剂、溶液剂、粉剂、颗粒剂、酏剂和混悬剂、舌下片剂、晶片(wafers)或贴片(如口腔贴片)。
因此，片剂组合物可含有单位剂量的活性多肽以及惰性稀释剂或载体，如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇；和/或非糖来源的稀释剂，如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙；或纤维素或其衍生物，如微晶纤维素(MCC)、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素；以及淀粉，如玉米淀粉。片剂还可以含有这样的标准成分，如粘结和成粒剂(如聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(例如可溶胀交联聚合物，如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸盐)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)以及泡腾剂(如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物)。这样的赋形剂是公知的，不需要在此详细讨论。
片剂可以设计成在与胃液接触时释放药物(立即释放片剂)、或在长期时间内或在胃肠道的特定区域以受控方式释放(控释片剂)。
胶囊制剂可以是硬明胶或软明胶品种，并且可以含有固体、半固体或液体形式的活性组分。明胶胶囊可以由动物明胶、或其合成或植物来源的等同物形成。
固体剂型(例如，片剂、胶囊等)可以是包衣的或未包衣的。包衣可以用作保护膜(例如聚合物、蜡或涂剂)，或用作控制药物释放的机制，或用于美学或识别目的。包衣(例如EudragitTM型聚合物)可被设计成在胃肠道内的期望位置释放活性成分。因此，可以选择包衣以便在胃肠道内的特定pH条件下降解，从而在胃中或在回肠、十二指肠、空肠(jejenum)或结肠中选择性释放多肽。
代替包衣或除包衣之外，所述药物可以存在于包含控释剂的固体基质中，例如释放延迟剂，其可以适于以受控的方式在胃肠道中释放多肽。或者，所述药物可以存在于聚合物包衣中，例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣，其可以适于在胃肠道中在不同酸度或碱度的条件下选择性释放多肽。或者，所述基质材料或缓释包衣可以是可溶蚀的聚合物(例如马来酸酐聚合物)的形式，当剂型通过胃肠道时，其基本上被连续地侵蚀。在另一个替代方案中，包衣可以设计成在肠道中在微生物作用下分解。作为另一种替代方案，活性多肽可以配制在提供多肽释放的渗透控制的递送***中。可以根据本领域技术人员熟知的方法制备渗透释放和其它延迟释放或持续释放制剂(例如基于离子交换树脂的制剂)。
本发明的多肽可以与载体一起配制并以纳米颗粒的形式给药，纳米颗粒的表面积增加有助于它们的吸收。此外，纳米颗粒提供直接渗透到细胞中的可能性。纳米颗粒药物递送***描述于2006年3月13日公开的Ram B Gupta和Uday B.Kompella编辑的“Nanoparticle Technology for Drug Delivery”，Informa Healthcare，ISBN9781574448573。药物递送的纳米颗粒也描述于J.Control.Release,2003,91(1-2),167-172，以及Sinha等，Mol.Cancer Ther.August 1,(2006)5,1909。
药物组合物通常包含约1％(w/w)至约95％(w/w)的活性成分和99％(w/w)至5％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。特别地，所述组合物包含约20％(w/w)至约90％(w/w)的活性成分和80％(w/w)至10％的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。药物组合物包含约1％至约95％，特别是约20％至约90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是例如单位剂量形式，如以安瓿、小瓶、栓剂、载药注射器、糖锭、片剂或胶囊的形式。
药学上可接受的赋形剂可以根据制剂的期望物理形式来选择，并且可以例如选自稀释剂(例如固体稀释剂，如填料或填充剂；以及液体稀释剂，如溶剂和助溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、流动助剂、释放控制剂(例如，释放延迟或延迟聚合物或蜡)、粘结剂、成粒剂、颜料、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、张力调节剂和包衣剂。
本领域技术人员将具有选择用于制剂中的适当量的成分的专门知识。例如，片剂和胶囊剂通常含有0-20％崩解剂、0-5％润滑剂、0-5％流动助剂和/或0-99％(w/w)填料/或填充剂(取决于药物剂量)。它们还可以含有0-10％(w/w)聚合物粘合剂、0-5％(w/w)抗氧化剂、0-5％(w/w)颜料。缓释片剂另外含有0-99％(w/w)释放控制(例如延迟)聚合物(取决于剂量)。片剂或胶囊剂的膜包衣通常含有0-10％(w/w)聚合物、0-3％(w/w)颜料和/或0-2％(w/w)增塑剂。
肠胃外制剂通常含有0-20％(w/w)缓冲液、0-50％(w/w)助溶剂和/或0-99％(w/w)注射用水(WFI)(取决于剂量和是否冷冻干燥)。用于肌内贮库的制剂还可以含有0-99％(w/w)的油。
用于口服给药的药物组合物可以通过将活性成分与固体载体混合，如果需要将所得混合物制粒，并且如果需要或必要，在加入适当的赋形剂后将混合物加工成片剂、糖衣丸芯或胶囊剂。它们也可以掺入聚合物或蜡质基质中，所述聚合物或蜡质基质允许活性成分以测得的量扩散或释放。
也可以将本发明的多肽配制成固体分散体。固体分散体是两种或更多种固体的均匀的极细分散相。一种固体分散体类型，固溶体(分子分散体系)在制药技术中是公知的(参见(Chiou和Riegelman，J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971))，并且在提高溶解速率和提高水难溶性药物的生物利用度中是有用的。
本发明还提供了包括上述固溶体的固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊剂、咀嚼片剂和可分散片剂或泡腾片剂。可以将已知的赋形剂与固溶体混合以提供所需的剂型。例如，胶囊剂可以含有与(a)崩解剂和润滑剂，或(b)崩解剂、润滑剂和表面活性剂混合的固溶体。此外，胶囊剂可以含有填充剂，例如乳糖或微晶纤维素。片剂可以包含与至少一种崩解剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂和助流剂混合的固溶体。咀嚼片剂可包含与填充剂、润滑剂，以及如果需要的话另外的甜味剂(例如人造甜味剂)以及合适的调味剂混合的固溶体。也可以通过将药物和合适的聚合物的溶液喷射到惰性载体，如糖珠(“non-pareils”)的表面上形成固溶体。这些珠随后可以填充到胶囊中或压成片。
药物制剂可以在单个包装(通常为泡罩包装)中以包含整个治疗过程的“患者包装(patient packs)”呈现给患者。患者包装具有优于传统处方的优点，其中药剂师从大宗供应中为患者分配药品，在于患者总是能够获取包含在患者包装中的通常在患者处方中缺失的药品说明书(package insert)。已经显示药品说明书的包含可以改善患者对医师指示的依从性。
用于局部使用和鼻递送的组合物包括软膏剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂、液滴剂和***物(例如眼内***物)。可以根据已知的方法配制这样的组合物。
用于直肠或***内施用的制剂的实例包括***栓剂和栓剂，其可以例如由含有活性多肽的成形的可模塑或蜡质材料形成。活性多肽的溶液也可用于直肠给药。
用于通过吸入给药的组合物可以采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以使用粉末吸入器装置或气溶胶分配装置以标准形式给药。这种装置是公知的。对于通过吸入给药，所述粉末制剂通常包含活性多肽以及惰性固体粉末稀释剂(如乳糖)。
本发明的多肽通常以单位剂型存在，因此通常含有足够的多肽以提供所需水平的生物学活性。例如，制剂可以含有1ng至2g的活性成分，例如，从1ng至2mg的活性成分。在这些范围内，多肽的具体子范围为0.1mg至2g活性成分(更通常为10mg至1g，例如50mg至500mg)，或1μg至20mg(例如1μg至10mg，例如0.1mg至2mg的活性成分)。
对于口服组合物，单位剂型可含有1mg至2g，更典型地为10mg至1g，例如50mg至1g，例如100mg至1g的活性多肽。
以足以实现所需治疗效果的量将活性多肽给药至需要其的患者(例如人或动物患者)。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗血管疾病或呼吸道疾病的方法，其包括将治疗有效量的选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体给药至需要其的受试者。
以下研究阐明本发明：
缩写
ActR-IIA(B)：激活素IIA型(B)受体；
ALK1,2,3,6：激活素受体样激酶1、2、3、6；
ALP：碱性磷酸酶；
BMP：骨形态发生蛋白；
BMPR-II：骨形态发生蛋白II型受体；
ECD：细胞外结构域；
FBS：胎牛血清；
HMEC-1：人类微血管内皮细胞；
hPAEC：人肺动脉内皮细胞；
MSC：间充质干细胞；
PAH：肺动脉高压；
pro.BMP9：前结构域结合的BMP9；
pro.BMP10：前结构域结合的BMP10；以及
qPCR：定量PCR。
材料和方法
产生重组人pro.BMP9和pro.BMP10
将包含人前原BMP9(pre-pro-BMP9)的开放阅读框的全长cDNA克隆到表达载体pCEP4的HindIII和XhoI位点之间(参见图1)。类似地，将人前原BMP10(pre-pro-BMP10)的全长cDNA克隆到表达载体pCEP4的XhoI和BamHI位点之间(参见图1)。通过DNA测序验证***物。使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene公司)产生Pro.BMP9变体，并通过DNA测序验证所有突变。
在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，使用聚乙烯亚胺将含有前原BMP9(或前原BMP10)的质粒转染到HEK-EBNA细胞中。共转染表达人弗林蛋白酶的质粒以促进pro-BMP9和pro-BMP10的加工。第二天为细胞更换为无血清的CDCHO培养基，3-4天后收获条件培养基(media)。通过蛋白质印迹法，分别使用抗BMP9(MAB3209，R&D Systems公司)、抗BMP9前结构域(AF3879，R&D Systems公司)或抗BMP10(MAB2926，R&DSystems公司)证实条件培养基中pro.BMP9和pro.BMP10的身份。
为了纯化pro.BMP10，将1-5升条件培养基上样到用50mM Tris.HCl，pH7.4、50mMNaCl预平衡的Q-Sepharose柱上。用NaCl梯度(50-2000mM)洗脱已结合的蛋白质。通过非还原SDS-PAGE分析级分，合并含有pro.BMP10的级分并浓缩，然后上样到S200凝胶过滤柱上。来自S200柱的Pro.BMP10纯度超过90％，并且通过凝胶内消化和质谱鉴定进一步证实了BMP10前结构域和成熟BMP10的身份。
通过定量PCR(qPCR)进行信号测定和在内皮细胞中的Smad1/5/8磷酸化
对于信号测定，通过ELISA使用R&D BMP9作为标准物测定pro.BMP9的浓度；并通过蛋白质印迹法和ImageJ，使用R&D BMP10作为标准物对pro.BMP10的浓度进行定量。
血清饥饿后，用指定浓度的BMP配体处理HMEC-1细胞。处理8小时后，提取mRNA，并通过定量PCR测量ID1、ID2或BMPR-II的表达水平。使用β2-微球蛋白作为对照并绘制相对于未处理样品的倍数变化。示出了平均值±SEM，N＝2。对于Smad1/5/8磷酸化测定，将经血清饥饿的HMEC-1细胞用指定浓度的BMP配体处理1小时，并通过将培养皿置于干冰上来停止信号传导。加入裂解缓冲液(125mM Tris·HCl，pH6.8、2％SDS和10％甘油)，并使用DCTM蛋白测定(Bio-Rad公司)测定总细胞裂解物中的蛋白质浓度。将25-35μg总细胞蛋白用于免疫印迹，并通过抗pSmad1/5/8抗体(Cell Signaling公司，产品号9516)监测Smad1/5/8的磷酸化。α-微管蛋白用作上样对照。
小鼠成肌细胞系C2C12中碱性磷酸酶(ALP)的活性
将C2C12细胞以20,000细胞/孔接种在含有10％FBS的DMEM中的24孔板中。48小时后，用含有0.25％FBS的DMEM使细胞静止16小时，并用指定浓度的BMP配体处理64小时。将细胞在1％Triton X-100/PBS中裂解，并使用DCTM蛋白测定(Bio-Rad公司)测定细胞裂解物中的总蛋白浓度。使用显色磷酸酶底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(Sigma公司，S0942)测量细胞裂解物中的ALP活性，并在酶标仪上在405nm下测量可溶性产物。在所有测定中，对照BMP9和BMP10购自R&D Systems公司。
结果
BMP9信号传导以及支持其在PAH中的治疗潜力的数据
BMP9和BMP10被鉴定为孤儿受体(orphan receptor)ALK1的配体(David等人(2007)Blood 109(5):1953-1961)。在内皮细胞中，它们诱导相似的一组基因，包括ID1、ID2和BMPRII。BMP9在肝脏中合成(Miller等人(2000)J.Biol.Chem.275(24):17937-17945；Bidart等人(2012)Cell.Mol.Life Sci.69(2):313-324)，以2-10ng/ml循环并且唯一确认的在活性浓度下BMP循环(Herrera和Inman(2009)BMC Cell Biol.10：20；David等(2008)Circ.Res.102(8)：914-922)。BMP9是血管静止因子，在体外抑制EC迁移、增殖和血管生成，从而促进血管稳定性(David等人(2008)，同上)。
BMP9变体的基因工程保留内皮保护特性，但没有骨形成活性
尽管通过选择性激活内皮受体治疗心血管疾病的潜能，BMP9也可以在间充质干细胞(MSC)和C2C12成肌细胞中发出信号。在测试的14种BMP中，发现BMP9在体外具有最高的成骨信号传导和体内骨形成活性(Kang等人Gene Ther.11(17):1312-1320；Luther等(2011)Curr.Gene Ther.11(3):229-240)。对于BMP9的成骨活性，需要ALK1和ALK2两者(Luo等人(2010)J.Biol.Chem.285(38):29588-29598)，但是在成骨活性的背景中BMP9与ALK1和ALK2的相互作用的性质的是未知的。虽然ALK2也由血管内皮细胞表达(Upton等人(2008)Mol.Pharmacol.73(2):539-552)，但ALK1是在这些细胞中介导BMP9应答的主要I型受体(Upton等人(2009)J.Biol.Chem.284(23):15794-15804；Scharpfenecker等(2007)J.CellSci.120(Pt 6):964-972)。已经在MSC中研究了BMP9-成骨活性所需的II型受体。已经显示所有三种II型BMP受体，BMPR-II、ActR-IIA和ActR-IIB的显性负性突变体的表达可以抑制BMP9诱导的成骨活性，其中显性负性ActR-IIB是最有效的(Wu等人(2010)Acta biochimicaet biophysica Sinica 42(10):699-708)。
发明人假设通过突变BMP9上的I型和II型受体结合位点，可以产生保留ALK1结合但丧失ALK2结合的BMP9变体。这样的BMP9变体可能保留内皮保护功能，但缺乏成骨活性。本发明人已经鉴定了两种这样的保持内皮细胞信号传导活性的BMP9变体，如通过诱导ID1和ID2基因表达但缺乏成骨信号传导活性来证实，这是在C2C12细胞中通过碱性磷酸酶测定评价得到的(图2)。由于这些BMP9变体(D366A和D408A)在内皮细胞中具有正常的信号传导活性，它们可能在体内维持有益的效果，但是它们不能启动成骨信号传导并因此通过在体内给药BMP9消除骨形成的潜在风险。
BMP9丙氨酸扫描诱变
产生24个BMP9丙氨酸变体(H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A)，并在HMEC-1细胞中测试ID1基因诱导和在C2C12细胞中测试碱性磷酸酶活性。该研究的结果总结在图5中，其中可以看出，证实13个BMP9变体(H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)能维持内皮特异性信号传导的有益效果，并且能大大降低成骨细胞信号传导(通过当与野生型BMP9相比时，至少0.75倍ID1诱导和小于0.5倍ALP活性证实)。此外，图5所示的结果证明，鉴定了8种BMP9变体(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)能维持内皮特异性信号传导但缺乏成骨信号传导(通过当与野生型BMP9相比时，至少0.75倍ID1诱导和可忽略的(小于0.1倍)ALP活性证实)。此外，图5中显示的结果证明两种BMP9变体(D366A或D408A)增加内皮特异性信号传导但缺乏成骨信号传导(通过当与野生型BMP9相比时，大于1倍的ID1诱导和可忽略的(小于0.1倍)ALP活性证实)。
原代内皮细胞中BMP9变体的验证
在原代内皮细胞中进一步验证了上文鉴定为维持内皮特异性信号传导但缺乏成骨信号传导的8种BMP9变体(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)。这些突变体都被发现在人肺动脉内皮细胞中诱导BMPR2基因表达(hPAEC，图6)。至少一种变体D408A已显示能够挽救由肿瘤坏死因子ɑ(TNFɑ)和放线菌酮(CHX)诱导的PAEC早期凋亡(图7)。
在内皮中BMP10信号转导
BMP10对于心脏发育是不可缺少的(Neuhaus等人(1999)Mech.Dev.80(2):181-184)。由于严重受损的心脏发育，BMP10缺失的小鼠是胚胎致死的(Chen H等人(2004)Development 131(9):2219-2231)。BMP10通过转录因子Tbx20调节心室壁发育(Zhang等人(2011)J.Biol.Chem.286(42):36820-36829)并且BMP10在心肌中的过表达干扰了出生后心脏肥大生长(Chen等人(2004)Development 131(9):2219-2231)。在成人中，BMP10仅在右心房中表达(Chen等人(2004)，同上)。已经显示循环的BMP10介导流动依赖性动脉静止(Laux等人(2013)Development 140(16):3403-3412)。
BMP10的循环水平是有争议的。虽然已经使用蛋白质组学方法在人血清中检测到BMP10蛋白(Souza等人(2008)Mol.Endocrinol.22(12):2689-2702)，并且可以通过ELISA测量(Ricard等人(2012)Blood 119(25):6162-6171)，使用活性测定的其它研究不能检测循环的BMP10(Bidart等人(2012)，以及Herrera和Inman(2009)，同上)。然而，最近的报告已经证明了BMP10在循环中的活性(Chen等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(29):11887-11892)。这种争议可能是由于循环BMP10处于活性/无活性状态、不完全加工、血清因子抑制或在公开的报道中所用的不同活性测定。BMP10的前结构域可以在其中起作用。例如，与其它BMP不同，已经报导了BMP10的前结构域可以在C2C12细胞中抑制BMP10诱导的基因表达(Sengle等人(2011)J.Biol.Chem.286(7):5087-5099)。此外，Biacore测量显示BMP10对ALK1/BMPR-II比BMP9具有更高的亲和力(Townson等人(2012)J.Biol.Chem.287(33):27313-27325)，以及在PAH的发生时，BMPR-II蛋白的丧失将明显地对BMP10信号传导有影响。重要的是，在体外和体内研究中，BMP10缺乏成骨活性。因此，在治疗PAH中，天然BMP10代表比天然BMP9更理想的激动剂。
BMP9和BMP10活性的比较
人类微血管内皮细胞(HMEC-1)中的浓度-应答信号测定显示BMP10在诱导ID1、ID2和BMPR-II基因表达方面与BMP9一样有效(图3A至3C)。重要的是，BMP10在保护hPAEC免受TNFα-CHX诱导的细胞凋亡方面表现出与BMP9相同的抗凋亡活性(图3D)。据报导，BMP9通过抑制内皮细胞增殖来维持血管***的稳定性(David等人(2008)，同上)。BMP9和BMP10都在hPAEC中将DNA合成抑制至类似的程度(作为3H-胸腺嘧啶摄取测量)(图3E)。碱性磷酸酶(ALP)是成骨通路中的关键酶，并且可以在C2C12细胞中以5ng/ml BMP9检测BMP9诱导的ALP活性。然而，在相同条件下，BMP10在测试的最高浓度(20ng/ml，图3F)下不诱导任何ALP活性，这与先前使用C2C12细胞中的腺病毒表达的BMP的研究一致(Kang等人(2004)，同上)。
给药BMP10和前结构域结合的BMP10在治疗PAH和其它心血管疾病中的潜能
BMP作为前原蛋白合成，并且在分泌后裂解前结构域(图4A)。以前的报告显示BMP10的前结构域可以抑制BMP10活性，并且BMP10可能以无活性形式循环。本发明人已产生大量的前结构域结合的BMP10(pro.BMP10)。与以前的报告相反，当从哺乳动物细胞产生BMP10时，发现前结构域保持与BMP10结合，并且pro.BMP10复合物是非常稳定的(图4B和4C)。这表明pro.BMP10可能是循环形式。此外，发明人已经在HMEC-1细胞(图4D和4E)和hPAEC中证明pro.BMP10具有与从商业来源(R&D Systems公司)购买的BMP9和BMP10相当的活性。由于前结构域保护BMP10的疏水表面并因此稳定BMP10的循环形式，pro.BMP10可能是用于治疗PAH和其它心血管疾病的体内给药的优选形式。
BMP9和BMP10抑制胶原凝胶中的血液过度生长内皮细胞(BOEC)管形成
血液过度生长内皮细胞可以从大多数个体的外周血中分离，并且代表高度增殖的细胞类型，其是人内皮细胞的高度代表。已经表明，像内皮细胞一样，BOEC在3维胶原:纤连蛋白基质中形成空泡化的毛细管样结构。该分析的结果示于图8中，其不仅证明了BMP9和BMP10的抗血管生成作用，而且还显示BMP9以及对于内皮细胞是抗增殖的，保护内皮细胞免于凋亡，并保护内皮细胞对抗增加的渗透性。即使在低浓度下，BMP9的抑制也是明显的。

Claims (26)

1.一种多肽，其选自骨形态发生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形态发生蛋白9(BMP9)变体，用于在血管疾病或呼吸道疾病的治疗中使用。
2.根据权利要求1使用的所述多肽，其中所述血管疾病选自：肺高压；肺动脉高压；遗传性毛细血管扩张症；动脉粥样硬化；和肝肺综合征。
3.如权利要求1或权利要求2使用的所述多肽，其包括对选自肺动脉高压的血管疾病的治疗。
4.如权利要求1使用的所述多肽，其中所述呼吸道疾病选自：阻塞性肺病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎和肺气肿；肺血管疾病，如肺水肿和肺出血；呼吸衰竭和呼吸窘迫综合征，如急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征；和间质性肺病，如特发性肺纤维化。
5.如权利要求1至4中任一项使用的所述多肽，其中所述多肽是BMP10。
6.如权利要求5使用的所述多肽，其中所述多肽为包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的BMP10。
7.如权利要求5或权利要求6使用的所述多肽，其中所述多肽是由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的BMP10。
8.如权利要求5至7中任一项使用的所述多肽，其中所述多肽是BMP10的前结构域结合形式(pro.BMP10)。
9.如权利要求8使用的所述多肽，其中所述pro.BMP10包含前肽序列与非共价结合的成熟BMP10序列，所述前肽序列包含SEQ ID NO:2的残基22-316的氨基酸序列，所述成熟BMP10序列包含SEQ ID NO:2的残基317-424的氨基酸序列。
10.如权利要求9使用的所述多肽，其中所述pro.BMP10包括含有两个所述前肽序列和两个所述成熟BMP10序列的四聚体。
11.如权利要求1至4中任一项使用的所述多肽，其中所述多肽是缺乏成骨活性的BMP9变体。
12.如权利要求11使用的所述多肽，其中所述多肽是BMP9的前结构域结合形式的变体(pro.BMP9)。
13.如权利要求12使用的所述多肽，其中pro.BMP9的变体包括以下的变体：前肽序列与非共价结合的成熟BMP9序列，所述前肽序列包含SEQ ID NO:4的残基23-319的氨基酸序列，所述成熟BMP9序列包含SEQ ID NO:4的残基320-429的氨基酸序列。
14.如权利要求13使用的所述多肽，其中所述pro.BMP9的变体包括含有两个所述前肽序列和两个所述成熟BMP9序列的四聚体。
15.如权利要求11至14中任一项使用的所述多肽，其中所述缺乏成骨活性的BMP9变体包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换、缺失或***突变体。
16.如权利要求15使用的所述多肽，其中所述缺乏成骨活性的BMP9变体包括SEQ IDNO：4的氨基酸序列的置换突变体。
17.如权利要求16使用的所述多肽，其中所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体包含以下一个或多个置换，例如一个置换：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A，例如H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A，特别是F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A，更特别地是D366A和D408A。
18.如权利要求17使用的所述多肽，其中所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体选自：D366A或D408A，例如D408A。
19.如权利要求16至18中任一项使用的所述多肽，其中所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列的置换突变体选自包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的D366A BMP9变体或包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的D408A BMP9变体。
20.一种药物组合物，包含BMP10或缺乏成骨活性的BMP9变体，用于在治疗血管疾病或呼吸道疾病中使用。
21.一种BMP9变体，包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
22.一种BMP9变体，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
23.一种药物组合物，其包含权利要求21或权利要求22所述的BMP9变体。
24.一种载体，其包含编码BMP10或BMP9变体的核苷酸序列，用于在治疗血管疾病或呼吸道疾病中使用。
25.如权利要求24使用的所述载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
26.根据权利要求24或权利要求25使用的所述载体，其中所述载体是病毒载体，例如选自以下的病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹、牛痘和腺病毒相关病毒，特别是腺病毒相关病毒。
CN201580036984.1A 2014-07-10 2015-07-09 骨形态发生蛋白的治疗用途 Active CN106661094B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1412290.7 2014-07-10
GBGB1412290.7A GB201412290D0 (en) 2014-07-10 2014-07-10 Novel use
PCT/GB2015/051989 WO2016005756A1 (en) 2014-07-10 2015-07-09 Therapeutic use of bone morphogenetic proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106661094A true CN106661094A (zh) 2017-05-10
CN106661094B CN106661094B (zh) 2020-09-08

Family

ID=51453948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580036984.1A Active CN106661094B (zh) 2014-07-10 2015-07-09 骨形态发生蛋白的治疗用途

Country Status (21)

Country Link
US (4) US10336800B2 (zh)
EP (3) EP3166628B2 (zh)
JP (1) JP6737770B2 (zh)
KR (2) KR102519869B1 (zh)
CN (1) CN106661094B (zh)
AU (1) AU2015287397B2 (zh)
CA (1) CA2954221C (zh)
CY (2) CY1123011T1 (zh)
DK (2) DK3669886T3 (zh)
ES (2) ES2770073T5 (zh)
GB (1) GB201412290D0 (zh)
HR (2) HRP20200418T1 (zh)
HU (2) HUE054512T2 (zh)
LT (2) LT3669886T (zh)
MX (2) MX2017000448A (zh)
PL (2) PL3669886T3 (zh)
PT (2) PT3166628T (zh)
RS (2) RS60181B1 (zh)
RU (1) RU2733318C2 (zh)
SI (2) SI3166628T1 (zh)
WO (1) WO2016005756A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107760779A (zh) * 2017-11-03 2018-03-06 中国医学科学院阜外医院 肺动脉高压相关的突变型bmp9基因及其应用
CN111344306A (zh) * 2017-11-02 2020-06-26 拜耳股份公司 结合alk-1和bmpr-2的双特异性抗体
CN111939245A (zh) * 2019-05-16 2020-11-17 龚笑海 一种心脏治疗和保护的药物组合物

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201412290D0 (en) 2014-07-10 2014-08-27 Cambridge Entpr Ltd Novel use
GB201603653D0 (en) * 2016-03-02 2016-04-13 Cambridge Entpr Ltd Combination Therapy
JP7144428B2 (ja) * 2017-02-06 2022-09-29 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド 心不全を処置するための組成物および方法
US20230285506A1 (en) * 2019-12-03 2023-09-14 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
KR20220021207A (ko) * 2020-08-13 2022-02-22 주식회사 나이벡 이소골 형성 부작용 경감으로 치료효과가 증진된 골형성 단백질-9, 10의 변이체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2023012318A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Actelion Pharmaceuticals Ltd Bmp9 variant polypeptides and uses thereof
CN114317604B (zh) * 2022-03-04 2022-06-17 中国医学科学院阜外医院 一种自发性肺动脉高压模型及构建方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000432A1 (en) * 1991-06-25 1993-01-07 Genetics Institute, Inc. Bmp-9 compositions
US20060024783A1 (en) * 2004-05-12 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. BMP10 propeptides and related methods
WO2008151078A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
CN101652387A (zh) * 2006-11-02 2010-02-17 阿塞勒隆制药公司 Alk1受体和配体拮抗剂及其用途

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US171355A (en) * 1875-12-21 Improvement in driers
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
JPH09501305A (ja) 1993-05-12 1997-02-10 ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｂｍｐ−１０組成物
WO1995024474A1 (en) 1994-03-10 1995-09-14 Human Genome Sciences, Inc. Bone morphogenic protein-10
WO1996039431A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Bone morphogenic protein-10
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
EP1571159A1 (en) † 2004-03-04 2005-09-07 Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg Mutein of a bone morphogenetic protein and use thereof
WO2006130022A1 (en) 2005-05-30 2006-12-07 Agresearch Limited Modulation of ovulation by agonists and antagonists of bmprii
WO2008014054A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Centocor, Inc. Bmp-7 variant compositions, methods and uses
JP5638961B2 (ja) 2008-03-13 2014-12-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Ｂｍｐシグナル伝達経路のインヒビター
US8999928B2 (en) 2009-04-01 2015-04-07 Indiana University Research And Technology Corporation Methods for treating diseases using a bone morphogenetic protein
WO2010115874A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment and the diagnosis ofpulmonary arterial hypertension
CA2826142A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
EP2699590B8 (en) 2011-04-20 2019-04-17 Acceleron Pharma Inc. Endoglin polypeptides and uses thereof
US9809636B2 (en) * 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
EP2970311A4 (en) 2013-03-14 2016-11-23 Brigham & Womens Hospital BMP INHIBITORS AND METHODS OF USE
GB201412290D0 (en) * 2014-07-10 2014-08-27 Cambridge Entpr Ltd Novel use
ES2875905T3 (es) * 2016-07-15 2021-11-11 Acceleron Pharma Inc Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar
CN107760779B (zh) 2017-11-03 2020-10-16 中国医学科学院阜外医院 肺动脉高压相关的突变型bmp9基因及其应用
KR20220021207A (ko) 2020-08-13 2022-02-22 주식회사 나이벡 이소골 형성 부작용 경감으로 치료효과가 증진된 골형성 단백질-9, 10의 변이체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000432A1 (en) * 1991-06-25 1993-01-07 Genetics Institute, Inc. Bmp-9 compositions
US20060024783A1 (en) * 2004-05-12 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. BMP10 propeptides and related methods
CN101652387A (zh) * 2006-11-02 2010-02-17 阿塞勒隆制药公司 Alk1受体和配体拮抗剂及其用途
WO2008151078A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAURENT DAVID等: "Bone morphogenetic protein-9 is a circulating vascular quiescence factor", 《CIRCULATION RESEARCH》 *
NICOLAS RICARD等: "BMP9 and BMP10 are critical for postnatal retinal vascular remodeling", 《BLOOD》 *
PARDEEP MAHLAWAT等: "Structure of the Alk1 extracellular domain and characterization", 《BIOCHEMISTRY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111344306A (zh) * 2017-11-02 2020-06-26 拜耳股份公司 结合alk-1和bmpr-2的双特异性抗体
CN107760779A (zh) * 2017-11-03 2018-03-06 中国医学科学院阜外医院 肺动脉高压相关的突变型bmp9基因及其应用
CN111939245A (zh) * 2019-05-16 2020-11-17 龚笑海 一种心脏治疗和保护的药物组合物
WO2020228705A1 (zh) * 2019-05-16 2020-11-19 龚笑海 一种心脏治疗和保护的药物组合物
CN111939245B (zh) * 2019-05-16 2024-03-01 龚笑海 一种心脏治疗和保护的药物组合物

Also Published As

Publication number Publication date
HUE048924T2 (hu) 2020-09-28
EP3166628B2 (en) 2023-07-26
LT3669886T (lt) 2021-06-10
EP3669886A1 (en) 2020-06-24
US20240043485A1 (en) 2024-02-08
DK3166628T3 (da) 2020-03-09
AU2015287397B2 (en) 2020-08-20
US20170209540A1 (en) 2017-07-27
DK3669886T3 (da) 2021-05-25
SI3669886T1 (sl) 2021-08-31
ES2876124T3 (es) 2021-11-11
SI3166628T1 (sl) 2020-07-31
LT3166628T (lt) 2020-04-10
ES2770073T5 (es) 2024-03-04
RU2733318C2 (ru) 2020-10-01
RU2017102381A3 (zh) 2019-02-28
RS61961B1 (sr) 2021-07-30
US11572396B2 (en) 2023-02-07
CA2954221C (en) 2023-02-14
HRP20200418T1 (hr) 2020-06-26
PT3166628T (pt) 2020-04-06
MX2020011333A (es) 2020-11-24
WO2016005756A1 (en) 2016-01-14
EP3906936A1 (en) 2021-11-10
CY1124143T1 (el) 2022-05-27
EP3669886B1 (en) 2021-02-24
KR20170029576A (ko) 2017-03-15
US10336800B2 (en) 2019-07-02
JP2017521074A (ja) 2017-08-03
CY1123011T1 (el) 2021-10-29
MX2017000448A (es) 2017-08-16
HRP20210734T1 (hr) 2021-06-11
PL3669886T3 (pl) 2021-09-13
PL3166628T3 (pl) 2020-06-15
JP6737770B2 (ja) 2020-08-12
RS60181B1 (sr) 2020-06-30
PT3669886T (pt) 2021-05-25
AU2015287397A1 (en) 2017-02-16
CA2954221A1 (en) 2016-01-14
EP3166628A1 (en) 2017-05-17
ES2770073T3 (es) 2020-06-30
HUE054512T2 (hu) 2021-09-28
GB201412290D0 (en) 2014-08-27
CN106661094B (zh) 2020-09-08
EP3166628B1 (en) 2020-01-01
PL3166628T5 (pl) 2023-11-27
US20190359668A1 (en) 2019-11-28
RU2017102381A (ru) 2018-08-10
KR102519869B1 (ko) 2023-04-07
KR20230049757A (ko) 2023-04-13
BR112017000113A2 (pt) 2018-01-02
US20170121383A1 (en) 2017-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106661094A (zh) 骨形态发生蛋白的治疗用途
Rufaihah et al. Dual delivery of VEGF and ANG-1 in ischemic hearts using an injectable hydrogel
Chu et al. Reversal of bleomycin-induced rat pulmonary fibrosis by a xenograft of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly
US20210322545A1 (en) Smc combination therapy for the treatment of cancer
US11104955B2 (en) MAP2K1 (MEK1) as a therapeutic target for arteriovenous malformations and associated disorders
US20060003932A1 (en) Method for promoting neovascularization
Wang et al. Nerve growth factor-induced Akt/mTOR activation protects the ischemic heart via restoring autophagic flux and attenuating ubiquitinated protein accumulation
Yi et al. Sequentially targeting cancer‐associated fibroblast and mitochondria alleviates tumor hypoxia and inhibits cancer metastasis by preventing “soil” formation and “seed” dissemination
JP6389172B2 (ja) 体外式膜型人工肺におけるアンチトロンビンの使用
Zhang et al. Airway epithelial cell-specific delivery of lipid nanoparticles loading siRNA for asthma treatment
Zhang et al. In Situ STING‐Activating Nanovaccination with TIGIT Blockade for Enhanced Immunotherapy of Anti‐PD‐1‐Resistant Tumors
CN108350458A (zh) 用豹蛙酶和/或两栖酶治疗病毒性结膜炎
Kawai et al. Prevention of skeletal muscle atrophy in vitro using anti-ubiquitination oligopeptide carried by atelocollagen
CN108472265A (zh) 中枢神经肿瘤的治疗
JP2017109987A (ja) ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージによって媒介される疾患の治療方法
NL2030945B1 (en) Polyomaviral gene delivery vector particle comprising a nucleic acid sequence encoding a phosphatase activity-possessing polypeptide
US11986501B2 (en) Treatment methods and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Nicholas W.Morrel

Inventor after: Wei*li

Inventor after: Paul D.Upton

Inventor before: Nicholas W.Morrel

Inventor before: Wei*li

Inventor before: Paul D.Upton

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant