JP6474058B2 - エンドセリン−1産生抑制剤 - Google Patents
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また、エンドセリン−1は、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞(ケラチノサイトとも言う)でエンドセリン−1が産生され(非特許文献1参照)、産生されたエンドセリン−1は、表皮メラニン細胞(メラノサイトとも言う)を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン−1の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる
またエンドセリンは、血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつであり、高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患に有効である。
肝細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor、HGF)は、毛母細胞を賦活化するとともに、メラノサイトの増殖を促進させて、メラニン生成を増加させる作用があるということが知られている。
さらには高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患にも有効な製剤を得ることにある。
ここで利用する真珠及び真珠層について説明する。
まず、真珠とは,生きた真珠貝の中で球状または半球状(多少の変形を含む)に形成される代謝生産物であって,かつ,この外見しうる部分の主たる構成物質が,真珠貝の真珠層と等質であるものをいう。
真珠貝は貝殻に真珠層を有する貝類をいうが、二枚貝綱、腹足綱、頭足綱などのうち特定の古い系統の貝類を指し、例示すれば、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイ、ベニコチョウガイ、マベガイ等のアコヤガイ属の二枚貝類の他に、イガイ、ムラサキイガイ、ヤコウガイ、イケチョウガイ、カワシンジュガイ、カサガイ等が挙げられる。
このうち、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイが養殖も実施されており原料の確保の点から好ましい。
真珠層を有する貝殻を利用する場合は貝殻に付着した、触手動物、軟体動物、節足動物、環形動物、脊索動物、海藻類等々多種多様の生物や海泥等の無機物を、水、ブラシ、ヘラ等で取り除く。(勿論貝肉等もなるべく取り除いておく)
また、貝殻の内、殻皮層、稜柱層は場合によっては、ブラシ、ヘラ、グラインダーを用いて取り除く。また、特開昭62−120319号公報、特開2003−250489号公報、特開2011−72207号公報等にも種々の方法が記載されているので任意の方法を選択すればよい。
以上、真珠或いは真珠層を有する貝殻の一方又は両方より、炭酸カルシウム等を除くために脱灰する。これをスムーズに行うために破砕・粉砕工程を必要に応じて加える。
破砕・粉砕は、金槌、棒等で破砕してもよいし、ジャイレトリクラッシャー 、コーンクラッシャー、シングルロールクラッシャー、ダブルロールクラッシャー 、インパクトクラッシャー、ボールミル、ハンマーミル、ロッドミル等のクラッシャーや粉砕機を用いて破砕・粉砕を行ってもよい。
また、反応時間は粉砕の程度、反応温度等によって変化するが、10時間〜10日間程度が好ましい。
加える塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解する程度でよいが、後工程の蛋白の加水分解工程で酸を用いる場合は加水分解時の酸濃度が変化するので、塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解するに必要な量より若干多めにし、充分に脱灰しておく。
これを遠心分離、濾過等で不溶物を集める。用途によっては後述する脱塩工程を実施する場合、脱塩の方法によってはこの工程で充分に塩を取り除く必要があるので、不溶物に水を加えて、撹拌後、遠心分離、濾過等で不溶物を集める工程を複数回繰り返すとよい。
酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、亜硫酸、シュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸、乳酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が例示されるが、このうちの1種又は2種以上を用いて、さらには蛋白分解酵素と組み合わせて蛋白を加水分解する。この中でもよく用いられるのは、塩酸、硫酸が挙げられる。
加水分解の条件は、酸、アルカリ、酵素の種類によって選択されるが、塩酸や硫酸を用いる場合は、1〜10モル、室温〜120℃、1時間〜10日間程度がよく、加圧も加えてもよい。
加水分解後、酸やアルカリを用いた場合は中和、酵素を用いた場合は加熱等の失活操作を必要に応じて行う。さらに用途によっては、完全に或いは一部脱塩する。
その後、必要に応じて脱色工程や乾燥工程を加え、真珠及び/又は真珠層由来蛋白加水分解物を得る。
また、特開昭62−223104号公報、特開平02−076597号公報、特開平05−043444号公報の方法も参考になる。
色素類;黄色4号、青色1号、黄色202号等の厚生省令に定められたタール色素別表I及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類;ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE等。
その他;殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約1〜5mm程度に粉砕したアコヤガイ貝殻50kgに水450kgを加えて撹拌しつつ、塩酸100kgを徐々に加えた。さらに水100kgを加え3日間撹拌した。塩酸10kgを徐々に加えた。さらに水200kgを加え2日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム3kgを徐々に加えた。
pH7になるように25%水酸化ナトリウムで調整した後水200kg加えた。これをシャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、0.1モル塩酸20kgを加えて24日間ゆっくり撹拌した。これに水1000kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、これに水1000kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
この沈殿200gに10倍希釈した硫酸を3kg加え、110℃のオイルバスで24時間加水分解した。
放冷後、水酸化バリウムを徐々に加えながらpH3.0に調整した後、遠心分離(6000rpm、15分間)し、上澄みにアンバーライトIRA910をpH7.0になるまで徐々に加えた。これを濾過して濾液に活性炭を10g加え30分間撹拌した。
これを濾過し、凍結乾燥した。
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約1〜5mm程度に粉砕した黒蝶貝殻5kgに水45kgを加えて撹拌しつつ、塩酸10kgを徐々に加えた。さらに水10kgを加え3日間撹拌した。塩酸1kgを徐々に加えた。さらに水200kgを加え2日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム300gを徐々に加えた。
10%硫酸500gを加え、110℃のオイルバスで24時間加水分解した。
放冷後、水酸化ナトリウムを徐々に加えながらpH7.0に調整した後、遠心分離(6000rpm、15分間)し、上澄みを得た。これに2倍量のエタノールを加え、ゆっくり撹拌した後、4℃で1週間静置した。
これを濾過し、凍結乾燥した。
市販品の加水分解コンキオリン液をエバポレートしたのち、凍結乾燥したものを用いた。(同品は加水分解コンキオリン、エタノール、水で構成されており、アコヤガイを由来とする)
試験方法は、製造例1の0.5%を表皮ケラチノサイトに作用して48時間後に上記(RealTimePCR)と同様にしてコントロールと共にRNAを抽出し、各3μgのRNAからQuick Amp Labeling Kit, two−color(Agilent Technologies)を用いてCy3,Cy5標識プローブを作成した。Quiagen RNeasy mini kit(Quiagen)を用いて標識プローブを精製後、Gene Expression Hybridization kit(Agilent Technologies)を用いてWhole Human Genomeスライド(4×44K, Agilent Technologies)上で60℃、17時間ハイブリダイズした。洗浄後、Agilent DNA microarray scanner(Agilent Technologies)を用いてスキャンし、Feature Extraction softwareを使ってデータ処理を行った。
2継代目のヒト***由来表皮細胞(クラボウ)を50−70%コンフルエントとなるようHuMedia−KG2培地(フェノールレッド不含)で培養後、前日にカルシウム濃度を1.8mMに変更したHuMedia−KG2培地に、製造例を添加し、37℃、5%CO2インキュベータ中で2日間培養した。
細胞からの Total RNAの抽出は、トリプシン/EDTAで剥離後、SV Total RNA Isolation System(プロメガ社)を用い、プロメガ社の添付マニュアル(日本語プロトコールNoTM048J2001年6月作成)に従い調製した。RNA濃度は、NanoDrop1000(Thermo SCIENTIFIC)を用い算出した。
2.5μgのTotal RNAを使い、MMLV Reverse Transcriptase RNaseH−(東洋紡社)を用い、東洋紡社推奨プロトコール(TOYOBO BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE 2008/2009のページ1−42)に従いRT反応を行なった。
リアルタイムPCRはAppliedBiosystems 7500 リアルタイムPCR Systemを用い、以下のように実施した。SYBR Green法を用い(THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix,東洋紡社)、7500 リアルタイムPCR Systemの操作マニュアル(AppliedBiosystems)を用いて、Comparative CT(△△CT)法(n=3)により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてGAPDHを使用した。
エンドセリン−1:フォワードプライマーがTCCTCTGCTGGTTCCTGACT(配列番号1)の塩基配列と、リバースプライマーがCAGAAACTCCACCCCTGTGT(配列番号2)の塩基配列とのセット
SCF:フォワードプライマーがCTCCAGTAAGTGGCCTTTGC(配列番号3)の塩基配列と、リバースプライマーがTATCTGAGGGCCTGAACACC(配列番号4)の塩基配列とのセット
bFGF:フォワードプライマーがGGTGAAACCCCGTCTCTACA(配列番号5)の塩基配列と、リバースプライマーがCTCTGTTGCCTAGGCTGGAC(配列番号6)の塩基配列とのセット
GAPDH:フォワードプライマーがGAGTCAACGGATTTGGTCGT(配列番号7)の塩基配列と、リバースプライマーがTTGATTTTGGAGGGATCTCG(配列番号8)の塩基配列とのセット
結果を見ると、製造例1は、コントロールを1としてSCFは約0.4、エンドセリン−1は約0.7、bFGFは約0.6となり、製造例1はこれらの遺伝子の働きを抑制することがわかった。
製造例2の結果を図2に示すが、これもコントロールを1としてSCFは約0.65、エンドセリン−1は約0.55となった。
製造例3の結果を図3に示すが、コントロールを1としてSCFは約0.35、エンドセリン−1は約0.25となった。
さらに、定量的なmRNA遺伝子発現試験で、エンドセリン−1、SCF、bFGFの各遺伝子の発現を確認したところいずれも抑制することを確認した。
また、クロチョウガイ由来の製造例2や市販の加水分解コンキオリン液(アコヤガイ由来)でもエンドセリン−1、SCFの遺伝子発現を抑制することを確認した。
Claims (3)
- 真珠及び/又は真珠層に由来する蛋白加水分解物を有効成分とするエンドセリン−1産生抑制剤。(但し、美白用途は除く)
- アコヤガイ属の二枚貝を由来とする真珠及び/又は真珠層に由来する蛋白加水分解物を有効成分とする請求項1に記載のエンドセリン−1産生抑制剤。(但し、美白用途は除く)
- アコヤガイを由来とする真珠及び/又は真珠層に由来する蛋白加水分解物を有効成分とする請求項1に記載のエンドセリン−1産生抑制剤。(但し、美白用途は除く)
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