JP6267103B2 - エンドセリン−１阻害剤及び美白用皮膚外用剤 - Google Patents

Description

本発明は、エンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤に関する。

メラニンは、紫外線から生体を保護する役目があり、紫外線を浴びると皮膚内に生成される。しかしながら、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミやソバカスの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。

これまでの美白剤の開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきた。しかし、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。

エンドセリン−１は、２１残基のアミノ酸からなる血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドで、エンドセリン−１は標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン−１の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの原因となる。

また、エンドセリン−１は、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイトとも言う）でエンドセリン−１が産生され（非特許文献１参照）、産生されたエンドセリン−１は、表皮メラニン細胞（メラノサイトとも言う）を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン−１の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる
またエンドセリンは、血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつであり、高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患に有効である。

このようにエンドセリン−１の過剰産生は、色素細胞の過剰増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。したがって、これらの発現を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。

ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ［１９９５， ３７１（２）：１８８−１９０］

本発明の目的はエンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤を得ることにある。
さらには高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患にも有効な製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンの混合物が本発明の課題を解決する手段として有効なことがわかった。
さらには以下の割合がエンドセリン−１の産生を阻害する効果が高いこともわかった。
ピロリドンカルボン酸またはその塩を２０〜５０重量部、Ｌ−アルギニンを１０〜２０重量部、Ｌ−アスパラギン酸を５〜１５重量部、グリシンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−アラニンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−セリンを１．０〜３．０重量部、Ｌ−バリンを１．０〜２．０重量部、Ｌ−プロリンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−スレオニンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−イソロイシンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−ヒスチジンを０．１〜０．５重量部、Ｌ−フェニルアラニンを０．１〜０．５重量。
さらに乳酸ナトリウムを配合することによって有効であることもわかった。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
上記のアミノ酸の混合物を皮膚外用剤に０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜５０重量％配合する。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
実施例
ピロリドンカルボン酸ナトリウム ３７．５重量部
ピロリドンカルボン酸 １０．９重量部
Ｌ−アルギニン ２０．０重量部
Ｌ−アスパラギン酸 １３．０重量部
グリシン ３．２重量部
Ｌ−アラニン ３．０重量部
Ｌ−セリン ２．０重量部
Ｌ−バリン １．６重量部
Ｌ−プロリン １．０重量部
Ｌ−スレオニン １．０重量部
Ｌ−イソロイシン １．０重量部
Ｌ−ヒスチジン ０．４重量部
Ｌ−フェニルアラニン ０．４重量部
乳酸ナトリウム ３０．０重量部
精製水 １２５．０重量部
以上の原料を充分に撹拌して得られる水溶液。

確認試験 ｍＲＮＡ遺伝子発現試験
２継代目のヒト***由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。

＜使用プライマー＞
エンドセリン−１：フォワードプライマーがＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット

実施例を１．０％作用させて実験した結果を図１に示す。
結果を見ると、実施例は１．０％で作用させた場合、エンドセリン−１の遺伝子発現量を約６０％抑制することがわかった。

また実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、エンドセリン−１の産生を抑制し、美白に有効なことがわかった。

実施例の終濃度１．０％での確認試験の結果で、エンドセリン−１の遺伝子発現量変化を示す図である。 縦軸は実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。

Claims (3)

1. ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、及びＬ−フェニルアラニンを有効成分とするエンドセリン−１阻害剤。
2. ピロリドンカルボン酸またはその塩を２０〜５０重量部、Ｌ−アルギニンを１０〜２０重量部、Ｌ−アスパラギン酸を５〜１５重量部、グリシンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−アラニンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−セリンを１．０〜３．０重量部、Ｌ−バリンを１．０〜２．０重量部、Ｌ−プロリンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−スレオニンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−イソロイシンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−ヒスチジンを０．１〜０．５重量部、Ｌ−フェニルアラニンを０．１〜０．５重量部配合した請求項１のエンドセリン−１阻害剤。
   
3. さらに乳酸ナトリウムを配合した請求項１乃至請求項２のエンドセリン−１阻害剤。