JP6441587B2 - 3d高解像度局在顕微鏡法のための方法 - Google Patents
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Description
図1は、試料2を、蛍光放射線を放出するように励起して撮像する顕微鏡1を概略的に示している。顕微鏡1は、PALM法を実施するために形成されている。試料2は、対物レンズ3によって広範囲に、(図1には特に示されていない)検出器上に撮像される。試料2内の蛍光放射線の励起および活性化のうちの少なくとも一方は、励起装置5から到来する活性化放射線および励起放射線のうちの少なくとも一方がその中に延びる、光シート4を用いて行われる。以下の説明では、上述の本明細書の導入部分において、蛍光を発しない長寿命の状態と蛍光を発する短寿命の状態とを有する分子の例で説明したように、これに限定するわけではないが例示的に、活性化および励起が同じ波長の放射線を用いて行われることを前提とする。そのため、以下で部分的に励起放射線のみについて述べている場合にも、それによって切替放射線をも指していることがある。
この状態は、光シート4が図3に示されたように焦点面7に対して非対称に照射される場合に変化する。ここでは、光シート4は焦点面7の上方に位置している。光シートがその中心面に関して対称であるということは例示に過ぎず、必須ではない。重要なことは、焦点面7に関して非対称であるということである。この焦点面7に対する光シート4の非対称性によって、PSFもまた非対称になるが、これが図3の下部の非対称な輪郭13によって示されている。PSFはその輪郭13においても、その強度分布においても、焦点面7に対して変位している。
図4は、図3の上部あるいは下部に似た断面図、すなわちx/z平面における断面を概略的に示している。ここでは、光シート4の強度推移が記載されている。光シート4が、焦点面7に対して非対称に位置する強度分布17を有していることが分かる。強度分布17はそれ自体においては対称であるものの、強度分布17の最大値18は焦点面7の外部に位置している。それにより、図3の下部に図示された非対称なPSFがもたらされる。このような非対称なPSFは、強度分布17自体が非対称である一実施形態においても得ることができる。
図6は、図1の顕微鏡あるいは図3/4の照射状況および検出状況の発展形態を示しており、図6では符号4.1を付された非対称な第1の光シートに加えて、図6の実施形態では例示的に焦点面7に対して配置された第2の光シート4.2が照射される。このように照射される試料2は、検出装置6において、チューブ・レンズ4を介して、焦点面7と共役な面16に配置された検出器15上に撮像される。
2つの側面、すなわち第1の側面の光シートおよび第2の側面の光シートの照射の場合に、ミラー配置を変化させることによって、光シートの軸方向のずれを容易に調節することができる。
Claims (8)
- 3D高解像度局在顕微鏡法のための方法であって、
− 励起工程において、試料(2)を励起放射線(4)で照射することによって、該試料(2)内に蛍光マーカを励起して発光させ、
− 撮像工程において、該試料(2)を、撮像光学系(3、14)を用いて、撮像方向(9)に沿って単一画像内に撮像し、該単一画像が発光する蛍光マーカ(11)の像を含んでおり、該撮像光学系(3)が焦点面(7)と光学的分解能とを有しており、
− 該励起工程および該撮像工程を複数回繰り返し、それにより複数の単一画像を生成し、該励起工程を、該発光する蛍光マーカ(11)の少なくとも一部について、該発光する蛍光マーカの像が該単一画像のそれぞれにおいて隔離されるように行い、
− 生成された複数の該単一画像において、該発光する蛍光マーカ(11)の隔離された像から、それぞれ対応する蛍光マーカの、該光学的分解能を超える精度を有する位置情報を確定し、
− このように確定した該位置情報から、高解像度の全体画像を生成する方法において、
− 該励起放射線を該試料(2)内に、第1の光シート(4、4.1)として照射し、該第1の光シートが、撮像方向(9)に沿って、該焦点面に対して非対称な強度分布(17、17.1)を有しており、
− 該単一画像において、該発光する蛍光マーカ(11)の隔離された該像を、その輪郭(13)に関して分析し、該輪郭(13)から、対応する該蛍光マーカ(11)の該焦点面(7)からの距離に関する情報を導出することを特徴とする方法。 - 前記撮像工程において、前記試料(2)を、前記焦点面(7)と共役な平面(16)上に位置する検出器(15)上に撮像することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記強度分布(17、17.1)が、前記焦点面の外部に位置する最大値(18、18.1)を有していることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の光シート(4.1)と接している第2の光シート(4.2)を照射することを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の光シート(4.2)が、前記焦点面(7)に関して、前記第1の光シート(4.1)に対して対称に位置しており、前記撮像工程において、前記試料(2)を、一方が前記焦点面(7)と共役な平面(16.1)の前方に位置しており、他方が前記焦点面(7)と共役な平面(16.2)の後方に位置している、2つの検出器(15.1、15.2)上に撮像することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 2枚の光シート(4.1、4.2)が、その波長スペクトルについて互いに異なっていることを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。
- 第2の光シート(4.2)の強度分布(17.2)が前記焦点面(7)に対して対称である、前記第2の光シート(4.2)を照射することを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの第2の光シート(4.2)を照射し、
前記第1および第2の光シート(4.1、4.2)が、前記撮像方向において、前記焦点面(7)と一致しない平面に対してずらされていることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
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