JP6796917B2 - 粒子撮像装置および粒子撮像方法 - Google Patents

Description

本発明は、粒子撮像装置および粒子撮像方法に関する。

非特許文献１には、励起用対物レンズから出射されたライトシートをフローセル中の試料に対して試料の流れ方向に傾いた方向から照射し、試料から生じた蛍光を試料の流れ方向に垂直な方向に配置された検出用対物レンズによりカメラに導く装置が記載されている。

"High resolution light-sheet based high-throughput imaging cytometry system enables visualization of intra-cellular organelles, Raju Regmi et al"

しかしながら、非特許文献１に記載の装置では、ライトシートがフローセルを通過することにより、ライトシートの厚みの増加等が生じ、ライトシートのビーム形状が崩れる。崩れたビーム形状のライトシートが試料に照射されると、撮像される画像の精度が低下する問題が生じる。このため、より高精度な画像を撮像可能な装置が求められている。

本発明の第１の態様は、粒子撮像装置に関する。本態様に係る粒子撮像装置は、粒子を含む試料を流すためのフローセルと、光源と、光源から出射された光から、フローセルに対しライトシートを形成するための照射光学系と、粒子から生じた光を集光するための集光光学系と、集光光学系により集光された光を受光するための撮像素子と、撮像素子により取得された画像に基づいて粒子の３次元画像を生成する処理部と、を備える。ライトシートのシート面は、光源から出射された光が入射するフローセルの外側面に対して垂直である。また、ライトシートのシート面は、試料の流れ方向に対して垂直ではなく所定の角度で傾いている。照射光学系の光軸と集光光学系の光軸とが互いに垂直であり、フローセルにおける試料の流れ方向と集光光学系の光軸とが互いに垂直である。処理部は、少なくともフローセルにおける粒子の移動量と試料の流れ方向に対するライトシートの角度とに基づいて、撮像素子の撮像面における粒子の像の移動量を算出し、算出した移動量と、１つの粒子について撮像素子により取得された複数の画像とに基づいて、１つの粒子の３次元画像を生成する。

本発明の第２の態様は、粒子撮像方法に関する。本態様に係る粒子撮像方法は、粒子を含む試料が流されるフローセルの外側面に対して垂直であり、試料の流れ方向に対して垂直ではなく所定の角度で傾いたライトシートを、照射光学系により試料の流れに対して形成し、試料に含まれる粒子から生じた光を、照射光光学系の光軸に垂直で且つ試料の流れ方向に垂直な光軸を有する集光光学系により撮像素子に集光して、粒子を撮像し、少なくともフローセルにおける粒子の移動量と試料の流れ方向に対するライトシートの角度とに基づいて、撮像面における粒子の像の移動量を算出し、算出した移動量と、１つの粒子について撮像により取得された複数の画像とに基づいて、１つの粒子の３次元画像を生成する。

本発明によれば、高精度な画像を撮像できる。

図１は、実施形態１に係る粒子撮像装置の構成を示す図である。 図２（ａ）は、実施形態１に係る光学レンズの構成を示す図である。図２（ｂ）は、実施形態１に係る光学レンズが傾いている状態を示す図である。図２（ｃ）は、実施形態１に係るフローセルおよびライトシートの流路における断面をＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図２（ｄ）は、実施形態１に係るライトシートおよびフローセルの断面を第１方向に見た場合の模式図である。 図３（ａ）は、実施形態１に係るライトシートおよびフローセルの断面を第２方向に見た場合の模式図である。図３（ｂ）〜（ｄ）は、実施形態１の変更例に係るライトシートおよびフローセルの断面を第２方向に見た場合の模式図である。 図４（ａ）は、実施形態１に係るライトシートのシート面とフローセルの外側面との関係を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態１の変更例に係るライトシートのシート面とフローセルの外側面との関係を示す模式図である。 図５は、実施形態１に係る撮像素子により取得した画像を重ね合わせる際のアスペクト比の補正および位置調整について説明するための図である。 図６（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る撮像素子により取得した画像を重ね合わせる際のアスペクト比の補正および位置調整について説明するための図である。 図７（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係るライトシートの傾きと撮像精度との関係について説明するための図である。 図８（ａ）は、実施形態１に係るノイズ成分を抑えながら全ての断面を取得可能な角度の条件について説明するための図である。図８（ｂ）は、実施形態１に係る最適な角度を粒子撮像装置に適用するための処理を示すフローチャートである。 図９は、実施形態１に係る３次元画像を生成する処理を示すフローチャートである。 図１０（ａ）は、実施形態２に係る集光光学系の構成を示す図である。図１０（ｂ）は、実施形態２に係る位相変調素子による効果を説明するための図である。 図１１は、実施形態３に係る粒子撮像装置の構成を示す図である。 図１２（ａ）は、実施形態３に係る光学レンズが傾いている状態を示す図である。図１２（ｂ）は、実施形態３に係るフローセルおよびライトシートの流路における断面をＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図１２（ｃ）は、実施形態３に係るフローセルに照射されるライトシートをＹ軸正方向に見た場合の模式図である。 図１３（ａ）は、実施形態４に係る２光子励起が可能となる領域を示す模式図である。図１３（ｂ）は、実施形態４の変更例に係る２光子励起が可能となる領域を示す模式図である。 図１４（ａ）は、実施形態５に係るフローセルおよびライトシートの流路における断面をＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図１４（ｂ）は、実施形態５に係るフローセルに照射されるライトシートをＹ軸正方向に見た場合の模式図である。 図１５（ａ）、（ｂ）は、実施形態５に係るライトシートおよび他のライトシートが試料の流れ方向に十分離れている必要があることを説明するための図である。 図１６（ａ）は、実施形態６に係る粒子撮像装置の構成を示す図である。図１６（ｂ）は、実施形態６に係る光学素子およびビームストッパの構成を説明するための図である。 図１７（ａ）は、実施形態６に係るフローセルおよびライトシートの流路における断面をＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図１７（ｂ）は、実施形態６に係るフローセルに照射されるライトシートをＹ軸正方向に見た場合の模式図である。 図１８（ａ）は、実施形態７に係るフローセルをＸ軸負方向に見た場合の模式図である。図１８（ｂ）は、実施形態７に係るフローセルをＺ軸正方向に見た場合の模式図である。

＜実施形態１＞
実施形態１は、光の照射により粒子から生じた蛍光を撮像して複数の画像を取得し、取得した複数の画像に基づいて粒子の３次元画像を生成する粒子撮像装置に本発明を適用したものである。実施形態１では、撮像対象の粒子は、細胞中の核、ＨＥＲ２遺伝子、および１７番染色体のセントロメア領域であるＣＥＰ１７である。この他、撮像対象の粒子は、他の遺伝子、核酸、細胞質、タンパク質、細胞内小器官等、細胞内の他の部分でも良い。また、撮像対象の粒子は、細胞自体であっても良い。たとえば、撮像対象の粒子は、血中循環腫瘍細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）、血管内皮細胞（CEC：Circulating Endothelial Cell）、血管内皮前駆細胞（EPC：Endothelial Progenitor Cell）、間葉系幹細胞（MSC：Mesenchymal Stem Cell）、造血幹細胞（HSC：Hematopoietic Stem Cell）、抗原特異的Ｔ細胞等であっても良い。

撮像対象の粒子は、細胞に限られず、細胞以外の粒子であっても良い。たとえば、撮像対象の粒子は、細胞以外の生体由来の粒子や、蛍光ビーズなどの光を透過する粒子等であっても良い。すなわち、撮像対象の粒子は、透光性を有し光の照射によってフローセルの外側に向けて光を生じる粒子であれば良い。

図１に示すように、粒子撮像装置１０は、撮像部１０ａと情報処理装置１０ｂを備える。撮像部１０ａは、光源２０と、照射光学系３０と、フローセル４０と、集光光学系５０と、撮像素子６０と、回転制御部７０と、を備える。照射光学系３０は、光学レンズ３１と、回転機構部３２と、対物レンズ３３と、を備える。集光光学系５０は、対物レンズ５１と、光学フィルタ５２と、集光レンズ５３を備える。図１には、撮像部１０ａの各部の配置を説明するためにＸＹＺ軸が示されている。ＸＹＺ軸は、互いに直交する。以下の図に示すＸＹＺ軸も、それぞれ図１に示すＸＹＺ軸に対応する。

光源２０は、Ｘ軸正方向に光を出射して、フローセル４０を流れる試料に光を照射する。光源２０は、たとえば半導体レーザ光源である。光源２０から出射される光の波長は、細胞を染色している蛍光色素から、蛍光を励起させるための光の波長に設定される。光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を後述するように収束させる。回転機構部３２は、光学レンズ３１を回転可能に支持している。回転機構部３２は、光源２０から出射された光の中心軸を中心に、言い換えれば、光学レンズ３１における照射光学系３０の光軸を中心に、光学レンズ３１を回転させる。

図２（ａ）に示すように、光学レンズ３１は、シリンドリカルレンズである。光学レンズ３１のＸ軸正側は平坦な面になっており、光学レンズ３１のＸ軸負側は曲面となっている。光学レンズ３１は、Ｘ軸正側の面がＸ軸に垂直となり、光学レンズ３１に入射する光の中心軸が光学レンズ３１の母線３１ａと交わるよう、回転機構部３２に支持される。光学レンズ３１は、上記のように、平坦な面がＸ軸正側に位置付けられ、曲面がＸ軸負側に位置付けられるように配置されるのが望ましいが、曲面がＸ軸正側に位置付けられ、平坦な面がＸ軸負側に位置付けられるように配置されても良い。

光学レンズ３１は、第１方向Ｄ１に対する光の収束と、第１方向Ｄ１と交わる第２方向Ｄ２における光の収束とが異なるように、光源２０から出射された光を収束させる。具体的には、第１方向Ｄ１は、母線３１ａとＸ軸に垂直な方向であり、第２方向Ｄ２は、母線３１ａに平行な方向である。光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を、第２方向Ｄ２に収束させず、第１方向Ｄ１にのみ収束させる。光学レンズ３１により第１方向Ｄ１に収束された光は、対物レンズ３３の瞳近傍に集光する。

図２（ｂ）に示すように、光学レンズ３１は、回転機構部３２によりＸ軸を中心に回転され、母線３１ａのＹ軸に対する角度が所定の角度θとなる回転位置に位置付けられる。これにより、光学レンズ３１は、光源２０から出射された光を、図２（ｂ）に示すようにＺ軸に対して傾いた第１方向Ｄ１にのみ収束させる。

図１に戻り、対物レンズ３３は、光学レンズ３１を透過した光をフローセル４０の流路４１に集光させる。具体的には、対物レンズ３３は、図２（ｂ）に示した第２方向Ｄ２における収束位置がフローセル４０の流路４１に位置付けられるように、光学レンズ３１を透過した光を収束させる。また、対物レンズ３３は、光学レンズ３１を透過した光の、図２（ｂ）に示した第１方向Ｄ１における広がりを平行にする。これにより、対物レンズ３３を透過した光は、フローセル４０の流路４１において扁平なビームとなる。

対物レンズ３３は省略することもできる。この場合、光学レンズ３１は、図２（ｂ）に示す状態からＸ軸を中心に９０°回転された回転位置に位置付けられる。そして、光源２０から出射された光が光学レンズ３１によって一方向にのみ収束されることにより、フローセル４０の流路４１において扁平なビームが形成される。

このように、照射光学系３０は、光学レンズ３１と対物レンズ３３により、光源２０から出射された光を、フローセル４０の流路４１の位置におけるＹＺ平面に平行な断面において、直線状となるように集光させる。すなわち、照射光学系３０は、光源２０から出射された光から、フローセル４０に対しライトシート１１を形成する。

光学レンズ３１は、第１方向Ｄ１に対する光の収束と第２方向Ｄ２に対する光の収束とが異なるレンズでも良い。光学レンズ３１は、位相板やホログラフィエレメントでも良い。また、照射光学系３０は、円錐レンズなどによりベッセルビームを形成し、形成したベッセルビームをスキャニングミラー等によって高速に一方向に走査することで、ライトシート１１を形成しても良い。この場合、スキャニングミラー等の走査方向は、ＹＺ平面内において、Ｙ軸方向およびＺ軸方向以外の方向とされる。

フローセル４０は、Ｚ軸方向に延びた形状を有しており、Ｚ軸方向に見て正方形形状の外形を有する。フローセル４０は、Ｚ軸方向に見て正方形形状以外の矩形形状の外形を有しても良い。フローセル４０の外側面４０ａ、４０ｂ、４０ｃ、４０ｄは平坦な面となっている。特に、照射光学系３０からの光が入射する外側面４０ａ、および、後述する集光光学系５０によって集光される蛍光が通過する外側面４０ｂは、平坦な面であるのが望ましい。実施形態１では、フローセル４０のＸ軸正側の外側面４０ｃおよびＸ軸負側の外側面４０ａは、ＹＺ平面に平行であり、フローセル４０のＹ軸正側の外側面４０ｂおよびＹ軸負側の外側面４０ｄは、ＸＺ平面に平行である。

フローセル４０の内部には、Ｚ軸方向に延びた流路４１が形成されている。フローセル４０は、細胞を含む試料を流路４１に流す。流路４１に流される試料は、被検者から採取された細胞に基づいて、あらかじめ調製されたものである。実施形態１では、試料の調製において、細胞内の核、ＨＥＲ２遺伝子、およびＣＥＰ１７が蛍光染色される。核は、核を特異的に染色可能な蛍光色素により染色される。ＨＥＲ２遺伝子およびＣＥＰ１７は、核酸プローブを介して蛍光色素が結合することにより染色される。核、ＨＥＲ２遺伝子、およびＣＥＰ１７を染色している染色色素は、光源２０から出射された光が照射されると、互いに異なる波長の蛍光が励起される。自家蛍光によって生じた蛍光を撮像する場合には、必ずしも細胞が蛍光染色されなくても良い。

図２（ｃ）に示すように、流路４１をＸ軸負方向に見た場合、ライトシート１１の長手方向は、試料の流れに対して傾いている。すなわち、ライトシート１１は、第１方向Ｄ１に延び、第２方向Ｄ２に幅が狭い形状となっている。ライトシート１１は、長鎖線で模式的に示されている。試料に含まれる細胞１２は、フローセル４０の流路４１内をＺ軸正方向に流れる。このとき、細胞１２内の核１２ａならびに核１２ａ内のＨＥＲ２遺伝子およびＣＥＰ１７も、流路４１内をＺ軸正方向に流れる。細胞１２がライトシート１１を横切ると、細胞１２の蛍光染色された部分から蛍光が生じる。

図２（ｃ）に示す断面Ｃ１―Ｃ２を第１方向Ｄ１に見ると、断面は図２（ｄ）に示すようになる。図２（ｄ）に示すように、照射光学系３０からフローセル４０に入射する光は、フローセル４０において、第１方向Ｄ１の幅は絞らずに平行光となっているが、第２方向Ｄ２の幅は絞られ薄くなっている。ライトシート１１とは、光源２０から照射された光のうち、第２方向Ｄ２の幅が粒子に対して十分に小さい領域のことである。ライトシート１１のシート面１１ａとは、ライトシート１１において、ライトシート１１の中心軸と第１方向Ｄ１とによって規定される平面のことである。図２（ｃ）、（ｄ）において、シート面１１ａは、点線で模式的に示されている。

図２（ｃ）に戻り、ライトシート１１のシート面１１ａは、光学レンズ３１の傾きに対応して、Ｚ軸に対して角度θだけ傾いている。シート面１１ａのＺ軸に対する傾きは、略垂直でないように設定される。これにより、細胞１２の断面画像をフローセル４０の周囲から取得しやすくなる。また、シート面１１ａは、Ｚ軸と平行でないように設定される。これにより、細胞１２の蛍光染色された部分について複数の異なる断面画像を取得できるようになる。このように、シート面１１ａは、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して、略垂直ではなく所定の角度で傾けられる。これにより、蛍光色素から生じた蛍光をフローセル４０の周囲から取得しやすくなり、かつ、異なる複数の細胞断面を取得できるようになる。角度θは、光学レンズ３１をＸ軸まわりに回転させることにより設定できる。

ここで、照射光学系３０の光軸は、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して垂直である。言い換えれば、対物レンズ３３の光軸は、Ｚ軸に対して垂直であり、照射光学系３０から出てフローセル４０に入射する光の中心軸は、Ｚ軸に対して垂直である。図２（ｃ）に示す断面Ｃ３―Ｃ４を第２方向Ｄ２に見ると、断面は図３（ａ）に示すようになる。図３（ａ）に示すように、ライトシート１１のシート面１１ａは、光源２０から出射された光が入射するフローセル４０の外側面４０ａに対して垂直となる。これにより、フローセル４０に入射する光がフローセル４０によって屈折することが抑制されるため、フローセル４０を通過して核１２ａに照射されるビーム形状が崩れにくくなる。したがって、適正な形状のライトシート１１を細胞に照射できるため、後述する撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

なお、核１２ａの一部についてのみ３次元画像が生成されれば良い場合、図３（ｂ）に示すように、ライトシート１１が撮像対象である核１２ａの一部にのみ掛かるように、ライトシート１１の第１方向Ｄ１の幅が設定されても良い。この場合、核１２ａ一部について断面画像が取得され、取得された核１２ａの一部の断面画像に基づいて３次元画像が生成される。

照射光学系３０の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直な状態からずれていても、シート面１１ａがフローセル４０の外側面４０ａに対して垂直であれば良い。この場合、図２（ｃ）に示す断面Ｃ３―Ｃ４を第２方向Ｄ２に見ると、断面は図３（ｃ）に示すようになる。図３（ｃ）では、照射光学系３０の光軸は試料の流れ方向に対して垂直ではないものの、図３（ａ）と同様、シート面１１ａは、光源２０から出射された光が入射するフローセル４０の外側面４０ａに対して垂直となっている。この場合、ライトシート１１は、外側面４０ａによって、第１方向Ｄ１において屈折することになるが、第２方向Ｄ２において屈折することがない。したがって、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みは、フローセル４０の外側面４０ａによる影響を受けにくくなる。よって、図３（ａ）の場合と同様、核１２ａに照射されるビーム形状が崩れにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

なお、核１２ａの一部についてのみ３次元画像が生成されれば良い場合、図３（ｄ）に示すように、ライトシート１１が撮像対象である核１２ａの一部にのみ掛かるように、ライトシート１１の第１方向Ｄ１の幅が設定されても良い。

シート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直な状態から僅かにずれていても良い。シート面１１ａが、外側面４０ａに対して略垂直であれば、細胞１２に照射されるビーム形状が崩れることが抑制され、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

図４（ａ）、（ｂ）を参照して、ライトシート１１のシート面１１ａが外側面４０ａに対して垂直となっている状態について、詳細に説明する。

実施形態１では、照射光学系３０の光軸がＸ軸に平行であり、フローセル４０の外側面４０ａはＹＺ平面に平行である。これにより、図４（ａ）に示すように、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直となり、ライトシート１１のシート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直となる。この場合、図３（ａ）を参照して説明したように、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みが外側面４０ａによる影響を受けにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

ただし、ライトシート１１のシート面１１ａが外側面４０ａに対して垂直であれば、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直でなくても良い。具体的には、図４（ａ）の中心軸９０が、第１方向Ｄ１において傾けられても良い。これにより、図４（ｂ）に示すように、外側面４０ａに入射する光の中心軸９０は、外側面４０ａに対して垂直ではないものの、ライトシート１１のシート面１１ａは、外側面４０ａに対して垂直となる。この場合も、図３（ｃ）を参照して説明したように、ライトシート１１の第２方向Ｄ２における厚みが外側面４０ａによる影響を受けにくくなるため、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

図１に戻り、集光光学系５０は、細胞１２から生じた蛍光を、フローセル４０のＹ軸正側で集光する。集光光学系５０は、細胞１２から生じた蛍光を、フローセル４０のＹ軸負側で集光しても良い。対物レンズ５１は、細胞１２から生じた蛍光を集光する。光学フィルタ５２は、細胞１２から生じる側方散乱光等の不要な光を遮断して、撮像したい蛍光のみを透過させる。不要な光が問題とならない場合、光学フィルタ５２を省略することもできる。集光レンズ５３は、光学フィルタ５２を透過した蛍光を、撮像素子６０の撮像面６１に結像させる。対物レンズ５１の仕様によっては、集光レンズ５３を省略することもできる。

撮像素子６０は、集光光学系５０により集光された蛍光を撮像面６１において受光する。撮像素子６０は、蛍光の２次元画像を撮像し、撮像した２次元画像を出力する。撮像される２次元画像は、細胞１２の断面画像である。撮像素子６０は、たとえばカラーＣＣＤにより構成される。実施形態１では、核１２ａ、ＨＥＲ２遺伝子、およびＣＥＰ１７から異なる波長の蛍光が生じるため、撮像素子６０は、異なる波長の光を識別可能に構成される。なお、カラーＣＣＤでは必要な感度が不足する場合には、フローセル４０を流れる試料の速度を十分落とす等の調整を行うことができる。

集光光学系５０において各波長帯域の蛍光を波長帯域ごとに分離して、分離した蛍光ごとに、１つの波長帯域の光のみを識別可能な撮像素子またはカラーＣＣＤからなる撮像素子により受光しても良い。この場合、複数の撮像素子で取得された同じタイミングにおける画像が、互いに重ね合わせられることにより１つの断面画像が生成される。細胞１２から１つの波長帯域の蛍光のみが生じる場合、撮像素子６０は、１つの波長帯域の光のみを識別可能に構成されれば良い。

ここで、集光光学系５０の光軸は、試料の流れ方向であるＺ軸方向に対して垂直である。言い換えれば、対物レンズ５１の光軸は、Ｚ軸に対して垂直である。これにより、撮像素子６０は、細胞１２から生じた蛍光のうち、フローセル４０によって略屈折せずにフローセル４０の外側に出た蛍光を受光するため、撮像面６１に照射される蛍光のビーム形状が崩れにくくなる。したがって、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

集光光学系５０の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直な状態から僅かにずれていても良い。集光光学系５０の光軸が、試料の流れ方向に対して略垂直であれば、撮像面６１に照射される蛍光のビーム形状が崩れることが抑制され、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とは、互いに垂直である。これにより、撮像素子６０は、細胞１２の断面から生じた蛍光を正面側から撮像できる。すなわち、撮像素子６０は、細胞１２の断面に対してＸ軸方向にずれた位置ではなく、細胞１２の断面を含むＹＺ平面内で蛍光を撮像する。これにより、撮像した画像をＸ軸方向に補正するといった処理が不要になる。

照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とは、互いに垂直な状態から僅かにずれていても良い。照射光学系３０の光軸と集光光学系５０の光軸とが互いに略垂直であれば、撮像素子６０は、細胞１２の断面から生じた蛍光を略正面側から撮像できるため、撮像した画像をＸ軸方向に補正するといった処理が略不要になる。

回転制御部７０は、回転機構部３２に接続されており、回転機構部３２の回転を制御する。回転制御部７０による制御については、追って図８（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。

情報処理装置１０ｂは、処理部８１と、記憶部８２と、表示部８３と、入力部８４と、インターフェース８５と、を備える。処理部８１は、たとえばＣＰＵにより構成される。記憶部８２は、たとえばＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスクにより構成される。処理部８１は、インターフェース８５を介して、情報処理装置１０ｂ内の各部を制御するとともに、撮像素子６０と回転制御部７０を制御する。処理部８１は、撮像素子６０により取得された画像に基づいて３次元画像を生成する。具体的には、撮像素子６０は、１つの細胞から取得した複数の断面画像を重ね合わせて３次元画像を生成する。表示部８３は、処理部８１による処理結果等を表示するためのディスプレイである。入力部８４は、オペレータによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。

粒子撮像装置１０は、撮像部１０ａのみから構成されても良い。この場合、情報処理装置１０ｂと同様の装置が、粒子撮像装置１０の外部に配置される。粒子撮像装置１０の撮像素子６０により取得された画像が外部の装置に送られ、外部の装置において３次元画像が生成される。

次に、撮像素子６０により取得した画像を重ね合わせる際のアスペクト比の補正および位置調整について説明する。

図５に示すように、細胞１２内の核１２ａが、フローセル４０の流路４１をＺ軸正方向に流れる。このとき、核１２ａがライトシート１１を通過すると、ライトシート１１が照射された核１２ａの断面から蛍光が生じ、生じた蛍光が、撮像素子６０の撮像面６１に照射される。図５において、核１２ａは、便宜上、球として図示されている。核１２ａが、順に流路４１の位置１０１〜１０３に位置付けられるとすると、位置１０１〜１０３に位置付けられた核１２ａから生じる蛍光は、それぞれ、撮像面６１上における照射領域１１１〜１１３に照射される。

ライトシート１１はＺ軸方向に対して傾いているため、撮像面６１における照射領域のＺ軸方向の長さは、ライトシート１１が照射された断面の第１方向Ｄ１における長さに比べて小さくなる。具体的には、撮像面６１における照射領域のＺ軸方向の長さは、ライトシート１１が照射された断面の第１方向Ｄ１における長さに、ｃｏｓθを乗算したものとなっている。したがって、照射領域のＺ軸方向の長さに１／ｃｏｓθを乗算することにより、画像上の照射領域を、実際の断面形状を反映した適正なアスペクト比に補正できる。

核１２ａが位置１０２にあるとき、ライトシート１１が核１２ａの中心に照射されるとする。このとき、核１２ａのＺ軸上における位置を０とすると、照射領域１１２のＺ軸上における位置も０となる。しかしながら、核１２ａが位置１０２とは異なる位置にあるとき、ライトシート１１が核１２ａの中心に照射されない。この場合、核１２ａの位置と照射領域の位置とがずれることになる。

ここで、位置１０３にある核１２ａのＺ軸上における位置をｘ１とし、照射領域１１３のＺ軸上における位置をｘ２とする。すなわち、フローセル４０の流路４１における核１２ａの移動量をｘ１、撮像面６１における核１２ａの像の移動量をｘ２とする。試料の流れ方向に対するライトシート１１の傾き角度をθとすると、ｘ２は以下の式（１）により算出される。

ｘ２＝ｘ１（１−ｓｉｎ^２θ） … （１）

図６（ａ）に示すように、位置１０２〜１０３にある核１２ａに基づいて、画像２０１〜２０３が撮像されたとする。画像２０１〜２０３には、それぞれ、核１２ａに対応する照射領域１１２〜１１４が撮像されている。

画像２０１〜２０３を重ね合わせるには、たとえば、Ｚ軸上の照射領域の位置が０である画像２０１が撮像されたタイミングが、基準時間に設定される。基準時間から撮像間隔Δｔだけ経過したときの核１２ａの移動量ｘ１１は、Δｔに試料の流れ速度を乗算することにより取得できる。このとき、照射領域１１３の位置ｘ２１は、上記式（１）のｘ１にｘ１１を代入することにより取得できる。同様に、基準時間から撮像間隔２Δｔだけ経過したときの核１２ａの移動量ｘ１２は、２Δｔに試料の流れ速度を乗算することにより取得できる。このとき、照射領域１１４の位置ｘ２２は、上記式（１）のｘ１にｘ１２を代入することにより取得できる。そして、画像２０２において、照射領域１１３が、Ｚ軸上の位置０に近付く方向にｘ２１だけ移動される。同様に、画像２０３においても、照射領域１１４が、Ｚ軸上の位置０に近付く方向にｘ２２だけ移動される。

撮像素子６０により撮像された画像は、記憶部８２に順次記憶されている。情報処理装置１０ｂの処理部８１は、記憶した複数の画像のうち、１つの核１２ａの断面が撮像されている最初の画像から最後の画像までの全ての画像をグループ化する。画像のグループ化において、核１２ａの断面が撮像されている最初の画像より前の画像と、核１２ａの断面が撮像されている最後の画像より後の画像もグループに含められても良い。なお、１つの粒子について撮像される画像の枚数が２枚〜１００枚程度となるように、撮像素子６０による撮像間隔が、流路４１を流れる試料の速度、粒子の大きさ、ライトシート１１の第２方向Ｄ２の厚み等によって決められる。

たとえば、図６（ｂ）の左側に示すように、処理部８１は、画像２０１〜２０７をグループ化する。処理部８１は、グループ化した画像２０１〜２０７に対して、上述したように画像上の照射領域のアスペクト比を補正する。そして、処理部８１は、アスペクト比の補正を行った画像２０１〜２０７に対して、上述したように画像上の照射領域の位置調整を行う。これにより、図６（ｂ）の右側に示すように、アスペクト比の補正および照射領域の中心位置の調整が行われた画像２１１〜２１７が取得される。

こうして、処理部８１は、アスペクト比の補正と位置調整を行った後の画像２１１〜２１７を重ね合わせることにより、１つの核１２ａについての適正な３次元画像を生成する。

なお、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７から生じた蛍光は、核１２ａの照射領域内に輝点として投影されるため、核１２ａの断面画像に、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７も含まれることになる。また、上記のようなアスペクト比の補正と位置調整により、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７についてもアスペクト比の補正と位置調整が行われる。したがって、実施形態１では、断面画像を重ね合わせて構成される核１２ａの３次元画像に、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７の輝点が含まれることになる。このように、実施形態１によれば、核１２ａのような所定の大きさを有する部分だけでなく、ＨＥＲ２遺伝子とＣＥＰ１７などの微小な部分についても、撮像素子６０によって取得される複数の画像に基づいて、３次元における分布状態を反映した３次元画像を取得できる。

３次元画像を生成する際のアスペクト比の補正と位置調整は、上記のような方法に限られない。たとえば、以下のような方法でも良い。

蛍光ビーズなどの球体粒子を含む試料をフローセル４０に流し、撮像素子６０により画像を撮像する。撮像された画像において、粒子断面の流れ方向における中心座標を取得し、粒子断面の中心座標を一致させるために各画像をどの程度ずらせば良いかを、位置ずれ補正のパラメータとして算出する。また、何れか１つの画像において、粒子断面を真円にするために画像を流れ方向にどの程度伸ばせば良いかを、アスペクト比の補正のパラメータとして算出する。こうして得られた２つのパラメータは、記憶部８２に記憶される。

実際の試料に基づいて３次元画像を生成する際には、処理部８１は、記憶部８２に記憶した２つのパラメータを用いて、各画像に対してアスペクト比の補正と位置調整を行う。そして、処理部８１は、補正および調整が行われた各画像を重ね合わせることにより３次元画像を生成する。こうすると、粒子撮像装置１０の光学系等の実際の状態に応じて、アスペクト比の補正と位置調整を行うことができるため、高精度な３次元画像を生成できる。なお、このような２つのパラメータは、１つのビーズに基づいて取得されても良いが、複数のビーズに基づいて取得されたパラメータを平均することにより取得されるのが望ましい。

次に、ライトシート１１の傾きと撮像精度との関係について説明する。

図７（ａ）、（ｂ）に示すように、ライトシート１１は、光学レンズ３１の回転位置に応じた第２方向Ｄ２に、所定の厚みを有する。ここで、核１２ａの中心にライトシート１１が照射されると、集光光学系５０の光軸方向、すなわちＹ軸方向におけるライトシート１１の厚みは幅ｄとなる。この場合、核１２ａの中心だけでなく、幅ｄの範囲に含まれる核１２ａの部分から蛍光が生じる。このため、核１２ａの中心を撮像しようとする場合に、核１２ａの中心以外の部分から生じた蛍光がノイズ成分となってしまう。このようなノイズ成分は、撮像される画像のバックグラウンドノイズとなるため、できるだけ小さい方が好ましい。

ここで、幅ｄは、図７（ａ）に示すように、シート面１１ａのＺ軸に対する傾きθが９０°に近付くにつれて大きくなる。一方、幅ｄは、図７（ｂ）に示すように、シート面１１ａのＺ軸に対する傾きθが０°に近付くにつれて小さくなる。したがって、ノイズ成分を小さくするために、角度θは小さい方が好ましい。ただし、上述したように、角度θが０°になると、複数の異なる断面画像を取得できなくなるため、角度θは、少なくとも０°より大きくする必要がある。

次に、ノイズ成分を抑えながら全ての断面を取得可能な角度θの条件について説明する。

図８（ａ）に示すように、核１２ａの直径をａとし、流路４１における結像視野の大きさ、すなわち撮像可能な流路４１のＺ軸方向の幅をｂとする。ノイズ成分を抑えるために角度θを小さくしながら、核１２ａの全ての断面を取得するためには、結像視野の上端に位置付けられた核１２ａの一方の端と、結像視野の下端に位置付けられた核１２ａの他方の端とにライトシート１１が掛かれば良い。このことから、最適な角度θは、以下の式（２）により算出される。

ｔａｎθ＝ａ／ｂ … （２）

式（２）を満たすように角度θが設定されると、核１２ａの全ての断面画像を取得しながら、バックグラウンドノイズを抑えた高精度な画像を撮像できる。

次に、上記のような最適な角度θを粒子撮像装置１０に適用するための処理について説明する。

図８（ｂ）に示すように、ステップＳ１１において、処理部８１は、入力部８４を介してユーザが入力した数値を受け付けて、受け付けた数値を撮像対象の平均的な大きさ、すなわち集光光学系５０の光軸方向における撮像対象の平均的な幅として回転制御部７０に設定する。実施形態１では、ユーザは核１２ａの平均的な直径を入力する。

ステップＳ１において、処理部８１は、撮像対象の一覧を表示部８３に表示し、入力部８４を介してユーザが選択した撮像対象を受け付けても良い。この場合、処理部８１は、ユーザから受け付けた撮像対象に対応する大きさを、予め記憶部８２に記憶した対応表から読み出し、読み出した大きさを回転制御部７０に設定する。また、ステップＳ１において、処理部８１は、予め撮像素子６０により撮像した画像に基づいて撮像対象の大きさを算出し、算出した大きさを回転制御部７０に設定しても良い。

ステップＳ２において、処理部８１は、入力部８４を介してユーザが入力した視野の大きさを受け付けて、受け付けた視野の大きさを回転制御部７０に設定する。視野の大きさは、集光光学系５０の対物レンズ５１の倍率や、撮像素子６０の画素数などに応じて変化する。

ステップＳ２において、処理部８１は、対物レンズ５１と撮像素子６０の一覧を表示部８３に表示し、入力部８４を介してユーザが選択した対物レンズ５１と撮像素子６０を受け付けても良い。この場合、処理部８１は、ユーザから受け付けた対物レンズ５１の倍率と撮像素子６０の画素数を、予め記憶部８２に記憶した対応表から読み出し、読み出した倍率と画素数に基づいて視野の大きさ計算し、算出した視野の大きさを回転制御部７０に設定しても良い。

ステップＳ３において、回転制御部７０は、処理部８１によって設定された撮像対象の大きさと視野の大きさを上記式（２）に代入し、ライトシート１１の傾き角度θを算出する。処理部８１が、ライトシート１１の傾き角度θを算出し、算出した角度θを回転制御部７０に送信しても良い。

ステップＳ４において、回転制御部７０は、ライトシート１１の傾きがステップＳ３で算出された角度θとなるよう、回転機構部３２を介して光学レンズ３１を回転させる。こうして、撮像対象の全ての断面画像を取得でき、バックグラウンドノイズを抑えた高精度な画像を撮像できるよう、ライトシート１１の傾きが設定される。

回転制御部７０は、必ずしも必要ではなく、省略されても良い。この場合、たとえば、オペレータが、光学レンズ３１の角度がθとなるよう、手動で回転機構部３２を回転させる。また、回転機構部３２に代えて、光学レンズ３１が固定されたホルダが、光学レンズ３１の複数の角度に対応して複数準備されても良い。この場合、角度θが算出されると、算出された角度θに対応するホルダが選択され、選択されたホルダが装置内に設置されることにより、光学レンズ３１の角度が変更される。このようなホルダの設置は、手動で行われても良く、自動で行われても良い。

次に、３次元画像を生成する処理について説明する。

図９に示すように、ステップＳ１１において、ユーザは、試料をフローセル４０の流路４１に流す。撮像部１０ａは、調製した試料を貯留するための貯留部と、貯留部に貯留された試料をフローセル４０に送るための移送部とを備えても良い。この場合、ステップＳ１１において、処理部８１が、貯留部に貯留された試料を、フローセル４０に流すよう、粒子撮像装置１０の移送部を制御する。

ステップＳ１２において、ユーザは、光源２０から光を出射させることにより、試料にライトシート１１を照射させる。光源２０がインターフェース８５に接続されても良い。この場合、ステップＳ１２において、処理部８１が、光源２０を制御して、試料にライトシート１１を照射させる。

ステップＳ１３において、処理部８１は、細胞１２内の核１２ａ、ＨＥＲ２遺伝子、およびＣＥＰ１７から生じた蛍光の画像を、撮像素子６０により撮像させる。具体的には、蛍光の画像が、撮像素子６０のフレームレートに基づいて連続的に撮像され、記憶部８２に順次記憶される。ステップＳ１４において、処理部８１は、撮像素子６０により撮像された複数の画像に基づいて、図５および図６（ａ）、（ｂ）を参照して説明したように、アスペクト比の補正と位置調整を行った上で、３次元画像を生成する。すなわち、処理部８１は、１つの核１２ａについて取得した複数の画像について、上記式（１）に基づいて撮像面６１における核１２ａの移動量を算出し、アスペクト比の補正を行う。処理部８１は、算出した移動量と、アスペクト比の補正を行った画像とに基づいて、１つの核１２ａの３次元画像を生成する。

＜実施形態２＞
上述したように、ライトシート１１は試料の流れ方向に対して傾いているため、ライトシート１１が照射される核１２ａの断面と対物レンズ５１との距離は、断面上の位置に応じて異なる。具体的には、断面のＺ軸負側は、対物レンズ５１に対して近い位置にあり、断面のＺ軸正側は、対物レンズ５１に対して離れた位置にある。この場合、ライトシート１１が照射される断面の端部が、被写界深度から外れやすくなるため、撮像された画像において、断面の端部に対応する部分のぼけが大きくなってしまう。実施形態２では、このようなぼけを抑制するために、被写界深度が、集光光学系５０の光軸方向における断面の広がりを含むように設定される。

図１０（ａ）に示すように、実施形態２の集光光学系５０は、実施形態１と比較して、対物レンズ５１と集光レンズ５３の間に、集光レンズ５４、５５と位相変調素子５６を備える。この他、実施形態２の構成と制御は、実施形態１と同様である。

集光レンズ５４、５５は、対物レンズ５１のＹ軸正側に配置され、集光光学系５０においてフーリエ面を形成する。フーリエ面は、集光レンズ５５と位相変調素子５６の間に、さらに偶数枚のレンズが設置されることにより形成されても良い。位相変調素子５６は、集光光学系５０のフーリエ面に配置され、位相を変調することで拡大された被写界深度（Extended Depth of Focus : EDoF）を実現する。位相変調素子５６は、拡大された被写界深度を得るための点像分布関数（Point Spread Function : PSF）を形成する。すなわち、位相変調素子５６は、被写界深度の拡大が可能となるように、点像分布関数を変調する作用を有する。実施形態２の位相変調素子５６は、１つの点から生じた蛍光が２つの焦点に結像されるＰＳＦを形成する。このようなＰＳＦは、ＤＨ−ＰＳＦ（Double-Helix Point Spread Function）と呼ばれる。

図１０（ｂ）に示すように、Ｙ軸方向において位置の異なる点から生じた蛍光は、撮像素子６０の撮像面６１上で２つの焦点に結像される。このとき、２つの焦点は、Ｙ軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像面６１上で回転する。つまり、２つの焦点を結ぶ直線と、基準となる直線とがなす角が、Ｙ軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像面６１上において変化する。しかしながら、撮像面６１上における蛍光の発光点の像については、蛍光の発光点の位置がＹ軸方向にある程度変化しても、ぼけが生じにくく明瞭となる。すなわち、被写界深度が拡大され、Ｙ軸方向において焦点の合う範囲が広くなる。

このように、実施形態２によれば、位相変調素子５６の作用により、細胞断面の部位が、各部位のＹ軸方向の位置に応じて、２つに分離されつつ回転して撮像面６１上に結像される。このため、断面を撮像した画像は、断面に基づく２つの像がややずれた状態で互いに重なり合ったような画像となる。しかしながら、２つの像は、図１０（ｂ）を参照して説明したように、Ｙ軸方向における断面の位置にかかわらず、ぼけの小さい明瞭な状態となる。また、２つの像のずれ量は、微小である。したがって、各断面の画像は、明瞭な像が僅かにずれた状態で重なり合った画像となる。このため、断面がＹ軸方向のどの位置にあっても、明瞭な断面画像が得られる。この結果、断面画像を重ね合わせて得た３次元画像も明瞭なものとなる。なお、撮像された画像において、各部位の回転ずれが問題となる場合には、処理部８１が、各部位の回転ずれを補正する処理を行ってもよい。

このように被写界深度が拡大されると、ライトシート１１の傾きにより生じる撮像画像のぼけを低減でき、細胞１２の核１２ａなど大きな粒子を明瞭に撮像できる。また、高倍率、高ＮＡの対物レンズ５１が用いられる場合には、被写界深度が狭くなる場合がある。このような場合でも、位相変調素子５６により被写界深度が拡大されるため、より大きな粒子を明瞭に撮像できる。

なお、被写界深度を拡大する構成は、上記の構成に限られない。位相変調素子５６は、ＤＨ−ＰＳＦ以外のＰＳＦを形成しても良い。また、集光光学系５０に可変焦点レンズを配置することにより被写界深度を拡大しても良い。また、集光光学系５０において、対物レンズ５１の後段において光路を分岐し、各光路に集光光学系５０の光軸方向の位置が異なるレンズを配置し、各レンズを通過した蛍光を撮像面６１上の異なる領域に結像させることにより被写界深度を拡大しても良い。

＜実施形態３＞
図１１に示すように、実施形態３の撮像部１０ａは、実施形態１と比較して、フローセル４０のＸ軸正側に、他の光源１２０と他の照射光学系１３０をさらに備える。この他、実施形態３の構成および制御は、実施形態１と同様である。

他の光源１２０は、光源２０と同様の構成であり、Ｘ軸負方向に光を出射して、フローセル４０を流れる試料に光を照射する。他の照射光学系１３０は、照射光学系３０と同様の構成であり、光学レンズ１３１と、回転機構部１３２と、対物レンズ１３３と、を備える。他の照射光学系１３０の光軸は、照射光学系３０の光軸と一致する。他の照射光学系１３０からの光が入射する外側面４０ｃは、平坦な面であるのが望ましい。

光学レンズ１３１は、図１２（ａ）に示すように、回転機構部１３２によりＸ軸を中心に回転され、母線１３１ａのＹ軸に対する角度が所定の角度θとなる回転位置に位置付けられる。このとき、光学レンズ１３１の傾き方向は、光学レンズ３１の傾き方向と同じとされる。他の照射光学系１３０は、他の光源１２０から出射された光から、フローセル４０に対し他のライトシート１３を形成する。回転機構部１３２は、回転制御部７０に接続されており、回転制御部７０により回転を制御される。回転機構部１３２は、回転制御部７０とは別の回転制御部により制御されても良い。

図１２（ｂ）に示すように、フローセル４０の流路４１において、他のライトシート１３のシート面１３ａは、ライトシート１１のシート面１１ａと重なり合う。これにより、図１２（ｃ）に示すように、流路４１を流れる細胞１２に対して、Ｘ軸正側からライトシート１１が照射され、Ｘ軸負側から他のライトシート１３が照射されることになる。なお、他の照射光学系１３０の光軸は、試料の流れ方向に対して垂直な状態からずれていても、他のライトシート１３のシート面１３ａが、他の光源１２０から出射された光が入射するフローセル４０の外側面４０ｃに対して垂直であれば良い。

このように、ライトシート１１と他のライトシート１３が、互いに異なる方向からフローセル４０の同じ位置に照射されると、片側からのみライトシートが照射される場合に比べて、細胞１２に照射される光のにじみや照射むらを抑制できる。たとえば、実施形態１のように、細胞１２に対してＸ軸正側からのみライトシート１１が照射される場合、照射光学系３０から遠ざかるにつれて細胞１２内で光が散乱するなどして、細胞１２に照射される光のにじみや照射むらが生じることがある。この場合、撮像素子６０により取得される核１２ａの画像において、たとえば、Ｘ軸負側が明るくＸ軸正側が暗くなってしまう。

しかしながら、実施形態３では、細胞１２に対してＸ軸正側とＸ軸負側からライトシートが同じ位置に照射されるため、細胞１２に照射される光のにじみや照射むらを抑制できる。これにより、撮像素子６０により撮像される画像の精度が向上し、高精度な３次元画像を生成できる。

＜実施形態４＞
実施形態４では、実施形態１と比較して、光源２０が、高パワーのレーザ光をパルス発光させる半導体レーザ光源とされる。高パワーのレーザ光に基づいてライトシート１１が形成されると、図１３（ａ）に示すように、ライトシート１１において、光子密度が高められ２光子励起が可能となる領域１１ｂが形成される。第２方向Ｄ２とＸ軸方向において、領域１１ｂの長さは、ライトシート１１の長さよりも小さい。第１方向Ｄ１において、領域１１ｂの長さとライトシート１１の長さは同程度である。

細胞１２の蛍光染色された部分が領域１１ｂを通過すると、２光子励起によって蛍光色素から蛍光が生じる。実施形態４では、２光子励起が生じた場合に実施形態１と同様の波長の蛍光が生じるよう、光源２０から出射されるレーザ光の波長は、近赤外光の波長帯域であることが好ましい。撮像対象の粒子によっては、可視域など他の波長帯域も利用できる。なお、細胞１２の蛍光染色された部分がライトシート１１のうち領域１１ｂ以外の部分を通過すると、不要な蛍光が生じる場合がある。この場合の不要な蛍光の波長は、近赤外光の波長帯域である。したがって、実施形態４では、撮像素子６０の前段に、不要な蛍光を遮断するためのフィルタが配置される。あるいは、光学フィルタ５２によって、不要な蛍光が遮断されるようにしても良い。この他、実施形態４の構成および制御は、実施形態１と同様である。

実施形態４によれば、２光子励起が生じる領域１１ｂが第２方向Ｄ２において狭いため、集光光学系５０の光軸方向において幅の狭い範囲の核１２ａから生じた蛍光を撮像できる。すなわち、より選択的に断面の画像を取得できる。これにより、高精度な画像を取得できる。

上述したように、２光子励起が生じる領域１１ｂのＸ軸方向の長さは、ライトシート１１のＸ軸方向の長さよりも短い。したがって、Ｘ軸方向に長い断面画像を取得するためには、実施形態３のように、フローセル４０に対してライトシート１１と他のライトシート１３を照射するのが好ましい。この場合、他の光源２０は、実施形態４の光源２０と同様に構成される。これにより、他のライトシート１３においても、２光子励起が可能となる領域１３ｂが形成される。図１３（ｂ）に示すように、ライトシート１１の２光子励起が可能となる領域１１ｂと、他のライトシート１３の２光子励起が可能となる領域１３ｂとが、Ｘ軸方向においてずれた位置に位置付けられる。こうすると、２光子励起が可能となる領域を、図１３（ａ）の場合に比べてＸ軸方向に長くできるため、Ｘ軸方向に長い断面画像を取得できる。

なお、ライトシート１１において２光子励起が生じるように光子密度が高められれば、光源２０は、連続的にレーザ光を出射する、いわゆるＣＷレーザであっても良い。また、２光子励起によって蛍光が生じさせられる場合に限らず、多光子励起によって蛍光が生じさせられても良い。

＜実施形態５＞
実施形態５では、実施形態３と比較して、他の光源２０の位置と他の照射光学系１３０の位置が、Ｚ軸正方向にずらされる。この他、実施形態５の構成および制御は、実施形態３と同様である。

図１４（ａ）に示すように、他の光源２０の位置と他の照射光学系１３０の位置がＺ軸正方向にずらされることにより、フローセル４０の流路４１において、ライトシート１１と他のライトシート１３が、Ｚ軸方向に離れている。このとき、ライトシート１１のシート面１１ａと他のライトシート１３のシート面１３ａは、平行となる。

図１４（ｂ）に示すように、ライトシート１１は、細胞１２のＸ軸負側に照射され、他のライトシート１３は、細胞１２のＸ軸正側に照射される。また、照射光学系３０の光軸と、他の照射光学系１３０の光軸とは、Ｚ軸方向にずれている。したがって、ライトシート１１に基づいて取得される核１２ａの画像と、他のライトシート１３に基づいて取得される画像は、いずれも、細胞１２に照射される光のにじみや照射むらを反映したものとなってしまう。しかしながら、実施形態３では、ライトシート１１に基づいて取得される核１２ａの画像と、他のライトシート１３に基づいて取得される核１２ａの画像とが、処理部８１により重ね合わされる。これにより、実施形態３と同様の１つの断面画像を取得できる。したがって、実施形態５においても、高精度な３次元画像を生成できる。

また、実施形態５によれば、ライトシート１１と他のライトシート１３に基づいて、同時に複数の断面画像を取得できる。これにより、実施形態１のように１つのライトシート１１に基づいて１つの断面画像を取得する場合に比べて、ライトシート１１と他のライトシート１３が核１２ａに照射される露光時間をそれぞれ短縮できるため、試料が流れる速度を上げることができる。よって、実施形態５によれば、実施形態１に比べて、より迅速に断面画像を取得して３次元画像を生成できる。なお、実施形態５では、２つのライトシートが、フローセル４０に対して異なる側から照射されたが、これに限らず、フローセル４０に対して同じ側から照射されても良い。

ここで、ライトシート１１と他のライトシート１３は、流路４１において、試料の流れ方向に十分離れている必要がある。たとえば、図１５（ａ）に示す場合、ライトシート１１に基づく撮像面６１上の照射領域１１５と、他のライトシート１３に基づく撮像面６１上の照射領域１１６とは互いに離れている。この場合、照射領域１１５に基づく画像と、照射領域１１６に基づく画像とを、異なる断面画像として識別できる。しかしながら、図１５（ｂ）に示す場合、ライトシート１１と他のライトシート１３が接近しているため、照射領域１１５と照射領域１１６とが互いに重なっている。この場合、照射領域１１５に基づく画像と、照射領域１１６に基づく画像とを、異なる断面画像として識別できない。

したがって、ライトシート１１と他のライトシート１３が、流路４１において試料の流れ方向に十分離れるように、Ｚ軸方向における光源２０と他の照射光学系１３０の位置が決められる。

＜実施形態６＞
図１６（ａ）に示すように、実施形態６では、実施形態１と比較して、照射光学系３０は、光学素子３４とビームストッパ３５をさらに備える。この他、実施形態６の構成と制御は、実施形態１と同様である。

光学素子３４は、光源２０から出射された光を分割することにより、ライトシートを試料の流れ方向に分離した状態でフローセル４０に照射する。具体的には、図１６（ｂ）に示すように、光学素子３４は、光源２０から出射された光を、０次回折光、＋１次回折光、および−１次回折光に分割する回折格子である。＋１次回折光と−１次回折光の中心軸は、Ｘ軸方向から、それぞれＺ軸負側とＺ軸正側に傾いている。光学レンズ３１は、光学素子３４によって分割された３つの回折光を、それぞれ実施形態１と同様に収束させる。

ビームストッパ３５は、図１６（ｂ）に示すように、０次回折光のみを遮断する。ビームストッパ３５の位置を通過した＋１次回折光と−１次回折光は、実施形態１と同様に対物レンズ３３によって収束され、フローセル４０の流路４１において扁平なビームとなる。こうして、照射光学系３０は、光源２０から出射された光から、フローセル４０に対しライトシート１４、１５を形成する。

図１７（ａ）に示すように、＋１次回折光に基づくライトシート１４と、−１次回折光に基づくライトシート１５が、フローセル４０の流路４１において、Ｚ軸方向に離れている。このとき、ライトシート１４のシート面１４ａとライトシート１５のシート面１５ａは、平行となる。

図１７（ｂ）に示すように、ライトシート１４、１５は、いずれも細胞１２のＸ軸負側に照射される。こうすると、２つのライトシート１４、１５に基づいて、同時に複数の断面画像を取得できる。これにより、実施形態１のように１つのライトシート１１に基づいて１つの断面画像を取得する場合に比べて、ライトシート１４、１５が核１２ａに照射される露光時間をそれぞれ短縮できるため、試料が流れる速度を上げることができる。よって、実施形態６によれば、実施形態１に比べて、より迅速に断面画像を取得して３次元画像を生成できる。

実施形態６においても、ライトシート１４、１５に基づく断面画像を分離できるよう、ライトシート１４、１５が試料の流れ方向に十分離される。ライトシート１４、１５の間隔は、光学素子３４の回折角によって決められる。

ビームストッパ３５に代えて、ＮＤフィルタを配置することにより、０次回折光を減光させても良い。こうすると、＋１、０、−１次回折光に基づく３つのライトシートをフローセル４０の流路４１に照射できる。この場合、ＮＤフィルタの透過率を調整することにより、＋１、０、−１次回折光の強度を同程度とし、３つのライトシートの強度を同程度とすることができる。また、＋１、−１次回折光のみを用いることに限らず、＋２、＋１、−１、−２次回折光に基づいて、４つのライトシートを形成しても良い。

＜実施形態７＞
図１８（ａ）に示すように、実施形態７では、実施形態１と比較して、フローセル４０は、Ｚ軸方向に連なった第１領域４２と第２領域４３からなる。この他、実施形態７の構成と制御は、実施形態１と同様である。

第１領域４２は流路４１ａを備え、第２領域４３は流路４１ｂを備える。流路４１ａのＸ軸方向の幅とＹ軸方向の幅は、実施形態１の流路４１と同様である。流路４１ｂのＹ軸方向の幅は、流路４１ａのＹ軸方向の幅よりも大きい。ライトシート１１は、流路４１ｂのＹ軸負側の端部からＹ軸正側の端部までをカバーするように、フローセル４０に照射される。図１８（ａ）に示す断面Ｃ５−Ｃ６をＺ軸正方向に見ると、断面は図１８（ｂ）に示すようになる。図１８（ｂ）に示すように、流路４１ｂのＸ軸方向の幅は、実施形態１の流路４１と同様である。

このように、フローセル４０は、ライトシート１１が照射される領域において、集光光学系５０の光軸の方向における幅、すなわちＹ軸方向の幅が、照射光学系３０の光軸の方向における幅、すなわちＸ軸方向の幅よりも大きくなるように構成されている。これにより、１つのライトシート１１を、複数の細胞１２が同時に通過可能となる。したがって、実施形態７によれば、複数の核１２ａの断面画像を並行して取得し、複数の核１２ａの３次元画像を並行して取得できる。

実施形態１〜７では、撮像素子６０が撮像する光は蛍光であったが、撮像素子６０が撮像する光は、撮像対象の粒子からフローセル４０の側方に生じた光、たとえば側方散乱光でも良い。

実施形態１〜７では、フローセル４０は、Ｚ軸方向に見て正方形形状の外形を有したが、Ｚ軸方向に見て円形形状の外形を有しても良い。たとえば、フローセル４０が円柱形状に構成される場合、フローセル４０はＺ軸方向に見て円形形状の外形を有し、フローセル４０の外側面は曲面となる。フローセル４０が円柱形状に構成される場合、ライトシートは、外側面の接平面に垂直とされる。こうすると、フローセル４０に入射するライトシートが外側面により屈折することが抑制されるため、細胞１２に照射されるライトシートの形状が崩れにくくなる。したがって、撮像素子６０により高精度な画像を撮像できる。

実施形態１〜７では、装置に設置されたフローセル４０に対して試料がＺ軸方向に流されたが、試料がフローセル４０内でゲル等によって固定され、フローセル４０がＺ軸方向に動かされるようにしても良い。この場合も、フローセル４０がＺ軸方向に動かされると、試料に含まれる粒子がライトシートを横切ることになるため、ライトシートが照射された断面から生じた蛍光を撮像素子６０により撮像できる。したがって、この場合も実施形態１〜７と同様、撮像素子６０により高精度な画像を撮像でき、高精度な粒子の３次元画像を生成できる。

１０ 粒子撮像装置
１１ ライトシート
１１ａ シート面
１３ 他のライトシート
１３ａ シート面
１４、１５ ライトシート
２０ 光源
３０ 照射光学系
３１ 光学レンズ
３２ 回転機構部
３４ 光学素子
４０ フローセル
４０ａ、４０ｃ 外側面
４１ 流路
５０ 集光光学系
５６ 位相変調素子
６０ 撮像素子
６１ 撮像面
８１ 処理部
１２０ 他の光源
１３０ 他の照射光学系

Claims (12)

1. 粒子を含む試料を流すためのフローセルと、
   光源と、
   前記光源から出射された光から、前記フローセルに対しライトシートを形成するための照射光学系と、
   前記粒子から生じた光を集光するための集光光学系と、
   前記集光光学系により集光された光を受光するための撮像素子と、
   前記撮像素子により取得された画像に基づいて前記粒子の３次元画像を生成する処理部と、を備え、
   前記ライトシートのシート面は、前記光源から出射された光が入射する前記フローセルの外側面に対して垂直であり、
   前記ライトシートのシート面は、前記試料の流れ方向に対して垂直ではなく所定の角度で傾いており、
   前記照射光学系の光軸と前記集光光学系の光軸とが互いに垂直であり、
   前記フローセルにおける前記試料の流れ方向と前記集光光学系の光軸とが互いに垂直であり、
   前記処理部は、
   少なくとも前記フローセルにおける前記粒子の移動量と前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度とに基づいて、前記撮像素子の撮像面における前記粒子の像の移動量を算出し、
   算出した前記移動量と、１つの前記粒子について前記撮像素子により取得された複数の前記画像とに基づいて、１つの前記粒子の前記３次元画像を生成する、粒子撮像装置。
2. 前記照射光学系は、
   第１方向における光の収束と、前記第１方向と交わる第２方向における光の収束とが異なるように前記光源から出射された光を収束させる光学レンズと、
   前記光学レンズにおける前記照射光学系の光軸を中心に前記光学レンズを回転させる回転機構部と、を備える、請求項１に記載の粒子撮像装置。
3. 前記処理部は、前記所定の角度に基づいて、前記撮像素子により取得された前記画像の大きさを補正する、請求項１または２に記載の粒子撮像装置。
4. 前記集光光学系は、被写界深度を拡大させるための構成をさらに備え、
   前記撮像素子は、前記被写界深度を拡大させるための構成を透過した光を受光する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
5. 前記被写界深度を拡大させるための構成は、点像分布関数を変調する作用を有する位相変調素子を含む、請求項４に記載の粒子撮像装置。
6. 他の光源と、
   前記他の光源から出射された光から、前記フローセルに対し他のライトシートを形成するための他の照射光学系と、をさらに備え、
   前記他のライトシートのシート面は、前記他の光源から出射された光が入射する前記フローセルの外側面に対して垂直であり、
   前記ライトシートのシート面と前記他のライトシートのシート面は平行である、請求項１ないし５の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
7. 前記ライトシートと前記他のライトシートは、互いに異なる方向から前記フローセルに照射される、請求項６に記載の粒子撮像装置。
8. 前記ライトシートと前記他のライトシートは、前記フローセルの流路において互いに重なり合う、請求項６または７に記載の粒子撮像装置。
9. 前記ライトシートと前記他のライトシートは、前記フローセルの流路において前記試料の流れ方向において互いに離れている、請求項６または７に記載の粒子撮像装置。
10. 前記照射光学系は、前記ライトシートを前記試料の流れ方向に分離した状態で前記フローセルに照射するための光学素子をさらに備える、請求項１ないし９の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
11. 前記フローセルは、前記ライトシートが照射される領域において、前記集光光学系の光軸の方向における幅が、前記照射光学系の光軸の方向における幅よりも大きくなるよう構成されている、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
12. 粒子を含む試料が流されるフローセルの外側面に対して垂直であり、前記試料の流れ方向に対して垂直ではなく所定の角度で傾いたライトシートを、照射光学系により前記試料の流れに対して形成し、
    前記試料に含まれる前記粒子から生じた光を、前記照射光光学系の光軸に垂直で且つ前記試料の流れ方向に垂直な光軸を有する集光光学系により撮像素子に集光して、前記粒子を撮像し、
    少なくとも前記フローセルにおける前記粒子の移動量と前記試料の流れ方向に対する前記ライトシートの角度とに基づいて、撮像面における前記粒子の像の移動量を算出し、
    算出した前記移動量と、１つの前記粒子について前記撮像により取得された複数の前記画像とに基づいて、１つの前記粒子の３次元画像を生成する、粒子撮像方法。

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